Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados

Peroxidase And

Nuclear Density Analysis

Lic. T.M. Jose Luis Vargas

Mètodo de IMPEDANCIAMMèètodotodo de IMPEDANCIAde IMPEDANCIA

•• Ley de Ley de OhmOhm: : U=RIU=RIU= U= VoltajeVoltajeR=R= ResistenciaResistenciaI= I= CorrienteCorriente

•• Mala Mala conducciònconducciòn de la electricidadde la electricidad

HISTOGRAMA G. ROJOSHISTOGRAMA G. ROJOSHISTOGRAMA G. ROJOS•• ADE:ADE: DistribuciDistribucióónn

HeterogHeterogèèneanea: : A. AdquiridaHomogHomogèèneanea: : A. Genética

•• VCM:VCM: TamaTamaññooMacrocMacrocììticoticoNormocNormocììticoticoMicrocMicrocììticotico

•• HCM,CHCM:HCM,CHCM: CantidadCantidadNormocròmicaNormocròmicaHipocròmicaHipocròmica

•• RBC,HTO,HbRBC,HTO,Hb::PoliglobuliaPoliglobuliaNormalidadNormalidadAnemiaAnemia

SUBPOBLACIONES WBCSUBPOBLACIONES WBC• LINFOCITOS:

Variantes de Linfocitos y Linfocitos maduros

• CEL GRANDES MONONUCLEARES: Monocitos, Linea Mieloide, Promonocitos, Prolinfocitos

• GRANULOCITOS: Todos los PMN màs cayados o segmentados

• Gràfica Normal segùn poblaciòn predominante acorde a la edad: NIÑOS ( LINFOCITOS )ADULTOS ( PMN )

• LINFOCITOS: Variantes de Linfocitos y Linfocitos maduros

• CEL GRANDES MONONUCLEARES: Monocitos, Linea Mieloide, Promonocitos, Prolinfocitos

• GRANULOCITOS: Todos los PMN màs cayados o segmentados

• Gràfica Normal segùn poblaciòn predominante acorde a la edad:NIÑOS ( LINFOCITOS )ADULTOS ( PMN )

LINFOCITOSLINFOCITOSLINFOCITOS

CELULASMONONUCLEARESGRANDES

CELULASCELULASMONONUCLEARESMONONUCLEARESGRANDESGRANDES

GRANULOCITOSGRANULOCITOSGRANULOCITOS

HISTOGRAMA DE PLAQUETAS

HISTOGRAMA DE HISTOGRAMA DE PLAQUETASPLAQUETAS

Generalidades de dispositivo Láser• Láser es un acrónimo de Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiation (Emisión de luz por emisión estimulada de radiación).

• La energía generada por un Láser está dentro de la porción óptica del espectro electromagnético, según ilustra la figuraUn haz Láser es no ionizante y abarca desde el ultravioleta (100 – 400 nm), visible (400-700 nm) e Infrarrojo (700 nm – 1 mm).

Propiedades de un haz Láser

1. Monocromaticidad

Propiedades de un haz Láser

2. Direccionabilidad

Propiedades de un haz Láser

3.Coherencia

Low Angle Scatter DetectorMeasures: Size/Volume

High Angle Scatter DetectorMeasures:Density/HGB conc/Refractive Index

Zero Angle:Retic Absorption/Staining

Laser

RBC/PLT/RTC MethodsRBC/PLT/RTC Methods

Reacción:

- Los eritrocitos son hemolizados para liberar la hemoglobina. - El grupo Hem se oxida de su forma ferrosa a férrica

y se combina con el cianuro para formar:

ReacciReaccióónn::

-- Los Los eritrocitoseritrocitos son son hemolizadoshemolizados parapara liberarliberar la la hemoglobinahemoglobina. . -- El El grupogrupo Hem se Hem se oxidaoxida de de susu forma forma ferrosaferrosa a a fféérricarrica

y se y se combinacombina con el con el cianurocianuro parapara formarformar::

HEMOGLOBINA+ HEMOGLOBINA+ reactivoreactivo HGB META HEMOGLOBINA CIANOMETA HB.HGB META HEMOGLOBINA CIANOMETA HB.

