Upload
gorelkin-petr
View
187
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
1
Сканирующая зондовая микроскопия
Методы создания сенсорных слоев для наномеханических
кантилеверных систем
Содержание лекции
1. Принцип работы наномеханических кантилеверных систем (НКС)2. Режимы работы НКС3. Виды сенсорных покрытий 4. Химическая модификация с целью сенсибилизации поверхности датчика.5.Примеры сенсорных покрытий.
Актуальность использования НКС
•Миниатюризация аналитического прибора
•Минимальное время анализа
•Высокая селективность
•Малый объем пробы для анализа
Создание рецепторных слоев, в которых предсказуемым образом формируются межмолекулярные взаимодействия при детектирование анализируемых веществ
Режимы измеренийИзмерение отклонения кантилевера Измерение сдвига
резонансной частоты
Поверхностное натяжение тонких пленок
Масса микрообъектов
лазерфотодиод
кантилевер
Кантилевер с прикрепленной частицей Диасорб-60-С16 массой 78,6±3,9 нг
-0,4
0
0,4
0,8
1,2
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Время, с
Ма
сса
со
рб
ир
ов
ан
ых п
ар
ов
, н
г Десорбция частицей толуола
Десорбция частицей этанола
Чистый кантилевер в парах толуола
Константы десорбции паров органических веществ с поверхности частицы Диасорб-60-С16
Сорбат
Константа десорбции,
1/с
Характерное время
десорбции, с
Толуол
0.0158±0.0005
63±2
Этанол
0.0312±0.0011
32±6
Кинетические кривые процессов десорбции паров толуола и этанола частицей массой 78,6±3,9 нг
Зависимость массы поглощенных паров толуола от массы частицы
0
1
2
3
4
5
6
7
0 50 100 150 200Масса частицы сорбента, нг
Ма
сс
а п
огл
ощ
ен
ны
х п
ар
ов
, н
г
Резонансный режим
• Частота резонатора составила 328,5 МГц. • Присоединение одного цептограмма массы (1 цептограмм (цг) = 10–24 –24 кг)
соответствует уменьшению частоты резонатора на Δf = 0,104 МГц (то есть чувствительность резонатора равна 0,104 МГц/цг).
Измерение массы атома золота: схема установки
Измерение массы атома золота: использование нанотрубки в качестве измерительного
элемента
Устройство атомного сенсора массы
Nature Nanotechnology 3, 533 - 537 (2008)
Измерение массы атома золота: результаты
Режим измерения статического изгиба
zl
Et
a
f ∆−
=2
2
)1(3 ν• f – сила, действующая между соседними молекулами,•a – расстояние между молекулами• l и t – длина и толщина прямоугольного кантилевера, • ν и E – коэффициент Пуассона и модуль Юнга материала кантилевера, • Δz – величина отклонения кантилевера.
Межмолекулярные взаимодействия в монослое
Отталкивание
Притяжение
При взаимодействии с анализируемым веществом в слое между молекулами могут возникнуть:
Исследование свойств монослоев низкомолекулярных веществ
1998 г. – проведен контроль самоорганизации алканотиолов на позолоченной поверхности кантилевера [R. Berger et al, J. Appl. Phys., A, 66, 55 (1998)]
-4,50E-02
-4,00E-02
-3,50E-02
-3,00E-02
-2,50E-02
-2,00E-02
-1,50E-02
-1,00E-02
-5,00E-03
0,00E+00
5,00E-03
0 2 4 6 8 10 12 14
Время протекания процесса, ч
По
вер
хн
остн
ое н
атя
жен
ие,Н
/м
Кинетика сорбции тиофенола (10-2M)Кинетика сорбции гексилтиола (10-2M)
Хемосорбция 4-аминотиофенола 0,001M концентрации из метанола
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 2 4 6 8 10 12 14
Время протекания процесса, ч
По
ве
рх
но
стн
ое
на
тяж
ен
ие
, Н
/м
Хемосорбция 4-аминотиофенола из МеОН Хемосорбция тиофенола и гексантиола из МеОН
N
S
HH
H
H
H H
H
Электронный нос на основе НКС датчиков
На каждый кантилевер нанесен полимер, способный по разному взаимодействовать тем или иным газом.
