View
228
Download
2
Category
Preview:
Citation preview
Clostridium difficile-påvisning av toksin i cellekultur
Hege Enger
Svein Arne Nordbø
St Olavs Hospital
Clostridium difficile
• Apatogen og patogen form– den patogene formen er toksinproduserende
– men produksjon av toksin alene er ikke nok til å gi sykdom
• Toksin A: enterotoksin, kjemotaktisk for nøytrofile granulocytter som infiltrerer ileum og frigjør toksiner. Cytopatogen effekt, ødeleggelse av tight junctions mellom cellene og økt permeabilitet av tarmveggen
– vanndig diare
• Toksin B: cytotoksin, depolymeriserer aktin, gir ødelagt cytoskjelett– colitt
• De fleste patogene Clostridium difficile har både toksin A og B, men toksin B er ansett å være mer sykdomsfremkallende
• Ribotype 027– hypervirulent stamme
– høyere toksinproduksjon
– i tillegg et binært toksin
– mer alvorlig klinikk
Forutsetning for Clostridium difficile-infeksjon
• Forstyrrelse av normal tykktarmsflora
– antibiotikabehandling, spesielt bredspektret
– normal tarmflora beskytter mot sykdom
• Eksposisjon for toksinproduserende CD-stamme
– toksin A og B
– skjer vanligvis på sykehus eller sykehjem
• Vertsfaktorer/mottagelighet for infeksjon
– nyfødte har høy forekomst av toksinproduserende CD, men sjelden sykdom(mangler reseptorer)
– høy alder
– alvorlig sykdom
• Smitte skjer fra person til person(kontaktsmitte) eller via kontaminert miljø(sporene kan overleve i lang tid)
• Inkubasjonstid: få dager-8 uker
Bærertilstand av Clostridium difficile
• Spedbarn <1 år:
– 30-50 %. De utvikler sjelden Clostridium difficile-assossiert sykdom, sannsynligvis fordi tarmcellene mangler reseptorer for toksinet
• Friske voksne:
– 3-5 %
• Hospitaliserte, sengeliggende pasienter:
– 10-50 %
Romney et al: Laboratory Diagnosis of Bacterial
Gastroenteritis(CMR jan 2015)
Klinikk
• Varierende sykdomsgrad
– Clostridium difficile- assossiert diare
– Clostridium difficile- assossiert colitt
– Pseudomembranøs colitt
– Toksisk megacolon
Diagnostikk, St Olav
• Avføringsprøve uten tilsetning
• Tidligere:
– ELISA-test med påvisning av toksin A og B
– real-time-PCR med påvisning av toksin B, dyrkning av positive
• Nå:
– bredt panel av PCR-tester, inkl C.difficile
– de som bare ber om C.difficile, får inhouse –PCR
– PCR-positive prøver: dyrkning på FA-skål og CD agar
– Dyrkningspositive->ny PCR for bekreftelse
• Ribotyping retrospektivt (alle inneliggende)
Hvorfor toksinpåvisning i cellekultur?