El reactivo ADVIA 120 HGB contiene:

- Cianuro de potasio, 20 mmol/L- Oxido de Dimethilaurilamina, 2.0%

El El reactivoreactivo ADVIA 120 HGB ADVIA 120 HGB contienecontiene::

-- CianuroCianuro de de potasiopotasio, 20, 20 mmolmmol/L/L-- OxidoOxido de de DimethilaurilaminaDimethilaurilamina, 2.0%, 2.0%

UFC Filtro +Fotodiodo

Cámara de reacción de HGB

Lámpara

ADVIA 120HEMOGLOBINA

ADVIA 120ADVIA 120HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA

GLOBULOS ROJOSGLOBULOS ROJOSGLOBULOS ROJOSLo

w A

ngle

/ Vo

lum

e (

Low

Ang

le /

Volu

me

( fLfL))

High Angle / High Angle / HgbHgb ConcentrationConcentration

120ƒL

Macrocrocytic

MicrocrocyticH

ypoc

hrom

ic

Hyperchrom

ic60ƒL

28 gm/dL 41 gm/41 gm/dLdL

CONCENTRACION DEHEMOGLOBINA

CONCENTRACION DECONCENTRACION DEHEMOGLOBINAHEMOGLOBINA

MICROCITOSISMICROCITOSISMICROCITOSIS

MACROCITOSISMACROCITOSISMACROCITOSIS

HIPOCROMIAHIPOCROMIAHIPOCROMIA

HIPERCROMIAHIPERCROMIAHIPERCROMIA

ANISOCITOSISANISOCITOSISANISOCITOSIS

Aniso HCVAR

Se relaciona con el VCM: grande, mediano, pequeño

ANISOCITOSISANISOCITOSISANISOCITOSIS

ANEMIA DIMORFA HETEROGENEA

LEUCOCITOS (Perox)LEUCOCITOS (LEUCOCITOS (PeroxPerox))ReacciReaccióónn::

- El Surfactante Sulfato dodecyl sódico y el Brij-35 en combinación con el calor, lisa las células rojas.El formaldeído fija las células blancas. El medio hipertónico produce crenación y contracción de las células blancas, lo cual incrementa el índice de refracción y permite la mejor identificación de los linfocitossobre el ruido.

Lámpara de tungsteno

Filtro

Detector de absorción

Corriente AnalíticaDetector de dispersión

Separador de luzCampoObscuro

# gr

anul

os

Maduración Celular

Blastos

PromielocitosMielocitos

MetamielocitosBandas

PMN Maduros

Médulo Oséa Sangre

Número de Gránulos NeutrófilosNúmero de Gránulos Neutrófilos

El método de peroxidasasEl El mméétodotodo de de peroxidasasperoxidasas

Neutrophils

Eosinophils

MonocytesLarge

UnstainedCells

Lymph and Basophil

PlateletClumps

NRBC

Noise

Perox Cytogram

METODO PEROXIDASAMETODO PEROXIDASAMETODO PEROXIDASASc

atte

r / V

olum

eSc

atte

r / V

olum

eSc

atte

r / V

olum

e

Absorption / StainingAbsorption / StainingAbsorption / Staining

Scat

ter /

Vol

ume

Scat

ter /

Vol

ume

Scat

ter /

Vol

ume

Absorption / StainingAbsorption / StainingAbsorption / Staining

12 uL de sangre

ADVIA 120 BASO contiene:

- Acido Hydroclórico, 9.00 mmol/L- Acido ftálico, 21.49 mmol/L- Preservativo- Surfactante

12 12 uLuL de de sangresangre

ADVIA 120 BASO ADVIA 120 BASO contienecontiene::

- AcidoAcido HydroclHydroclóóricorico, 9.00 , 9.00 mmolmmol/L/L-- AcidoAcido ftftáálicolico, 21.49 , 21.49 mmolmmol/L/L-- PreservativoPreservativo-- SurfactanteSurfactante

Reacción:

- El reactivo ADVIA 120 BASO contiene ácido ftálico y un surfactanteel cual lisa las células rojas y destruye las membranas de lasplaquetas y leucocitos, excepto basófilos.

