出生缺陷筛查与遗传性疾病的实验诊断

上海交通大学医学院附属瑞金医院

樊绮诗

遗传性疾病的分类 染色体病：在生殖细胞发生和受精卵早期发育过

程中发生差错，产生整条染色体或染色体节段超过或少于二倍体数，表现出先天发育异常

单基因病：起因于致病基因，在一对同源染色体上可能其中一条带有突变基因，也可能同源染色体上的对应位点都是突变基因。有特征性家系传递格局

遗传性疾病的分类 多基因病：亦称多因子病，起因于遗传素质和环

境因素，包括一些先天性发育异常和常见病 线粒体遗传病：线粒体基因突变可导致线粒体遗

传病，随线粒体传递，呈细胞质遗传 体细胞遗传病：癌肿起因于体细胞遗传物质的突

变，可表现出家族性癌肿遗传易感性。有些先天畸形亦属此类。

单基因遗传病的分类 常染色体连锁遗传性疾病：致病基因

位于常染色体

性染色体连锁遗传性疾病：致病基因位于性染色体

常染色体连锁遗传性疾病常染色体连锁隐性遗传 位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变

才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病称为常染色体连锁隐性遗传性疾病

同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子

囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传 (7q31)

常染色体连锁遗传性疾病常染色体连锁显性遗传 位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突

变即产生临床症状，所导致的相应疾病称为常染色体连锁显性遗传性疾病

特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者

Huntington 舞蹈症：常染色体显性遗传 (4p16.3)

性染色体连锁遗传性疾病

X 染色体连锁遗传 大多为隐性遗传 ( 如甲型血友病、杜氏肌

营养不良症 ) 显性遗传非常罕见

Y 染色体连锁遗传

产前筛查（诊断） 在胎儿出生前对其出生缺陷（包括先天异

常和宫内感染）进行检查 产前筛查包括实验室检测、影像学检查等 围产医学

产前筛查的实验室检测

染色体病的实验室筛查 胎儿宫内感染的实验室检测 遗传性疾病的基因检测

染色体病的实验室筛查

孕早期筛查（孕 7 ～ 11 周） 孕中期筛查（孕 15 ～ 20 周） 产前筛查只是对胎儿罹患某一先天性或遗

传性疾病的风险评估而非确诊

中国出生缺陷现状 中国每年约有 100 万缺陷儿出生，其中只

有 30% 可以治愈或纠正 全国累计近 3000 万个家庭曾生育过出生缺

陷和先天残疾儿，占全国家庭总数 1/10 中国每年出生约 3-5 万唐氏儿， 10 万神经

管缺陷患儿

造成沉重的社会负担和精神压力此项支出每年达到 300 亿每个唐氏患儿仅医药费支出就达 25 万1 个患儿平均累及 7 个成人

关键在于预防三级预防可大幅度减少出生缺陷儿的发生 1 级：孕前保健 2 级：孕期保健 ( 产前筛查与诊断 ) 3 级：新生儿筛查 ( 早发现早干预 )

筛查指征 危害严重 发病率较高，人群分布明确 筛查阳性有进一步明确诊断方法 筛查方法较简易 筛查费用明显低于治疗费用

孕期保健筛查的主要疾病 21- 三体综合症，发病率为 1/700~1/800 18- 三体综合症，发病率 1/6000~1/8000开放性神经管缺陷，发病率 1/1000~1/2000

新生儿筛查的主要疾病先天性甲状腺功能低下苯丙酮尿症先天性肾上腺皮质增生症葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶缺乏

采集一滴新生儿足跟末梢静脉血于滤纸上，干燥后运输至筛查中心统一检测。

血清学筛查的基本概念安全性抽取孕妇 2ml静脉血，通过测定血清中的特定标志物，间接地判断胎儿患遗传缺陷疾病的风险度非创伤性

筛查对象原则上为孕 9-20+6 周的所有孕妇

血清学筛查的基本概念孕妇自愿 孕妇接受产前筛查遵循自愿原则，明确产前筛查

的内容、意义和相应风险，并签署产血清学前筛查知情同意书

筛查与确诊 筛查 ( 高危 ) 病例，需进一步做绒毛膜 ( 孕早期 )

