Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров

Лаврик О.И.Лаврик О.И.

N

C H 3

O

НГУ-2012НГУ-2012

6. Многосубстратные ферментативные реакции. 6. Многосубстратные ферментативные реакции.

Уравнения, описывающие эти реакции. Уравнения, описывающие эти реакции. Определение параметров в стационарном Определение параметров в стационарном

режиме. Порядок присоединения субстратов. режиме. Порядок присоединения субстратов.

Методы его определенияМетоды его определения

Простейший случай многосубстратной Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратамиреакции – реакция с двумя субстратами

Двусубстратная ОдносубстратнаяДвусубстратная Односубстратная реакция реакцияреакция реакция

SS11>>S>>S22

Должен быть известен порядок присоединения субстратов

Простейший случай многосубстратной Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратамиреакции – реакция с двумя субстратами

1.1. Последовательное связывание Последовательное связывание субстратов с образованием тройного субстратов с образованием тройного комплекса:комплекса:

Простейший случай многосубстратной Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратамиреакции – реакция с двумя субстратами

0dt

]d[ES1

Для схемы с последовательным связыванием субстратов уравнение скорости реакции:

v=k3[ES1S2] Для нахождения [ES1S2] в систему уравнений добавляется уравнение материального баланса и условия квазистационарности:E0 = [E] + [ES1] + [ES1S2]

0dt

]Sd[ES 21

Простейший случай многосубстратной Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратамиреакции – реакция с двумя субстратами

DE = k-1k-2+k2S2k3+k-1k3 ; ;

DES1 = k1S1k3+k1S1k-2

DES1S2 = k1S1k2S2

v = =211

21

SESESE

SES03

DDD

DEk

2211

32-1-

22

32-

11

3

03

SkSk

)k(kk

Sk

)k(k

Sk

k1

Ek

Для определения параметров реакции из экспериментальных данных это уравнение можно линеаризовать :

22113

32-1-

223

32-

113

0

SkSkk

)k(kk

Skk

)k(k

Sk

1

k

1

v

E

21

12

2

2

1

10 SSSS

=

Определение величин коэффициентов Определение величин коэффициентов φφii

Накопление продукта реакции во времени при различных концентрациях S1 и S2=const, или наоборот, при различных концентрациях

S2 и S1=const.

Определение величин коэффициентов Определение величин коэффициентов φφii

a=φ0+φ2/S2 b=φ1+φ12/S2

Простейший случай многосубстратной Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратамиреакции – реакция с двумя субстратами

2.2. ПроизвольныйПроизвольный порядок порядок присоединения двух субстратов в процессе присоединения двух субстратов в процессе образования тройного комплекса: образования тройного комплекса:

2121

21

SESESESE

SES03

DDDD

DEk

v =

где DES1S2 – определитель узла графа, в котором происходит

образование продуктов реакции.

Методы определения порядка Методы определения порядка присоединения субстратовприсоединения субстратов

• Гель-фильтрацияГель-фильтрация. • Метод задержки в гелеМетод задержки в геле (gel retardation, или

electrophoretic mobility shift assay – EMSA).• Тушение флуоресценцииТушение флуоресценции. Можно следить за

изменением интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента, происходящим при комплексообразовании. Интенсивность флуоресценции при образовании комплекса с ферментом может изменяться и для субстрата. В этом случае можно использовать аналог субстрата, имеющий флуоресцентную метку.

Использование аналогов субстратов для Использование аналогов субстратов для определения порядка присоединения определения порядка присоединения

субстратовсубстратов

• Аналоги субстратов выбираются таким Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного каталитических стадиях ферментативного процесса.процесса.

• В случае аналога субстрата кинетические В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции характеристики ферментативной реакции ((KKMM, , kkcatcat) могут измениться, для тех стадий, ) могут измениться, для тех стадий,

в которых принимает участие данный в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).субстрат (его аналоги).

Определение порядка присоединения субстратовОпределение порядка присоединения субстратов

Для исследования порядка присоединения субстратов Для исследования порядка присоединения субстратов в реакции аминоацилирования, катализируемой в реакции аминоацилирования, катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованыаминоацил-тРНК-синтетазами, были использованыфторированные аналоги аминокислот, например:фторированные аналоги аминокислот, например:

Фенилаланин Пара-фторфенилаланин

Метод конкурентных ингибиторовМетод конкурентных ингибиторов

Реакция аминоацилирования тРНК с Реакция аминоацилирования тРНК с образованием фенилаланил-тРНК, образованием фенилаланил-тРНК, катализируемая фенилаланил-тРНК-катализируемая фенилаланил-тРНК-синтетазой)синтетазой)::

E + АТР + Phe Е-Phe-АМР + ррi

Е-Phe-АМР + тРНКPhe Е + Phe-тРНКPhe + АМР

Метод конкурентных ингибиторовМетод конкурентных ингибиторов

• Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падаетферменту резко падает

• Фенильная группа участвует в узнавании субстрата.Фенильная группа участвует в узнавании субстрата.• Фенилаланинол (Фенилаланинол (PhePhe--olol) – конкурентный ингибитор ) – конкурентный ингибитор

фенилаланина в реакции аминоацилирования.фенилаланина в реакции аминоацилирования.

Kd (Phe)=10-6M Kd (Phe-ol)=10-5M

Фенилаланин Фенилаланинол

Метод конкурентных ингибиторовМетод конкурентных ингибиторов

1. Ингибитор образует комплекс с ферментом

2. Ингибитор образует

тройной комплекс ES1I

Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов.