LIPID ANALYSIS.ppt

LIPID ANALYSIS

Lipids and Lipoprotein Analysis

CholesterolTriglycerideLDL-CholesterolHDL-Cholesterol

Apo BLp(a)Small-Dense LDLOx-LDL

Bagaimana mendeteksi Hiperlipidemia ?

• Bila ada satu atau gabungan dari :

Kolesterol total > 240 mg/dl

Trigliserida > 400 mg/dl

LDL >160 mg/dl

HDL < 45 mg/dl

Apakah yang disebut Kolesterol ?Apakah yang disebut Kolesterol ?

- Kolesterol adalah bagian dari Lemak

yang ada pada semua sel dalam tubuh

dan berasal dari dalam tubuh maupun makanan

- Normal sebagai kalori, bahan lapisan sel,

bahan dasar hormon dan jaringan tubuh

Apakah yang disebut Trigliserida ?Apakah yang disebut Trigliserida ?

- Trigliserida adalah bagian dari Lemak yang

terutama berasal dari makanan

- Merupakan sumber energi dan banyak

terdapat pada jaringan tepi di bawah kulit

Apakah yang disebut HDL Kolesterol ?Apakah yang disebut HDL Kolesterol ?

- Merupakan protein pengangkut kolesterol

dari jaringan tepi ke organ hati

- Kadar HDL yang tinggi mengurangi risiko

aterosklerosis

Apakah yang disebut LDL Kolesterol ?Apakah yang disebut LDL Kolesterol ?

- Merupakan protein pengangkut kolesterol

dari organ hati ke jaringan tepi

- Kadar LDL yang tinggi meningkatkan

risiko aterosklerosis

Bagaimana mengetahui adanya Bagaimana mengetahui adanya Hiperlipidemia ?Hiperlipidemia ?

Pemeriksaan Diinginkan

mg/dl

Diwaspadai

mg/dl

Berbahaya

mg/dl

Kolesterol

Trigliserida

HDL

LDL

< 200

< 150

> 40

< 130

200 – 239

200 – 399

36 – 44

130 – 159

> 240

> 400

< 35

> 160

Apakah yang disebut Apo B ?Apakah yang disebut Apo B ?

- Merupakan protein bagian dari LDL

- Rasio LDL terhadap Apo B < 1,2

merupakan Small Dense LDL yang

bersifat sangat aterogenik

DISLIPIDEMIA

Kelainan metabolisme lipid yang ditandai dengan peningkatan komponen lemak dalam darah

Diet untuk penderita Dislipidemia

- Kurangi makanan berlemak

- Minum susu non-fat- Makan banyak ikan laut,

ayam dan kalkun tanpa kulit

Proses terjadinya Atherosclerosis

DISLIPIDEMIA

Bagaimana mendeteksi Hiperlipidemia ?

• Bila ada satu atau gabungan dari :

Kolesterol total > 240 mg/dl

Trigliserida > 400 mg/dl

LDL >160 mg/dl

HDL < 45 mg/dl

Pengukuran Lipid dan Lipoprotein

SpectrophotometryPrinsip:

Konsentrasi suatu zat diukur dengan melewatkan cahaya monokromatis melalui

suatu larutan. Semakin tinggi konsentrasi zat semakin banyak cahaya yang diserap.

Hubungan antara jumlah cahaya yang diserap dan konsentrasi larutan ditunjukkan dengan

hukum Beer, yang menyatakan bahwa besarnya penyerapan berkaitan langsung

dengan konsentrasi zat.

