작품번호

1419

제58회 전국과학전람회

버드나무속(Salix) 식물 추출물이

충치유발 세균(Streptococcus

mutans)의 생장에 미치는 영향 탐구

출품분야 학생부 출품부문 식물

2012. 07.

구 분 성 명

출품학생

고현숙

김성은

홍다영글

지도교사 박상규

<제목 차례>

1. 연구 동기 및 목적 ···············································································································1

2. 이론적 배경 ···························································································································1

가. 버드나무속(Salix) ·············································································································1

1) 버드나무(Salix koreensis) ·····························································································2

2) 능수버들(Salix pseudolasiogyne) ················································································2

나. Streptococcus mutans(충치유발세균) ·········································································3

다. MIC(최소저해농도) ··········································································································4

라. 생균수 측정법 ···················································································································4

3. 실험 과정 ·······························································································································5

가. 실험 준비 ···························································································································5

1) 자료 조사 및 실험 설계 ·································································································5

2) 버드나무 채집 및 보관 ···································································································5

3) 버드나무, 능수버들 가지와 잎의 용매별 추출물 제조 ··········································6

4) 추출물 희석 ·······················································································································7

5) BHI(Brain Heart Infusion) 배지 제조 ········································································8

6) 세균배양 ·····························································································································8

7) 세균 Washing 및 희석 ···································································································8

나. 실험 수행 ···························································································································9

1) MIC ·····································································································································9

2) 생균수 측정 ·······················································································································9

4. 실험 결과 ·····························································································································10

가. MIC 측정 결과 ···············································································································10

1) 버드나무 가지 추출물에 대한 MIC측정 결과 ·························································11

2) 버드나무 잎 추출물에 대한 MIC측정 결과 ·····························································11

3) 능수버들 가지 추출물에 대한 MIC측정 결과 ·························································12

4) 능수버들 잎 추출물에 대한 MIC측정 결과 ·····························································12

나. 생균수 측정 결과 및 생장률 ·······················································································12

1) 농도별 세균 수 총 평균 ·······························································································17

2) 식물 종에 따른 농도별 세균 수 평균 ·······································································17

3) 식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균 ···································································18

4) 용매에 따른 종과 부위의 농도별 세균 수 ·······························································18

5) 종과 부위에 따른 용매의 농도별 세균 수 ·······························································19

6) 용매에 따른 농도별 세균 수 평균 ·············································································20

5. 결론 및 제언 ·······················································································································20

가. 결론 ···································································································································20

나. 제언 ···································································································································21

6. 추후 연구 ·····························································································································22

7. 참고 문헌 및 사이트 ·········································································································23

<표 차례>

표 1. 추출물 종류에 따른 S. mutans균 생장 여부 ·························································10

표 2. 추출물 종류에 따른 colony 수 ·················································································13

표 3. 추출물 종류에 따른 생장률 ·······················································································16

<그림 차례>

그림 1. 버드나무속(Salix) 식물의 계통수 ···········································································1

그림 2. 버드나무(Salix koreensis) ························································································2

그림 3. 능수버들(Salix pseudolasiogyne) ···········································································3

그림 4. Streptococcus mutans(충치유발세균) ···································································4

그림 5. 버드나무 채집 ·············································································································5

그림 6. 잎과 가지 분리 ·········································································································5

그림 7. 밀봉 보관 ·····················································································································6

그림 8. 추출 ·······························································································································6

그림 9. 거름종이를 이용한 추출물 분리 ·············································································6

그림 10. 감압증류 ·····················································································································7

그림 11. 버드나무, 능수버들 가지와 잎의 용매별 추출물 원액 ····································7

그림 12. 추출물 희석 ···············································································································7

그림 13. 고체배지 제조 ···········································································································8

그림 14. BHI 고체배지 ············································································································8

그림 15. 세균 Washing ···········································································································9

그림 16. 세균 희석 ···················································································································9

그림 17. MIC 실험과정 ···········································································································9

그림 18. MIC 측정을 위한 시험관 ·······················································································9

그림 19. 세균과 추출물 도말 ·······························································································10

그림 20. colony 수 측정 ·······································································································10

그림 21. 버드나무 가지 추출물 MIC측정 결과 ·······························································11

그림 22. 버드나무 잎 추출물 MIC측정 결과 ···································································11

그림 23. 능수버들 가지 추출물 MIC측정 결과 ·······························································12

그림 24. 능수버들 잎 추출물 MIC측정 결과 ···································································12

그림 25. 버드나무 가지 추출물의 생균수 측정 ·······························································14

그림 26. 버드나무 잎 추출물의 생균수 측정 ···································································14

그림 27. 능수버들 가지 추출물의 생균수 측정 ·······························································15

그림 28. 능수버들 잎 추출물의 생균수 측정 ···································································15

그림 29. 대조군 ·······················································································································16

그림 30. 농도별 세균 수 총 평균 ·······················································································17

그림 31. 식물 종에 따른 농도별 세균 수 평균 ·······························································17

그림 32. 식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균 ···························································18

그림 33. 용매에 따른 종과 부위의 농도별 세균 수 ·······················································18

그림 34. 종과 부위에 따른 용매의 농도별 세균 수 ·······················································19

그림 35. 용매에 따른 농도별 세균 수 평균 ·····································································20

- 1 -

1. 연구 동기 및 목적

최근 우리나라 사람들의 건강에 대한 관심이 높아지고 있는 것에 반해, 구강 건강

실태는 그렇지 못하다. 국민구강건강실태조사(보건복지부, 한국보건의료연구원, 2000

년)자료 중 5세 아동 유치 우식 국제 비교에 따르면 우리나라 아동의 유치우식경험

자율이 83.3%로 가장 높게 나왔다. 또한, 전국 12세 아동 1인 보유 평균 우식경험

영구치아수가 해가 지남에 따라 점점 증가하는 추이를 보이고 있다.

