Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров

Лаврик О.И.Лаврик О.И.

N

C H 3

O

НГУ-2012НГУ-2012

12. Вклад рентгеноструктурного анализа в 12. Вклад рентгеноструктурного анализа в

изучение структуры и функции изучение структуры и функции ферментов ферментов

Метод рентгеноструктурного анализа (РСА) – один Метод рентгеноструктурного анализа (РСА) – один из основных методов исследования структуры и из основных методов исследования структуры и

функций ферментов и их активных центровфункций ферментов и их активных центров

Последние 20 лет метод РСА интенсивно Последние 20 лет метод РСА интенсивно развивался благодаря: развивался благодаря:

1.1. улучшению качества очистки белков, улучшению качества очистки белков, 2.2. оптимизации методов кристаллизации белков, оптимизации методов кристаллизации белков, 3.3. улучшению технического оснащения РСА и, в улучшению технического оснащения РСА и, в

связи с глобальной компьютеризацией, связи с глобальной компьютеризацией, внедрению машинной и компьютерной обработки внедрению машинной и компьютерной обработки данных. данных.

На заре использования РСА для кристаллизации На заре использования РСА для кристаллизации требовалось порядка 100 мг белка, на требовалось порядка 100 мг белка, на сегодняшний день требуется не более 10 мг.сегодняшний день требуется не более 10 мг.

Проблемы метода РСАПроблемы метода РСА

Получение необходимого количества анализируемого белка:• получают рекомбинантную молекулу ДНК, • встраивают конструкцию, кодирующую целевой белок, в клетки

E.сoli или бакуловируса, и инициируют направленную экспрессию требуемого белка,

• очищают белок от примесей.

Некоторые белки трудно экспрессировать с помощью Некоторые белки трудно экспрессировать с помощью рекомбинантных молекул, в частности, может возникнуть рекомбинантных молекул, в частности, может возникнуть проблема сборки многосубъединичных белков.проблема сборки многосубъединичных белков.

Можно столкнуться с другой трудностью, в процессе очистки Можно столкнуться с другой трудностью, в процессе очистки целевой белок бывает трудно отделить от примесей без целевой белок бывает трудно отделить от примесей без значительных потерь.значительных потерь.

Многие белки, качественно очищенные, бывает трудно Многие белки, качественно очищенные, бывает трудно закристаллизовать. закристаллизовать.

Выявляемые с помощью РСА молекулярные Выявляемые с помощью РСА молекулярные структуры и соответствующее разрешениеструктуры и соответствующее разрешение

Разрешение, Ǻ Выявляемая структура

5,5 Общая конфигурация молекулы. Спирали в виде

интенсивно рассеивающих лучи палочек

3,5 Полипептидный остов, не четко

3,0 Боковые цепи, не четко

2,5 Разрешение боковых цепей, плоскости пептидной

группы. Расположение атомов определено с точностью +0,4 Ǻ

1,5 Расположение атомов определено с точностью

+0,1 Ǻ

Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза)Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза)

Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) является первым ферментом, для которого У. Стайн и С. Мур в 1960 г. установили полностью первичную структуру.

Уильям Говард СтайнУильям Говард Стайн1911 – 1980, Нью-Йорк, США1911 – 1980, Нью-Йорк, США

биохимикбиохимикНобелевская премия по

химии 1972 г.

Станфорд МурСтанфорд Мур1913, Чикаго - 1982, Нью-Йорк, США1913, Чикаго - 1982, Нью-Йорк, США

биохимикбиохимикНобелевская премия по

химии 1972 г.

Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза)Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза)

На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен

впервые в 1960 г. четко сформулировал представление о

том, что пространственное строение белка определяется его

первичной структурой. Рибонуклеаза гидролизует

межнуклеотидные связи в РНК около пиримидиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированными по 3'-положению. Механизм реакции,

катализируемой рибонуклеазой, расшифрован с помощью методов

РСА, ЯМР и химической модификации.

Кристиан Бемер АнфинсенКристиан Бемер Анфинсен1916, Монессен, США - 1995 1916, Монессен, США - 1995 американскийамериканский биохимикбиохимик

Нобелевская премия по химии 1972 г.

КарбоксипептидазаКарбоксипептидаза

Пространственная структура фермента и его комплекса с

дипептидом Gly-Tyr как с моделью субстрата была установлена с

разрешением 2 Ǻ в 1967 г. При сравнительном анализе структур

фермента и его каталитического прокомплекса с дипептидом Gly-Туг была получена важная информация о строении фермент-субстратного

комплекса. В частности, установлено, что при образовании комплекса

гидроксильная группа Туг248 перемещается на 1,2 нм по

отношению к своему положению в свободном ферменте (т. е. примерно

на 1/3 диаметра молекулы).

Уильям ЛипскомбУильям Липскомб191919, Кливленд19, Кливленд – – 20112011,, Кембридж, Кембридж,

СШАСШАХимикХимик

Нобелевская премия по химии 1972 г.

ХимотрипсинХимотрипсин

Трехмерная структура химотрипсина с разрешением 2 Ǻ была

установлена методом РСА в 1976 г. Первичная структура фермента

установлена Б. Хартли в 1964 г. Результаты кристаллографических

исследований подтвердили предположение, сделанное с помощью необратимых ингибиторов, о том, что

остатки Ser195 и His57 сближены. Следует отметить, что химические

исследования не могли выявить участия Asp102 в функционировании

активного центра, поскольку этот остаток погружен внутрь молекулы. В настоящее время считается, что три

остатка Asp102, His57 и Ser195 образуют систему переноса заряда, которая играет решающую роль в

процессе катализа.

Дэвид Мэрвин БлоуДэвид Мэрвин Блоу 191931, Бирмингем31, Бирмингем – – 20042004,, ЭпплдорЭпплдор

Английский Английский биобиофизикфизик

Томас Артур СтэйтцТомас Артур Стэйтц19401940,, СШАСША

биохимик и биохимик и биофизикбиофизикНобелевская премия по

химии 2009 г. за структуру большой 50Sсубчастицы рибосомы

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I EI E. . colicoli

Первой ДНК-полимеразой, которая была закристаллизована, был

фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli.

Фрагмент Кленова лишен 5’-3’ экзонуклеазного домена ДНК-

полимеразы I, и обладает двумя активностями: ДНК-полимеризующей

и 3’-5’ экзонуклеазной. РСА фрагмента Кленова впервые обнаружил специфическую

архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть

правой руки и состоит из пространственных доменов «ладонь»,

«большой палец», прижимающий праймер-матричный двунитевой

участок, и «пальцы», которые удерживают однонитевую матрицу.

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I EI E. . colicoliАналогичную трехмерную организацию «правой руки» имеют полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы (ревертазы) ВИЧ. РСА позволяет детализировать и модифицировать эту модель применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот. Наиболее консервативна топология домена «ладонь». В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания ДНК и входящего dNTP, основанием которой является домен «ладонь».

алкилирующиеагенты

O6-meG

прямая репарация

УФ-излучениемутагены

окружающей среды

пиримидиновыедимеры

крупные аддукты

репарациянуклеотидов

рентгеновскоеизлучение

двойныеразрывы

репарациядвойных

разрывов ДНК

ошибкирепликации

неправильноеспариваниеоснований

вставки, делеции

репарациянеправильноспаренныхоснований

Механизмы поврежденийМеханизмы повреждений и репарации ДНКи репарации ДНК

спонтанные реакцииэндогенные окислители

активные формы кислорода

апуриновые/апиримидиновые(АР-) сайтыокисленные

дезаминированные иалкилированные основания

однонитевые разрывы

репарацияоснований

Дефекты систем

репарацииДНК

Рак

СтарениеКата

ракта

Прогрессивный

церебральный

паралич

Умственная и иммунная

недостаточность

Синдром Коккейна

Пигментн

ая

ксеродерма

(меланома,

карцинома)

Трихотио-дистрофия

ПоврежденнаяДНК

Остановкаклеточного

цикла

Репарация ДНК

Апоптоз -программируемая

клеточнаясмерть

МутацииРак

Действие используемых в клинике антираковых препаратов и экзогенных факторов (ионизирующая радиация, цисплатина, алкилирующие агенты) основано на повреждении ДНК и нивелируется системами репарации.