或羊水穿刺 ( 孕中期 )做染色体核型分析进行确诊。

年龄曾是唐氏综合征产前筛查的指标

产前筛查的血清标志物 1984 年首次报道怀有染色体异常特别是 DS胎儿的

孕妇血清AFP水平偏低，建议将AFP作为 35岁以下孕妇胎儿染色体异常的筛查指标

1987 年报道怀有 DS胎儿的母血中人绒毛膜促性腺激素（ HCG）的水平是正常孕妇的 2倍；非结合雌三醇（ uE3 ）的水平比正常低 25% ，提示可以作为另两个筛查指标

1991 年报道妊娠相关血浆蛋白A（ PAPP-A）与 DS有关

1996 年，抑制素A (inhibin A) 成为第四个血清检测指标

以上单个指标进行唐氏综合征的筛查，检出率均太低 (30%左右 )

将AFP、 HCG、 uE3 和 Inhibin A四项指标联合检测称为四联筛查

对 14-20 周的孕妇进行筛查，检出率为 81% ，假阳性率约 5%

目前国内孕中期血清学产前筛查模式 (Second-trimester maternal serum screening)

AFP + free βHCG/HCG

AFP + free βHCG/HCG + uE3

AFP + free βHCG/HCG + uE3 + Inh A

全球筛查模式模式 孕周 项目 优势 缺点

孕早期联合筛查(1st Trimester Combined)

9~13 ＋ 6 NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG

时间早：筛查在 14 周前结束

具有超声影像支持 尽可能早做出决策 得到证实的检出率： 90 ％

DR / 5%FPR(1T Combined)

必须具备开展 NT 的条件和技术25 ％孕妇错过了早期筛查时间 , 中国尤甚必须具备 CVS 的条件和技术

孕中期筛查 (2nd Trimester)

14-20+6 4 联： AFP ， hCG (Total 或 Free) ，uE3 ， Inhibin-A

已得到广泛应用，成熟模式所有孕妇都可以进行中期筛查检出率高 :81%DR/5%FPR

决策时间晚无超声监测终止妊娠不够安全

血清学整合筛查 (Serum integrated)( 孕早期不出报告 )

9~13 ＋ 6

& 14-20+6

孕早期： PAPP-A孕中期： 4 联

仅生化测试，简单易行 无需 NT ， DR/FPR 与孕早

期筛查类似 可据此建立孕早期筛查项目 检出率高 :86%DR/5%FPR

决策时间晚无超声监测不能提供完整的孕早期数据

整合筛查 (Integrated)( 孕早期不出报告 )

9~13 ＋ 6

& 14-20+6

孕早期： NT&PAPP-A孕中期： 4 联

降低 FPR(2%)/90%DR －减少羊水穿刺率

建立孕早期筛查项目

决策时间晚保留风险较高的结果 , 如NT>3mm终止妊娠不够安全不能提供完整的孕早期数据

序贯筛查 (Stepwise sequential)( 仅高危病例在孕早期出报告 )

9~13 ＋ 6

& 14-20+6

孕早期： NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期： 4 联

建立孕早期筛查项目 早期高风险结果进行诊断性

检查 同样的 DR(90%) ， FPR 降

低 (3.7%)

只有很少部分 (1%) 孕妇在孕早期结束筛查终止妊娠时间晚，不安全遗传咨询难度高

酌情筛查 (Contingent)( 仅灰色区域风险孕妇进行孕中期筛查 )

9~13 ＋ 6

& 14-20+6

孕早期： NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期： 4 联

可建立完整的孕早期筛查项目80 ％以上孕妇在孕早期结束筛查

对高危组，中间组和低危组的界定可能导致中间组孕妇焦虑：须等待 4 周

我国开展筛查的现状及可选方案

我国开展现状：

对孕早期筛查的重要意义认识不足，孕中期筛查仍为主流

孕早期筛查技术不成熟，尤其规范 NT 检测有相当难度

大多数孕妇孕中期才参加产前保健

大多数中心仅限于传统的中期两项筛查

产筛质量管理意识有待加强

针对我国国情推荐参考方案：

积极宣传孕早期筛查的重要意义，产筛未来发展趋势

在不具备规范 NT 检测情况下，建议进行孕中期四联筛查，使其成为国内产筛的基础性工作

有条件的地区开展酌情、序贯或血清整合等多种模式筛查，为孕妇提供更多选择

胎儿宫内感染的实验室检查

TORCH综合征的孕前和产前检测 TORCH综合征是病原微生物感染引起胎儿异

常的一组疾病 弓形虫（ toxoplasma, TOXO） 风疹病毒（ rubella virus, RV） 巨细胞病毒（ human cytomegalovirus, CM