현재 구강 청결 방법으로 치약, 구강 세정제 등을 이용하고 있지만 이는 일부 유

해한 화학 약품이 첨가되어 있는 것으로 보고되어 인공적인 방법들은 인체에 해를

미칠 것으로 염려된다. 이에 구강 청결을 위한 자연 친화적인 방법의 필요성을 느

껴 새로운 해결 방안을 모색하던 중 전통적이고 친환경적인 구강 건강관리방법에

관심을 가지고 연구하게 되었다.

옛날 사람들은 버드나무 가지를 잘게 잘라 이를 닦았다고 한다. ‘양치질’의 어원도

버드나무 가지를 뜻하는 ‘양지’에 접미사인 ‘질’을 붙여 ‘양지질’에서 ‘양치질’로 변한

것이라고 한다. 또한 동의보감에 의하면, 버드나무 가지는 치통을 주로 치료하고 풍

열로 인한 붓고 가려운데 고약으로 만들어 붙이거나 전탕하여 씻어주면 최고의 명

약이 된다고 한다. 버드나무 가지를 잘게 잘라 치아에 문지르면 소독도 될 뿐만 아

니라 치통도 멎게 해줬다고 한다. 따라서 우리는 버드나무와 충치의 관계를 확인하

기 위해 버드나무속(Salix) 식물 추출물이 충치유발세균(Streptococcus mutans)의

생장에 미치는 영향을 탐구하고 이를 활용하여 한국인들의 구강 건강 상태를 증진

시키고자 이 실험을 고안하게 되었다.

2. 이론적 배경

가. 버드나무속(Salix)

그림 1. 버드나무속(Salix) 식물의 계통수

- 2 -

1) 버드나무(Salix koreensis)

버들·뚝버들 이라고도 한다. 들이나 냇가에서 흔히 자란다. 높이는 약 20m, 지름

은 약 80cm이다. 나무껍질은 검은 갈색이고 얕게 갈라지며 작은가지는 노란빛을

띤 녹색으로 밑으로 처지고 털이 나지만 없어진다. 잎은 어긋나고 바소꼴 이거나

긴 타원형이며 길이는 5∼12cm, 나비는 7∼20cm이다. 끝이 뾰족하고 가장자리에

안으로 굽은 톱니가 있다. 잎자루는 길이가 2∼10mm이고 털이 없거나 약간 난다.

꽃은 4월에 유이꽃차례로 피고 암수딴그루이다. 수꽃은 길이가 1∼2cm이며 꿀샘

과 수술이 2개씩이고 수술대 밑에는 털이 난다. 암꽃은 길이가 1∼2cm이고 1∼2개

의 꿀샘이 있다. 꽃대에 털이 나고 포는 녹색의 달걀 모양이며 털이 난다. 씨방은

달걀 모양으로서 자루가 없으며 털이 나고 암술대는 약간 길며 암술머리는 4개이

다.

열매는 삭과로서 5월에 익으며 털이 달린 종자가 들어 있다. 가로수와 풍치목으

로 심으며 나무껍질을 수렴제·해열제·이뇨제로 사용한다. 한국·일본, 중국 북동부

등지에 분포한다[그림 2].

그림 2. 버드나무(Salix koreensis)

2) 능수버들(Salix pseudolasiogyne)

고려수양(高麗垂楊)이라고도 한다. 들이나 물가에서 자라며 가로수 또는 풍치수

로 흔히 심는다. 높이는 20m, 지름은 80cm이고, 가지는 길게 늘어지며 나무 껍질

은 회색을 띤 갈색이고 작은가지는 황록색이다. 잎은 바소 모양 또는 좁은 바소 모

양으로 길이가 7∼12cm, 폭이 10∼17mm이고 양끝이 뾰족하고 가장자리에 잔톱니

가 있다. 잎 앞면은 녹색이고 뒷면은 흰색이 돈다. 잎자루는 2∼4mm이다.

꽃은 암수딴그루이지만 드물게 암수한그루인 경우도 있고 4월에 피며 미상꽃차

례를 이룬다. 수꽃이삭은 길이가 1∼2cm이고 꽃대에 털이 있으며, 포는 타원 모양

이고 길이가 1.5mm이다. 수술과 꿀샘이 2개씩 있고, 수술대 밑 부분에 털이 있다.

암꽃이삭은 길이가 1∼2cm이고, 포는 달걀 모양으로 녹색이며 털이 있고 꿀샘이 1

개 있다.

- 3 -

씨방은 달걀 모양이고 털이 있으나 암술대에는 털이 없으며 암술머리가 2개이다.

열매는 삭과이고 비단 같은 털이 있으며 여름에 익는다. 목재는 재질이 가볍고 연

하여 기구재 등으로 이용한다. 한국·중국 등지에 분포한다[그림 3].

그림 3. 능수버들(Salix pseudolasiogyne)

나. Streptococcus mutans(충치유발세균)

Streptococcus mutans는 인간의 충치 생성의 근본 원인이 되는 혐기성의, 그램

양성 구강 박테리아이다[그림 4].

