26
Физическая химия биополимеров Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. Лаврик О.И. N C H 3 O НГУ-2012 НГУ-2012

Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

  • Upload
    avak

  • View
    51

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012. 5. Аллостерические ферменты. Функциональные димеры, механизм их функционирования. Аллостерические ферменты. Аллостерические эффекторы. Положительные Аллостерические активаторы. Отрицательные Аллостерические ингибиторы. - PowerPoint PPT Presentation

Citation preview

Page 1: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров

Лаврик О.И.Лаврик О.И.

N

C H 3

O

НГУ-2012НГУ-2012

Page 2: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

5. Аллостерические ферменты. 5. Аллостерические ферменты.

Функциональные димеры, механизм их Функциональные димеры, механизм их функционированияфункционирования

Page 3: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Аллостерические ферментыАллостерические ферменты

Page 4: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Аллостерическиеэффекторы

ОтрицательныеАллостерические Аллостерические

ингибиторыингибиторы

Снижают активность фермента

ПоложительныеАллостерические Аллостерические

активаторыактиваторы

Повышают активность фермента

ГомотропнаяГомотропная регуляция – аллостерическая регуляция, когда субстрат

может выступать в качестве эффектора (эффектор и субстрат - одно и то же вещество).

Page 5: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)

Page 6: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза)Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза)

АКТ-аза – фермент биосинтеза пиримидинов, обеспечивает образование карбамоиласпартата – одного из промежуточных продуктов синтеза СТР.

6 каталитических субъединиц(34 кДа, 2 тримера)

Карбамоил-фосфат

L-аспартат карбамоиласпартат

6 регуляторных субъединиц(16 кДа, 3 димера)

Бактериальная АКТ-аза E. coli

Page 7: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Работа регуляторных субъединиц АКТ-азыРабота регуляторных субъединиц АКТ-азы

Протекание реакции во времени приводит к появлению СTP – конечного продукта цепи. По мере накопления СTP и его связывания с ферментом сродство к субстратам снижается и фермент включается в работу только при гораздо больших концентрациях субстрата. АТР конкурирует с СTP и может устранять его ингибирующее действие. Регуляция является обратимой и при изменении в клетке концентрации АТР или СTP скорость работы фермента изменяется. Таким образом АКТ-аза обеспечивает постоянное присутствие в клетке нужных количеств СТР.

Регуляторные субъединицыРегуляторные субъединицы

СTPСTPАллостерическийАллостерический

ингибиторингибитор

АТРАТРАллостерический Аллостерический

активаторактиватор

Page 8: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

NH CH

SH

C

O

O + ClHg COOH-HCl Hg COOH

CH

S

р-ClHg-бензоатДве –SH группы остатков Cysна каждую регуляторную

субъединицу

Разделение каталитических и регуляторных субъединиц аспартат

карбамоил-трансферазы (АКТ-азы) на анионообменнике в градиенте

соли KCl. Первый пик (1) – каталитические субъединицы, второй

пик (2) – регуляторные субъединицы.

Номер фракцииНомер фракции

Page 9: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

S-образная кривая зависимости скорости S-образная кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстратареакции от концентрации субстрата

Арчибальд ХиллАрчибальд Хилл1886-19771886-1977

Английский физиологАнглийский физиологНобелевская премия по физиологии и медицине

1922 г.

График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в виде S-образной кривой на примере АКТ-азы: без эффектора, с АТР, с СTP. Субстрат – аспартат.

Впервые S-образные функции для насыщения были получены в 1909 году (А. Хилл)

Page 10: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Кооперативное связываниеКооперативное связывание

Аллостерические ферменты обладают

свойством кооперативности: взаимодействие эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и к изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента.

Page 11: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая кооперативность связывания лиганда ферментомкооперативность связывания лиганда ферментом

hh0,5

h

[L][L]

[L]Y

h0

h0,5

h0

max ][S[S]

][SVv

Y – степень насыщения, [L] – равновесная концентрация лиганда и [L]0,5 – равновесная концентрация лиганда, при которой Y=0,5 от максимального насыщения.