ReacciReaccióónn::

- El El reactivoreactivo ADVIA 120 BASO ADVIA 120 BASO contienecontiene áácidocido ftftáálicolico y un y un surfactantesurfactanteel el cualcual lisalisa laslas ccéélulaslulas rojasrojas y y destruyedestruye laslas membranasmembranas de de laslasplaquetasplaquetas y y leucocitosleucocitos, , exceptoexcepto basbasóófilosfilos. .

BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOS

Baso Cytogram

BasoSuspect

Basophils

Blasts

MN

PMN

Noise

BasoSaturation

METODO BASOLOBULARIDAD

METODO METODO BASOLOBULARIDADBASOLOBULARIDADLo

w A

ngle

/ Vo

lum

eLo

w A

ngle

/ Vo

lum

eLo

w A

ngle

/ Vo

lum

e

High Angle / Density/Lobularity High Angle / Density/Lobularity

Low

Ang

le /

Volu

me

Low

Ang

le /

Volu

me

High Angle / Density/High Angle / Density/LobularityLobularity

Indice de Lobularidad

1.- Mononucleares

2.- Polimorfonucleares

3- Valle

El índice de lobularidad (LI) proporciona una indicación del grado de maduración de la curva leucocitaria

Relación 2:1

BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOS

BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOSGranulocitos Inmaduros

La presente muestra fue tomada a un paciente con Leucemia mieloblástica aguda.La alarma de GI apareció porque [(%NEUT+%EOS)-%PMN] fue mayor de 5.0%.

1 Neutrófilos 2 Eosinófilos 3 Polimorfonucleares

Mapa de plaquetas Mapa de plaquetas 22--DD

Palquetas

Plaquetas Gigantes

Fantasmas RBC

Fragmentos de RBC’s

Detritus

Microcitos....

Indice de Refracción

Volu

men

(fL)

ADVIA 120 PLAQUETAS ADVIA 120ADVIA 120

PLAQUETASPLAQUETAS

•• 1.1.-- AreaArea cubierta por el cubierta por el citogramacitograma de de plaquetasplaquetas

•• 2.2.-- Fragmentos Fragmentos de de RBCRBC’’ss

•• 3.3.-- Plaquetas Plaquetas GigantesGigantes

Quality Of Results

Impedance 3Impedance 2

Impedance 1ADVIA 120

0

50

100

150

200

0 20 40 60 80 100Immunophenotypic Count (x 10 9/L)

‘ADVIA 120/2120 Very Close To Immuno Method’

Lipemic

ITP

British Journal of Haematology 2000, 108:2,228-235, Machin

RETICULOCITOSRETICULOCITOSRETICULOCITOS

El reactivo ADVIA 120 autoRETIC contiene:

- Oxazina 750, 11.4 mg/L- Buffer- N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate, 0.023 mmol/L

Reacción:

El El reactivoreactivo ADVIA 120 ADVIA 120 autoRETICautoRETIC contienecontiene un un detergentedetergente ((surfactantesurfactante))queque hacehace esfesfééricosricos ((isovolumisovoluméétricamentetricamente) a los ) a los eritrocitoseritrocitos. . TambiTambiéénn contienecontiene un un colorantecolorante caticatióóniconico, , OxazinaOxazina 750, 750, queque titiññee laslas ccéélulaslulasde de acuerdoacuerdo a a susu contenidocontenido de RNA. de RNA.

RETICULOCITOSRETICULOCITOSRETICULOCITOS

Absorption

BENEFICIOS RETICULOCITOSBENEFICIOS RETICULOCITOSBENEFICIOS RETICULOCITOS•• La La ferritinaferritina es una es una evaluacionevaluacion indirecta de la deficiencia indirecta de la deficiencia

funcional de hierrofuncional de hierro•• Monitorear el porcentaje de cMonitorear el porcentaje de céélulas lulas hipocrhipocróómicasmicas

permite un monitoreo directopermite un monitoreo directo•• El contenido de hemoglobina (El contenido de hemoglobina (CHrCHr) de los ) de los reticulocitosreticulocitos

ha demostrado ser mas sensible que el porcentaje de ha demostrado ser mas sensible que el porcentaje de hipocromiahipocromia