구강의 상태는 복잡하며 자주 변화한다. 따라서 구강에서 생존하기 위해서 S.

mutans은 거친 환경변화 및 다양한 독성 화학물질에 노출되어도 견딜 수 있어야

한다. 그러나 이러한 극한 환경에서 이 충치 유발균이 살아남고 증식할 수 있는 기

작에 대해서는 많은 연구가 시행되지 않아 대부분 밝혀지지 않았다.

Streptococcus에는 25종의 구강세균이 있다. 각각의 종은 경쟁균과 싸우고 외부

의 공격에 견딜 수 있도록 변화하는 환경과 각각 다른 구강 상태에서 증식 할 수

있는 특성화된 성질을 갖고 있다. 미생물군의 불균형은 구강질환을 발병시킬 수 있

다. 특정한 환경에서, Streptococcus는 기회감염 병원균으로 변하여 질병을 유발시

키고, 숙주를 공격 할 수 있다. Streptococcus에는 무해한 박테리아와 유해한 박테

리아가 모두 있다. 그 중 Streptococcus mutans는 충치에 관련된 가장 중요한 박테

리아이며 자연적으로 인간의 구강에 존재한다.

치아 표면에서 서식하는 균은 주로 Neisseria와 Streptococcus이다. 이런 선구수

종의 신진대사는 그 주위의 환경을 변화시켜 더 많은 까다로운 유기체들이 서식하

고 치석을 만들 수 있게 한다. S.sobrinus와 함께 S. mutans는 글루칸수크라제 효

소를 이용하여 설탕을 젖산으로 대사시킴으로 인해 충치의 주요 원인이 된다. 이러

한 과정을 통해 만들어진 입 안의 산성 환경은 치아의 에나멜을 부식되기 쉬운 상

태로 만드는 원인이 된다. 설탕은 S. mutans에 의해 사용되어 끈끈한 다당류를 만

들어 낸다. 그 다당류들이 뭉쳐 치석을 형성한다. S. mutans은 덱스트란수크라제효

소(hexosyltransferase)를 통하여 설탕을 기질로 사용하여 다음 반응에 따라 덱스트

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란을 생성한다.

n sucrose → (glucose)n + n fructose

설탕은 S. mutans균이 이 끈적이는 다당류를 만드는데 사용되는 유일한 당이다.

많은 다른 당류(글루코오스, 과당, 젖당 )는 S. mutans균에 의해 분해되며, 생성물

로 젖산을 만들어 낸다. 치석과 젖산의 결합으로 충치가 만들어진다.

그림 4. Streptococcus mutans(충치유발세

균)

다. MIC(최소저해농도)

MIC(Minimum Inhibitory Concentration)는 균의 생장을 완전히 저해하는 추출물

의 최소농도를 말한다. 액체 배지를 넣은 시험관에 배양한 세균을 넣고 추출물의

농도를 달리 하여 접종한 후 일정 시간이 지나면 시험관을 육안으로 관찰한다. 육

안으로 측정하였을 때 시험관이 투명하게 보이는 것이 99.9%의 살균상태를 나타내

며 이때의 농도가 최소저해농도(MIC)를 뜻한다.

라. 생균수 측정법

식품 등의 시료 중에 존재하는 세균의 양을 측정하는 하나의 방법. 일정한 조건

으로 colony를 만드는 세균 수를 육안으로 측정한다. 세균 수 측정법에는 총 균수

측정법이라고 하여 생균과 사균을 동시에 염색하여 검경하는 법(우유 등에서 이용)

도 있고 이것과 구별하여 생균수 측정법이 있다. 본 법에도 여러 가지 있어 페트리

디시를 쓰는 평판법이 일반적이고 그 밖에 막 여과(membrane filter)나 시험관, 유

리모세관을 쓰는 방법도 있다. 한천을 함유하는 배지 중 혹은 표면에 colony를 만

들어 이것을 계측한다. 사용배지는 대상물에 따라 조성이 조금 다르고, 식품 위생법

규로서는 표준한천배지를 사용하도록 규정되어 있다. 또한 특정한 균만을 측정하는

경우에는 선택배지를 사용한다. 배양온도, 시간은 대상과 목적에 따라 다르지만 3

5～37℃, 48시간 정도가 일반적이다. 생균수라고 하더라도 모든 생균이 colony를 만

들고 있는 것은 아니고 일정한 배지조성, 배양시간, 배양온도에서 colony를 만드는

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균만을 측정한다. 시료를 생리식염수 등으로 적시어 희석하여 그 1ml를 페트리접시

에 넣어 배지를 부어 응고 후 부란기에 넣어 일정조건으로 배양 후 colony계산기

(colony counter)에서 계측한다. 너무 colony가 많은 것은 제외하고 petri dish에 3

0～300의 것을 계측하여 희석배율을 곱하여 시료 중의 생균수로 한다.

