View
226
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Nespecifické složky buněčné
imunity
RNDr. Jan Lašťovička, CSc.
Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol
- Mechanizmy vrozené imunity fungují okamžitě
- Ihned následuje časná indukovaná odpověď
- Nevytvoří se imunologická paměť
- Specifická reakce je zahájena jen v případě, že infekce
překoná tyto nespecifické mechanizmy
Patogeny
- Viry, bakterie, houby, prvoci, červi
- Pronikají do těla různými cestami, množí se
a působí onemocnění různým způsobem
- Imunitní systém používá k jejich eliminaci
odlišné mechanizmy
Možné cesty průniku infekce
• Naše tělo je neustále vystaveno
mikroorganizmům přítomným v prostředí
• Kontakt na epiteliálních površích
• Na sliznicích dýchacích cest
• Na střevních sliznicích
• Na sliznicích genitálií
• Při poranění kůže (kousnutí hmyzem)
Antimikrobiální peptidy
Lysozym, fosfolipáza A (sliny)
Histatiny
Trávící enzymy
Lysolipidy
α a β-defensiny (intestinální)
Surfaktanty SP-A, SP-D
opsonizace
Odpověď na průnik mikroorganizmu je rozdělena na několik stádií:
- Lokální nespecifická odpověď se pokusí infekci zlikvidovat
- pokud se to nepodaří, je antigen transportován do lymfatických uzlin
- aktivují se specifické mechanizmy
Mechanizmy nespecifické imunity:
• Jsou založeny na rozpoznání chemických
struktur (hlavně sacharidů), na povrchu
mnoha různých mikroorganizmů, ale
nepřítomných na povrchu vlastních buněk
organizmu
Rozpoznávací mechanizmy fagocytů
• Struktury, které se nacházejí na povrchu mikroorganizmů, ale ne na vlastních nepoškozených buňkách
• Evolučně velmi konzervované antigeny nezbytné pro život mikroorganizmů – PAMP (pathogen associated molecular patterns)
• Endotoxiny (LPS) gramnegativních bakterií
• Peptidoglykany grampozitivních bakterií
• Glukany a manany kvasinek a plísní
• Povrchové fosfolipidy apoptotických buněk
• Tyto struktury jsou rovněž rozpoznávány humorálními složkami nespecifické imunity
Rozpoznávací mechanizmy fagocytů
Receptory, které tyto struktury rozpoznávají, se
označují jako pattern recognition receptors
(PRR):
• Manózový receptor
• Galaktózový receptor
• CD14
• TLR (Toll-like receptory)
• Scavangerové (uklízecí) receptory
• FC receptory
Nespecifické
rozpoznávání
pomocí Toll-like
receptorů: každý z
TLR receptorů
rozpoznává jeden
či více
mikrobiálních
antigenů přímou
interakcí s
molekulami na
jejich povrchu
Bakteriální LPS
poskytuje signál přes
TLR -4 a aktivuje
transkripční faktor
NFκB, který pak
aktivuje geny kódující
proteiny sloužící k
obraně proti infekci
(TNFα)
• Bakteriální
proteoglykany mohou
být rozpoznány buď
TLR receptory na
povrchu buněk nebo
NOD proteiny v
cytoplazmě
• Obě cesty vedou k
aktivaci transkripčního
faktoru NFκB a k
expresi prozánětlivých
genů
Opsonizace
• Působení složek humorální imunity
• Fc receptory fagocytů
• Komplementové receptory
• Proteiny akutní fáze:
• Lektin vážící manózu (MBL)
• C reaktivní protein (CRP)
• Sérový amyloid P
Salmonella typhi – její dlouhý bičík je rozpoznán Toll-like receptory
Fagocyty a fagocytóza
• Evolučně velmi starý proces
• Dva hlavní typy buněk - profesionální
fagocyty: neutrofilní a eozinofilní
granulocyty a monocyty (makrofágy)
Makrofágy jsou aktivované patogenními
mikroorganizmy, pohltí je a zahájí zánětlivou
odpověď
Makrofágy exprimují řadu receptorů pro
bakterální komponenty včetně receptorů pro
karbohydráty (manózový a glukanový
receptor), lipidy (LPS receptor) nebo jiné
bakteriální komponenty (Toll-like receptory).
Navázání bakterie na receptory stimuluje
fagocytózu a pohlcení bakterie do
intracelulárních váčků zvaných fagozómy,
kde jsou zničeny.
Signál přes některé receptory, jako např.
TLR, způsobí sekreci prozánětlivých
cytokinů jako IL-1β, IL-6 a TNF-α a lipidové
mediátory zánětu.
