Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях

8. Группоспецифическая химическая 8. Группоспецифическая химическая

модификация. Применение для модификация. Применение для исследования структуры и функции исследования структуры и функции

активных центров ферментовактивных центров ферментов

Методы изучения структуры и функций Методы изучения структуры и функций биополимеров и активных центров ферментовбиополимеров и активных центров ферментов

Рентгеноструктурный анализРентгеноструктурный анализ (РСА) – основной на сегодняшний день метод исследования структуры ферментов,

Сайт-направленный мутагенезСайт-направленный мутагенез,Химическая модификацияХимическая модификация и ее более

специфический тип – аффинная модификация,

Методы, основанные на применении флуоресцентных и спиновых метокфлуоресцентных и спиновых меток.

Подбор химических модифицирующих агентовПодбор химических модифицирующих агентов

1.1. Высказывается предположение об аминокислотных Высказывается предположение об аминокислотных остатках, находящихся в активном центре ферментаостатках, находящихся в активном центре фермента или интересующем сайте,или интересующем сайте,

2.2. Осуществляется подбор реагентов, специфичным к Осуществляется подбор реагентов, специфичным к определенным аминокислотам,определенным аминокислотам,

3.3. Исследуется ковалентное присоединение реагента к Исследуется ковалентное присоединение реагента к белку и стехиометрия присоединения,белку и стехиометрия присоединения,

4.4. Определяется уровень инактивации фермента, как Определяется уровень инактивации фермента, как следствие такого воздействия.следствие такого воздействия.

Схема химической модификации. Х – модифицируемый остаток аминокислоты в активном центре, R – химический реагент.

RRRR

Недостаток методаНедостаток метода

RR RR

YY

YYRRRR

После реакции модификации:После реакции модификации:

• Входит ли модифицированный Входит ли модифицированный аминокислотный остаток в активный аминокислотный остаток в активный центр фермента?центр фермента?

• Важен ли он для активности фермента?Важен ли он для активности фермента?

После реакции модификации:После реакции модификации:

Анализ образовавшихся продуктовАнализ образовавшихся продуктов

Гидролиз с помощью протеазГидролиз с помощью протеаз

Идентификация модифицированного остатка Идентификация модифицированного остатка (разделение полученной смеси пептидов)(разделение полученной смеси пептидов)

Двумерный электрофорезДвумерный электрофорезанализируемый пептид анализируемый пептид

вырезали из геля и вырезали из геля и секвенировали по Эдманусеквенировали по Эдману

Масс-спектрометрическийМасс-спектрометрическийметод метод MALDIMALDI и его и его

различные разновидностиразличные разновидности

Экспериментальная подготовка образца к Экспериментальная подготовка образца к идентификации модифицированной части белка с идентификации модифицированной части белка с

помощью масс-спектрометрического метода помощью масс-спектрометрического метода MALDIMALDI

Если инактивация при модификации фермента Если инактивация при модификации фермента группоспецифичным реагентом неполная, значит, группоспецифичным реагентом неполная, значит, на поверхности белка есть другие остатки на поверхности белка есть другие остатки аминокислоты, доступные для модификации, и аминокислоты, доступные для модификации, и они функционально важны для протекания они функционально важны для протекания ферментативной реакции. ферментативной реакции.

Эмпирически показано:при наличии в составе фермента остатков цистеина при наличии в составе фермента остатков цистеина ((CysCys) взаимодействие, прежде всего, происходит с ) взаимодействие, прежде всего, происходит с CysCys в активном центре, потом – с другими остатками в активном центре, потом – с другими остатками CysCys, поскольку аминокислоты в активном центре, как , поскольку аминокислоты в активном центре, как правило, более реакционноспособны.правило, более реакционноспособны.

Модификация остатков гистидина в активном Модификация остатков гистидина в активном центре панкреатической рибонуклеазыцентре панкреатической рибонуклеазы

С помощью этого реагента была проведена модификация остатков гистидина (His) в активном центре рибонуклеазы. Было показано, что на 2 М ДНФ приходится 1 М фермента. Позднее было подтверждено с помощью ЯМР, что у рибонуклеазы в активном центре 2 остатка His.

