Teresa Nuez Polo Departamento de microbiología … · Vigilancia activa y pasiva OBJETIVO...

ANALISIS LABORATORIAL INFLUENZA AVIAR

Teresa Nuez PoloDepartamento de microbiologíaUASA Conselleria Agricultura Pesca y Agua17/02/2016

EL BROTE DE INFLUENZA AVIAR EN FRANCIA SE ACERCA A ESPAÑA

● Pirineos Atlánticos, el departamento que hace frontera con Gipuzkoa y Navarra La cepa detectada es H5N2 altamente patógena y ha aparecido en una granja de patos de 1.280 cabezas. No es un caso aislado.

H5N2 15,02/2016 HPAI INCUBADORA.

H5N9 09/02/2016 HPAI.POLLOS

(LPAI) H5N2 EN PATITOS (LPAI) H5N2 EN PATITOS (LPAI) H5N3 EN PATOS 22/01/2016

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAREnfermedad OIE de la lista A

VIRUS DE LA FAMILIA ORTHOMIXOVIRIDAE:

GENEROS:

INFLUENZA A aves, mamíferos y hombreUN VIRUS ARN SEGMENTADO DE CADENA NEGATIVA

la IA denominada altamente patógena (HPAI) conocida como “peste aviar” es una de las enfermedades más temidas

INFLUENZA B

INFLUENZA C

THOGOTOVIRUS O INFLUENZA D

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

Tipo A : hemoaglutinina (H) y neuraminidasa (N)

15 subtipos HAs (H1-H15)

9 subtipos NAs (N1-N9)

Aislando en aves todas las combinaciones posibles

Subtipos H5 y H7 predominantes en los brotes de IA en aves de corral

aunque no todos son virulentos HPAI.

virus (LPAI) HPAI. proceso mas grave

MUTACIONES O RECOMBINACIONES

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

La mayoría de los virus de la gripe aviar no infectan al ser humano, pero algunos, como A(H5N1) y A(H7N9), causan infecciones humanas graves, contacto directo o indirecto con aves de corral infectadas

en aves de corral pueden ser motivo de preocupación para la salud pública mundial por su por la posibilidad de que causen enfermedad humana grave, y por su potencial pandémico.

La aparición de epidemias de gripe aviar HPAI. en aves de corral como el A(H5N1) puede tener graves repercusiones en la economía local y mundial, así como en el comercio internacional.

No hay pruebas de que la enfermedad pueda transmitirse a las personas a través de los alimentos, siempre que hayan sido bien cocinados.

El control de la enfermedad en los animales es la primera medida para reducir el riesgo para el ser humano.

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

HOSPEDADORES NATURALESpatos y aves acuáticas: tracto gastrointestinal en lugar del respiratorio

de forma subclínica, siendo reservorio del virus en la naturaleza :

Liberan el virus durante 30 días Resistencia del virusInfecten otras especies (Cerdos, Caballos,Visones, Aves de corral, Mamíferos acuáticos)

Los cerdos son susceptibles a cepas aviares y humanas por lo que se les considera verdaderas cocteleras en las que se pueden producir cepas nuevas de composición mixta

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

TRANSMISION:En explotaciones avícolas :contacto directo o indirecto con aves acuáticas infectadasEstas liberan virus en heces, secreciones nasales y orales No demostrada la transmisión vertical

PROPAGACIÓNVirus en explotación se disemina de granja a granja

mecánica avesequipos utensilios,personal aérea si la densidad de animales es alta

Resiste activo largos periodos de tiempoHeces: 8 díasAgua contaminada: 4 díasMaterial orgánico granja infectada: 100diasSENSIBLE Tª 60ºC/30´ y UV

PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016MUESTREO REPRESENTATIVO EN CCAA

Vigilancia activa y pasiva

OBJETIVO

DETECCION A TRAVES DE VIGILANCIA ACTIVA DE:

-INF.SUBC DE LPAI DE H5 Y H7 EN AVES GALLINACEAS Y RATITES PARA EVITAR DISEMINACIÓN Y POSIBLE MUTACIÓN A CEPAS DE ALTA PATOGENICIDAD HPAI.