Монослои тиолов на золоте
CH3(CH2)nSH + Aum => СН3(СН2)nS (Au3+) • Aum-3+1/2H2
Химическая реакция тиолов с поверхностью золота:
Стадии самоорганизация молекул тиола на золоте:
Низкомолекулярные слои на золоте
SHO
N
NN Cu
Cl
Cl
10
Au
CH3OH
10
N
N
N
O S Au
CuCl
Cl
Бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфид (Лиганд I)
4’-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,’;6’,2’’]-терпиридин (Лиганд II)
N
N
S S
NN
S
N
Au
S
N
AuAu
NN
S
N
Au
S
N
AuAu
NN
Au
CH3OH
Для модификации использовались растворы с концентрацией 10-3 моль/л
Ионоселективные датчики
2000 г. - первый ионоселективный датчик Сs+ на основе кантилевера [H.-F. Ji et al, Chem. Commun., 457 (2000)]
Основной объект исследования:1. молекулы сурфактанта бис-4-(2-
пиридилметиленаминофинил)дисульфида (лиганда), способные образовывать хелатный комплекс с ионами тяжелых двухвалентных металлов: Co2+, Ni2+, Cu2+
2. водные растворы солей: MX2·6H2O (M – Co, Cu, Ni; X – ClO4) (концентрация 10-3М).
0
0,1
0,2
0,3
0 50 100 150 200 250
t, мин
σ,
Н/м
Межмолекулярные силы в монослоях
Возникновение π-π взаимодействий между
сопряженными ароматическими системами
приводит к притяжению молекул в слое
1 - Лиганд I 2 - Лиганд II
1
2
f/a,
Координационные полиэдры лиганда I
I - квадрат II – неплоская III – тетраэдр
Формы координационных полиэдров хелатных комплексов кобальта никеля и меди с лигандом I:
Изменение конформации полиэдра
Влияние структуры координационного полиэдра
Никель
Медь
Кобальт
Замещение хлора на гистидин в лигандной оболочке
SO Au
N
NN Cu
Cl
Cl
10
L-Histidine HCl H2O
CH3OH N
N
N
O S Au
CuCl
N
N
COOHNH2
10
N
N
N
O S Au
CuCl
NH
N
COOHNH2
Cl
10
-HCl
*[S. L. Gao, S. Chen, H. Liu, R. Hou, and Q. Ji, Russian Journal of General Chemistry, Vol. 74, No. 3, 2004, pp. 371375]
Замещение хлора на гистидин происходит через образование интермедиата*
Изменение структуры лигандной оболочки металлокомплекса
f/a,
N
N
N
O S Au
CuCl
NH
N
COOHNH2
Cl
10
Пример нанесения функциональных групп на поверхность
кантилеверного датчика
OH OHOH
SiSiSi+ N CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 NH2
CH2
CH2 CH2
CH2
OHOO
SiCH2N CH2 CH2 NH2
(CH2)2
(CH2)2
OH
HO
SiSiSi
Au + HS CH2 CH2 COOH Au S CH2 CH2 COOH
COO- COO-COO-COO-COO-COO-
NH2 NH2 NH2 NH2NH2 NH2NH2NH2
Адсорбции полиэлектролитов на отрицательно заряженной поверхности
?
Диффузия макромолекул к поверхности
Конформационные изменения
R1
Образование точек зацепления
Адсорбция 4-ВП на модифицированную золотую поверхность
Изгиб
I
I
II
II
Формирование латеральных напряжений в слое
Изменение резонансной частоты колебаний кварцевого кристалла за счет прироста массы
I – Образование точек зацепления
R1
II – Конформационные изменения
f/a,
Гибридизация молекул ДНКJ. Fritz et al., Science 288, 316 (2000);
Два кантилевера модифицированы различными олигонуклеотидами:
I. БуферII. Гибридизация
на 1-ом кантилевере
III. Гибридизация на 2-ом кантилевере
АптамерыАптамер – олигонуклеотид, который проявляет специфическое связывание с молекулой-"мишенью". Обычно аптамеры находят методом выборки из случайного массива последовательностей. Природные аптамеры встречаются в РНК-переключателях.
Сенсорные слои на основе аптамеров
SH- 3’-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3’ (длина линкера: ~1,1 нм)
SH- 3’-(CH2)24-GGT TGG TGT GGT TGG-3’ (длина линкера: ~3,9 нм)
~3,5 нм
Измерения в потоке•С(тромбина) = 5 мг/мл,
•Объем анализируемого раствора – 250 мкл
•Скорость 20 мкл/мин
•Связывание аптамера с тромбином осуществлялось в буфере0,1M Трис, 0,14М NaCl, 0,02М MgCl2, 0,02М KCl (pH = 7.4)
Связывание аптамер-тромбин
Формирование латеральных напряжений в слое
Изменение резонансной частоты колебаний кварцевого кристалла за
счет прироста массы
1
2
3
1
2
Данные формирования латеральных напряжений и изменения резонансной частоты колебаний кварцевого кристала при адсорбции тромбина на слои: 1 – аптамер с 6 метиленовыми группами, 2 – аптамер с 24 метиленовыми группами и 3 – полиаденин.