3. 실험 과정

가. 실험 준비

1) 자료 조사 및 실험 설계

옛 선조들이 버드나무를 이용하고 활용한 방법과 버드나무의 효능을 문헌 및 자

료조사를 통해 확인하고 선행연구 결과를 바탕으로 실험방법을 찾아보았다. 버드나

무 속에 속하는 식물 중 주변에서 쉽게 구할 수 있는 능수버들과 버드나무를 선택

하였고, 충치의 대표적 원인인 S. mutans균과 이를 배양하기 위한 BHI배지를 이용

하기로 하였다. 결과 측정 방법으로는 MIC, 생균수 측정법을 이용하여 추출물 별

S. mutans균 억제 효과를 확인하기로 하였다.

2) 버드나무 채집 및 보관

버드나무 속에 속하는 버드나무와 능수버들의 잎과 가지를 학교 주변(N : 37° 2

2′, E : 127° 58′)에서 채집한다[그림 5]. 채집한 잎과 가지를 각각 부위별, 종류

별로 비닐 팩에 밀봉하여 4℃ 냉장보관한 후, 60℃ 건조기에서 12시간동안 건조시

킨다[그림 6]. 건조가 완료된 잎과 가지는 다시 밀봉하여 실온에 보관한다[그림 7].

그림 5. 버드나무 채집 그림 6. 잎과 가지 분리

- 6 -

그림 7. 밀봉 보관

3) 버드나무, 능수버들 가지와 잎의 용매별 추출물 제조

① 건조시킨 잎은 잘게 부수고, 가지는 짧게 자른다.

② 버드나무와 능수버들의 잎 20g에는 각각의 용매(94% 에탄올, 99.9% 메탄올, 증

류수)를 200ml씩, 가지 20g에는 용매 200ml씩(94% 에탄올, 99.9% 메탄올, 증류

수)을 유리병에 함께 담가 실온의 암실에서 각각 12일 간 추출한다[그림 8]. 단,

증류수를 용매로 사용한 혼합물만 고압 멸균기에서 멸균하여 밀봉한 후 실온의

암실에서 12일 간 추출한다.

③ 추출한 용액을 거름 장치를 이용하여 추출물만을 걸러낸다[그림 9].

④ 걸러낸 추출물을 감압증류를 이용하여 추출된 성분물질과 용매를 분리한다[그

림 10].

⑤ 걸러진 성분물질을 구분하여 냉동 보관한다[그림 11].

그림 8. 추출 그림 9. 거름종이를 이용한 추출물 분리

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그림 10. 감압증류 그림 11. 버드나무, 능수버들 가지와 잎의

용매별 추출물 원액

4) 추출물 희석

① 감압증류 시킨 추출물 원액과 1.5ml 튜브 A, B, C, D, E를 준비한다.

② 튜브 A에 추출물 원액 200㎕를 넣는다.

③ 튜브 B, C, D, E에는 각각 증류수 100㎕를 넣는다.

④ 튜브 B에 튜브 A의 추출물 원액의 1/2을 넣어 희석액을 만들고 이것을 1/2 희

석액이라 명한다.

⑤ 튜브 B의 희석액의 1/2을 취하여 튜브 C에 넣어 희석액을 만들고 이것을 1/4

희석액이라 명한다.

⑥ 튜브 C의 희석액의 1/2을 취하여 튜브 D에 넣어 희석액을 만들고 이것을 1/8

희석액이라 명한다.

⑦ 튜브 D의 희석액의 1/4을 취하여 튜브 E에 넣어 희석액을 만들고 이것을 1/16

희석액이라 명한다.

⑧ 위와 같은 방법으로 각각의 추출물에 대하여 원액 및 1/2, 1/4, 1/8, 1/16의 희석

액을 만든다[그림 12].

그림 12. 추출물 희석

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5) BHI(Brain Heart Infusion) 배지 제조

① 액체배지 용액으로 증류수 1L에 BHI 배지 37g을 넣고 고체배지 용액에는 agar

powder 16g을 추가적으로 첨가한다.

② 교반한 후 가열하여 용해시킨다.

③ 완전한 용해를 위해 1분간 끓인다.

④ 121℃의 고온 멸균 처리기에서 15분간 멸균한다.

⑤ 액체 배지 용액은 palcon tube에 각 30ml씩 넣고, 고체 배지 용액은 petri dish

에 15ml씩 부어 평판배지로 만들어 4℃ 냉장보관 한다[그림 13, 그림 14].

그림 13. 고체배지 제조 그림 14. BHI 고체배지

6) 세균배양

본 실험에 사용된 균주는 충치유발세균(Streptococcus mutans)으로 한국 미생물

학회에서 분양받아 Brain Heart Infusion 액체 배지 30ml에서 먼저 배양한 후, 3차

계대 배양하여 사용하였다.

7) 세균 Washing 및 희석

① 3차 계대배양 한 세균배양액 원액 1ml를 원심분리 시킨다.

② 원심 분리 된 배양액에서 상층액을 제거 한 후 생리식염수 1ml를 넣어

Washing한다[그림 15].

③ 위 실험과정 ①과 ②를 한 번 더 반복한다.

④ Washing 한 세균 배양액 1ml를 취하여 생리식염수 9ml에 넣고 섞는다.

⑤ ④에서 만든 세균 배양액 1ml를 취하여 다시 생리식염수 9ml에 넣고 희석배수

100배의 세균 희석액을 만든다[그림 16].

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그림 15. 세균 Washing 그림 16. 세균 희석

나. 실험 수행

1) MIC

추출물 종류별 60개의 시험관에 각각 BHI 액체배지 5ml, 3차 계대배양 후 희석

한 세균 100㎕, 추출물 100㎕를 넣는다[그림 17]. 이 때, 액체배지는 미리 항온기에

넣어 두어 37℃로 맞춘 후 사용한다. 캡을 닫은 후 37℃ 항온기에서 배양한다. 24

시간 후 육안으로 관찰하여 세균이 자라지 않는 최소 저해 농도(MIC)를 확인한다

[그림 18].

