第三章 样品制备第三章 样品制备

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演示文稿本章目录

辽农职院 工程系 质检中心

目的要求 样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样品制备方法和技术是一个重要问题。

通过本章的学习，目的是使学生掌握溶剂萃取、固相萃取、超临界流体萃取、微波萃取以及衍生化技术等色谱分析用样品的前处理方法，了解有关样品前处理仪器的一些相关知识。

学习要点　溶剂萃取技术；蒸馏及精馏技术；固相萃取技术；气体萃取技术；超临界流体萃取技术； 微波萃取技术；衍生化技术 　

技能要点　溶剂萃取技术；蒸馏及精馏技术；固相萃取技术；超临界流体萃取技术；波萃取技术

学习目标

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第五节 超临界萃取技术等第五节 超临界萃取技术等

一、超临界萃取技术 二、微波萃取技术

三、超声波辅助萃取

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四、衍生化技术

五 、生物大分子的细胞破碎与蛋白质的去除

一 、超临界萃取技术一 、超临界萃取技术

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临界温度：临界温度： 3232℃

一 、超临界萃取技术一 、超临界萃取技术

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11 、三相点和临界点、三相点和临界点

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临界点：液、气两相呈平衡状态的点。

临界温度：在临界点时的温度。

临界压力：在临界点时的压力。

2 2 、超临界流体、超临界流体

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物体处于其临界温度和临界压力以上时的状态。气体：粘稠度、表面张力低，溶解能力强，萃取功能高。压力↑，溶解能力↑。液体：体积小。

流体名称 分子式 临界压力(bar)

临界温度(℃)

临界密度(g/cm3)

二氧化碳 CO2 72.9 31.2 0.433

水 H2O 217.6 374.2 0.332

氨 NH3 112.5 132.4 0.235

乙烷 C2H6 48.1 32.2 0.203

氧化二氮 N2O 71.7 36.5 0.450

3 3 、超临界流体的性质、超临界流体的性质

4 4 、特 点、特 点

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⑴ 在 35 ～ 40℃下提取⑵ 干净的提取方法⑶ CO2 是一种不活泼的气体。⑷ 循环使用，降低成本。⑸ 参数可以调节

流动相

二 、微波萃取二 、微波萃取

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微 波微 波

金属金属

水分水分

二 、微波萃取二 、微波萃取

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二 、微波萃取二 、微波萃取

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11 、微 波、微 波

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频率： 300—300 000MHz 的电磁波。

穿透：玻璃、塑料、陶瓷等绝缘体。

当微波作用于水和酸性物质时，将被极

性分子所吸收，因而物质很快被加热。

2 2 、工作原理、工作原理

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吸收微波→细胞内部温度↑，→细胞内

部压力超过细胞壁膨胀承受能力→细胞

破裂→有效成分自由流出。

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33 、影响因素、影响因素

㈠ 萃取温度的影响

㈡ 萃取溶剂的影响

㈢ 样品杯：聚四氟乙烯

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三、超声波辅助萃取三、超声波辅助萃取

能量→外部向内部→传递。

超声波使溶液形成气泡（空化效应）

→爆裂→温度和压力↑，→增强化学

反应能力。

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三、超声波辅助萃取三、超声波辅助萃取

优点：价廉快速，

简便安全，批量

处理样品。

四 、衍生化技术四 、衍生化技术

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化学反应→定量生成→适于分析。

1 1 、衍生化的目的、衍生化的目的

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① 灵敏度与选择性

② 改善色谱分离：

挥发性、降低与色谱材料的相互作用

③ 理化稳定性

2 2 、分 类、分 类

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柱前衍生化：为了分离

柱后衍生化：为了检测

33 、气相色谱的衍生化、气相色谱的衍生化

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（ 1）硅烷化衍生化方法

（ 2）酯化衍生化方法

（ 3）卤化衍生化方法

（ 4）酚化衍生化方法

方法

（（ 11 ）、硅烷化衍生化方法）、硅烷化衍生化方法

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利用醇，酚，酸，胺等与硅烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷衍生物