Proces fagocytózy
Likvidace pohlceného mikroorganizmu
• Baktericidní látky (bazické peptidy
defensiny)
• Hydrolytické enzymy (proteázy katepsiny,
lysozym, kyselé hydrolázy)
• Nízké pH (3,5 - 5)
• BPI (bactericidal permeability-increasing
protein)
Likvidace pohlceného mikroorganizmu
• Aktivace enzymů: NADPH-oxidáza, myeloperoxidáza, superoxid dismutáza
• Reaktivní kyslíkové intermediáty (ROI):
- superoxidový radikál O2- (molekula kyslíku
s připojeným elektronem)
- Singletový kyslík, H2O2 , hydroxylový radikál a chlornanové anionty Cl-
- ROI jsou používány hlavně pro likvidaci pohlcených extracelulárních patogenů
Likvidace pohlceného mikroorganizmu
• Oxid dusnatý (NO), produkovaný NO
syntázou
• Je hlavním nástrojem zabíjení
intracelulárních parazitů
• Baktericidní látky a ROI se mohou
uvolňovat i do okolních tkání
Oxidační vzplanutí je způsobeno přechodným zvýšením
spotřeby kyslíku během produkce mikrobicidních kyslíkových
metabolitů
Neutrofily tvoří první vlnu buněk, které
opouští cévy a vstupují do místa infekce
• V místě infekce jsou cévy rozšířené
• Leukocyty mohou být v kontaktu s
endotelem
• Endotel v místě infekce exprimuje pod
vlivem TNF-α a IL-8 selektiny, molekuly
ICAM-1 a ICAM-2
• Dochází k extravazaci (diapedéze)
neutrofilů
Infekce stimuluje makrofágy k produkci
cytokinů a chemokinů, které spouštějí
zánětlivou reakci
Bakteriální LPS
poskytuje signál přes
TLR -4 a aktivuje
transkripční faktor
NFκB, který pak
aktivuje geny kódující
proteiny sloužící k
obraně proti infekci
(TNF-α)
Aktivace Toll-like receptorů spouští produkci
prozánětlivých cytokinů a chemokinů a expresi
kostimulačních molekul
• Toll signalizační dráha vede také k
povrchové expresi kostimulačních molekul
• Tyto molekuly, nazývané B7.1 (CD80) a
B7.2 (CD86), jsou povrchové proteiny
exprimované makrofágy a DC v odpověď
na signál z TLR-4. Tyto molekuly pak
spolu s MHC II aktivují naivní T buňky
Bakteriální LPS přes Toll signální cestu
indukuje změny v Langerhansových
buňkách (nezralé dendritické bb).
- Stimuluje je k migraci do lymfatických uzlin
- Působí změny v expresi povrchových molekul
(CD80 , CD86 a MHC )
Tím je zahájena specifická imunitní reakce (stimulace
CD4 T-buněk).
Cytokiny uvolňované fagocyty
aktivují akutní fázi odpovědi
• TNF-α, IL-1β a IL-6: endogenní pyrogeny
• Zvýšení tělěsné teploty
• Syntéza proteinů akutní fáze
• C-reaktivní protein se váže na fosfocholin
na bakterální stěně, opsonizuje a spouští
komplementovou kaskádu
• Konečný efekt prozánětlivých cytokinů je
leukocytóza
TNF-α je důležitým cytokinem, který
kontroluje lokální obranu proti infekci, ale
pokud je uvolňován systémově, má
destruktivní účinky.
Cytokiny TNF-α, IL-1β a IL-6 mají široké spektrum biologických aktivit,
které pomáhají koordinovat odpověď organizmu na infekci
Interferony jsou antivirové proteiny produkované buňkami jako odpověď na virovou infekci.
Vážou se na interferonové receptory na buňkách a indukují syntézu proteinů inhibujících replikaci virů (oligoadenylát syntetáza, PKR kináza)
Poruchy fagocytózy
Chybějící nebo snížená tvorba oxidativních produktů fagocytujících buněk je příčinou závažného onemocnění chronické granulomatosy(chronic granulomatous disease, CGD).
Onemocnění se projevuje opakujícími se těžkými infekcemi, které způsobují bakterie, kvasinky i plísně. Obyčejně probíhají formou zápalu plic nebo abscesů kůže, tkání a orgánů.
Onemocnění je nejčastěji způsobené mutací genu kódujícího enzym fagocytární NADPH-oxidasu na chromozomu X, kdy tento enzym má sníženou nebo nulovou aktivitu.