-INFECC.LPAI DE H5 Y H7 Y HPAI EN PATOS, GANSOS Y AVES DE CAZA ANÁTIDAS

PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016MUESTREO REPRESENTATIVO EN CCAA

OBJETIVO

VIGILANCIA PASIVA

VIGILANCIA CLINICA DE LAS AVES POR EL PROPIETARIO O VETERINARIO Y

REMISION A LABORATORIO MUESTRAS DE AVES MUERTAS O ENFERMAS

ESPECIAL: AVES ACUATICAS, SILVESTRES MIGRATORIAS ESPECIES OBJETIVO

PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016

MUESTRAS ANÁLISIS SEROLÓGICOS ELISA:

EL NÚMERO DE EXPLOT. A CHEQUEAR :PARA GARANTIZAR LA IDENTIFICACIÓN COMO MINIMO DE UNA EXPLOT INFECTADA EN CASO DE PREVALENCIA 5% CON UN INTERVALO DE CONFIANZA 95%

EN INSTALACIONES:AVES DOMESTICAS Y RATITES

EXPLOTACIONES /MANADAS DE AVES DE CAZA ANÁTIDAS, PATOS Y GANSOS DOMÉSTICOS (MEDIO AMBIENTE)

PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES

PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES

ESPAÑA IMPORTANCIA INTERNACIONAL DE PASO DE AVES . • ACUATICAS • LIMICOLAS Y MARINAS

DOS RUTASCORREDOR ATLANTICOCORREDOR MEDITERRANEO HASTA LA SUR-ATLANTICA

45% ANATIDAS Y FOCHAS30% GAVIOTAS15% LIMICOLAS

PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES

OBJETIVODETECTAR (HPAI) DE SUBTIPO H5N1 A. SILVESTRES PROTEGER AVES DE CORRAL

COLABORACION ORNITOLOGOS CON LA AUTORIDAD COMPETENTE

VIGILANCIA PASIVAMUESTREO LABORATORIAL AVES MORIBUNDAS O AVES MUERTAS ACUATICAS

AVES SILVESTRES EN CONTACTO CON MORIBUNDAS O MUERTAS

AUMENTAR VIGILANCIA SI:

EN HUMEDALES SI EXISTEN EXPLOT DOMESTICAS Y ZONAS DE ALTA DENSIDAD

MUESTRAS HISOPOS CLOACALES Y TRAQ U OROFARINGEOSANIMAL MUERTOMUESTRAS TISULARES:ENCEFALO, CORAZON, PULMÓN, TRAQUEA ,RIÑON O INTESTINO

NOTIFICACIÓN DE ENFERMEDADRD526/2014DE 20 de junio por el que se establece lista

de enf. de DO

Los titulares , propietarios criadores o personal de instalaciones de animales cautivos notificaran si demora a la autoridad competente de Sanidad Animal alguno de estos signos

Caida consumo pienso o agu >20%

Caida puesta >5% durante dos dias

Mort >3% durante una semana

Cualquier signo clinico o post morten sospechoso

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

SINTOMATOLOGÍA• Cese postura• Signos respiratorios• Lagrimeo• Edema cabeza y cara• Hemorragias subcutáneas• Cianosis piel, cresta y barbillas• Diarrea• Ocasionalmente signos neurológicos• Puede llegar al 100% de mortalidad

Los subtipos menos virulentos:• Caída puesta• Enf. Respiratoria • Anorexia• Depresión• Ligero aumento de la mortalidad

SINTOMAS

HPAI edema periobital en un brolier

HPAI incoordinacion movimientos en broiler

SINTOMAS

HPAI ponedora en fase preagónica con postración y rechazo al

movimiento

congestion y cianosis de cresta y barbillas

INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR

LESIONESLas aves que mueren de forma aguda :Fuerte congestión en musculatura y deshidratación Congestión conjuntiva con petequiasHemorragias petequiales en peritoneo y superficies serosas piel,hígado,bazo,corazón,riñón, pulmón, molleja y proventrículoriñón tubulos renales con uratosEdema subcutáneo en cabeza y cuelloExudado mucoso en traqueaTraqueitis hemorrágica similar a laringotraqueitisPancreatitisExudado serofibrinoso en pericardioBazo nódulos linfoides necróticosEn gallina ponedoras ovario hemorrágica y cavidad peritoneal llena de yema de huevos rotos

LESIONES

HPAI traqueitis catarral en gallina ponedora II

LESIONES

HPAI congestión del músculo pectoral en una gallina ponedora

hemorragia traquea

LESIONES

HPAI hemorragias en el epicardio de reproductora de carne

HPAI hemorragia en grasa abdominal gallina ponedora

LESIONES

hemorragias intestino

FOLICULOS HEMORRAGICOS

LESIONES

HPAI congestión y hemorragia de folículos ováricos

HPAI folículos ováricos hemorrágicos en gallina puesta

LESIONES

HPAI Esplenomegalia y folículos ováricos hemorrágicos

HPAI focos necróticos en el bazo de reproductora de carne

HPAI focos necróticos en

bazo

LESIONES

HPAI pancreatitis

HPAI pancreatitis y duodenitis en una oca

LESIONES

HPAI congestión del riñón y depósitos de uratos en uréteres

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Los síntomas y lesionesEn LPAI: pueden variar dramáticamente En HPAI: se confunden

