Сучасні підходи до лабораторної діагностики...

туберкулеза• : – 2013 2016 . 9 . 160 Бюджет Общий с до гг млн

. . – 19,500 тыс грн пациентов получат быстрый и достоверный диагноз

• : 2013 – 860 . .По годам тыс грн• 2014 - 2,5 . – 3000 млн грн пациентов• 2015 - 3 . – 6,500 млн грн пациентов• 2016 - 2,8 .- 10 000 млн грнпациентов

Сучасні підходи до лабораторної діагностики туберкульозу

Крістіна Попова – Менеджер з лабораторної діагностики туберкульозу

Фонд Ріната Ахметова “Розвиток України”

Критичні проблеми існуючої діагностики ТБ

• Фенотипові (культуральні) методи занадто повільні та потребують від 4 до 9 тижнів для визначення спектру медикаментозної чутливості

• Високий ризик зараження лабораторного персоналу

• Високі вимоги до підготовки кадрів та інфраструктури (BSL 3)

• Коштовні

В епоху широкого розповсюдження мультирезистентних штамів ці методи занадто повільні для прийняття оперативних рішень щодо госпіталізації та лікування хворого.

Переваги генотипових методів діагностики мікобактеріальних інфекцій

Пряма експрес-діагностика при дослідженні будь-якого біологічного матеріалу на наявність M.tuberculosis complex та інших бактерій роду Mycobacterium

Висока специфічність (98,9%)

Висока чутливість (10-100 клітин у 1 мл зразку)

Експрес-диференціація штамів бактерій роду

Mycobacterium і, зокрема, M. tuberculosis complex

Експрес-виявлення генетичних маркерів стійкості

M.tuberculosis complex до медичних препаратів

Універсальність процедури для будь-яких збудників

Різноманіття форматів детекції

Основою генотипових методів є - полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

ПЛР – метод, який дозволяє досягнути значного збільшення концентрації визначених фрагментів нуклеїнових кислот.

Генетична характеристика мікобактерій

• Геном M.tuberculosis надзвичайно консервативний

• Особливістю генома M.tuberculosis complex є велика кількість повторів послідовності ДНК (IS-елементів), які забезпечують ДНК-поліморфізм M.tuberculosis. Більшість із них – незмінні, за виключенням IS6110

• Схеми генотипування мікобактерій засновані на виявленні геномного поліморфізму

Генетика стійкості в M. tuberculosis

GGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTG TCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG

507

rpoB

533* ** * * *** **** * *Ключова область, яка складається з 81 пари основ

* * *** ** ******* **

**

InsertionTTC

InsertionTTCATG

DeletionCCATTC

DeletionGGCACC

DelAAC

DeletionCAGAAC

DeletionGACCAG

DeletionAATTCATGG

DeletionGAACAA

Ідеальний діагностичний тест - Xpert MTB/RIF

Зі Звіту ВООЗ "Діагностика Туберкульозу"

Ідеальні характеристики діагностичного тесту

Доступний в більшості випадків

Чутливий (мін. кількість хибно негативних результатів)

Специфічний (мін. кількість хибно позитивних результатів)

Простий у використанні, потребує мін. інструктажу

Швидкий (в клініці) і стійкий (зберігається при кімн. темп.)

Не потребує коштовного обладнанння. Дешевий

Доступний для всіх, хто його потребує

Застосування Xpert MTB/RIF

Тест Xpert MTB/RIF, призначений для використання з системою GeneXpert®, є полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) у реальному часі in vitro, що проводиться з метою виявлення:

1. ДНК M. tuberculosis в зразках мокротиння, або концентрованих осадах мокротиння;

2. Мутацій резистентності до рифампіцину гену rpoB в зразках.

Важливо: Xpert MTB/Rif тест не застосовується для

моніторингу лікування!

Xpert MTB/RIF: Інтегрована система для детекції ДНК та діагностики ТБ/ММС-ТБ

1. Додати 2:1 бактерицидного буфера до зразка Розпочати тест…

4. Перенести 2 мл і в картридж2. Струсити та

залишити на 10 хв

3. Струсити та залишити на 5 хв

Автоматична підготовка зразкаАмпліфікація та детекціядетекція

< 2 год

•Повна автоматизація з простою підготовкою зразка•Час проведення дослідження < 2 год (можна залишати на ніч)•Продуктивність: 16-20 тестів/день•Не потребує ШББ•Замкнута система картриджа (немає ризику крос-контамінації)

Реагенти в формі горошинок

Реагенти для специфічної цілі:праймери для rpoB; контроль

Реагенти для ПЛР:Taq polymerase; dNTPs; Buffers; Mg 2+

Горошинки для підготування зразка: спори Bacillus globigii

Підтримуючі горошинки

Приклад Рифампіцин-чутливого профілю: всі 5 зондів позитивні

Схема методу

Молекулярний Маяк

Ціль

Гібрид

Кожний зонд помічений флюоресцентною міткою, що вирізняється та дозволяє одночасну детекцію на