f/a,
Межмолекулярные взаимодействия в слое, содержащем аптамер с 24
метиленовыми группами
Возможный механизм межмолекулярных взаимодействий в слое с аптамером,
содержащим 6 метиленовых групп
Аптамер, связываясь с тромбином меняет свою конформацию
Иммобилизация белков на поверхность кремния и золота
OH OHOH
SiSiSi+ N CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 NH2
CH2
CH2 CH2
CH2
OHOO
SiCH2N CH2 CH2 NH2
(CH2)2
(CH2)2
OH
HO
SiSiSi
Au + HS NH2 Au S NH2
NH2OHC(CH2)3CHO
H2ON CH(CH2)3CHO
N CH(CH2)3CHOH2N-белок
БуферN CH(CH2)3CH N белок
N CH(CH2)3CHOH2NC(CH2OH)3
Буфер
N CH(CH2)3CH NC(CH2OH)3
a)
б)
в)р
Иммобилизация белков на поверхность золота
Иммобилизация фрагментов антител
Модификация кантилевера с помощью микрокапель
• sciFLEXARRAYER SX• Nozzle PDC 70, non-coated• Drop volume: ~ 320 pl• Humidity: ~35%• Temperature: 21°C
Анализ онкомаркеров с помощью НКС
Wu, Ram H. Datar, Karolyn M. Hansen, Thomas Thundat, Richard J. Cote & Arun MajumdarNature Biotechnology 19, 856 - 860 (2001)
Процесс сорбции антител на поверхность, содержащую морфин
-0,03
-0,025
-0,02
-0,015
-0,01
-0,005
0
0,005
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Время протекания процесса, мин
По
вер
хн
остн
ое н
атя
жен
ие,
Н/м Степени
разбавления исходной сыворотки
крови иммунизированного
кролика
500 150 50
Процесс сорбции антител на поверхность, содержащую морфин
Процесс диссоциации иммунных комплексов под действием морфина
Процесс диссоциации иммунных комплексов с рецепторной поверхности под действием морфина
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0 30 60 90
Концентрация морфина, мг/мл
Макси
ма
ль
ны
е
по
ве
рхн
остн
ые с
ил
ы,
Н/м
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Время протекания процесса, мин
По
вер
хно
стн
ое
нат
яж
ени
е, Н
/м
Р я д 3
Р я д 1
Р я д 2
1 0 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 1 )
7 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 3 )
8 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 2 )
3 мкг/мл10 мкг/мл100 мкг/мл
-0,0002
0,0098
0,0198
0 3 6 9 12 15
Увеличенная область
Зависимость максимальной силы изгиба от концентрации морфина
Агрегация белков как причина
нейродегенеративных заболеваний 1997 г. - за обоснование концепции инфекционных-прионных белков С. Прусинеру вручена Нобелевская премия
Существуют мнения что до 50 % всех заболеваний человека связаныс нарушениями конформационного строения биополимеров [M.T. Fisher PNAS, 103, 36, p. 13265, (2006)]
Неправильная укладка лизоцима приводит к амилоидозу Остегтага
(а) Структура молекулы лизоцима (Hen Egg-White Lysozyme) PDB ID: 1GXV [M. Refaee et al. J.Mol.Biol. 327, 857, (2003)]
(б) Предполагаемый механизм агрегации белка лизоцима [L.C. Serpell et al , Cell. Mol. Life Sci., 53, 871, (1997)]
Исследование агрегации лизоцима
-0,065
-0,05
-0,035
-0,02
-0,005
0,01
0,025
0,04
0 2 4 6 8 10 12 14
Время протекания процесса, ч
Пов
ерхн
остн
ое н
атяж
ени
е,Н
/м
а
г
бв
Зависимость от времени поверхностного натяжения пленки лизоцима, находящейся на золотой (г) и кремниевой (а) поверхности кантилевера, помещенной в глициновый буфер pH = 3.0
Направление изгиба кантилевера
Скорость агрегации при экспоненциальной аппроксимации, ч-1.
Характерное время агрегации при экспоненциальной аппроксимации, ч.
Поверхность кремния
В сторону монослоя 0,167 ± 0,002 6,00 ± 0,10
Золотая поверхность
В сторону монослоя 0,73 ± 0,01 1,37 ± 0,01
Ковалентная иммобилизация лизоцима на поверхности кантилевера
Кантилеверные микрочипы
Непрерывная контроль лекарств в режиме реального времени
Экстренный биохимический анализ у постели больного
Перспективы применения