그림 17. MIC 실험과정 그림 18. MIC 측정을 위한 시험관

2) 생균수 측정

추출물 종류별 60개의 BHI 평판배지를 항온기에 넣어 37℃로 온도를 맞춘다. 일

정한 온도로 맞추어진 평판배지에 각각 3차 계대배양 후 100배로 희석한 세균 100

㎕와 추출물 100㎕를 스프레더로 도말한 뒤 45～50℃의 BHI고체배지 용액 5ml로

덮는다[그림 19]. 37℃ 항온기에서 48시간 배양한 뒤 colony counter로 형성된

colony 수를 측정한다[그림 20].

- 10 -

그림 19. 세균과 추출물 도말 그림 20. colony 수 측정

4. 실험 결과

가. MIC 측정 결과

다음은 버드나무 속 식물 추출물의 S. mutans균에 대한 MIC(최소 저해 농도)를

측정한 결과이다[표 1]. BHI 액체 배지에 세균 배양액과 추출물을 함께 넣어 24시

간 배양한 후 관찰하였다.

종 부위 용매추출물 농도

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

버드나무

가지

에탄올 - - - - +

메탄올 - - - - -

증류수 - - + + +

잎

에탄올 - - - - +

메탄올 - - - + +

증류수 - + + + +

능수버들

가지

에탄올 - - - - -

메탄올 - - - - -

증류수 + + + + +

잎

에탄올 - - - - -

메탄올 - - + + +

증류수 + + + + +

(+): 균이 생장 (-): 균이 생장하지 않음

표 1. 추출물 종류에 따른 S. mutans균 생장 여부

시험관 안의 배지가 탁해진 것은 S. mutans균이 생장 한 것으로, 추출물이 세균

번식 억제에 효능을 내지 못하여 세균이 번식한 것을 의미한다. 반면 배지가 탁하

지 않은 것은 S. mutans균이 생장하지 않은 것으로, 추출물이 세균 번식 억제에 효

- 11 -

능을 나타낸 것을 의미한다. 위 표에서 세균이 생장한 경우 (+), 생장하지 않은 경

우 (-)로 표시하였다. 이 결과를 바탕으로 각 추출물 별 세균이 생장하지 않은 최

소의 농도인 MIC를 결정하였다.

1) 버드나무 가지 추출물에 대한 MIC측정 결과

그림 21. 버드나무 가지 추출물 MIC측정 결과(왼쪽부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

버드나무 가지의 에탄올 추출물은 1/8 희석액에서 최소 저해 농도를 보였다. 버

드나무 가지의 메탄올 추출물은 1/16 희석액에서도 세균 생장이 억제됨을 나타내

최소 저해 농도를 측정할 수 없었다. 버드나무 가지의 증류수 추출물은 1/2 희석액

에서 최소 저해 농도를 보였다[그림 21].

2) 버드나무 잎 추출물에 대한 MIC측정 결과

그림 22. 버드나무 잎 추출물 MIC측정 결과(왼쪽부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

버드나무 잎의 에탄올 추출물은 1/8 희석액에서 최소 저해 농도를 보였고, 버드

나무 잎의 메탄올 추출물은 1/4 희석액에서 최소 저해 농도를 보였다. 버드나무 잎

의 증류수 추출물은 원액에서 최소 저해 농도를 보였다[그림 22].

- 12 -

3) 능수버들 가지 추출물에 대한 MIC측정 결과

그림 23. 능수버들 가지 추출물 MIC측정 결과(왼쪽부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

능수버들 가지의 에탄올 추출물과 메탄올 추출물은 1/16 희석액에서도 세균 생장

이 억제됨을 나타내 최소 저해 농도를 측정할 수 없었다. 능수버들 가지의 증류수

추출물은 원액에서도 세균이 번식함이 나타나 최소저해농도를 측정할 수 없었다

[그림 23].

4) 능수버들 잎 추출물에 대한 MIC측정 결과

그림 24. 능수버들 잎 추출물 MIC측정 결과(왼쪽부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

능수버들 잎의 에탄올 추출물은 1/16 희석액에서도 세균 생장이 억제됨을 나타내

최소 저해 농도를 측정할 수 없었다. 능수버들 잎의 메탄올 추출물은 1/2 희석액에

서 최소 저해 농도를 보였다. 능수버들 잎의 증류수 추출물은 원액에서도 세균이

번식함이 나타나 최소저해농도를 측정할 수 없었다[그림 24].

나. 생균수 측정 결과 및 생장률

다음은 세균과 추출물을 평판배지에 함께 도말하여 48시간 배양한 후 배지에 생

긴 세균의 colony 개수를 측정하여 나타낸 생균수 측정 결과표이다[표 2]. 대조군으

- 13 -

로는 증류수 100㎕와 세균 100㎕를 함께 도말한 것을 사용하였고, 대조군의 생균수

측정 결과는 4.4×104 CFUs/100㎕로 나타났다.

