Миронова Жанна АлександровнаМиронова Жанна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫМОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИУ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙУ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

Санкт-Петербургский Государственный

Медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Кафедра госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого

Научные консультантыНаучные консультантыпрофессор Трофимов В.И.

чл.-корр. РАН, профессор Дубина М.В.

АктуальностьАктуальность

Несмотря на выявление ключевых механизмов Несмотря на выявление ключевых механизмов развития БА, успехи фармакотерапии, ТРБА развития БА, успехи фармакотерапии, ТРБА остается наименее изученной, и ситуация с остается наименее изученной, и ситуация с контролем БА в мире и РФ остается нерешеннойконтролем БА в мире и РФ остается нерешенной

«…отличительным признаком ТРБА «…отличительным признаком ТРБА

является сложный контроль заболевания в является сложный контроль заболевания в связи со сниженной чувствительностью к связи со сниженной чувствительностью к терапии…»терапии…» ((Chung K.F., 2011)Chung K.F., 2011)

Цель исследованияЦель исследования

Оценить значение Оценить значение

фармакогенетических факторов в терапиифармакогенетических факторов в терапии

глюкокортикостероидами и бета2-агонистамиглюкокортикостероидами и бета2-агонистами

у больных терапевтически резистентной БА у больных терапевтически резистентной БА

и разработать критерии прогнозирования и разработать критерии прогнозирования

терапевтической резистентности терапевтической резистентности

с учетом генетических маркеровс учетом генетических маркеров

Задачи исследования Задачи исследования 1. Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена

множественной лекарственной устойчивости (MDR1); Gly16Arg и

Gln27Glu гена бета2-адренорецептора (ADRB2); Ile559Asn, Val729Ile,

Ile747Met, Asn363Ser, Arg23Lys гена глюкокортикоидного рецептора

(NR3C1); С–589Т гена интерлейкина 4 (IL4) и Arg130Gln (IL13) у

больных ТРБА и в контрольной группе.

2. Определить уровень экспрессии изоформ ГРα и ГРβ, кодируемых геном NR3C1 у пациентов с БА до и после терапии ГКС

3. Выявить вклад всех вышеперечисленных генетических детерминант в формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также их ассоциацию с ответом на терапию глюкокортикостероидами

4. Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярно-генетического исследования, для выявления маркерного профиля терапевтической резистентности у больных БА

Общеклинические методы

• Анамнез, физикальное исследование

Лабораторная диагностика

• Клинический и биохимический анализ крови

• Цитологическое исследование мокроты

• Гормональное исследование

• Иммунологические исследования (IL4 и IL13 сыворотке крови (ИФА)

Функциональные показатели

• Спирография - исследование ФВД

Статистические методы (Statistica 6)

Методы исследованияМетоды исследования

Методы молекулярно-генетического исследованияМетоды молекулярно-генетического исследования

ПЦР и рестрикционный анализ (ПЦР-ПДРФ)

ПЦР в режиме реального времени

(real-time ПЦР)

РНК

Периферическая кровь

кДНК

ДНК

Производство ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия

Амплификатор ABI 7000 («Applied Biosystems», США) Реагенты производства «Синтол», РоссияМетод TaqMan Эндогенный контроль: G-белок GNB2L1

Стабилизация внутриклеточной РНК, реагент «Среда-РНК»

Выделение РНК, набор реагентов «РИБО-золь-В»

Обратная транскрипция, набор реагентов «РЕВЕРТА-L»

Обследованные лицаОбследованные лица

БАБА (n=122)(n=122)

((GINA 2008GINA 2008))

Группа контроляГруппа контроля ((nn=103)=103)

• возраст от 20 до 75 лет • отсутствие курения в анамнезе

• без бронхолегочной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии

• с неотягощенной наследственностьюпо аллергическим заболеваниям

Гендерный состав больных БАГендерный состав больных БА

Мужчины30,3%

n=37

Женщины69,7%

n=85

Дизайн:Дизайн:случай- контрольслучай- контроль

• жители Северо-Западного региона• славянской национальности• не связанные узами родства

Терапевтически резистентная БА (Терапевтически резистентная БА (ATS 2000ATS 2000))

Большие критерииБольшие критерии1. Потребность в применении ТГКС > 50% времени от длительности БА

2. Необходимость использования высоких доз ИГКС (беклометазон ≥1260 мкг/сутки, будесонид >1200 мкг/сутки, триамсинолон и флунизолид >2000 мкг/сутки, флутиказон пропионат >880 мкг/сутки)

Малые критерииМалые критерии1. Ежедневная потребность в длительнодействующих β-агонистах (ДДБА),

теофиллине, антилейкотриеновах препаратах

2. Ежедневные симптомы астмы, требующие применения короткодействующих β-агонистов (КДБА)

3. Сохраняющаяся бронхообструкция ( ОФВ1< 80%, дневная вариабельность ПСВ > 20% )

4. ≥ 1 вызова скорой помощи за последний год

5. ≥ 3 курсов терапии СГКС за последний год

6. Быстрое обострение БА при уменьшении на ≤ 25% дозы ИГКС или ТГКС

7. Жизнеугрожающие события, связанные с астмой в прошлом

Распределение больных БА в зависимости от степени Распределение больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания и терапевтической тяжести заболевания и терапевтической

резистентностирезистентности

БАБА

ТРБАТРБА ТЧБАТЧБА

12%(n=15)

45% (n=55)

43%(n=52)

83%(n=38)

ТРБА38% (n=46)ТЧБА

62% (n=76)

17%(n=8) 22%

(n=17)

58%(n=44) 20%

(n=15)