2,4-динитро-2,4-динитро-фторбензол (ДНФ)фторбензол (ДНФ)

Факторы, определяющие реакционную способность Факторы, определяющие реакционную способность функциональных групп биополимеровфункциональных групп биополимеров

1. Общее пространственное экранирование вследствие 1. Общее пространственное экранирование вследствие погруженности функциональной группы внутрь белковой погруженности функциональной группы внутрь белковой глобулы или образования кoмплекса биополимера с другой глобулы или образования кoмплекса биополимера с другой макромолекулой. При этом группа недоступна для макромолекулой. При этом группа недоступна для модификации любыми реагентами или реагентами, размер модификации любыми реагентами или реагентами, размер которых значителен. Например, участие оснований которых значителен. Например, участие оснований нуклеиновых кислот в стекинг-взаимодействиях делает их нуклеиновых кислот в стекинг-взаимодействиях делает их менее реакционноспособными, особенно если атака реагентом менее реакционноспособными, особенно если атака реагентом происходит перпендикулярно плоскости основания. происходит перпендикулярно плоскости основания. 2. Участие функциональной группы в образовании водородных 2. Участие функциональной группы в образовании водородных связей или во взаимодействии с ионами металлов. При этом связей или во взаимодействии с ионами металлов. При этом изменяется ее нуклеофильность.изменяется ее нуклеофильность. 3. Наличие вблизи функциональной группы электростатически 3. Наличие вблизи функциональной группы электростатически заряженных центров может изменять ее рК. Значение рК заряженных центров может изменять ее рК. Значение рК аминокислотного остатка в составе активного центра фермента аминокислотного остатка в составе активного центра фермента может существенно изменяться под действием окружения и может существенно изменяться под действием окружения и отличаться от рК той же аминокислоты в свободном состоянии. отличаться от рК той же аминокислоты в свободном состоянии. 4. Окружение функциональной группы (аминокислотного 4. Окружение функциональной группы (аминокислотного остатка), подвергающейся модификации, может влиять на остатка), подвергающейся модификации, может влиять на реакцию за счет воздействия на реагент. В некоторых случаях реакцию за счет воздействия на реагент. В некоторых случаях может наблюдаться адсорбция реагента полимером. может наблюдаться адсорбция реагента полимером.

Пиридоксальфосфат – пример группоспецифического Пиридоксальфосфат – пример группоспецифического реагента для химической модификацииреагента для химической модификации

Пиридоксальфосфат - кофермент в реакциях дезаминирования, Пиридоксальфосфат - кофермент в реакциях дезаминирования, декарбоксилирования, переаминирования, катализируемых декарбоксилирования, переаминирования, катализируемых аминотрансферазами, синтетазами, гидроксилазами и другими аминотрансферазами, синтетазами, гидроксилазами и другими ферментами, участвующими в метаболизме аминокислот; ферментами, участвующими в метаболизме аминокислот; особенно важна его роль в метаболизме триптофана , глицина , особенно важна его роль в метаболизме триптофана , глицина , серина , глутаминовой кислоты и серосодержащих серина , глутаминовой кислоты и серосодержащих аминокислот. Модифицирует белки по аминокислот. Модифицирует белки по αα--NHNH22-группам и -группам и εε--NHNH22--группам остатков группам остатков LysLys с образованием основания Шифа с образованием основания Шифа..

Метод дифференциального меченияМетод дифференциального мечения

Химически неактивные прочно связанные лиганды Химически неактивные прочно связанные лиганды защищают свой сайт связывания от модификациизащищают свой сайт связывания от модификации

Реакция идет только по другим Реакция идет только по другим реакционноспособным сайтамреакционноспособным сайтам

Ликвидация лиганда с последующей заменой на тот Ликвидация лиганда с последующей заменой на тот же самый реакционноспособный агент, но в же самый реакционноспособный агент, но в

радиоактивной форме, модифицирует только сайт, радиоактивной форме, модифицирует только сайт, ранее защищенный лигандомранее защищенный лигандом

Метод направлен на повышение селективности модификацииМетод направлен на повышение селективности модификации

Недостаток метода: белок может изменять свою конформацию во время дополнительной стадии удаления лиганда из комплекса, что делает выводы менее однозначными.

Влияние рК функциональных групп Влияние рК функциональных групп биополимеров на их реакционную способностьбиополимеров на их реакционную способность

Изменение рК боковых радикалов Изменение рК боковых радикалов аминокислотных остатков вследствие аминокислотных остатков вследствие

их окружения в составе белков их окружения в составе белков является одним из главных факторов, является одним из главных факторов,

определяющих их реакционную определяющих их реакционную способность. способность.

Например, большинство аминокислот Например, большинство аминокислот реагируют в непротонированной реагируют в непротонированной

форме, а значения рК для форме, а значения рК для фyнкциональных групп одинакового фyнкциональных групп одинакового

строения, в зависимости от их строения, в зависимости от их окружения в молекуле белка, могут окружения в молекуле белка, могут

отличаться на 2 единицы. отличаться на 2 единицы.