종 부위 용매추출물 농도

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

버드나무

가지

에탄올 7 12 13 23 64

메탄올 7 22 26 38 37

증류수 - 47 80 96 35

잎

에탄올 6 28 23 27 43

메탄올 3 11 29 28 50

증류수 82 - 91 140 142

능수버들

가지

에탄올 0 4 1 14 11

메탄올 5 12 38 34 22

증류수 90 121 111 81 134

잎

에탄올 5 68 109 138 153

메탄올 0 32 80 75 81

증류수 437 421 322 476 649

(단위 : ×102 CFUs/100㎕)

표 2. 추출물 종류에 따른 colony 수

위 표를 분석한 결과 추출물의 농도가 옅어짐에 따라 세균 수가 증가하였고, 능

수버들 가지의 에탄올 추출물과 능수버들 잎의 메탄올 추출물을 도말한 배지에서

는 세균 수가 0으로 측정되었다. 또한 증류수를 용매로 한 추출물에서는 다른 용매

를 이용한 추출물보다 대체로 세균 수가 많이 측정되었고, 에탄올과 메탄올을 용매

로 이용한 추출물은 세균 수가 비슷한 범위로 나타났다. 버드나무 가지의 증류수

추출물의 원액과 버드나무 잎의 증류수 추출물의 1/2 희석액은 colony 수가 너무

많아 그 결과를 측정하지 못하였다.

- 14 -

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

그림 25. 버드나무 가지 추출물의 생균수 측정(위에서부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

그림 26. 버드나무 잎 추출물의 생균수 측정(위에서부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

- 15 -

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

그림 27. 능수버들 가지 추출물의 생균수 측정(위에서부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

그림 28. 능수버들 잎 추출물의 생균수 측정(위에서부터 에탄올, 메탄올, 증류수 추출물)

- 16 -

그림 29. 대조군

위 사진은 생균수 측정을 위하여 추출물별 60개의 배지에 세균과 추출물을 함께

도말하여 수행한 사진이다[그림 25, 26, 27, 28, 29].

종 부위 용매추출물 농도

원액 1/2 1/4 1/8 1/16

버드나무

가지

에탄올 1.61% 2.75% 2.98% 5.28% 14.68%

메탄올 1.61% 5.05% 5.96% 8.72% 8.49%

증류수 0.00% 10.78% 18.35% 22.02% 8.03%

잎

에탄올 1.38% 6.42% 5.28% 6.19% 9.86%

메탄올 0.69% 2.52% 6.65% 6.42% 11.47%

증류수 18.81% 0.00% 20.87% 32.11% 32.57%

능수버들

가지

에탄올 0.00% 0.92% 0.23% 3.21% 2.52%

메탄올 1.15% 2.75% 8.72% 7.80% 5.05%

증류수 20.64% 27.75% 25.46% 18.58% 30.73%

잎

에탄올 1.15% 15.60% 25.00% 31.65% 35.09%

메탄올 0.00% 7.34% 18.35% 17.20% 18.58%

증류수 100.23% 96.56% 73.85% 109.17% 148.85%

표 3. 추출물 종류에 따른 생장률

위 표는 실험을 통하여 측정된 세균수를 이용하여 생장률을 구한 것이다[표 3].

생장률은 각 추출물 별 세균수를 대조군의 세균수로 나눈 뒤 100을 곱하여 나타내

었다. 생장률은 세균 수 측정 결과와 비슷한 경향성을 나타내었고 거의 대부분의

경우 생장률이 50%를 넘지 못한 것을 알 수 있었다. 하지만 능수버들 잎의 증류수

추출물의 경우에는 대조군에 비교하였을 때 생장률이 100%가 넘는 것으로 나타나

오히려 더 효과가 없음을 알 수 있었다.

- 17 -

1) 농도별 세균 수 총 평균

농도별 추출물에 따른 세균 수

총 평균농도별 세균 수 총 평균

그림 30. 농도별 세균 수 총 평균

모든 종류의 추출물에서 농도에 따라 관찰되는 세균 수의 총 평균을 내어 비교

했을 때, 농도가 옅어 질수록 평균 세균 수가 증가하였다. 또한 원액부터 1/4 구간

에서 보다 1/4 부터 1/16 농도 구간에서 급격히 증가하는 것이 나타났다[그림 30].

2) 식물 종에 따른 농도별 세균 수 평균

그림 31. 식물 종에 따른 농도별 세균 수 평균

식물 종에 따른 농도별 세균 수 평균을 통해 버드나무와 능수버들 추출물에서의

세균 수를 비교 했을 때, 능수버들 추출물 보다 버드나무 추출물에서의 세균 수가

적게 나타났다[그림 31].

- 18 -

3) 식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균

식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균

그림 32. 식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균

식물 부위에 따른 농도별 세균 수 평균을 통해 잎과 가지 추출물에서의 세균 수

를 비교 했을 때, 잎 추출물 보다 가지 추출물에서 세균 수가 적게 나타났다[그림

32].

4) 용매에 따른 종과 부위의 농도별 세균 수

그림 33. 용매에 따른 종과 부위의 농도별 세균 수

- 19 -

각각의 종과 부위별 추출물에서 용매에 따라 관찰되는 세균 수를 비교하였다. 버

드나무 가지와 능수버들 가지는 에탄올 추출물에서의 세균 수가 가장 적게 관찰되

었다. 버드나무 잎에서는 에탄올 추출물과 메탄올 추출물에서의 세균 수가 비슷하

게 나타났다. 능수버들 잎은 메탄올 추출물을 사용한 배지의 세균 수가 가장 적게

나타났다[그림 33].