V） 单纯疱疹病毒（ herpes simple virus, HSV） 其他病原微生物（ other, O）

孕妇为易感人群，感染途径与一般人相同 可发生在妊娠各期，宫内感染可造成严重后果 感染后除免疫缺陷者外，机体均产生特异性抗

体。采集孕妇外周血检测相关病原体的特异性抗体 IgG 和 IgM ，以判断孕妇是否曾经或正在感染某一病原体

抗体检测：免疫学方法血清学检测的局限性 抗体产生时间 判断胎儿感染须谨慎 孕前筛查更为重要 免疫缺陷者可能检测不到相应抗体

单基因遗传病的基因诊断

单基因遗传病中常见的分子异常

遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。

基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。

点突变 (point mutation) 包括错义突变、无义突变、移码突变

各种点突变所造成的后果： 蛋白质分子量改变 蛋白质合成量下降 无蛋白质合成

片段性突变 (fragememtal mutation)

核苷酸的丢失和增多 缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复 基因重排：基因组中原来不在一起的基因由

于某些原因重新排列

动态性突变 (dynamic mutation)

以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中 不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往 往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。

脆性 X综合征： CGG重复 少年脊髓型共济失调： GAA重复 亨廷顿病： CAG重复

X 染色体（ xq27.3 ）的脆性位点

•脆性 X 综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。

•致病基因 FMR-1 的 5’端有 CGG 三核苷酸重复

区。•普通男性群体中的患病率为 1/4000。•普通女性群体中的患病率为 1/6000。•患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊

面容。

正常个体： CGG 重复次数 6~52次，中国人群以 (CGG)28 为多见。

前突变 (premutation) ： (CGG) 53~230 为携带者，虽表型正常，但在传递过程中易发生进一步扩展，使后代的 CGG 重复次数大大增加，并有异常表型。

全突变： (CGG) ≥230 时， 100% 的男性表现为典型的脆性 X 综合征 ,

53% 的女性表现为程度不同的智力低下。

遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略

基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。

直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。

直接诊断常用技术Southern 印迹技术 将基因组DNA用限制性内切酶水解，经凝胶电泳分离

用碱处理使凝胶中的 DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上

用标记的特异性探针与变性单链杂交，可使特异条带显影

实验结果为限制性长度片段多态性分析（ restriction fragment length polymorphism, RFLP）

直接诊断常用技术聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR） 在突变点二侧设计引物，经扩增后可得含有突变

点的扩增产物 以突变筛查技术找出突变点　 SSCP 、 DGGE

Melting curve analysis

DNA sequencing

DMD的基因检测Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一种

高发病率、高致残、高致死的 X 连锁的遗传性疾病，平均每 3500 个活产男婴中即有一个患者

DMD 基因的全长为 250kb ，有 79 个外显子DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占突

变的 60%~70%

用多重 PCR技术对外显子进行筛查

DMD基因外显子的检测

（二）间接诊断策略 间接诊断是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体（与致病基因连锁），从而判断该个体是否带有致病基因 间接诊断不是寻找 DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性

遗传标志及其多态性

单拷贝序列

在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数基因 (50%~80%) 在单倍体中都为单拷贝

重复序列

真核生物染色体 DNA中存在许多不同程度的重复序列，按照孟德尔遗传定律传递

大多存在于基因的非编码区根据 DNA序列重复出现频率的不同而分

为不同类型

中度重复序列短分散片段 (short interspersed segments, SINEs)

平均长度 300bp ，拷贝数可达 10 万左右长分散片段 (long interspersed segments, LINEs)

平均长度 3500~5000bp ，拷贝数达 1 万左右 在人类基因组中约占 12%

中度重复序列 大多数不编码蛋白质 ,与单拷贝基因间隔排列 有些是编码蛋白质或 RNA的结构基因（ HLA、rRNA、 tRNA、组蛋白、免疫球蛋白基因）

可存在于结构基因之间、基因簇之中、内含子内部

高度重复序列

存在于基因组的间隔区和基因的内含子等非编码区

重复频率可高达 106 以上，不转录具高度多态性，成为有效的遗传标志，已广泛用于基因定位和基因诊断

小卫星序列也称数量可变的串联重复序列 (Variable N

umber of Tandem Repeat, VNTR)

