SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH...

SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ

MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCIUNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Katedra ekologie a životního prostředíKatedra ekologie a životního prostředí

Jana CUPALOVÁ

BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENTŮ HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA

• hlavní formou výskytu bakterií v hyporeálu je biofilm, tj. komplex organických látek, mikroorganismů a jejich extracelulárních produktů, pevně vázaný na podklad (substrát)

•využití běžných molekulárních detekčních metod není možné bez předchozí úpravy sedimentu (sonifikace, detergenty, hustotní centrifugace)

Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií I.

1. Volba zrnitostní frakce sedimentu pro analýzu

2. ukotvení bakterie k substrátu i v matrix je velmi pevné a často je možné přerušit je fyzikálními nebo chemickými prostředky pouze u určitého procenta organismů, část tak zůstává nedetekovatelná.

3. Velikost a aktivita baktérií - bakterie sedimentu jsou často velmi malé a pomalu rostoucí a tím pádem hůře detekovatelné než bakterie volné vody

Grain size < 1mm represents ~ 20 % of total sediment weight,however, 60 % of total POC of the sediment

60 %

TPOC

< 1 mm

Grain size < 1mm

20 %< 1 mm

Dry sediment

Grain size fraction < 1 mm

1 : 9

< 0.063 mm 0.063 < 1

mm

Parameter fine fraction (n) coarse fraction (n)

TPOC (mg. g-1 DW) 27.1 ± 1.3 (52) 4.0 0.2 (52)Carbohydrates (mgC. g-1DW) 26.2 4.2 (16) 0.4 0.1 (16) Bacteria (1010cells.g-1DW) 21.9 38.3 (36) 0.4 ± 0.5 (16)Proteins (g.g-1DW) 189.5 8.3 (32) 95.4 2.7 (31)FDA (mol.g-1DW.h-1) 19.3 23.3 (16) 2.9 1.8 (16)

Fine fraction Coarse fraction

Celková bakteriální abundance

snímek DAPI z epifluorescenčního mikroskopu

sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC

4. Nízký obsah cílových nukleových kyselin je příčinou slabého nebo dokonce nezachytitelného signálu (excitačního paprsku) a tím často podhodnocení celkové bakteriální abundance (FISH)(Amann et al., 1995).

5. K tomuto problému se v případě detekce in situ často přidružuje ještě tzv. maskování („masking effect“) buněk nečistotami, resp. sedimentem (Kepner et al, 1993).

Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií II.

MOLEKULÁRNÍ DETEKČNÍ METODY- taxonomické složení bakteriálního společenstva

sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC

snímek FISH z epifluorescenčního mikroskopu

Postup při analýze vzorkuPostup při analýze vzorku

Odběr vzorkůOdběr vzorků

Extrakce buněk ze sedimentuExtrakce buněk ze sedimentu

Mikroskopická analýzaMikroskopická analýza

Barvení DAPI a FISHBarvení DAPI a FISH

Freeze-core (N2)

sonikace

DETERGENT, SONIKACE A HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE

PŮSOBENÍ DETRERGENTU A ULTRAZVUKOVÝCH VLN

přerušení vazeb bakterie- částice,

resp. bakterie- bakterie

PO CENTRIFUGACIPŘED CENTRIFUGACÍ

rozdělení částic vzorku podle jejich

hustoty

5-(N-2,3-dihydroxypropylacetamido) – 2,4,6 – trijodo –N, N´- bis(2,3- dihydroxypropyl) isophtalamide

ZHODNOCENÍ EFEKTIVITY HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0- 10 10-- 20 20- 30 30- 40 40- 50

vrstva [cm]

Prů

měrn

á a

bundance

bakte

rií

10

6 g-1

ABUNDANCE VEVZORCÍCH POHUSTOTNÍCENTRIFUGACI

ABUNDANCE VEVZORCÍCH PŘEDHUSTOTNÍCENTRIFUGACÍ

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

a b c d

frakce

Prů

měrn

á a

bundance

bakte

rií

10

6 g-1 ABUNDANCE VE

VZORCÍCH POHUSTOTNÍCENTRIFUGACIi

ABUNDANCE VEVZORCÍCH PŘEDHUSTOTNÍCENTRIFUGACÍ

frakcerozměr [mm]

a < 1

b 1- 3

c 3- 5,6

d 5,6- 22,4

signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)

signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)

- kombinace využití sonifikace, detergentu a hustotní centrifugace byla posouzena jako vhodná a efektivní pro separaci bakterií a sedimentu

- zařazení těchto „přípravných“ metod před vlastní molekulárně- detekční postupy významně zvýšilo počet detekovatelných bakteriálních buněk

SHRNUTÍ

cílový roztok detergentu

požadované množství 400 ml

složka koncentrace složky, molární hmotnost

množství

difosforečnan sodný M = 446 g.mol-1

0,1 M výsl. koncentrace m = 17,84 g

Tween 20 0,5% výsledná koncentrace V = 2 ml

NaCl 9,0 g. l-1 m = 3,6 g

destilovaná voda doplníme do výsledného objemu

doplníme do výsledného objemu

Ultrazvukové vlny o vysoké energii rozrušují agregáty sedimentů, destruují vlákna fibril i kotvící vrstvy exopolymerů, kterými jsou bakterie přichyceny k povrchu, nebo dokonce odtrhávají celé kusy biofilmu. Kromě toho však při určité vlnové délce a intenzitě porušují také struktury vlastních buněk, zapříčiňují jejich praskání a tím možné zkreslení následných detekčních metod

isopyknická centrifugace v hustotním gradientu probíhá výhradně na principu různé hustoty částic, tedy nezávisle na jejich ostatních vlastnostech (velikosti, tvaru, viskozitě aj). Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od horního okraje centrifugační zkumavky ke dnu.

Chemické postupy, jejichž cílem je oddělit bakterie od substrátu, pracují především s nejrůznějšími detergenty, tedy obecně látkami, které mají schopnost snižovat povrchové napětí vody a tím výrazně zesilovat její vlastnosti rozpouštědla. Účinnost takových látek však závisí na charakteru vazby bakterie- substrát; jsou-li cílové buňky součástí biofilmu, efektivita použití detergentu může být velmi nízká.

HYPOREÁL

ZÁSADNÍ VÝZNAM PRO:

• hydrogeologický režim krajiny

• ekologii toku (biomineralizace, samočištění)

HYPOREÁL

= veškeré propustné prostředí dna a břehů vodního toku, v němž dochází k mísení vody z toku s vodou podzemní (White, 1993)

Sediment analysis

GranulometryBiofilm organic carbon (BPOC)Bacterial abundance and biomassRespirationCarbohydrates and proteinsBacterial productionEnzyme activity Gas production potentialPlant detritus organic carbon

Freeze-core with liquid nitrogen

Two layers (0-20 cm and 20-50 cm) were separated