R3Si—X + H—R` R3Si—R` + H—X

（（ 22）酯化衍生化方法）酯化衍生化方法

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大多数有机酸挥发性、热稳定性差。在 GC分析之前衍生为相应的酯。

① 甲醇法② 重氮甲烷法 ③ 三氟乙酸配法

① ① 甲醇法甲醇法

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甲醇法 有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸的甲酯

RCOOH + CH3OH催化剂

RCOO CH3 + H2 O△

② ② 重氮甲烷法重氮甲烷法

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与有机酸反应，生成有机酸的甲酯，

重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒。

RCOOH + CH2N2RCOO CH3 + N2

（（ 33 ）、卤化衍生化方法）、卤化衍生化方法

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引入卤原子→ ECD 检测器→也改善挥发性和稳定性。

卤素的作用是加成或取代

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44 、液相色谱的衍生化、液相色谱的衍生化

1. 紫外衍生化反应

2 ．荧光衍生化反应

3．电化学衍生化反应

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（（ 11 ）紫外衍生化反应）紫外衍生化反应

苯甲酰氯 + 胺、醇、酚→苯甲酸酯类衍生物（２００～３６０ｎｍ ）

苯甲酰化反应 苯甲酰化反应

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（（ 22 ）荧光衍生化反应）荧光衍生化反应

在目标化合物上接上能发出荧光的生色基团，如荧光素。

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55 、制备衍生物的反应罐瓶、制备衍生物的反应罐瓶

五 、生物大分子的细胞破五 、生物大分子的细胞破碎与蛋白质的去除碎与蛋白质的去除

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（一）、生物样品

植物：营养成分、农药残留等

动物：体内的药物及代谢产物、

糖类、维生素、氨基酸等

微生物：

待测物的位置待测物的位置

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体液或细胞外：采用萃取方法。也

可将干扰组分（如蛋白质、 DNA、多

糖等等）沉淀除去。

生物细胞内：首先将细胞破碎，再

采用萃取或沉淀等方法。

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（二）、细胞的破碎

目的：就是为了破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。

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1 、细胞的破碎方法

① 组织较柔软：匀浆器研磨② 组织较韧：铰碎→匀浆③ 纤维组织：捣碎器破碎或加砂研磨。④ 微生物坚韧的细胞壁：用自溶、冷热交 替、加砂研磨、超声波和加压处理。

1 、细胞的破碎方法

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2 、机械法（机械切力）

① 高速组织捣碎机： 20000r ／ min。 对象：动植物组织② 匀浆器：铰碎组织。对生物大分 子破坏较少。③ 研磨 ：玻璃砂。

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3 、物理法（物理作用）

① 反复冻融法： -15 ～ -20℃。

② 冷热交替法： 90℃维持数分钟，立即置于冰浴中冷却。③ 超声波处理法：用于微生物。④ 加压破碎法： 加气压或水压，可使 90

％以上细胞被压碎。

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4 、化学及生物化学法（化学试剂或酶）

① 自溶法： 在一定条件（ pH 、温度），

利用自身的酶系将细胞破坏。

② 溶菌酶处理： 具有专一地破坏细菌细胞壁的功能。

本节首页 退出本章Antifungal activityAntifungal activity

例：溶菌酶处理

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（三）、蛋白质的去除

目的：蛋白质的存在，常常严重干扰分析

1、加热法 2 、盐析法3、膜分离法 4 、高速离心5 、有机溶剂沉淀法

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1 、 加热法

欲测组分热稳定性好时采用。加热到 9

0℃。

蛋白沉淀后可用离心或过滤除去，能

除去热变性蛋白。

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2 、盐析法

原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升高而增加，称为盐溶作用。 当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降，并先后析出沉淀，称为盐析作用。

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3 、膜分离法

超滤：靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离不同分子量的物质。将欲测小分子化合物和大分子蛋白质分离。

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4 、高速离心

物质沉降系数、质量、

浮力因子等不同，

用离心力使物质分离、

浓缩、提纯的方法。

小中大

复习思考题1、超临界流体萃取有哪些特点？2 、微波萃取和超声波萃取区别？3 、柱前衍生化与柱后衍生化的目的 各是什么？4 、细胞破碎的具体方法5、蛋白质的去除方法

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