Enfermedades con las que puede confundirse

Cólera aviar agudo

Forma velogénica de la enfermedad de Newcastle

Enfermedades respiratorias: laringotraqueítis infecciosa

Toma de muestras

TOMA DE MUESTRAS

IMPORTANCIA BIOSEGURIDAD PERSONAL EXTREMA

GAFAS GUANTES

MASCARILLAS

MONOS BOTAS

LEJIA

VACUNACIÓN

TRANSMISIÓN DEL VIRUS

NORMAS BASICAS DE HIGIENE Y BIOSEGURIDAD PRESERVAR EXPLOTACIONES

IDENTIFICACION Y ACREDITACION , NO INTRODUCIR VEHICULO NO SUPERAR LA ZONA DE DESINFECCIÓN

ANOTAR VISITA EN LIBRO DE REGISTRO

CUMPLIR NORMAS DE BIOSEGURIDAD EXPLOTACION :PEDILUVIOS ,PASILLOS DE CAL, DESINFECC ETC , AL ENTRAR LAVARSE Y DESINFECTARSE LAS MANOS

USO DE LA ROPA PROPORCIONADA EN EXPLOT. MASCARILLAS ETC. SI SE INDICA DUCHA Y

SI POR EL CONTRARIO NO SE NOS INDICA NADA AL RESPECTO• ROPA Y CALZADO ESPECIFICO DE PROTECCION LIMPIO Y PULCRO• MONOS DESECHABLES• CALZAS

SI CABINAS DE DESINFEC. MEDIDAS PARA EVITAR IRRITACION DE PIEL Y MUCOSAS

EVITAR ENTRADAS Y SALIDAS INNEC. LAS VISITAS SEGUIR ORDEN DE MENOR EDAD A MAS EDAD

TODO MATERIAL DESECHABLE DEPOSITAR EN BOLSA O CONTENEDORES DE RESIDUOS A LA SALIDAD ELA EXPLOT.

MANTENER ESTRICTO ESTADO DE LIMPIEZA DE PUERTAS ADENTRO COMO DE PUERTAS AFUERA

PROGRAMA DE VIGILNCIA DE IA EN ESPAÑA 2016

20 MUESTRAS POR INSTALACIÓN ELISA O IH

Si serología +(H5,H7): 20m. Serología y 20 hisopos traq y cloaca o 5 aves enfermas o muertas para PCR (H5,H7,H1) ,secuenciación , inoculación en embrión de pollo

Si H5 H7 + encuesta epidemiológica

Los resultados de los LLAA se remiten semestral SGSHAT

Remisión de muestras al LNR acompañada del anexo II

Remitir al LCR los virus hemaglutinantes , guardar copia de suero sanguineo del orden anseriforme

MUESTRAS SEROLOGIALA CALIDAD DE LA MUESTRA ASÍ COMO LA CANTIDAD SON FACTORES CLAVE PARA LA OBTENCIÓN DE UN BUEN

RESULTADO:

VENA BRAQUIAL AGUJA O BISTURI

COLECTAR LA SANGRE MINIMO 3ML. SANGRE O 1ML.SUERO

TUBO SIN ANTICOAGULANTE

EN POSICIÓN HORIZONTAL PARA DESUERADO

ENVIO REFRIGERACIÓN (4ºC) /24H.

NO CONGELAR LA SANGRE ENTERA

VIGILANCIA VIROLOGICA

Vigilancia en aves silvestres :

Hisopos cloacales y traqueales u orofarÍngeosMuestras tisulares:

EncéfaloCorazónPulmónTráqueaRiñonIntestino

Adecuado almacenamiento y transporte (inmersión en transporte vírico) refrigeración y remisión inmediata a laboratorio

El transporte de las muestras

Torunda oHisopo o

heces frescas

Colocar en medio de transporte estéril (con

antibióticos)PBS, pH 7,0 – 7,4 con penicilina (2.000 u/ml),

estreptomicina (2 mg/ml) en muestras de tejidos o hisopo traqueal (5 veces mas en el

caso de heces)

Identificar muestra

Introducir en un recipiente adecuado

Las muestras para aislamiento vírico:• Deben mantenerse en condiciones de refrigeración (4ºC)• Los cadaveres en refrig. No mas de 72h o congelados• Deben ser analizadas entre 24 y 48 h como máximo

Las muestras remitida al Laboratorio de forma

rápida (para evitar su deterioro)

*segura (para evitar la posible infección de otros animales durante el transporte, así como para evitar la contaminación de las mismas muestras).

El envío a 4ºC con un refrigerante dentro de la caja.

Las muestras con un mismo origen (granja, explotación, lote, etc.) deben ir dentro de una caja cerrada y sellada.