Пример: модификация остатка серина Пример: модификация остатка серина протеаз, протеаз, RR=-СН=-СН22ОНОН

Для модификации гистидина в активном центре протеазДля модификации гистидина в активном центре протеаз: :

BrCH2C(O)NH2 BrCH2COOH

BrBr-ацетамид-ацетамид Br Br-уксусная кислота-уксусная кислота

ICH2C(O)NH2 ICH2COOH II-ацетамид-ацетамид I I-уксусная кислота-уксусная кислота

R?

Пример: модификация остатка серина Пример: модификация остатка серина протеаз, протеаз, RR=-СН=-СН22ОНОН

При рН 6-7 модификации подвергался остаток При рН 6-7 модификации подвергался остаток серина (серина (SerSer), хотя при таких значениях рН –ОН ), хотя при таких значениях рН –ОН группы серина почти не гидролизуются. группы серина почти не гидролизуются. CCерин ерин изначально проявляет слабую нуклеофильность. изначально проявляет слабую нуклеофильность. В растворе такая реакция не пойдет, а в активном В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре нуклеофильность серина существенно центре нуклеофильность серина существенно повышается при помощи гистидина, оттягивающего повышается при помощи гистидина, оттягивающего на себя протон в паре Ser-Hisна себя протон в паре Ser-His..

SerSer HisHis

рН-зависимая константа k΄r задается уравнением:

k΄r = = krαA

RAK][H

Kk

dt

R)-d(Atr

K][H

Kk r

A + R A-R

pH-зависимость простой бимолекулярной реакции основной формы pH-зависимость простой бимолекулярной реакции основной формы нуклеофильной аминокислоты с неионизованным реагентом, где К – нуклеофильной аминокислоты с неионизованным реагентом, где К – константа диссоциации, Aконстанта диссоциации, Att – общая концентрация аминокислоты. – общая концентрация аминокислоты.

наблюдаемая константа скорости при любом рН будет функцией наблюдаемая константа скорости при любом рН будет функцией реакционной способности нуклеофила (величина kреакционной способности нуклеофила (величина krr) и фракции ) и фракции

нуклеофила в непротонированной форме нуклеофила в непротонированной форме ααAA=К/([Н=К/([Н++]+К).]+К).

При каждом значении рН kПри каждом значении рН k΄́rr будет расти с ростом К, так как при будет расти с ростом К, так как при увеличении константы диссоциации (уменьшении рК) происходит увеличении константы диссоциации (уменьшении рК) происходит увеличение концентрации нуклеофильной формы аминокислоты. увеличение концентрации нуклеофильной формы аминокислоты.

Константа скорости бимолекулярной реакции kКонстанта скорости бимолекулярной реакции krr изменяется как изменяется как функция рК нуклеофильной группы в соответствии с уравнением функция рК нуклеофильной группы в соответствии с уравнением Бренстеда:Бренстеда:

logkr = βpK+γгде где γγ – реакционная константа, зависящая от природы реагента, а – реакционная константа, зависящая от природы реагента, а ββ описывает чувствительность в серии нyклеофилов к рКописывает чувствительность в серии нyклеофилов к рК.

Выигрываемое за счет увеличения концентрации Выигрываемое за счет увеличения концентрации реакционноспособной формы нуклеофилов ускорение реакции реакционноспособной формы нуклеофилов ускорение реакции частично компенсируется уменьшением частично компенсируется уменьшением kkrr. Величина . Величина ββ обычно обычно близка к 0,5, и происходит общее увеличение скорости, особенно близка к 0,5, и происходит общее увеличение скорости, особенно если рН реакционной смеси находится вблизи рК ионизуемой если рН реакционной смеси находится вблизи рК ионизуемой группы.группы.

k΄r = = krαA

K][H

Kk r

Выбор реагентов и реакционных условий Выбор реагентов и реакционных условий для модификации биополимеровдля модификации биополимеров

УсловиеУсловие: биополимеры должны быть в нативной, : биополимеры должны быть в нативной, "физиологически активной" форме"физиологически активной" форме.

Это накладывает серьезные ограничения на возможность Это накладывает серьезные ограничения на возможность применения для модификации биополимеров различных реагентов.применения для модификации биополимеров различных реагентов.

Необходимо: знать механизм реакции модификации знать механизм реакции модификации уметь идентифицировать продукты реакции, то есть определять уметь идентифицировать продукты реакции, то есть определять

степень модификации различных участков молекулы биополимера. степень модификации различных участков молекулы биополимера.