• Få laboratorier bruker den i rutinediagnostikken – høyt prøvevolum
– mer ressurskrevende enn f eks PCR
• Men:
• Er PCR for sensitivt? Mange publikasjoner støtter dette
• PCR skiller ikke mellom bærerskap og infeksjon, mulig at toksinpåvisning i cellekultur skiller bedre? Påvisning av toksineffekt
versus påvisning av genet for toksinet *
• Toksinpåvisning i cellekultur historisk ansett som gullstandard
• *The Lancet Infectious Diseases 2013: Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection
Metode
• Kommersielt kit med toksin og antitoksin (Techlab, Alere)
• Vi testet ut HE-celler, TMG1 og LLC-MK2-celler, som allerede benyttes i rutinen på virus dyrkningslab
– HE-celler(Humane Embryonale fibroblaster) fungerte best
• Sannsynligvis bare toksin B som påvises, toksin A gir bare toksineffekt på spesialceller(HT29-celler)*
• Prosedyre:
– forbehandling av fæces
– fortynning av fæces, toksin og antitoksin
– tilsetting i cellekultur
– Avlesning etter 18-24 timer
*Manual of Clinical Microbiology, 10th edition
Forbehandling av fæces/fortynning
Forbehandling av fæces
• Flytende konsistens: bruker volum 1-1,5 ml
• Fastere konsistens: blandes med virusdyrkningsmedium til volum ca 1-1,5 ml
• Sentrifugeres 10 min
• Supernatant filtreres gjennom 450 µm membran
Fortynning
• Fæces 1:100
• Toksin 1:100
• Antitoksin 1:25
Utsæd i cellekultur og avlesning av CPE
• Utsæd:
– Fortynnet fæcesprøve tilsettes cellekultur med HE-celler
– Fortynnet fæces + antitoksin tilsettes i parallell brønn med HE-celler for å se etter opphevet toksineffekt/nøytralisasjon
• Avlesning:
– Kan se ganske umiddelbar toksineffekt i noen tilfeller, men anbefalt avlesning skjer etter 18-24 timer
– Positiv test dersom typisk CPE(cytopatogen effekt) i brønn tilsatt fortynnet fæces og dersom toksineffekt oppheves i parallell brønn tilsatt fortynnet fæces og antitoksin
Resultater
• Til sammen 70 PCR-positive prøver testet
• Positive i cellekultur: 55 (79 %)
• Negative i cellekultur: 15 (21 %)(inkludert 1 som var litt usikker)
• Dersom prøver med sparsomt materiale ble ekskludert: 62
• Positive i cellekultur: 50 (81%)
• Negative i cellekultur: 12 (19%)
Resultater
Pos i cellekultur Neg i cellekultur
Gjennomsnittlig CT-verdi 29,96 32,06
Pos i cellekultur Neg i cellekultur
CT≥35(12 prøver) 7(58%) 5(42%)
Pos i cellekultur Neg i cellekultur
CT<35(57 prøver) 48(84%) 9(16%)
Konsistens
• Registrert på 49 av prøvene
• 10 av 49 prøver hadde fast konsistens
• CT-verdier: 40-40-39-40-29-36-32-28-26-28
• Fast konsistens utelukker ikke positivt resultat (verken for PCR eller cellekultur)
• Unødvendig prøvetaking, da disse pasientene per definisjon ikke har Clostridium difficile-assossiert diare og etter retningslinjene ikke skal ha behandling. Avvisning av slike prøver har vært praktisert tidligere
Pos i cellekultur Neg i cellekultur
10 prøver 7 3
Hva med de PCR-positive som ble negative i cellekultur?
• 15 prøver/pasienter
• 10 var testet for tarmpatogene: negative
• 3 var testet for norovirus: negative
– 1 av disse 3 var også testet for andre virus(adeno og rota): negativ
De PCR-positive og cellekultur negative
Pas 1 Barn kreft Nøytropenfeber
Pas 9 Fastlege Ktr. etter beh. Cl.diff
Pas 2 ØNH Løs mage Pas 10 Gastro pol Ulcerøs colitt 6 mndr.
Pas 3 Gastrokir Diare Pas 11 Ort avd Slim, hyppig avføring
Pas 4 Gastrokir Diare x 11, CRP 200
Pas 12 Fastlege Løs og hyppig avføring
Pas 5 Med OSS Høy feber, red AT
Pas 13 Fastlege Vært i Tyrkia, diare
Pas 6 Gastro pol Løs avf 1 mnd
Pas 14 Øya helsehus
Ingen kliniske opplysninger
Pas 7 Med OSS Nitritt pos Pas 15 Ort avd Tyntflytende vanndigdiare 1 døgn
Pas 8 Nyre/endo Redusert AT, diare
Hva skjer videre?
• Cellekultur i tillegg til PCR på PCR-positive med usikre symptomer?
• Cellekultur på PCR-negative med høy klinisk mistanke om Clostridium difficile-infeksjon?
– Vi har ikke testet PCR-negative bortsett fra en prøve med rotavirus(som ble negativ i cellekultur). Sensitivitet har ikke vært beskrevet som et problem med PCR
• Vi sliter med leveranse av antitoksin…..
Recommended