Monoklonaalsete antikehade saamise meetod

Monoklonaalsete antikehade saamise meetod.

HPGRT ensüüm -DNA sünteesi varutee eest vastutav

H-hüpoksantiinT-tümidiinA-aminopteriin (blokeerib DNA sünteesi peatee)

Nobeli preemia 1984

Niels K. Jerne Taani

Georges J.F. Köhler Saksamaa

César Milstein Argentiina ja Suurbritannia

1911-1994 1946-1995 1927-2002

Preparaatide alusklaaside ja katteklaaside ettevalmistamine.

• Alusklaaside ja katteklaaside puhastamine1) 3 osa lämmastikhapet ja 1 osa soolhapet

2) 2M NaOH

3) Detergent

Alusklaaside ja katteklaaside katmine1) želatiiniga

2) aminoalküülsilaan

3) polü-L-lüsiin

Preparaatide fikseerimine.

• Orgaanilised solvendid ja valkudevahelisi ristseoseid tekitavad ained.

• 1. Orgaanilised solvendid (eraldavad rakust vee ja membraanidest lipiidid, valgud koaguleeruvad ning sadenevad rakustruktuuride külge): etanool, metanool, atsetoon, ksülool, toluool.

• 2. Ristseoseid tekitavad ained (seosed tekivad valkude vabade aminorühmade kaudu): formaldehüüd, paraformaldehüüd, glutaaraldehüüd; formaliin (37% formaldehüüdi lahus vees).

• 3. Kombineeritud fikseerimine:– Paraformaldehüüd-atsetoon

– Metanool-jää-äädikas

– Metanool-atsetoon

– Paraformaldehüüd-glutaaraldehüüd

4. Külmutsuslõigud.

5. Parafiini sisestamine (kasutatakse põhiliselt tahkete kudede korral). Koe fikseerimine, veetustamine, rasva eemaldamine (ksüleen), parafiini sisestamine, deparafiniseerimine.

Rakkude fikseerimine ja permeabiliseerimine.

Glutaaraldehüüd: HCO-(CH2)3-CHO

metüleenhüdraat

metüleensild

Elektronmikroskoopia.

• 1. Fikseerimine.• Paraformaldehüüd (2-4%) või glutaaraldehüüd (4-8%).

• Osmium oksiid (OsO4)-seostub küllastamata lipiididele. Kasutatakse elektronmikroskoopia preparaatide järelfikseerimiseks.

• Uranüülatsetaat (UO2(CH3COO)2·2H2O)-negatiivne värv elektronmikroskoopias (2%)

• 2. Veetustamine (25%, 50%, 75%, 95%, 100% etanool).

• 3. Sisestamine.• Epoksüüdvaik: Epon 812

• LR White

• Lowicryl

• Krüo e. külmutus elektronmikroskoopia (rakusisesed struktuurid ja valkude konformatsioon säiluvad kõige paremini)

Värvained.• Hematoksüliin. Kreeka k. Haimato (veri) and Xylon (puu, Haematoxylon campechianum). Aluseline

värv, mis värvib rakkudes happelisi piirkondi (DNA, RNA).• Eosiin on flourestseiini derivaat. Happeline värv, mis värvib rakus aluselisi piirkondi (tsütoplasma).• Trüpaansinine-happeline värv, mis läbib surnud rakkude kahjustatud plasmamembraani ning värvib

tsütoplasma valke.• Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid-positiivselt laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud

rakkude kahjustatud plasmamembraani ning värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. Absorbtsiooni maksimum 535 nm ja emissiooni maksimum 617 nm.

• DAPI

fluorestsiin eosiin propiidiumjodiid etiidiumbromiid

DAPI= 4',6-diamidino-2-fenüülindool

Wright’i värviga värvitud vererakud.

James Homer Wright (1869–1928)

monotsüüt eosinofiil basofiil lümfotsüüt

neutrofiil

Eosiin Y ja metüleensinine, mis on lahustatud metanoolis. Gustav Giemsa (1867-1948) lisas sellele stabiliseerimiseks glütserooli.

Rakutuum.

Mitokondrid.

Golgi kompleks.

Hepatotsüüt.

1-mitokonder

2-sile tsütoplasma võrgustik

3-kare tsütoplasma võrgustik

4-Golgi kompleks

Karedapinnaline tsütoplasma võrgustik.

1-tuum 2-mitokonder 3-tsütoplasma võrgustik 4-polüribosoomid

Siledapinnaline tsütoplasma võrgustik.

Hepatotsüüt.

Glükogeeni graanulid

Peroksüsoomid ja lüsosoomid.

Immunokullaga värvitud MHC II antigeen.

α-amülaasi värvimine kõhunäärme koes immunokulla/hõbetamise meetodiga.

Paljutuumsed Langerhansi rakud epiteelis.

Paljutuumsed rakud (hiiglaslik sarkoomi rakk).

Inimese platsenta (süntsütsiaalsed rakud).

Polüploidsus (maisi juure rakk).

Seljaaju motoneuron.

Epiteeli karikrakud.

Säilitusgraanulid maksa epiteelirakkudes.

Tuuma struktuur.

Sibula meristeemi rakkude mitokondrid.

Spinaalganglioni Golgi aparaat.

Kõhunäärme eksokriinsete rakkude Golgi aparaat.

Kloroplastide graanumid Tradescantia võrses.

Taime mesofülli rakk kloroplastidega.

Taime mesofülli rakkude kloroplastide graanumid.

Meioos: liilia tolmutera areng. Diploteeni staadium. Kiasmid.

Imetajate munaraku areng (oogenees), noor Graafi folliikul.

Imetajate munaraku areng (oogenees), küps Graafi folliikul.

Imetajate munaraku areng (oogenees), küps munarakk (ootsüüt).

Merisiiliku (Echinus) areng.