присутність дикого типу мікобактерій

Метод базується на аналізі цілевої послідовності RRDR гену rpoB, яка складається з 81 пар основ

SPC - контроль підготовки зразка

Результати використання тесту Xpert® MTB/RIF висвітлені в публікації NEJM

• Пацієнти з позитивним мазком (Б+) – Чутливість 98.2%, Специфічність 99.2%

• Пацієнти з негативними мазками (Б-) позитивною культурою (К+)

– Чутливість 90.2% на трьох зразках– Чутливість 72.5% на одному зразку

• Пацієнти з стійкістю до Ріфампіцину – Чутливість 97.6%, – Специфічність 98.1%

Чутливість та специфічність тесту Xpert MTB/RIFCatharina Boehme, et al. New England Journal of Medicine, 1 Sept, 2011

Простота та ясність результатів

Тривалість тесту 1 год 45 хвТривалість тесту 1 год 45 хв

Алгоритм застосування Xpert MTB/Rif

Підозра на ТБПідозра на ТБ

Xpert MTB/Rif

Xpert MTB/Rif

MБТ виявлено / RIF стійкий

MБТ виявлено / RIF стійкий

MБТ виявлено / RIF чутливий

MБТ виявлено / RIF чутливий

MБТ не виявлено MБТ не виявлено

Ізоляція та лікування препаратами 2-го ряду

Ізоляція та лікування препаратами 2-го ряду

Культура, ТМЧ 1-ий та 2-ий ряд

Культура, ТМЧ 1-ий та 2-ий ряд

Лікування препаратами 1-го ряду

Лікування препаратами 1-го ряду

Подальші дослідженняПодальші дослідження

Культура, ТМЧКультура, ТМЧ

Лінійний зонд-аналіз (LPA)

15

MTBDR plus стріпи для ідентифікації M.tuberculosis complex та визначення

резистентності до Рифампіцину та Ізоніазиду

Застосування лінійного зонд-аналізу (LPA, Hain)

• GenoType® MTBDRplus забезпечує виявлення стійкісті комплексу M.

tuberculosis до препаратів 1-го ряду: рифампіцину та ізоніазиду;

• GenoType® MTBDRsl забезпечує виявлення стійкості комплексу М. tuberculosis до препаратів 2-го ряду: фторхінолонів, аміноглікозидів/ циклічних пептидів та етамбутолу.

Вимоги до розміщення системи обладнання для лінійного зонд-аналізу (LPA)

• Рівень лабораторії (обов’язково ІІІ рівень лабораторії (BSL2/BSL3))

• До приміщень лабораторії:

- мінімум 3 окремі кімнат («Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами “ Наказ МОЗ №26 від 24.01.2008)

- дозвіл на проведення ПЛР діагностики• До кадрів - післядипломна підготовка лікарів бактеріологів з напрямку «молекулярна діагностика».

18

Порівняння чутливості методів дослідження на ТБ

Тест Мінімальне значення для виявлення (КУО/мл)

Культура 10 - 100

Xpert 50 - 150

Лінійний зонд аналіз (LPA) 200 - 10 000

Mікроскопія 5 000 - 10 000

КУО – колоній-утворююча одиниця

Термін виконання дослідження

Тест Час

Xpert MTB/RIF 2 години

Мікроскопія 3 години

Лінійний зонд аналіз(LPA) 2 дні

Рідке середовище та ТМЧ 15 – 40 днів

Щільні середовища та ТМЧ 30 – 75 днів

Вимоги до приміщення та персоналу

Тест Тренінг/кваліфікація

Інфраструктура

Мікроскопія + BSL1

Xpert MTB/RIF + BSL1

Лінійний зонд-аналіз (LPA)

++/+++ BSL2/BSL3

Культура +++ BSL2

Культура&ТМЧ +++ BSL3

Порівняння швидких методів діагностики ММС ТБ

Тест Час Вартість/тест

Xpert MTB/RIF 2 години 78 грн

Лінійний зонд-аналіз (LPA, Hain тест)

2 дні 130 грн

Рідке середовище та ТМЧ (Bactec MGIT)

15-40 днів 810 грн

Висновки

Чому важливе застосування експрес-методів діагностики ТБ:

• Для пацієнта: 22 908 пацієнтів в рік отримають достовірний діагноз (98,9 %) протягом 2-х днів та своєчасно розпочнуть лікування відповідно до спектру медикаментозної чутливості, що є запорукою успішного лікування від ТБ.

• Для суспільства: 57 270 осіб врятовано від інфікування ТБ, оскільки заразні пацієнти виявлені та ізольовані (під час очікування діагнозу (2 місяці) заразний пацієнт інфікує 2,5 особи

(22 908*2,5=57 270 осіб)).• Для мед. працівників: Ризик захворюваності серед

лабораторного персоналу знижений 0 %, завдяки сучасним аналізаторам.

Дякую за увагу!Дякую Вам за

увагу!

Дякую Вам за увагу!

Email: kpopova@fdu.org.uaTel: +38 050 347 38 48