以 6-70bp 为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列

微卫星序列 (microsatellite)

又称短串联重复序列 (STR) 以 2-6bp 为单位，重复次数可达几十次 在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性

碱基组成不同于其他部分，用密度梯度离心可将其与主体 DNA分开

重复序列的检测

PCR技术 在重复序列二侧设定引物，经 PCR扩增用凝胶电泳分离扩增产物根据产物片段大小即可决定重复序列的重复次数

遗传咨询和产前基因诊断

遗传咨询 明确诊断先证者，确定引起疾病的分子异常了解本病传递至下代的风险率判断胎儿是否患病

遗传咨询和产前基因诊断产前基因诊断羊水细胞（ 16~20 周）绒毛膜细胞（ 8~12 周）

非创伤性取样母体外周血中胎儿游离 DNA

遗传咨询战略路线（以 DMD 为例）

MD 是否由Dystrophin缺陷所致 ?

是。孕妇是否携带者？

是。或可能是。胎儿性别？

男孩。分子生物学研究

不是。寻找引起本病的原因

不是。不进行产前基因诊断，但应研究家系中其他有风险者

女孩。不进行分子生物学研究

C50: C49: C45: C44:

Cjp:

11223

C50: C49: C45: C44: Cjp:

12212

21313

C50: C49: C45: C44: Cjp:

21121

21313

C50: C49: C45: C44: Cjp:

21121

21313

C50: C49: C45: C44: Cjp:

21121

12212

C50: C49: C45: C44: Cjp:

12212

C50: C49: C45: C44: Cjp:

21313

C50: C49: C45: C44: Cjp:

11223

12212

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21313

C50: C49: C45: C44: Cjp:

21313

1 2

3 4 5 67 8

9 10 11 12 13 1415 16 17 18

1920 21

22 23

DMD 家系分析

1 2

5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5

5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5

1 2 3 4

血友病Ａ家系分析

间接诊断的不确定性 遗传标志所带的信息性有限（多态性程度不高） 新突变 基因重组（若遗传标志离致病基因的遗传距离为

5cM, 此时基因重组的可能性为 5% ） 家系成员不完整

单基因病遗传缺陷的实验诊断

肢带型肌营养不良 (LGMD2) 是一类常染 色体连锁隐性遗传病，已有 LGMD2A~2H8 种类型。由于遗传学和临床表现具高度异质性，临床诊断和分类十分困难

家系资料

致病基因的定位

用已报道的 LGMD2A~2H 8个基因所在位点附近共 14 个 STR标记对家系成员 DNA样本进行连锁分析，寻找与该家系连锁的致病基因

连锁基因 标志位点 基因位置

LGMD2A D15S994 15q15.1-15.3 LGMD2A D15S778 LGMD2A D15S779LGMD2B D2S337 2p13LGMD2B D2S286LGMD2B D2S2333LGMD2C D13S175 13q12LGMD2D D17S1816 17q12LGMD2D D17S787LGMD2E D4S1592 4q12LGMD2F D5S436 5q33-34LGMD2F D5S422 LGMD2G D17S789 17q11-12LGMD2H D9S1682 9q31-33

致病基因定位结果

D2S377 位点的 Lod Score值为 1.85 D2S286 位点的 Lod score值为 0.51 其他各位点的值均为负数 Lod score值 < 1 ：不支持连锁 Lod score值 >1 ： 支持连锁 Lod score值 >3 ： 强烈支持连锁

致病基因编码产物检测结果

先证者 LGMD2B的基因编码蛋白 dysferlin条带密度与正常对照相比有明显下降

其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变

DYSF--LGMD2B 的致病基因

DYSF 基因全长 150kb ，有 55 个外显子 cDNA长度为 6.9kb ，含有一个 6243bp 的开放读码框，编码 2080 个氨基酸

DYSF基因突变的检测

在 DYSF 基因的突变热点区筛查，以期发现导致 dysferlin 缺陷的基因突变

逆转录 PCR

产物克隆至载体后作序列分析

G

DYSF基因检测结果 cDNA第 6425/6426位 (52 号外显子 ) 缺失 1个 G碱基 (6425/6426 del G)

第 2019位密码子 agg agc，下游读码发生移位，使第 2035位密码子 atg tga，产生无义突变 (M2035X)

蛋白质合成提前终止 诊断意见：肢带 2B型肌营养不良

谢 谢 ！