5) 종과 부위에 따른 용매의 농도별 세균 수

그림 34. 종과 부위에 따른 용매의 농도별 세균 수

종과 부위에 따른 용매별 추출물에서의 세균 수를 관찰 한 결과, 모든 용매에서

능수버들 잎 추출물을 사용한 배지의 세균 수가 가장 많이 관찰되었다. 에탄올을

용매로 이용한 추출물을 제외한 모든 용매별 추출물에서는 버드나무 가지, 버드나

무 잎, 능수버들 가지 추출물에서의 세균 수가 비슷하게 나타났으며, 에탄올을 용

매로 이용한 추출물에서는 능수버들 가지의 추출물에서 세균 수가 가장 적게 관

찰되었다[그림 34].

- 20 -

6) 용매에 따른 농도별 세균 수 평균

용매별 세균 수

평

용매에 따른 농도별 세균 수 평균

그림 35. 용매에 따른 농도별 세균 수 평균

용매에 따른 추출물에서의 세균 수 평균을 비교하였다. 에탄올과 메탄올을 용매

로 한 추출물을 이용한 배지에서는 세균 수의 차이가 거의 없이 농도에 따른 경향

성을 띠고 있는 반면, 증류수를 용매로 이용한 배지에서는 세균 수가 현저히 높게

나타났다[그림 35].

5. 결론 및 제언

가. 결론

MIC와 생균수 측정 결과를 종합적으로 비교·분석 해 본 결과, 대조군인 증류수

만을 넣은 배지와 비교할 때 버드나무속 식물 추출물을 이용한 배지에서의 세균

수가 현저히 차이가 남으로써 버드나무속 식물 추출물은 S. mutans균의 생장 억제

효과가 있음을 확인하였다.

추출물의 농도가 진할수록 세균 수가 적어지는 경향으로 보아 농도가 진할수록

S. mutans균 생장 억제에 더 큰 효능이 있는 것을 알 수 있었다.

버드나무속 식물 종별 추출물 중 버드나무 추출물이 능수버들 추출물 보다 S.

mutans균 생장 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 이에 따라 버드나무에 S. mutans

균 생장을 억제시키는 성분이 더 많은 것으로 판단된다.

식물 부위별 추출물 중 가지 부위의 추출물이 S. mutans균 생장 억제 효능이 더

높게 나타났다. 이를 통해 잎보다 가지가 S. mutans균 생장을 억제시키는 성분을

더 많이 함유하고 있을 것으로 판단된다.

종별, 부위별 추출물의 용매에 따른 세균 수를 관찰한 결과, 버드나무 가지, 버드

나무 잎, 능수버들 가지는 에탄올 추출물에서 능수버들 잎은 메탄올 추출물에서 세

균 수가 가장 적게 나타났다. 이를 통해 종과 부위에 따라 S. mutans균의 생장 억

- 21 -

제 효과가 가장 높게 나타나는 용매가 다른 것으로 판단된다.

용매별 추출물의 종과 부위에 따른 세균 수를 관찰한 결과, 에탄올 용매에서는

능수버들 가지를, 메탄올 용매에서는 버드나무 잎을, 증류수에서는 버드나무 가지를

사용한 추출물에서 세균 수가 가장 적게 관찰 되었다. 이를 통해 용매에 따라 최적

의 생장 억제 효과를 나타내는 종과 부위가 각각 다른 것으로 판단된다.

모든 용매에 따른 종별, 부위별 추출물의 세균 수의 측정 결과를 바탕으로 대조

군과 비교하였을 때, 능수버들 잎 추출물에서는 세균 수가 크게 감소되지 않음이

관찰되었다. 이를 통해 다른 종과 부위에 비하여 능수버들 잎에는 S. mutans균의

생장을 억제시키는 물질이 비교적 적게 포함되어 있는 것으로 판단된다. S. mutans

균의 생장 억제에 효과를 나타내는 성분 물질은 극성을 띠는 증류수보다는 비극성

을 띠는 에탄올과 메탄올 같은 유기용매에 잘 녹으며 비극성인 것으로 판단된다.

용매에 따라 S. mutans균 생장 억제 효과의 차이가 있다는 결과를 바탕으로 세

균 수가 많이 관찰된 증류수를 이용하는 것보다 세균 수가 적게 관찰된 에탄올과

메탄올을 추출물의 용매로 이용하는 것이 S. mutans균 생장 억제에 효과가 더 좋

을 것이라 판단된다. 또한 에탄올과 메탄올 추출물에서는 세균 수가 현저히 감소한

데에 비해 증류수 추출물에서는 세균 수의 감소가 미미한 것을 보아 S. mutans균

억제하는 물질이 증류수에는 용해되지 않는 물질임을 알 수 있다.

모든 결과를 바탕으로 S. mutans균의 생장 억제에는 능수버들 가지의 에탄올 추

출물이 가장 효과가 큰 것으로 판단된다.

나. 제언

현재 사용되는 치약에는 충치 예방제로 불소화합물이 사용된다. 불소는 세균생장

을 억제해 충치예방 효과가 있는 반면, 강한 독성을 가지고 있어 불소를 과잉 섭취

할 경우 불소중독, 골다공증 등 인체에 많은 유해한 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌

다. 그 외에도 치약의 성분 중 이산화규소, 폴리비닐피롤리돈 등은 인체에 유해한

영향을 끼치는 성분으로 확인되었다. 뿐만 아니라, 치약에 사용되는 다양한 물질들

이 하수도를 통해 하천에 흘러들어갈 경우 수중 생태계를 위협하며 특히, 파라벤은

동물의 내분비계에 부정적인 영향을 주는 것으로 알려졌다.

이와 같이 현재 사용되는 치약에는 인체와 환경에 유해한 물질을 함유하고 있다.