Pengukuran Lipid dan Lipoprotein

• Metode pengukuran :– Kimia– Enzymatic– Immunochemical – Fisika

Cholesterol Structure

Cholesterol

Cholesterol analysis was first reported by Libermann in 1885 folowed by Burchard in

1889. In the Libermann-Burchard reaction, cholesterol forms a blue-green dye from

polymeric unsaturated carbohydrates in an acetic acid/acetic anhydride/concentrated

sulfuric acid medium. The Abell and Kendall method is specific for cholesterol, but is technically complex and

requires the use of corrosive reagents. In 1974, Roeschlau and Allain described the

first fully enzymatic method.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

Principle:Although analysis of total cholesterol

and HDL-C required the same reagent, HDL-C measurement requires a

preliminary step where the HDL-C fraction is extracted and separated from

other lipoproteins before analysis.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

Ultracentrifugation

this technique is performed by adjusting the density of the sample to 1.063 g/ml using potassium bromide and then centrifuging the sample at 105.000 rpm for 24 hours at room temperature. The supernatant containing the LDL and VLDL is remove and the pellet containing the HDL-C fraction is dialyzed and then analyzed using total cholesterol reagents.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement• Precipitation with Polyanion Compounds

This technique is based on the precipitation of LDL and VLDL in the sample by polyanion (charged ions that the capable of binding to LDL and VLDL) agents leaving HDL-C in the supernatant. The sample is then analyzed using total cholesterol reagents. The polyanion agents include dextran sulfate, manganese chloride solution, heparin manganese chloride solution, sodium phosphotungstate solution, and polyethylene glycol solution.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

• Libermann-Burchard ReactionCholesterol is oxidized in the

presence of sulfuric and acetic acids forming a colored cholesthapolyene-sulfonic acid chromophoric compound. Which has a maximum absorbance at 610 nm. The intensity of this colored complex is measured using a spectrophotometer and is directly proportional to the concentration of cholesterol in the sample.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

• Iron-salt-acid reactionFerric chloride, in the presence of

sulfuric and acetic acid and iron salts, reacts with cholesterol forming a colored tetraenylic compound, which has a maximum absorbance at 563 nm. The intensity of this colored complex is measured using a spectrophotometer and is directly proportional to the concentration of cholesterol in the sample.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

• Electrophoresis

The percentage of each lipoprotein is measured through a physical separation of the individual fractions in a buffered-support (agarose gel or cellulose acetate membrane) medium.

CHOLESTEROL (Total & HDL-C): Automated Measurement

• Enzymatic oxidation

Cholesterol is oxidized by cholesterol oxidase to form choles-4-en-3-one and H2O2. Subsequent measurement of the H2O2 can then be performed using various methods. The measured value is directly proportional to the cholesterol concentration in the sample.

Manual measurement:• Persiapan: reagen blank, standard, control dan

sampel• Pencampuran sampel dan reagen dilakukan

secara manual• Inkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit• Baca absorban pada panjang gelombang 500 nm• Hasil dihitung secara manual dengan formula:

A (control/pasien) – A (reagen blank) x standard value

A (standard) – A (reagen blank)

Total Cholesterol

Kolesterol Total

• Kandungan Reagen:– 4-aminoantipyrine– ρ-hydroxy-benzenosulfonate– Cholesterol oxidase– Cholesterol esterase– Peroksidase– pH 6.5

Metode pengukuran kolesterol total didasarkan: 1. hidrolisis kolesterol ester dari serum atau plasma (sampel)

menggunakan enzim kolesterol esterase membentuk kolesterol nonesterifikasi (bebas) dan asam lemak bebas.

2. Kolesterol nonesterifikasi kemudian dioksidasi menggunakan kolesterol oksidase sebagai katalis membentuk koles-4-en-3-one dan hidrogen peroksidase (H2O2)

3. Selanjutnya H2O2 bereaksi dengan suatu kromogen (pewarna) misalnya 4-amynoantipyrine (4-AAP) atau p-hidroxybenzenesulfonate yang dengan adanya H2O2 akan menghasilkan suatu kompleks warna

4. Intensitas warna yang terbentuk kemudian diukur menggunakan spektrofotometer pada panjan gelombang 500 nm.

5. Intensitas warna yang terbentuk secara langsung proporsional terhadap total kolesterol yang ada dalam sampel

Total Cholesterol

Gambaran reaksi yang terjadi:

