Isolasi Dan Karakterisasi Fragmen C Dna

Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi

Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet

YASSIER ANWARP055040011

Pembimbing1. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA2. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI, M.Si

Latar Belakang

Kebutuhan kedelai dalam negeri2 juta ton/tahun

Produksi kedelai dalam negeri0.8 juta ton/tahun

Impor kedelai1.2 juta ton/tahun

Peningkatan produksi kedelaidengan

INTENSIFIKASIEKSTENSIFIKASI

Potensi lahan + lahan asam ± 20 juta ha

BPS, 2007

Latar Belakang

Kedelai Slamet

Sumber gen untuk mekanisme toleran Al

Kultivar lokal yang toleran terhadap tanah asam

Studi MT Pada Kedelai

Metallothionein

Protein pengikat ion logam, mengandung banyak asam amino cysteine, berat molekul rendah & ditemukan pada berbagai organisme dan berbagai tingkat jaringan/organ Berperan dalam detoksifikasi logam-logam yang dapat bersifat toksik

Terlibat dalam proses fisiologis, proliferasi, aktifitas dari metalloenzim, dan faktor transkripsi Memiliki karakteristik yang unik dari komposisi asam amino cysteine

Berperan dalam mekanisme homeostasis logam-logam esensial Berperan dalam menanggani & mencegah kerusakan akibat cekaman oksidatif

Mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen penyandi metallothionein tipe 2

dari G. max (GmMt2) kultivar Slamet

Tujuan Penelitian

Tempat PenelitianBIORINBMST

(PSSHB IPB)

Waktu PenelitianSeptember 2007 s/d April 2008

METODOLOGI PENELITIAN

Tempat penyisipan

2. pGEM-T Easy1. Tanaman Kedelai

Bahan

3. E. coli galur DH5α4. Primer spesifik MF & M7R Primer aktin ActF & ActR

Isolasi RNA total

Sintesis cDNA total

Verifikasi cDNA

Isolasi Fragmen cDNA Mt2

Pengklonan Fragmen cDNA GmMt2

Seleksi E. coli pembawa plasmid

Isolasi plasmid

rekombinan

Analisis cDNA

Sisipan

Sequensing

Analisis danKarakterisasi

Simpulan

Desain Primer

Metode Penelitian

Bahan Absorban pada Rasio λ260/λ280

Total RNA (μg/g sampel

segar)λ260 λ280

1g ujung akar 0.223 0.118 1.88 187Rasio 1.8 s/d 2 menunjukkan kemurnian tinggiTidak terkontaminasi oleh protein

Hasil Penelitian

Isolasi RNA

Elektroforesis RNA total

28S 18S

1.Integritas RNA tinggi

2.Bersih dari Genom

RT

RT-PCR

1. cDNA terbentuk

2. Bebas DNA

1. Terdapat fragmen GmMt2

2. Ukuran 250 pb

mt2 M

1000 pb

250 pb

M Akar

1000 pb

500 pb

Kloning-transformasi dan Verifikasi

vektor pGEM-T Easy

M Mt2

1000 pb

250 pb

PCR Klon Rekombinan

Koloni biru

Koloni putih

Hasil Transformasi

3000 pb

1000 pb

250 pb

p M

EcoRI

Fragmen GmMt2 berhasil diklonkan ke E. Coli DH5α

Plasmid Rekombinan

pGEM-T Easy + GmMt2

Pensekuenan Fragmen GmMt2

Sequence ID: GmMt2

atgtcttgctgtggaggaaactgcggatgtggatctggctgcaagtgcggcaacggttgtggaggttgcaaaatgtaccctgacttgggattctccggcgagacaaccacaactgagacttttgtcttgggcgttgcaccggcgatgaagaatcagtacgaggcttcaggggagagtaacaacgctgagaacgatgcttgcaagtgtggatctgactgcaagtgtgatccttgcacctgcaagtga

Fragmen GmMt2 berukuran 246 pb

Deduksi Asam Amino

81 asam amino

Open Reading Frame

Analisis Restriksi

Tidak mengandung situs restriksi dari MCS pGEM-T Easy

BLASTn

BLASTp

cDNA utuh GmMt2 telah berhasil diisolasi dari G. max L. dengan ukuran 246 pb.

Fragmen GmMt2 mempunyai urutan nukleotida dan asam amino yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana.

Motif urutan asam amino GmMT2 terdiri dari Cys-

Cys, Cys-X-Cys dan Cys-X-X-Cys.

GmMT2 diduga memiliki peran yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi unsur logam dan membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman

Simpulan

Terima Kasih

1. Proyek HPTP batch III (atas nama Dr. Ir. SUHARSONO, DEA)2. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 3. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO,

M.Si 4. Dr. Ir. MUHAMMAD JUSUF, DEA5. Rekan-rekan di Lab. BIORIN dan BMST

1 g sampel digerus dengan N2 cair

+ 800 μl TRIzol

Inkubasi 3 menit,T ruang

+ 200 μl Chloroform

Inkubasi 5 menit, T ruang

9000 rpm, 6˚C, 15 menit

Fase cair dipindahkan,+ 500 μl Isopropyl alcohol

Pelet + 500μl EtOH 70%

Inkubasi 10 menit,T ruang

9000 rpm, 6˚C, 10 menit

5700 rpm, 6˚C, 5 menit

Pelet dikeringkan + 30μlddH2O-DEPC treated

Kuantifikasi (Spektofotometer)Kualifikasi (Elektroforesis)