Vmax – максимальная скорость при S0→∞, [S]0,5 – концентрация субстрата при половине максимальной скорости, которая входит в уравнение вместо константы Михаэлиса KМ.

Page 12: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Графическое определение Графическое определение коэффициента Хиллакоэффициента Хилла

lg(v/( Vmax-v)) = h lg[S0] – h lg[S]0,5

Page 13: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

• Для изостерических ферментов, у которых кооперативного взаимодействия между активными центрами нет, то есть сродство фермента к субстрату не зависит от уже присоединенных молекул субстрата, h=1h=1.

• Положительная кооперативность (hh>1>1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы субстрата к активному центру фермента увеличивает сродство к субстрату остальных активных центров.S-образные кривые зависимости скорости реакции от концентрации субстрата характерны для положительной кооперативности. Связывание кислорода с гемоглобином, имеющим 4 центра связи, характеризуется параметром Хилла h=2,9.

• Отрицательная кооперативность (hh<1<1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы лиганда к активному центру фермента уменьшает сродство к лиганду остальных активных центров.

Page 14: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Конформационные состояния и возможные переходы между Конформационные состояния и возможные переходы между ними при аллостерических взаимодействиях протомеров ними при аллостерических взаимодействиях протомеров

тетрамерного белкатетрамерного белка

Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния, верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния, для которых переход из одного в другое индуцируется лигандомдля которых переход из одного в другое индуцируется лигандом

Page 15: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

АКТ-аза:АКТ-аза: субстрат и эффекторы влияют на равновесие между Т- и R-формами и тем самым на сигмоидность кривой. С возрастанием концентрации аспартата равновесие смещается к R-форме. АТР стабилизирует R-состояние путем связывания с регуляторной субъединицей. Напротив, присоединение СTP содействует переходу в Т-состояние.

Белковый олигомер может находиться в одном из двух состояний:

Т-состоянии (от англ. tense – напряженное) и R-состоянии (от англ. relaxed – расслабленное).

Page 16: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Функциональные димерыФункциональные димеры

Page 17: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Примеры структур функциональных димеровПримеры структур функциональных димеров

α2 α4 α2β2α2 α4 α2β2

Page 18: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Ассоциация мономеров позволяет уменьшить объем гидрофобной поверхности белка, и это более экономично провести через ассоциацию мономеров, чем путем увеличения молекулярного веса белка в пересчете на активный центр.

Это позволяет организовать в олигомер субъединицы различной химической природы, на которых в случае регуляторных ферментов можно расположить аллостерически активные центры и регуляторные участки, и тем самым разделить их в пространстве.

Жак Люсьен МоноЖак Люсьен Моно1910, Париж – 1976, Канн1910, Париж – 1976, Каннфранцузский биохимикфранцузский биохимик

и микробиологи микробиологНобелевская премия по физиологии и медицине

1965 г.

Page 19: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской кинетике и проявляет свойство отрицательной кинетике и проявляет свойство отрицательной кооперативности при связывании субстратовкооперативности при связывании субстратов

Возможные причины ухудшения связывания второго Возможные причины ухудшения связывания второго субстрата для фермента, состоящего из двух субстрата для фермента, состоящего из двух субъединиц:субъединиц:

1.1. Активные центры, расположенные на субъединицах, Активные центры, расположенные на субъединицах, изначально неравноценны.изначально неравноценны.

2.2. Центры изначально равноценны, но их Центры изначально равноценны, но их неэквивалентность возникает в результате неэквивалентность возникает в результате гетерологической укладки субъединиц.гетерологической укладки субъединиц.

3.3. Один из центров экранирован, сродство фермента ко Один из центров экранирован, сродство фермента ко второму субстрату снижается по стерическим второму субстрату снижается по стерическим причинам. причинам.