1. Cholesterol ester + H2O Cholesterol ester

hydrolase kolesterol + Fatty acid

2. Cholesterol + O2 Cholesterol oxidase Cholest-4-en-3-one + H2O2

3. H2O2 + phenol + 4-aminoantipyrine peroksidase quinoneimine dye + 2 H2O

Total Cholesterol

Total Cholesterol

• Sampel : Serum atau plasma heparin / EDTA (puasa 12 jam)

• Stabilitas sampel (sesuai kit reagen):– Suhu 2 – 8 o C : 5 – 7 hari– Suhu (-15) – (-25) °C : 3 bulan

• Metode pemeriksaan : enzimatik kolorimetri

• Alat : manual spektrofotometri dan automatic analyzer

Kolesterol Total

Interferences :

• Serum lipemik

• Serum hemolysis

• Beku ulang

• Mengandung obat-obatan yang mengganggu sistem metobolisme dan hidrolisis lipid

HDL Cholesterol

A variety of methods are available to determine HDL-C, including

ultracentrifugation, electrophoresis, HPLC,and precipitation-based method. Of these, precipitation-based method are

use routinely. HDL-C is first separated by precipitating

apo-protein B-containinng lipoproteins from serum by using a combination of a

polyanion and a divalent cation, such as dextran sulfate/magnesium chloride.

HDL Cholesterol

The principle for the measurement of HDL cholesterol in a clinical sample is based on

precipitation. Dextran sulfate and magnesium ion, when added to the sample, precipitate the very-low-density-lipoprotein (VLDL) and the low density lipoprotein leaving only the HDL-C

in the remaining supernatant. The supernatant then is analyzed using total

cholesterol reagents. The concentration of cholesterol measured indicates the HDL-C

level in the sample.

HDL Cholesterol• The automated method for direct determination of

HDL-C in serum and plasma uses polyethylene glycol (PEG)-modified enzymes, sulfated α-cyclodextrin and dextran sulfate. When cholesterol oxidase enzyme are modified by PEG, they show selective catalytic activities toward lipoprotein fractions, with the reactivity increasing in the order : LDL < VLDL < Chylomicrons < HDL.

• In the presence of magnesium ions, sulfated α-cyclodextrin reduce the activity of cholesterol, especially in chylomicrons and VLDL, without the need for precipitation of lipoprotein aggregates.

HDL Cholesterol

• HDL-C esters + H2O PEG Chol. Esterase > Chol. + RCOOH

• Chol. + O2 PEG Chol. Oxidase > Cholest-4-en-3-one + H2O2

• 2 H2O2 + 4-aminophenazone + HSDA + H+ + H2O2 peroksidase purple blue pigment + 5 H2O

PEG : Polyethylene Glycol

HSDA : N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline

HDL Cholesterol• Sampel : serum, plasma Li-Na heparin

(puasa)• Stabilitas sampel:

– 7 hari pada 2 – 8 °C– 30 hari pada -70 °C

• Kalibrasi : sesuai rekomendasi (mis. Penggantian no lot reagen, setelah servis alat)

• Kontrol : normal dan abnormal• Interferensi : ikterik (D-Bil > 30 mg/dL, I-

Bil > 70 mg/dL, lipemik, hemolisis, vitamin C > 50 mg/dL)

LDL-Cholesterol• Various methods are available for the determination of

LDL-C such as ultracentrifugation as the refrence method, lipoprotein electrophoresis and precipitation methods.

• Lipid Research Clinics recommend a combination of ultracentrifugation and precipitation methods using polyanions in presence of devalent cations.