El uso de El uso de CHrCHr permite un monitoreo mpermite un monitoreo máás s eficiente, que nos da la optimizacieficiente, que nos da la optimizacióón del n del uso de EPO y tratamientos con hierro, lo uso de EPO y tratamientos con hierro, lo que como consecuencia tiene un mejor que como consecuencia tiene un mejor manejo del paciente anmanejo del paciente anéémicomico

InicioDespués de 4 días

Después de 2 semanas Después de 1 mes

Antecedentes

• Guideline for Reference Leukocyte Count (Proportional) And Evaluation of Instrumental Methods.

• CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute).

SISTEMA DE AUTOMATIZACIÓN DE

ANALISIS DE HEMOGRAMASMEDIANTE PROCESAMIENTO

DIGITAL DE IMÁGENES

Esquema de Captacion de Imagen

Los resultados serán presentados visualmente vía monitor del computador o impresión en papel. En esos resultados seespecificará lo siguiente:

· Número de elementos contabilizados en la muestra de sangre.· Número de glóbulos rojos contabilizados, en cantidades y en porcentaje.· Numero de glóbulos blancos contabilizados (en cantidades y porcentaje) y clasificados según su tipo: monocitos, linfocitos,eosinófilos, etc.· Número de plaquetas encontradas en la muestra analizada.· Área y perímetro medio de los glóbulos rojos analizados.· Área y perímetro medio de los glóbulos blancos analizados?

Introducción• Contadores Automatizados.

• Clasificación de Sistemas Automatizados para el conteo Diferencial.

• Limitaciones. (Alarmas, Experiencia, Sensibilidad Analítica y Funcional, Especificidad, etc.).

Causas de Variabilidad

• Fuentes de Variación.(preanalitica, analítica, biológica, fisiológica y patológica).

• Rutina vs. Tiempo Optimo para el Test.

Principios

• Selección de Método de Referencia.– Exactitud.– Subjetividad.– Seguridad y Efectividad del conteo

diferencial.

Desempeño del Test

• Comparación.• Consistencia

Interna.• Establecer Valores

de Referencia.• Sensibilidad

Clínica.

• Seguridad y Efectividad.

• Evaluación Célula por Célula.

• Datos tabulados vs. Alarmas del fabricante.

• Comparación.• Consistencia

Interna.• Establecer Valores

de Referencia.• Sensibilidad

Clínica.

• Seguridad y Efectividad.

• Evaluación Célula por Célula.

• Datos tabulados vs. Alarmas del fabricante.

Definiciones• Anormalidad.• Arbitro.• Sistema Automatizado.• Sensibilidad Clínica.

(concordancia con método de Referencia VP).

• Especificidad Clínica (concordancia con método de Referencia VN).

• Evaluación de Elementos Formes.– Tabular leucocitos.– Anormalidades de RBCs.– Suficiencia, morfología,

exceso o aglutinación PLT.

• Falso Positivo.• Falso Negativo.• Verdadero Positivo.• Verdadero Negativo.

Grafica de Bayes

Método de Referencia

Positivo Negativo

Positivo VP (Verdadero Positivo)

FN(Falso Negativo)

Negativo FP(Falso Positivo)

VN(Verdadero Negativo)

Conteo Diferencial de Referencia

• Colección de Espécimen.• Condición de la Muestra.• Prep. Lamina.• Requerimientos.• Coloración.

– Leucocitos Aceptables.– Coloración reproducible.

Células Nucleadas Hematológicas

Calificación

Calificacion Conteo Neutrofilos

0102030405060708090

0 20 40 60 80 100

Serie1

Serie2

Serie3

Calificación

Calificacion Conteo Monocitos

02468

101214

0 5 10 15

Conteos Individuales

Prom

edio

de

Con

teos

Serie1

Serie2

Serie3

Diseño de la Evaluación• Preparación de la muestra.

• Comparación de Leucocitos para Inexactitud e Imprecisión.