4.4. Изменение структуры второго центра приводит к Изменение структуры второго центра приводит к уменьшению сродства фермента к субстрату в уменьшению сродства фермента к субстрату в результате конформационных взаимодействий результате конформационных взаимодействий субъединиц.субъединиц.

Page 20: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Механизм реакционной способности половины Механизм реакционной способности половины активных центров (активных центров (halfhalf--ofof--thethe--sites reactivitysites reactivity))

Отрицательная кооперативность для ферментов, подчиняющихся Михаэлисовской кинетике, может проявляться не только при связывании субстратов, но и в процессе формирования продуктов реакции.

При механизме реакционной способности половины активных центров

только один активный центр функционирует в единицу времени

и продукт формируется на 1 центре фермента.

Page 21: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

•Димер с молекулярным весом 94 кДа. •Гидролаза, дефосфорилирующая многие типы молекул, например, нуклеотидов, белков и алкалоидов. •Проявляет наибольшую активность в щелочной среде. •На каждой субъединице имеет три центра связывания двухвалентных металлов Zn2+, а также Mg2+, Co2+, Cd2+ и др., из которых два являются прочно связывающими.

E + ROPO32- E~O-PO3

2- + ROH E + HPO42-

Page 22: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

Фосфорилирование гидроксильной группы остатка серина происходит как при взаимодействии с субстратом, так и с продуктом реакции. Нековалентное связывание ортофосфата с Zn2+ идет по двум центрам фосфатазы. Соответствующие константы диссоциации отличаются на порядок, что обусловлено выраженной отрицательной отрицательной кооперативностью связываниякооперативностью связывания.

Имеет ли место отрицательная кооперативность при отрицательная кооперативность при

образовании ковалентных производныхобразовании ковалентных производных?

Page 23: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

Отрицательная кооперативность была обнаружена в кислых рН, когда ковалентные производные устойчивы. При фосфорилировании второго центра концентрацию [32Р]-ортофосфата повышали:– при рН 4,2 в 20-40 раз, – при рН 5 на три порядка.

Фосфорилирование активных центров Фосфорилирование активных центров ZnZn2+2+ препаратов фосфатазыпрепаратов фосфатазы

При щелочном рН, которое оптимально для катализа,обнаруживается фосфорилирование фермента строго по одному центру.

Page 24: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

*Е и **Е указывают на внутри и межсубъединичные взаимодействия соответственно. *E-S – нековалентное присоединение субстрата, Е-Р или * Е-Р – ковалентное фосфорилирование. Межсубъединичные взаимодействия необходимы как для фосфорилирования (*Е), так и для дефосфорилирования (**Е).

Внутрисубъединичная кооперативность обуславливает фосфорилирование,

а межсубъединичная – дефосфорилирование.

Page 25: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

Реакция может быть представлена в виде следующей схемы (графа):

Для этой схемы:

S

K1

V

M

max

42

1

1-4

3

33-2

M kk

kkkk

)k(kkK

V =V =

042

42max E

kk

kkV

Page 26: Физическая химия биополимеров Лаврик О.И

• В случае функционального димера на 1 моль фермента может приходиться 2 или 1,5 моль субстрата. Связывание менее двух молей субстрата на моль фермента можно наблюдать, когда вторая молекула субстрата связывается с ферментом с меньшим сродством. Действующими являются оба активных центра, но активность второго во время функционирования первого подавляется.

• При связывании двух субстратов, как правило, Kd(2) >> Kd(1): для первого субстрата Kd(1)=[E][S]/[ES], для второго субстрата Kd(2)=[E][ЕS]/[ES2].

Функциональная димерность фермента нужна в основном Функциональная димерность фермента нужна в основном для повышения числа оборотов ферментативной реакции, для повышения числа оборотов ферментативной реакции, то есть для повышения каталитической активности то есть для повышения каталитической активности фермента.фермента.