• The calculation of the LDL-C concentration according to Friedewald’s formula is commonly practiced. LDL-C = (Total chol.) – (HDL-C) – (Trig/5)

The Friedewald equation should not be use in samples that have triglyceride concentrations above 400 mg/dL (4.52 mmol/L), in those that contain significant amounts of chylomicrons (nonfasting specimen), or in patients with type III hiperlipoproteinemia. These individuals have abnormal VLDL compositions, and the factor (trig/5) doesn’t apply

LDL-Cholesterol

• LDL-C ester cholesterol esterase Chol.+fatty acid + H2O

detergent

• Chol + O2 cholesterol oxidase Cholestenone + H2O2

• 2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + HSDA + H2O + H+ peroksidase purple blue pigment + 5 H2O

HSDA : N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline

• Sampel : serum, plasma heparin (puasa)• Stabilitas sampel:

– 7 hari pada 2 – 8 °C– 30 hari pada -70 °C

• Kalibrasi : sesuai rekomendasi (mis. Penggantian no lot reagen, setelah servis alat, sesuai prosedur QC)

• Kontrol : normal dan abnormal• Interferensi : ikterik (D-Bil > 39 mg/dL, I-

Bil > 70 mg/dL, lipemik, hemolisis, vitamin C > 50 mg/dL)

LDL-Cholesterol

• The measurement of triglyceride in serum or plasma is based on either the chemical hydrolysis or the enzymatic hydrolysis of the triglyceride to glycerol and fatty acids.

• Chemical hydrolysis involves saponification (the use of potassium hydroxide) or transesterification (the use of alkoxide agent)

• Enzymatic hydrolysis involves the addition of lipoprotein lipase to the sample.

• The subsequent measurement of the glycerol generated by either form or hydrolysis is directly proportional to the concentration of triglyceride in the sample.

Triglyceride

• A number of enzymatic methods have been developed to measure triglycerides directly in plasma or serum. A single reagent that combines all the required enzymes, cofactors, and buffers generally is used.

• In all the methods the first step is the lipasecatalized hydrolysis of triglycerides to glycerol and fatty acids. Trig. + 3 H2O Lipase glycerol + 3 fatty acids

• Glycerol then is phosphorylated in an ATP-requiring reaction catalized by glycerol kinase Glycerol + ATP glycerol kinase glycerol phosphate+ADP

Triglyceride

Triglyceride

• In the most commonly used methods, glycerolphosphate is oxidized to dihydroxyaceton and H2O2 in the glycerolphosphate oxidase-catalyzed reaction

Glycerolphosphate + O2 GPO dihydroxiacetone+ H2O2• H2O2 + 4-aminophenazone + 4-chlorophenol peroxidase

4–(p-bnezoquinone-monoimino)-phenazone +2H2O+HCl

• Sampel : serum, plasma EDTA / heparin (puasa)• Stabilitas sampel:

– 7 hari pada 2 – 8 °C– 3 bulan pada -20 °C

• Kalibrasi : sesuai rekomendasi (mis. Penggantian no lot reagen, setelah servis alat, sesuai prosedur QC)

• Kontrol : normal dan abnormal• Interferensi : lipemik, hemolisis, obat-obatan yang

mengganggu metabolisme dan hidrolisis lipid dan kontaminasi gliserol pada tabung yang digunakan untuk pemeriksaan.

Triglyceride

APO - B

Prinsip : Pengukuran secara fotometrik dari reaksi antigen-antibodi dengan metode end point menggunakan blanko sampel.

Metode : Imunoturbidimetri

• Sampel : serum, plasma EDTA / heparin (puasa)• Stabilitas sampel:

– 1 hari pada suhu 20 – 25 °C– 3 hari pada 2 – 8 °C– 2 bulan pada -20 °C

• Kalibrasi : sesuai rekomendasi (mis. Penggantian no lot reagen, setelah servis alat, sesuai prosedur QC)

• Kontrol : normal dan abnormal• Interferensi :

– Ikterik > 60 mg/dL– Hemolisis > 1000mg/dL– Lipemik > 1000 mg/ dL

APO - B

Performance Alat / Metode

• Sensitivitas analitik (batas bawah deteksi)• Range pemeriksaan• Pengenceran / larutan pengencer

– Manual– Automatic

• Penanganan / pemeliharaan alat– Pemeliharaan rutin– Servis berkala– Penggantian spare part– Kalibrasi

QUALITY CONTROLdi Laboratorium Klinik

Control Chart

Metoda grafik untuk menampilkan

hasil kontrol dan mengevaluasi

apakah suatu prosedur pemeriksaan

in-control atau out-of-control.