Aktivovaná NADPH-oxidasa zdravých jedinců katalyzuje reakci, při níž NADPH* reaguje s kyslíkem za vzniku NADP+ a superoxidového radikálu O2-, ze kterého následnými reakcemi vzniká singletový kyslík, peroxid vodíku, hydroxylový radikál a chlornan. Tyto reaktivní oxidační meziprodukty jsou zodpovědné za ničení patogenů uvnitř fagocytů po jejich ingesci
Testování fagocytózy
• Testy ingesce
• Baktericidní test
• Testy oxidačního metabolizmu
• Chemiluminiscence
Testy ingesce
• Testují schopnost fagocytů pohltit cizorodý materiál
• Používané substráty: bakterie nebo kvasinky, mikrosférické hydrofilní partikule (MSHP), velikost 1μM
• Suspenze částic se inkubuje s krví pacienta, pak se zhotoví nátěr na sklíčko
• Fagocytární aktivita = podíl fagocytujících neutrofilů ze 100
• Fagocytární index = počet pohlcených částic na buňku
• Výpovědní hodnota testů ingesce v rutinní diagnostice je velmi malá – primární porucha fagocytózy neexistuje
• K výraznému snížení fagocytózy dochází jen u velmi těžkých klinických stavů
• Použití spíše pro výzkumné účely
• Pokud se použijí inertní partikule, testuje se nereceptorově zprostředkovaná fagocytóza
• Nezralé neutrofily nejsou schopny partikule pohltit
• Stafylokoky vyžadují opsonizaci sérovými Ig
• Kvasinky vyžadují opsonizaci komplementem C3b
• Patologické výsledky mohou odrážet i poruchy opsonizace
Testy ingesce
Baktericidní test
• Testuje všechny fáze fagocytózy včetně
usmrcení pohlceného mikroorganizmu
• Substrátem je živý mikroorganizmus: C.
albicans, S. aureus, Pseudomonas
• Hodnocení se provádí různými způsoby:
mikroskopicky, cytometricky
Testy oxidačního metabolizmu
• Nitroblue tetrazolium chlorid (NBT)
• iod nitroblue tetrazolium (INT)
• Testuje se kyslíkový metabolizmus granulocytů
(schopnost tvořit kyslíkové radikály) pomocí
schopnosti redukovat bezbarvé tetrazoliové soli
na tmavě modré formazány
• Odečítá se na sklíčku (mikroskopicky) nebo na
destičkách (fotometricky)
Chemiluminiscence
• Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí
• Fagocyty při oxidačním vzplanutí vytvářejí vysoce reaktivní kyslíkové metabolity. Během těchto procesů vznikají emise fotonů a to se projevuje chemiluminiscencí fagocytů. Toto chemické světlo se zesiluje luminolem a detekuje na chemiluminometru
Měření oxidačního vzplanutí
průtokovou cytometrií (FagoFlow)• Princip
• Test je založen na měření respiračního (oxidačního) vzplanutí granulocytů po jejich stimulaci inaktivovanými bakteriemi E. coli.
• Po ingesci bakterií je ve fagocytech aktivována NADP-oxidáza,která spustí respirační (oxidační) vzplanutí.
• Vznikající reaktivní meziprodukty uvnitř fagocytů oxidují dihydrorhodamin 123(DHR123) na fluorescenční produkt rhodamin 123, který je detekován průtokovým cytometrem.
Histogram populace stimulovaných granulocytů.
Vzorek byl inkubován s bakteriemi E. coli a DHR123.
Histogram populace kontrolních nestimulovaných
granulocytů po inkubaci s DHR123.
O2 NEZÁVISLÉ MECHANIZMY:
imunochemické stanovení defensinů
stanovení lysozymu
deficience specifických granul
Další testy nespecifické imunity
- adherence
- chemotaxe:
Rebuckovo kožní okénko (in vivo)
agarózový test (formylmethionylleucylfenylalanin)
Boydenova komůrka
(nitrocelulózový filtr)
AKTIVACE A ADHERENCE FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK:
je testována schopnost adherovat k pevným povrchům
je testována přítomnost a denzita exprese adhezivních molekul
imunofluorescencí
LAD-I syndrom: - absence řetězce (CD18) integrinového heterodimeru LFA-1
CHEMOTAXE:orientovaný pohyb granulocytů v chemoatraktivním gradientu
migrace granulocytů pod agarózou
poruchy chemotaxe: - primární defekty: syndrom líných leukocytů- sekundární defekty: diabetes, popáleniny
Další testy nespecifické imunity
Test aktivace bazofilů:Bazofily společně s mastocyty jsou klíčovými
buňkami časné fáze alergické reakce
(vysokoafinitní receptor pro Fc fragment IgE)
Dochází k degranulaci a k expresi CD63
Možno měřit cytometricky
Další testy nespecifické imunity
Eozinofilní kationický protein (ECP)ECP patří mezi preformované granulární proteiny
eozinofilů, uvolňují se při aktivaci
Stanovujeme chemiluminiscencí
Recommended