Определение уровня модификации удобнее всего при Определение уровня модификации удобнее всего при использовании реагентов, несущих «метку», например, использовании реагентов, несущих «метку», например, радиоактивную. Прямым путем определения положения радиоактивную. Прямым путем определения положения модифицированных звеньев в структуре биополимеров является модифицированных звеньев в структуре биополимеров является анализ их первичной структуры, то есть гидролиз биополимера и анализ их первичной структуры, то есть гидролиз биополимера и идентификация модифицированных остатков.идентификация модифицированных остатков.

Исчерпывающая модификация функциональных групп Исчерпывающая модификация функциональных групп биополимера в условиях, стабилизирующих его биополимера в условиях, стабилизирующих его

пространственную структурупространственную структуру

Предполагают, что потенциально реакционноспособные Предполагают, что потенциально реакционноспособные «экспонированные» участки молекулы модифицируются «экспонированные» участки молекулы модифицируются количественно, а «экранированные» участки не модифициpуются количественно, а «экранированные» участки не модифициpуются при выходе на плато кинетической кривой реакции модификации. при выходе на плато кинетической кривой реакции модификации. ««ЭкспонированныеЭкспонированные» – реагирующие в данных условиях » – реагирующие в данных условиях функциональные группы. функциональные группы. ««ЭкранированныеЭкранированные» – любые не реагирующие функциональные » – любые не реагирующие функциональные группы.группы.

Недостатки: необходимо проводить модификацию на большую глубину. теряется информация о различиях в реакционной способности

"экспонированных" групп – они подвергаются полной модификации. при глубокой модификации биополимера могут происходить

изменения его структуры, сопровождающиеся модификацией групп, которые "экранированы" в нативной молекуле.

Определение начальных скоростей модификации Определение начальных скоростей модификации функциональных групп биополимеровфункциональных групп биополимеров

• Начальные скорости определяются при малых глубинах Начальные скорости определяются при малых глубинах модификации и могут служить количественными модификации и могут служить количественными характеристиками реакционной способности функциональных характеристиками реакционной способности функциональных групп в нативной, не измененной модификацией, структуре групп в нативной, не измененной модификацией, структуре биополимера.биополимера.

• Этот подход позволяет избежать осложнений, возникающих за Этот подход позволяет избежать осложнений, возникающих за счет повреждений структуры биополимера при глубокой счет повреждений структуры биополимера при глубокой модификации. модификации.

• Применение такого подхода связано с определением количеств Применение такого подхода связано с определением количеств отдельных модифицированных остатков в составе отдельных модифицированных остатков в составе биополимера при глубине модификации биополимера около 1 биополимера при глубине модификации биополимера около 1 эквивалента реагента на моль биополимера. Эта сложная эквивалента реагента на моль биополимера. Эта сложная задача может быть решена с помощью специальных методов задача может быть решена с помощью специальных методов анализа, обладающих высоким разрешением. анализа, обладающих высоким разрешением.

При облучении реакционной смеси из азидогруппы генерируются При облучении реакционной смеси из азидогруппы генерируются высокореакционноспособные нитрены. Такой реагент способен высокореакционноспособные нитрены. Такой реагент способен модифицировать максимальное количество функциональных групп модифицировать максимальное количество функциональных групп биополимеров. биополимеров.

Данный подход применим для изучения структуры и Данный подход применим для изучения структуры и конформационных изменений биополимеров, так как, применяя конформационных изменений биополимеров, так как, применяя соответствующие реагенты, можно проводить реакцию со скоростью, соответствующие реагенты, можно проводить реакцию со скоростью, превосходящей скорость конформационного превращения белка.превосходящей скорость конформационного превращения белка.

Пример модификации реагентом, Пример модификации реагентом, содержащим азидогруппусодержащим азидогруппу

N-(4-азидо-2-нитрофенил)-2-аминоэтилсульфонат применяемый для модификации рибонуклеазы (РНК-азы)

Модификация биополимеров Модификация биополимеров бифункциональными реагентамибифункциональными реагентами

Реагенты, содержащие две модифицирующие группировки, Реагенты, содержащие две модифицирующие группировки, способны присоединяться к двум сближенным группам в способны присоединяться к двум сближенным группам в составе одного белка или молекулы нуклеиновой кислоты или составе одного белка или молекулы нуклеиновой кислоты или образовывать ковалентные связи с двумя молекулами образовывать ковалентные связи с двумя молекулами биополимеров, соединяя их ковалентно. биополимеров, соединяя их ковалентно.