Isolasi RNA Total

No Bahan Kons. Jumlah (μl)

1 RNA 5μg/μl 10

2 Buffer RT 1X 4

3 Primer Oligo (dT) 20 pmol 1

4 Dithiotreitol (DTT) 10 mM 2

5 RT enzyme (Invitrogen) 2U/ μl 0.2

6 dNTP mix 2 mM/μl 2

7 ddH2O(DEPC) - 0.8

Final Volume 20

No Suhu (˚C) Waktu (menit)

1 30 10

2 45 50

3 95 5

4 15 10

Sintesis cDNA Total

No Bahan Kons. Jumlah (μl)

1 Template cDNA ( ± 200 ng)

10 ng/μl 1

2 Buffer Taq 10x 1

3 Primer ActF 10 pmol 0.5

4 Primer ActR 10 pmol 0.5

5 dNTP mix 2 mM/μl 1

6 DMSO 4 % 0.4

7 Taq Polymerase 5 U/μl 0.1

8 ddH2O - 5.5

Volume final 10

No PCR Suhu Waktu

1 Pra-PCR 95˚C 5 menit

2 Denaturasi 94˚C 30 detik

3 Annealing 55˚C 30 detik

4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit

5 Siklus - 37 siklus

6 Final-PCR 72˚C 5 menit

7 Post-PCR 15˚C 5 menit

Primer ActF : ATGGCAGATGCCGAGGATAT ActR : CAGTTGTGCGACCACTTGCA

PCR Aktin

Searching sequences of Mt2

Clustering of Mt2

FASTA Format a Group

Primer3(http://www.primer3.com)

Find consensus sequence(BIOEDIT versi 7.0.5.2)

Selection of Primer

Spesific Primer of Mt2

Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG

Desain Primer Spesifik

No Bahan Kons. Jumlah (μl)

1 Template cDNA ( ± 200 ng)

10 ng/μl 2

2 Buffer Taq (10x) 1x 2

3 Primer MF 20 pmol 1

4 primer M7R 20 pmol 1

5 dNTP mix 2 mM/μl 2

6 DMSO 4 % 0.8

7 Taq Polymerase 5 U/μl 0.2

8 ddH2O - 11

Volume final 20

No PCR Suhu Waktu

1 Pra-PCR 95˚C 5 menit

2 Denaturasi 94˚C 30 detik

3 Annealing 58˚C 30 detik

4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit

5 Siklus - 37 siklus

6 Final-PCR 72˚C 5 menit

7 Post-PCR 15 ˚C 5 menit

Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG

Isolasi Fragmen cDNA GmMt2

No Bahan Kons. Volume (μl)

1 Produk PCR ± 5 ng 3

2 pGEM-T Easy ± 10 ng 1

3 Buffer T4 DNA Ligase

10x 1

4 DNA ligase 1U/μl 0.5

5 ddH2O - 4.5

Volume final 10

Ligasi Fragmen Mt2 Sel kompeten +

hasil ligasi

Di es 20 menit

Kejutan suhu 42°Cselama 45 detik

Inkubasi 37°C;250rpm; selama 20menit

+ 100μl YT

Di es 5 menit

Sebar di mediaLA+ Ampisilin

Inkubasi 38°C 16 jamSeleksi Biru-Putih

Pengklonan & Seleksi

Inkubasi 4°C;overnight

E. Coli DH5α

Blue-white selection

Kultur klon semalam

@1.5ml

12000rpm 10‘ 4°C

12000rpm 5‘ 4°C

150µl buffer resuspensi, vortex

150µl buffer lysis, bolak-balik

150µl buffer netralisasi

pelet

①②

③

12000rpm 5‘ 4°C vortex

fase aqueous

NaOAc 3M etOH abs

2xvol

Inkubasi -20ºC, 2 jam

12000rpm 5‘ 4°C

pelet

Cuci dg etOH 70%

12000rpm 10‘ 4°C

Kering vacuum 30-45’

Dilarutkan dlm TE/ddH2O, inkubasi semalam

+ RNase 0.1x vol

Plasmid

cek

Isolasi DNA Plasmid

No Bahan Kons. Volume (μl)

1 Plasmid rekombinan 13 ng/μl 15

2 Buffer EcoR1 (10x) 1X 2

3 Enzim EcoR1 10 U/μl 1

4 ddH2O - 2

Volume final 20

Analisis Plasmid Rekombinan

Inkubasi 37°C; 2 jam

Analisis Situs Restriksi http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html

Translasi (deduksi asam amino) http://www.expasy.ch/tools/translate

BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

ORF http://www.softberry/bestorf/htm

Domain http://www.myhits/motifscan/htm

Analisis Sekuen

Hasil Sekuen

Biomolekuler Website

Cystein

Verifikasi dengan Aktin

450 pbcDNA murni Ekson 1 Ekson 2

Ekson 1 Ekson 2Intron90 pb 540 pb

cDNA tidak murni Template: DNA genom

Primer aktin dari kedelaiPrimer ActF 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’Primer ActR5’CAGTTGTGCGACCACTTGCA3’