En el exterior de la caja se incluirá un informe

En el exterior de la caja debe llevar la siguiente identificación:

1. Etiqueta de “Consérvese a 4ºC.2. Nombre y dirección completa del remitente.3. Dirección del Laboratorio de destino.4. Muestras IA en rojo

Envio de muestras

*REMISION DE MUESTRAS SEGURA

1. EMBALAJE PRIMARIO Estanco enroscable Si van varios recipientes primarios cada uno envuelto individualmente para evitar dañosNo deben contener mas de 500g o 500ml

2. EMBALAJE SECUNDARIOCon suficiente material absorbente para absorber contenido del embalaje primario en caso de

rotura o filtracionesEstanco debe de medir en su superficie externa, al menos 10cmDebe poder llevar los documentos necesarios del transporte

3. EMBALAJE EXTERNONo debe contener mas de 4 litros o 4 kgSi es necesario se pondrá hielo seco o húmedo alrededor del e. secundarioEn caso de hielo seco el envoltorio debe permitir la salida de dióxido de carbono para evitar

incrementos de presiones que lleven a la ruptura del paqueteEntre el e. secundario y el externo se debe incluir lista detallada de los contenidos del paqueteEl embalaje externo de introducirse en una bolsa sellada de plástico para protegerlo de la

humedad

● HOJA DE REMISION DE MUESTRAS

● Señalar si es plan de vigilancia o es sospecha● Categoria del ave o especie en caso de aves silvestres● Datos del remitente

DIAGNOSTICO LABORATORIAL

LABORATORIOS Y PRUEBAS DE LABORATORIO

LNR LCV de Algete

LA CCAA(apoyo y reactivos)

ELISA

Inmunoensayo en la cual un antigeno, o anticuerpo inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo o antigeno enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, con cambio de color

ESPECTROFOTOMETRO

PCRMETODO ENZIMATICO IN VITRO QUE PERMITE AMPLIFICAR MILLONES DE

VECES UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA

OBJETIVO ES LA DETECCIÓN VIRUS INFLUENZA A Y DEL VIRUS PANDEMICO H1N1(2009)

MEDIANTE LA RETROTRANSCRIPTASA PCR(RT-PCR)POR TECNOLOGIA PCR EN TIEMPO REAL A

PARTIR DE MUESTRAS DE ORIGEN ANIMAL

TECNICA OPTIMIZADA PARA DETECTAR VIRUS INFLUENZA :

AVIAR

PORCINO

VARIANTE H1N1

PRIMERS M+25 M-124 Y M-124 MODIFICADO

PCRINACTIVACIÓN

1)MUESTRAS( VISCERAS , HECES, HISOPOS DE ARRASTRE) SE

INACTIVAN TERMOBLOQUE EN P3 ( GENOMA VIRICO RNA)

PCR

2) EXTRACCION POR COLUMNAS, BOLAS MAGNÉTICAS O POR CALOR

PCR3)AMPLIFICACIÓN DE ADN O ARN SELECCIONAR UNA REGION DEL

GENOMA A ESTUDIAR Y REALIZAR MULTIPLES COPIAS

Sintesis in vitro del acido nucleicoTAMPONCLORURO DE MAGNESIOMASTER MIX comercialDESOXINUCLEOTIDOS TRIFOSFATO dNTPsPRIMERS INICIADORES O CEBADORESTaq POLIMERASA ACIDO NUCLEICO MOLDE obtenido de la extracción .el ARN previamente es

transformado en ADNc mediante la transcripción inversaSONDA ESPECIFICA utilizan oligonucleotidos fluorescentes

PCR-FASE DE DESNATURALIZACIÓN separación de las dos hebras de ADN 94-95ºC

-FASE DE ANILLAMIENTO unión de los primers a la hebra correspondiente de

ADN 50-60ºC

-FASE DE EXTENSIÓN :La ADN POLIMERASA comienza a añadir nucleótidos por

los extremos de cada uno de los primers reproduciendo así la secuencia del ADN

MOLDE 72ºC

PCRRESULTADO

Ct Cycle threshold Numero de ciclos necesarios para aumento d

fluorescencia significativo con respecto a una señal base viene dado

por termociclador y es invers proporc a la cantidad inicial d

moleculas molde

CT

IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS LNR ALGETE

INOCULACIÓN DE HUEVOS DE GALLINA EMBRIONADOS DE 9-11 DÍAS DE EDAD SEGUIDA POR:

DEMOSTRACIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN PARA CONFIRMAR LA PRESENCIA

DEL VIRUS DE LA INFLUENZA A DETERMINACIÓN DEL SUBTIPO CON ANTISUEROS

MONOESPECÍFICOS

EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LA CEPA: EVALUACIÓN DEL

ÍNDICE DE PATOGENICIDAD INTRAVENOSO EN GALLINAS DE 4-8

SEMANAS DE EDAD SI >1,2 (HPAI)

GRACIAS