Embed Size (px)
DESCRIPTION
Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012. 10. Сайт-направленный мутагенез, применение для исследования механизма ферментативного катализа. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров
Лаврик ОИЛаврик ОИ
N
C H 3
O
НГУ-2012НГУ-2012
10 Сайт-направленный мутагенез 10 Сайт-направленный мутагенез
применение для исследования механизма применение для исследования механизма ферментативного катализаферментативного катализа
Химический мутагенезХимический мутагенезодноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash
метод введения большого числа точковых мутаций разной метод введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitroлокализации в исследуемые части генов in vitro
Принцип методаПринцип метода некоторые химические мутагены такие как бисульфит натрия гидроксиламин или метоксиламин действуют только на одноцепочечные участки ДНКПримерПример
Одноцепочечные участки ДНК
Дезаминирование остатков цитозина
С U
Достройка цепи ДНК-полимеразой
G-С-пары T-U-пары
Трансформация ДНК с мутацией в
бактериальные клетки
РепликацияЗамена остатков U на T и полная замена G-С-пары на A-T
(транзиция)
NaHSO3
Недостатки метода химического мутагенезаНедостатки метода химического мутагенеза
Ограничения на спектр возникающих мутацийОграничения на спектр возникающих мутаций так как лишь так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов Проблему можно частично решить химических мутагенов Проблему можно частично решить используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды некомплементарные матрице нуклеотиды
Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки подверженные мутации представляют собой сложную смесьподверженные мутации представляют собой сложную смесь в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций Для введения мутаций в определенный локус мутаций Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора сопряженную с анализом большого числа мутантовотбора сопряженную с анализом большого числа мутантов
Сайт-направленный (сайт-специфический) Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенезмутагенез
Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах основанных на использовании генно-инженерных подходов
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и следовательно направленной замены аминокислотного остатка получать белки и ферменты с измененными свойствами
С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии Кроме того поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры) комплементарные целевой ДНК за исключением места выбранного для мутации метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов
Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века когда перечисленные методы стали активно развиваться
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
10 Сайт-направленный мутагенез 10 Сайт-направленный мутагенез
применение для исследования механизма применение для исследования механизма ферментативного катализаферментативного катализа
Химический мутагенезХимический мутагенезодноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash
метод введения большого числа точковых мутаций разной метод введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitroлокализации в исследуемые части генов in vitro
Принцип методаПринцип метода некоторые химические мутагены такие как бисульфит натрия гидроксиламин или метоксиламин действуют только на одноцепочечные участки ДНКПримерПример
Одноцепочечные участки ДНК
Дезаминирование остатков цитозина
С U
Достройка цепи ДНК-полимеразой
G-С-пары T-U-пары
Трансформация ДНК с мутацией в
бактериальные клетки
РепликацияЗамена остатков U на T и полная замена G-С-пары на A-T
(транзиция)
NaHSO3
Недостатки метода химического мутагенезаНедостатки метода химического мутагенеза
Ограничения на спектр возникающих мутацийОграничения на спектр возникающих мутаций так как лишь так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов Проблему можно частично решить химических мутагенов Проблему можно частично решить используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды некомплементарные матрице нуклеотиды
Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки подверженные мутации представляют собой сложную смесьподверженные мутации представляют собой сложную смесь в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций Для введения мутаций в определенный локус мутаций Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора сопряженную с анализом большого числа мутантовотбора сопряженную с анализом большого числа мутантов
Сайт-направленный (сайт-специфический) Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенезмутагенез
Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах основанных на использовании генно-инженерных подходов
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и следовательно направленной замены аминокислотного остатка получать белки и ферменты с измененными свойствами
С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии Кроме того поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры) комплементарные целевой ДНК за исключением места выбранного для мутации метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов
Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века когда перечисленные методы стали активно развиваться
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Химический мутагенезХимический мутагенезодноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК ndash
метод введения большого числа точковых мутаций разной метод введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitroлокализации в исследуемые части генов in vitro
Принцип методаПринцип метода некоторые химические мутагены такие как бисульфит натрия гидроксиламин или метоксиламин действуют только на одноцепочечные участки ДНКПримерПример
Одноцепочечные участки ДНК
Дезаминирование остатков цитозина
С U
Достройка цепи ДНК-полимеразой
G-С-пары T-U-пары
Трансформация ДНК с мутацией в
бактериальные клетки
РепликацияЗамена остатков U на T и полная замена G-С-пары на A-T
(транзиция)
NaHSO3
Недостатки метода химического мутагенезаНедостатки метода химического мутагенеза
Ограничения на спектр возникающих мутацийОграничения на спектр возникающих мутаций так как лишь так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов Проблему можно частично решить химических мутагенов Проблему можно частично решить используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды некомплементарные матрице нуклеотиды
Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки подверженные мутации представляют собой сложную смесьподверженные мутации представляют собой сложную смесь в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций Для введения мутаций в определенный локус мутаций Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора сопряженную с анализом большого числа мутантовотбора сопряженную с анализом большого числа мутантов
Сайт-направленный (сайт-специфический) Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенезмутагенез
Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах основанных на использовании генно-инженерных подходов
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и следовательно направленной замены аминокислотного остатка получать белки и ферменты с измененными свойствами
С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии Кроме того поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры) комплементарные целевой ДНК за исключением места выбранного для мутации метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов
Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века когда перечисленные методы стали активно развиваться
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Недостатки метода химического мутагенезаНедостатки метода химического мутагенеза
Ограничения на спектр возникающих мутацийОграничения на спектр возникающих мутаций так как лишь так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов Проблему можно частично решить химических мутагенов Проблему можно частично решить используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в нуклеотидов например N-гидроксицитидинтрифосфат который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G или создавая такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает такие условия при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды некомплементарные матрице нуклеотиды
Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки подверженные мутации представляют собой сложную смесьподверженные мутации представляют собой сложную смесь в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций Для введения мутаций в определенный локус мутаций Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора сопряженную с анализом большого числа мутантовотбора сопряженную с анализом большого числа мутантов
Сайт-направленный (сайт-специфический) Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенезмутагенез
Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах основанных на использовании генно-инженерных подходов
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и следовательно направленной замены аминокислотного остатка получать белки и ферменты с измененными свойствами
С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии Кроме того поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры) комплементарные целевой ДНК за исключением места выбранного для мутации метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов
Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века когда перечисленные методы стали активно развиваться
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Сайт-направленный (сайт-специфический) Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенезмутагенез
Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах основанных на использовании генно-инженерных подходов
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и следовательно направленной замены аминокислотного остатка получать белки и ферменты с измененными свойствами
С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии Кроме того поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры) комплементарные целевой ДНК за исключением места выбранного для мутации метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов
Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века когда перечисленные методы стали активно развиваться
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белковс рентгеноструктурным анализом (РСА) белков
РСА исходного белка дикого типа
Получение мутантного белка
Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА
методов ферментативной кинетики и др
РСА мутантных ферментов для их комплексов с
субстратами и ингибиторами
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Майкл СмитМайкл Смит1932-20001932-2000
Блэкпул Блэкпул UK - UK - Ванкувер КанадаВанкувер КанадаБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Кэри Б МуллисКэри Б Муллис19441944
Леноир СШАЛеноир СШАБиохимикБиохимик
Нобелевская премия по химии 1993 г
Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б Муллис (Kary B Mullis) независимо от него разработавшего метод ПЦР
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
ПЦР для сайт-направленного ПЦР для сайт-направленного мутагенезамутагенеза
Исходная ДНК и праймеры
1-ая ПЦР
2-ая ПЦР
3-я ПЦР
ДНК-копия с мутацией
Синтезируют пару праймеров несущих мутацию и пару праймеров комплементарных концам нужного фрагмента ДНК В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией которые объединяют в третьей реакции Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию
ПЦР позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров несущих мутацию а также случайный мутагенез В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях понижающих ее специфичность
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
SerSer AlaAla
Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера
TTССCC ( (SerSer))rarrrarrGCCGCC ( (AlaAla) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной ) Далее полимераза без 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает
целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и целостность цепи Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа подвергается необходимым процедурам анализа
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Аланиновое сканированиеАланиновое сканирование
Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту ndash чаще всего на аланин (чаще всего на аланин (AlaAla) )
Введение остатка Введение остатка AlaAla в полипептидные цепи не изменяет их в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации как например при заменах на глицин или общей конформации как например при заменах на глицин или пролин и не сопровождается электростатическими или пролин и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами стерическими эффектами
Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних Аланин часто встречается как во внутренних так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул участках полипептидных цепей белковых глобул
С помощью сканирования аланином можно локализовать С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты образующие активный центр ферментов аминокислоты образующие активный центр ферментов влияющие на активность белка а также исследовать участки влияющие на активность белка а также исследовать участки полипептидных цепей существенные для взаимодействия полипептидных цепей существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами изучить структурные и функциональные лигандами изучить структурные и функциональные особенности белков особенности белков
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на Аминокислоты остатки которых в составе белков заменяются на AlaAla при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины при применении метода сайт-направленного мутагенеза и причины
по которым они могут подвергаться заменепо которым они могут подвергаться замене
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и
изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик
реакции (КМ и kcat) катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus
Stearothermophilus
Водородная связь является Водородная связь является направленной и поэтому играет направленной и поэтому играет
большую роль в проявлении большую роль в проявлении специфичности ферментов а специфичности ферментов а
образование сетки водородных образование сетки водородных связей ndash хороший способ связей ndash хороший способ
организации субстрата в активном организации субстрата в активном центрецентре
Сэр Алан ФерштСэр Алан Фершт19431943
Лондон - Кембридж Лондон - Кембридж UKUKБиохимикБиохимик
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Тирозил-тРНК-синтетазаТирозил-тРНК-синтетаза
Функциональный димер (α2) катализирует аминоацилирование тРНК промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил-аденилат (Tyr-АМР)
Фермент из B Stearothermophilus был закристаллизован В том числе было показано что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК ndash тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков CysCys35 35 ThrThr51 и 51 и HisHis4848
Е + АТР + Tyr EАМРTyr + ppi+тРНКTyr E + Tyr-тРНКTyr + АМР
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Водородные связи между тирозил-тРНК-Водородные связи между тирозил-тРНК-синтетазой и тирозил-аденилатомсинтетазой и тирозил-аденилатом
Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки подающие для образования водородных связей группы основной цепи
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35 rarrGly35 и Cys35rarrSer35 Сродство к субстрату АТР (kcatКМ реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов как для первого лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы так и для второго у которого ndashSH группа заменена на ndashОН группу Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР чем фермент с заменой на Gly35 хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи Возможно это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35rarrSer35 с молекулой воды что затрудняет образование фермент-субстратного комплекса
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Роль Роль CysCys35 в активности фермента35 в активности фермента
Cys35rarrAla35 Эта замена позволяет определить роль ndashSH группы цистеина в функционировании активного центра фермента Так согласно данным РСА ndashSH группа цистеина расположена близко от 3rsquo-ОН группы субстрата значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи При замене на Ala величина КМ упала в 20 раз а величина kcat для АТР упала в 2 раза Эффективность реакции (kcatКМ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз в основном за счет снижения КМ Вероятно в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
C помощью РСА было показано что ndashOH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР В отсутствие субстрата однако ndashOH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды что способствует диссоциации комплекса фермент-субстрат Замена Thr51 rarr Ala51 привела к незначительным изменениям величин параметра kcat обеих реакций но повлияла на сродство фермента к АТР увеличив его поскольку КМ снизилась в два раза Соответственно увеличились вдвое величины параметров kcatКМ Это согласуется с предположением что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Роль Роль ThrThr5511 в активности фермента в активности фермента
В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из EColi остаток Thr51 заменен на пролин и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали) У мутантного фермента из B Stearothermophilus с заменой Thr51rarrPro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины kcat выросло почти в два раза тогда как для второй ndash упало в 26 раза Сродство фермента к АТР (КМ) повысилось в обоих случаях ndash в 15 и 130 раз соответственно Для обеих реакций повысилась их эффективность (kcatКМ для АТР) наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции в основном за счет снижения КМ для АТР Таким образом был получен мутант тирозил-тРНК-синтетазы обладающий более высокой каталитической эффективностью
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Кинетические параметры реакции образования Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого
типа и мутантных форм ферментатипа и мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 76 09 84
Ala51 86 054 159
Pro51 120 0058 2080
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и
мутантных форм фермента
Фермент kcat (с-1)
КМ для АТР
(мМ)kcatКМ (с-1М-1)
WT (Thr51) 47 25 186
Ala51 40 12 320
Pro51 18 0019 958
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
Развитие сайт-направленного мутагенеза Развитие сайт-направленного мутагенеза модификации и усовершенствованиямодификации и усовершенствования
С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию конкретных участках ДНК В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) (вместо четырех) dNTPdNTP причем один из них причем один из них ndash ndash в высокой концентрации в высокой концентрации Именно этот нуклеотид преимущественно включается в Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы точности функционирования ДНК- полимеразы
При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые При использовании в ПЦР вырожденных праймеров которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов содержащих многие точковые мутации можно сканировать мутациями многие точковые мутации можно сканировать мутациями определенные участки ДНК В таком классическом варианте определенные участки ДНК В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно получать делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки Целенаправленно получать точковые мутации делеции и вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-вставки а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с лигазы можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеровпомощью перекрывающихся праймеров
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
bull Направленное получение мутаций в сегментах Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов введение мутантных генов в рекомбинантных генов введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена ndash совокупность мутаций на функционирование гена ndash совокупность таких подходов получила название таких подходов получила название обратной обратной генетикигенетики
bull Возможность замены конкретных аминокислот в Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой а также белках с известной первичной структурой а также объединение в одной полипептидной цепи доменов объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили по сути различных белков и ферментов позволили по сути дела конструировать in vitro новые белки не дела конструировать in vitro новые белки не встречающиеся в природе и привели к созданию в встречающиеся в природе и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления ndash молекулярной генетике нового направления ndash белковой инженериибелковой инженерии