QUALITY CONTROLdi Laboratorium Klinik

Control Limits

Batasan pada grafik kontrol yang digunakan untuk menilai suatu prosedur pemeriksaan in-control atau out -of-control

Batasan kontrol dihitung dari Nilai rata-rata dan standar deviasi dari hasil pengukuran kontrol

Control Rule

Suatu ukuran/standar untuk

memberikan keputusan terhadap

perjalanan suatu pemeriksaan apakah

in atau out-of control

QUALITY CONTROLdi Laboratorium Klinik

Control Chart

Dasar Quality Control

Melibatkan Pemeriksaan Bahan kontrol spesifik (serum, urine, darah) bersamaan dengan sampel pasien Data hasil pemeriksaan bahan kontrol dianalisis secara statistik dan dipantau untuk menilai keandalan pemeriksaan Frekuensi analisis bahan kontrol ditetapkan oleh setiap lab. Untuk setiap metode pemeriksaan

Dasar Quality Control

Bahan kontrol yang digunakan minimal 2 level, normal dan abnormal Bahan kontrol tidak dapat digunakan sebagai kalibrator atau sebaliknya Kalibrator digunakan untuk menstandarisasi suatu metoda atau instrumen

Analisa Quality Control

Digunakan Tehnik Statistik untuk Mendeteksi,Mengurangi dan memperbaiki PenyimpanganYang terjadi selama proses analisis BerlangsungMetode: Levey Jennings Westgard Multirule

Tolak Ukur QC

Akurasi & Presisi

Akurasi = Kesesuaian hasil pemeriksaan dengan Nilai yang benar Akurasi = Ketepatan d% (Inakurasi)

Presisi = Kesesuaian antara hasil-hasil pada pemeriksaan berulangPresisi = Ketelitian CV (impresisi)

Akurasi dan Presisi

Manfaat Program QC (Levey Jennings & Westgard Multirule)

Memantau Kinerja Pemeriksaan Menganalisis data QC secara obyektif Membantu mengidentifikasi Masalah Membantu dalam pemecahan masalah

SUMBER TERJADINYA MUTU RENDAH

• Kesalahan Pra-analitik

• Kesalahan Analitik

• Kesalahan Pasca-analitik

Kesalahan Acak vs Kesalahan Sistemik

DUA TIPE KESALAHAN YANG DITEMUKAN SELAMA PROSES PEMERIKSAAN

1. Kesalahan acak (random error) tidak dapat diprediksi dan tidak ada trend atau shift, penyebab :

a. Pencampuran tidak homogen b. Suhu inkubasi tidak stabil c. Sumber listrik tidak stabil d. Gelembung udara pada reagen e. Variasi individual dalam pemipetan atau

waktu inkubasi

Random Error

2. Kesalahan sistematik adanya trend : hasil kontrol perlahan-lahan naik/turun adanya shift : pergeseran hasil kontrol diatas/dibawah Penyebab :

a. Perubahan no. lot reagen, no. lot kalibrator

b. Reagen atau kalibrator rusak

c. Nilai kalibrator salah

d. Penyimpanan yang tidak tepat dari reagen &

kalibrator

DUA TIPE KESALAHAN YANG DITEMUKAN SELAMA PROSES PEMERIKSAAN

h. Berubahnya volume sampel dan reagen karena pipet

tidak dikalibrasi/kalibrasi salahi. Gangguan pada sumber cahaya

fotometerj. Berubahnya suhu inkubasii. Prosedur salah

DUA TIPE KESALAHAN YANG DITEMUKAN SELAMA PROSES PEMERIKSAAN

Systematic Error