ТБА

СБА

ТЧБА

ЛБА

ТРБА

ГенГен множественной лекарственной устойчивостимножественной лекарственной устойчивости

Ген MDR1

транспортныйбелок

Pgp-170

Эффлюкслипофильных

соединений

Апоптоз

Изменение pH внутри клетки

С3435Т MDR1

%

%

p=0,007p=0,049

p=0,015

p=0,001

p=0,007p=0,008p=0,004p=0,005

Распределение генотипа Распределение генотипа 3435СС3435СС по гену по гену MDR1MDR1 у больных ТРБА и ТЧБАу больных ТРБА и ТЧБА

Распределение генотипа Распределение генотипа 3435ТТ3435ТТ по гену по гену MDR1MDR1 у больных ТРБА и ТЧБАу больных ТРБА и ТЧБА

Влияние генотипа 3435СС по гену Влияние генотипа 3435СС по гену MDR1MDR1 на риск развития БАна риск развития БА

0 5 10 15 20 25

ТГКС>20мг/сут

ТРБА

ТБА

БА

OR=20,89 (95% CI 5,10–85,53)

OR=OR=6,126,12 (95% CI 2,42–15,48)

OR=OR=3,923,92 (95% CI 1,74 – 8,79)

OR=OR=5,225,22 (95% CI 2,11–12,92)

ТРБА

ADRB2ADRB2 – – ген бета2-адренорецептораген бета2-адренорецептора

Ген ADRB2

2-адренорецептор

Ассоциация аллельных вариантов Ассоциация аллельных вариантов Gly16ArgGly16Arg и и Gln27GluGln27Glu по гену по гену ADRB2ADRB2 с ОФВ с ОФВ11

у больных ТРБА и ТЧБАу больных ТРБА и ТЧБА

ТРБА

ТЧБА

47,40

76,22

57,81

75,11

52,77

77,02

0

20

40

60

80

ОФ

В1

, %

16GlyGly 16GlyArg 16ArgArg

56,96

71,68

51,97

78,47

52,18

76,57

0

20

40

60

80

ОФ

В1

, %

27GlnGln 27GlnGlu 27GluGlu

p<0,001 p=0,004

p<0,001 p=0,020

Распределение аллельных вариантов Распределение аллельных вариантов Arg130GlnArg130Gln гена гена IL13IL13 у больных ТРБА и ТЧБА у больных ТРБА и ТЧБА

0

10

20

30

40

50

60

ArgArg ArgGln GlnGln

ТРБА

ТЧБАКонтроль

39,1 38,2

57,352,2

51,3

38,8 8,7 10,5

3,9

р=0,009

р=0,031Частоты аллеля 130Gln гена IL13

0

0,1

0,2

0,3

0,4

ТРБ

А

ТЧБ

А

Конт

роль

p<0,050p<0,050

0,34

8

0,23

3

0,36

2

NR3C1NR3C1 – – ген глюкокортикоидного рецептораген глюкокортикоидного рецептора

9 экзонов

Изоформы ГР:

Р γ А α

Альтернативный сплайсинг

Экспрессия изоформ глюкокортикоидного рецептораЭкспрессия изоформ глюкокортикоидного рецептора

у больных ЛБА и СБА в зависимости от терапии ГКСу больных ЛБА и СБА в зависимости от терапии ГКС

0

20

40

60

80

100

120

Эксп

ресс

ия Г

Р-ал

ьфа,

ед.

ЛБА СБА

0

5

10

15

20

25

30

35

Экс

пр

есси

я Г

Р-б

ета,

ед

.

ЛБА СБА

Экспрессия изоформы Экспрессия изоформы

ГРГРααЭкспрессия изоформы Экспрессия изоформы

ГРГР

4,2 8,81,3

105,431,8

20,6

11,9 1,5

До лечения ГКС

После лечения ГКС

Молекулярно-генетические и клинические аспекты ТРБА

ГКТ:Длительная ГКТИГКС>1200 мкг

Высокие дозы ТГКС

ГКС-ассоциированные осложнения

IL4 -589T

Фатальные осложнения

(астматический статус)

Нейтрофильное воспаление

MDR13435C

кортизола

↑ потребности в КДБА

↑ экспрессии ГР

NR3C1 363SN

Отягощенная наследственность

ДН

ОФВ1, МОС75,SGaw

IL13130Gln

ADRB216Gly

ADRB227Glu

ТРБА

Фенотип ТРБАФенотип ТРБА

НейтрофильноевоспалениеОжирение

ХОБЛ

ГЭРБ

ИБС

ГБ

Курение

Рестриктивные изменения

Частично обратимаябронхообструкция

Поздняя манифестация БА

Старший возраст

Женский пол

Плохой контрользаболевания

ТРБАТРБА

Молекулярно-генетические механизмы развития Молекулярно-генетические механизмы развития ТРБАТРБА

ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯРЕЗИСТЕНТНОСТЬ

Факторы внешней среды(инфекция, аллергены, поллютанты)

Персистенциявоспаления

NR3C1

Лекарственные мишени: чувствительности к

глюкокортикостероидам

мРНК ГР α/

Алгоритм диагностики ТРБААлгоритм диагностики ТРБА

Генетическое тестированиеПЦР

Ген MDR1 (3435C)Ген IL13 (130Gln)

Ген (-589Т)Ген ADRB2 (16GlyArg)Ген ADRB2 (27GluGlu)

ПЦР в реальном времениГен NR3C1 (изоформы ГР α/β)

Трудноконтролируемая БАДонозологическая диагностика БА

Персонифицированная терапия ТРБА

ГЕНОТИП

Стандартное клинико-лабораторное

исследование

Фенотип ТРБА

БлагодарюБлагодарю

за за внимание!внимание!