Поэтому избирательное ингибирование репарации улучшает терапевтические эффекты.

Системы репарации являются мишенямиСистемы репарации являются мишенямидля создания новых лекарствдля создания новых лекарств

Репарация основанийРепарация оснований

ХДНКгликозилаза

Активные формы кислородаметилирование, дезаминирование

Спонтанный гидролизгликозидной связи

(АР-сайт)

Рентгеновское излучение(одноцепочечный разрыв)

АР-эндонуклеаза 1 (APE1)PNK

Поли(ADP-рибозо)полимераза 1

(PARP1)

XRCC1

XRCC1 Pol

+dGTP +4dNTP

PCNAPol /ε

FEN1

ДНК-лигаза III

ДНК-лигаза I

+ATP +ATP

XR

CC

1 ДНК-лигаза IIIPol Pol

XR

CC

1

X

dGTP

XR

CC

1

ATPРепарация оснований

Первичные дифракционные картины кристаллов РПервичные дифракционные картины кристаллов Рol βol β, , полученные на лабораторном дифрактометре (А) и на полученные на лабораторном дифрактометре (А) и на

станции «Белковая кристаллография» (Б)станции «Белковая кристаллография» (Б)

.

А Б

Кристаллографические исследования выполнены ЛБХФ ИХБФМ СО РАНв рамках междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН на белковой станции ИЯФ СО РАН (А) и на лабораторном дифрактометре НОЦ МДЭБТ НГУ (Б)

Общий вид трехмерных структур комплексовОбщий вид трехмерных структур комплексов ДНК-гликозилаз ДНК-гликозилаз с модельными ДНК-субстратамис модельными ДНК-субстратами

• Lau coauth, Cell, 1998, 95, 249–258.• Bruner coauth, Nature, 2000, 403, 859–866.• Parker coauth,Nature, 2007, 449, 433–437.

Трехмерная структура комплекса Трехмерная структура комплекса АРЕ1АРЕ1 человека с человека с продуктом катализируемой этим ферментом реакциипродуктом катализируемой этим ферментом реакции

Показаны две проекции модели (Mol coauth, Nature, 2000, 403, 451–456). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием АРЕ1.

Трехмерная структура комплекса Трехмерная структура комплекса

ДНК-полимеразы βДНК-полимеразы β человека с субстратами человека с субстратами

Приведена структура комплекса с субстратами: дезоксицитидин-5′-трифосфатом и двуцепочечной ДНК, содержащей в одной из цепей однонуклеотидную брешь (Sawaya coauth, Biochemistry, 1997, 36, 11205–11215 ). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием ДНК-полимеразы β (Pol β).

Структура комплексов восстановленной (А) и Структура комплексов восстановленной (А) и

окисленной (Б) форм фрагмента окисленной (Б) форм фрагмента XRCCXRCC1 с 1 с ДНК-полимеразой βДНК-полимеразой β ( (PolPol β) β)

Показаны остатки цистеина, ответственные за структурные перестройки разных форм XRCC1, и электростатический потенциал на поверхности соответствующих форм белка (Cuneo and London, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 6805–6810).

Трехмерные структуры флэп-эндонуклеазы 1 (Трехмерные структуры флэп-эндонуклеазы 1 (FENFEN11) и ) и

ДНК-лигазы ДНК-лигазы II в комплексах с ДНК-субстратами в комплексах с ДНК-субстратами

А. Chapados coauth, Cell, 2004, 116, 39–50.Б. Pascal coauth, Nature, 2004, 432, 473–478.

Трехмерная структура каталитического домена Трехмерная структура каталитического домена PARPPARP11

Iwashita coauth, FEBS Lett., 2005, 579, 1389–1393.

Строение малой субчастицы рибосомыСтроение малой субчастицы рибосомы по по данным РСАданным РСА

Полипептидные цепи рибосомных белков выделены разными цветами, полинуклеотидные цепи рРНК показаны серым цветом (Yusupov coauth, Science, 2001, 292, 883–896).