• Sensibilidad Clínica.

• Métodos Estadísticos.

Protocolo Estudio de Sensibilidad200 Muestras

100 Normales 100 Anormales

Método de Referencia Método Automatizado

Intervalo de Referencia

Sensibilidad Clínica

Comparar DiscrepanciasMorfológicas y Numéricas

ArbitroReconteo & Reasignación

Sensibilidad Clínica Final

Tipos de Muestra para Estudio de Sensibilidad

Condición Clínica

Hallazgo del conteo Leucotitario

Conteo Absoluto

Conteo Relativo

Inflamación Aguda GranulocitosisDesv. Izq (Bandas)

>=9.0 x 10 9/ L >80 %

Inflamación Crónica

Monocitosis >=0.8 x10 9 /L > 10%

Inf. Parasitaria reacción Alérgica

Eosinofilia >=0.5 x 10 9 /L > 7%

Inf. Viral Linfocitosis y Variantes

>=3.5 x10 9 /L > 50%

Anemia AplasicaQuimioterapia

Granulocitopenia >= 1.5 x10 9 /L < 10%

Inf. HIV Linfopenia <= 0.1 x10 9 /L > 2%

Leucemia Aguda Cells. Inmad 0.1 x 10 9 /L > 2%

Anemia Severa NRBC >= 0.02 x 10 9 /L > 2%

…PREGUNTAS??

Tendencias en Hematologia Automatizada

EXTENSIÓN DE LAS APTITUDES DE SISTEMAS AUTOMATIZADOS CON EL USO DE MARCADORES

LINFOIDES

(American Journal of Clinical Pathology)

Automated Cell Counts in Cerebrospinal FluidThis article was written with the cooperation of our 10 CSF clinical trial sites reporting results on 325 samples. The sites include Roswell Park Cancer Institute - Buffalo, NY; Children's Hospital - Boston, MA; Brigham and Women's Hospital - Boston, MA; St. Mary Medical Center - Long Beach, CA; Memorial Health University Medical Center - Savannah, GA; University of Heidelberg - Heidelberg, Germany; Haukeland University Hospital - Bergen, Norway; University of Mainz - Mainz, Germany; Aarhus University Hospital - Aarhus Amtssygehus, Denmark; and Karolinska University Hospital - Stockholm, Sweden. Key message:Study results demonstrate that the automated ADVIA 120 CSF Assay is an acceptable alternative to the labor-intensive manual method.

Análisis de LCR Automatizado

• Diferencial de 5 estirpes en LCR de forma automática y citograma propio.

• Posibilidad de hacer controles periódicos de patologías del SNC.

• Análisis cuantitativo y cualitativo de las sospechas de alarma.

Análisis de Liq. Amniótico Automat.

• Cuerpos lamelares (relación lecitina- esfingomielina).

• SDR (síndrome de Distress Respiratorio.• Maduración Pulmonar Fetal.

Cat WBC

This area includes nonlysed MN’s that are included in the MN count. Samples should be run at room temp to minimize nonlysis.

Eos’s average 2%-12% but may be as high as 35%

Eos’s not counted here

Eos’s are counted in the retic channel (even without ordering a retic). Retic reagent must be available on the analyzer at all times when running cats.

Dog WBCMono’s about 1% higher on ADVIA 120

Baso positioned lower

Dog Retic

%Retic low on dogs (but can be 5%)

Guinea Pig HGB, Platelet and RBC

Small Platelets

Horse WBCEos’s are located out to the side and are giant in size

Mono’s

LUC’s

Unlysed MN - can warm the blood but non-lysis may not be eliminated

Monkey-Cyno WBCPerox cytogram looks like a weak staining human

Pig WBCLUC’s

Mono’s

Neutrophils sometimes weak stainers

Rabbit WBCMany Baso’s

Very little noise

Lymph threshold is low due to small size of lymphs

Baso’s can equal 4-10%

Sheep WBCLUC’s

Mono’s

Lymphs

Inverted Diff

Sheep Retic

Low %Retic

…..el Laboratorio como Fuente de Informacion ….AHORA.

• ….GRACIAS POR SU ATENCION