Расстояние между функциональными группами, Расстояние между функциональными группами, подвергающимися модификации одной молекулой реагента, подвергающимися модификации одной молекулой реагента, ограничено его длинной. Поэтому исследование модификации с ограничено его длинной. Поэтому исследование модификации с помощью бифyнкциональных реагентов различной длины помощью бифyнкциональных реагентов различной длины позволяет получить информацию о взаимном расположении позволяет получить информацию о взаимном расположении различных функциональных групп в составе биополимеров, различных функциональных групп в составе биополимеров, макромолекул в сложных комплексах (рибосомы, хроматин) или макромолекул в сложных комплексах (рибосомы, хроматин) или в клеточных структурах (например, белки в мембранах) или в клеточных структурах (например, белки в мембранах) или даже об организации ферментных комплексов внутри живой даже об организации ферментных комплексов внутри живой клетки. клетки.

Бифyнкциональные реагентыБифyнкциональные реагенты

Содержат две одинаковые Содержат две одинаковые реакционноспособные группыреакционноспособные группы

ГетерофункциональныеГетерофункциональные содержат две реакционноспособныесодержат две реакционноспособные

группы различной специфичностигруппы различной специфичности

Модификация осуществляется Модификация осуществляется простой обработкой исследуемого простой обработкой исследуемого

биополимера или биополимера или макромолекулярного комплекса макромолекулярного комплекса

с помощью реагентас помощью реагента

Модификация осуществляетсяМодификация осуществляетсяпоследовательнопоследовательно

Реагент может быть Реагент может быть сначала присоединен к одной сначала присоединен к одной

из макромолекул. Затем из макромолекул. Затем после помещения биополимера после помещения биополимера

в какие-то новые условия в какие-то новые условия проводится модификация проводится модификация

второй функциональной группойвторой функциональной группой

Примеры бифункциональных реагентовПримеры бифункциональных реагентов

диимидоэфиры

1,5-дифтор-2,4-динитро-бензол1,5-дифтор-2,4-динитро-бензол

Первоначально можно присоединить эти реагенты к определенным Первоначально можно присоединить эти реагенты к определенным точкам в структуре белка за счет светонезависимых специфичных точкам в структуре белка за счет светонезависимых специфичных реакций. Затем может быть проведена активация азидогрyпп реакций. Затем может быть проведена активация азидогрyпп реагента. При этом будут происходить реакции в окрестности реагента. При этом будут происходить реакции в окрестности модифицированной аминогрyппы или SH –группы.модифицированной аминогрyппы или SH –группы.

Реагенты содержат азидогруппы и группы, Реагенты содержат азидогруппы и группы, специфично модифицирующие аминогруппы или SH-гpyппыспецифично модифицирующие аминогруппы или SH-гpyппы

Пример гетерофункциональных реагентовПример гетерофункциональных реагентов

Расщепляемые бифyнкциональные реагентыРасщепляемые бифyнкциональные реагентыСодержат между реакционноспособными группами специальную Содержат между реакционноспособными группами специальную структуру, которая позволяет расщепить реагент на две части после структуру, которая позволяет расщепить реагент на две части после проведения модификации. В качестве таких структур используют, проведения модификации. В качестве таких структур используют, например, дисульфидную связь, которая может быть разрушена например, дисульфидную связь, которая может быть разрушена окислением или восстановлением:окислением или восстановлением:

Или цис-гликольную группировку, которую можно разрушить окислением перйодатом. Примером могут служить реагенты общей формулы, применявшиеся для модификации рибосом:

При модификации диэпоксибутаном цис-гликольная группировка При модификации диэпоксибутаном цис-гликольная группировка возникает при реакции:возникает при реакции:

Смесь модифицированных белков разделяют электрофорезом в одном направлении. Затем белки, не извлекая их из геля, подвергают расщеплению с помощью процедуры, разрушающей реагент. После этого проводят электрофорез во втором направлении в условиях, идентичных условиям разделения в первом направлении. Неизмененные белки – на диагонали геля. Белки, вновь образовавшиеся при расщеплении реагента, соединяющего их в агрегат, будут находиться в стороне от диагонали, так как отличаются по подвижности от белка, в составе которого они были во время первого разделения.

Идентификация продуктов модификации Идентификация продуктов модификации в случае применения расщепляемых реагентовв случае применения расщепляемых реагентов

с помощью «диагональных методов», с помощью «диагональных методов», например, диагонального электрофорезанапример, диагонального электрофореза