따라서 환경 친화적인 버드나무를 이용 할 경우, 인체와 환경에 무해하여 인류보건

과 생태계 보호에 도움이 될 것으로 기대된다. 또한 우리나라에서 쉽게 구할 수 있

는 버드나무의 효용성을 규명함으로써 천연 자원 개발의 가능성을 확인해 볼 수

있을 것으로 기대된다.

핀란드는 경재협력개발기구 회원 국가 중 충치 발생률이 1인당 1.1개로 가장 적

은 것으로 나타났다. S. mutans의 생장 억제 효과가 있는 자일리톨은 자작나무에서

그 성분을 얻을 수 있는데, 자작나무 주산지인 핀란드는 자일리톨 성분이 함유된

식품을 이용하여 충치예방 프로그램을 국가적으로 시행한 결과, 충치 발생률이 감

- 22 -

소할 수 있었다. 우리나라도 버드나무를 이용한 충치예방 프로그램을 시행하여 국

민 구강 건강 상태를 증진시키고, 버드나무 추출물이 함유된 충치예방 상품의 개발

과 상품화를 기대해 본다.

6. 추후 연구

본 탐구에서는 버드나무 종별, 부위별, 추출 용매별, 농도별 추출물의 충치유발 세

균(Streptococcus mutans)의 번식 억제 효능을 알아보기 위한 실험을 하였다. 그

결과 모든 추출물의 종류에 따라 S. mutans균 생장 억제 효과가 다름을 알 수 있었

다.

버드나무에는 살리신, 플라보노이드 등 여러 성분 물질이 함유 되어 있다. 이러한

성분물질들이 감기나 통증에 쓰이는 것으로 알려져 있지만, 어떠한 성분물질이 정

확히 S. mutans의 생장 억제에 영향을 미치는 가는 아직 밝히지 못하였다. 하지만

이번 실험을 통해 버드나무속 식물 속의 S. mutans의 생장 억제 효과를 보이는 물

질이 비극성인 것을 알게 되었다. 따라서 어떤 비극성 물질이 S. mutans의 생장 억

제 효과를 보이는지 확인하기 위해 전문가의 도움을 얻고자 한다.

또한, 본 실험에서는 버드나무, 능수버들 두 가지의 버드나무 종만을 이용하여 실

험하였기 때문에 버드나무에 대한 일반적인 결론을 이끌어내기 위하여 다양한 종을

채집하여 실험하고자 한다. 또한 버드나무속 식물의 부위에 대한 추가적인 실험으

로 뿌리부위에 대한 실험과 가지부분을 겉껍질 부분과 속껍질 부분으로 구분하여

실험을 수행하는 확인과정도 필요할 것이다.

MIC수행 결과에서 모두 (-)로 나타난 추출물에 대하여 1/32 이하 농도의 희석액

으로 실험을 다시 수행하여 더 낮은 농도에서 MIC가 나타날지 확인해 보고자 한

다.

이렇게 효능이 밝혀진 버드나무 추출물을 효능 탐구에서만 그치지 않고 연구 결

과를 바탕으로 국민들의 구강건강 증진과 버드나무 추출물의 상용화에 기여하고자

한다. 이를 위하여 안전성평가연구소(KIT)에 버드나무 추출물의 안정성 평가를 맡

기고, 가글 용액, 치약, 껌 등 구강 청결 방법으로서의 추출물의 활용방안에 대하여

생각해 본다.

- 23 -

7. 참고 문헌 및 사이트

1. 공희정, 최경규, 박상혁, 이진용, 최기운. 2009. Porphyromonas endodontalis의 침

투에 따른 혈관 내피세포의 유전자 발현

2. Prescott. 2008. 미생물학. 라이프사이언스.

3. 송민준, 이윤혁, 노영희. 2009. 서리태 껍질 추출물의 구강세균 성장 억제 효능에

관한 연구

4. 이창복. 2003. 원색 대한 식물 도감. 향문사.

5.http://www.wrongdiagnosis.com/medical/porphyromonas.htm.Porphyromonas

endodontalis ATCC35406

6. http://www.anaerobesystems.com/Home/pras-mono-plated-media/Brain-Heart-

Infusion-Agar. Anerobe Systems

7. 곽동주, 남상용, 이덕수. 구강균 Streptococcus sanguis에 대한 황백의 생육 저해

효과

8. http://www.mw.go.kr/. 보건복지부.

9. http://100.naver.com. 네이버 백과사전.

10. http://www.wikipedia.org. 위키피디아.

11. 한만덕, 김영권 1998. 구강미생물학. 고문사. 227.

12. 김국경, 홍태희, 김병인. 2005. 녹차추출물이 김치 젖산균에 대해 나타내는 항균

효과에 대한 연구

13. 강원규, 권오경. 초피나무 추출물의 항균효과와 우량개체 증식에 관한 연구

14. 유현희, 김동규, 김진국, 유용욱. 구맥 추출물의 Streptococcus mutans 활성 억

제 효능

15. 이다홍, 유현희, 정수영, 문해닮아, 김수민, 전병훈, 유용욱. 백질려 추출물이

Streptococcus mutans에 대한 항치아우식에 미치는 영향

16. http://blog.daum.net/js06_04/18289574

17. 김건우, 백정규, 장영욱, 금은주, 권윤숙, 김홍주, 손호용. 자생 및 약용 식물의

Streptococcus mutans 항균 활성의 검색