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实验三十 碳纳米管组装血红蛋白的直接电化学 和对过氧化氢的电催化研究. 一、研究背景. 1 、血红蛋白( Hemoglobin, Hb ). 由两条 α 和两条 β 多肽链构成的四聚体. 分子结构庞大,电活性中心不易暴露. 在电极表面的吸附造成蛋白构象变化和丧失活性 以及电极表面的钝化. 在一般固体电极的电子传递速率很低,电子传递受阻. 电子传递媒介体、促进剂、特殊电极材料. 加速 Hb 的电子传递. 2 、血红蛋白直接电子转移的意义: 获得有关蛋白质或酶的热力学和动力学性质等重要信息。 - PowerPoint PPT Presentation
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分子结构庞大,电活性中心不易暴露 分子结构庞大,电活性中心不易暴露
在电极表面的吸附造成蛋白构象变化和丧失活性以及电极表面的钝化
在电极表面的吸附造成蛋白构象变化和丧失活性以及电极表面的钝化
在一般固体电极的电子传递速率很低,电子传递受阻在一般固体电极的电子传递速率很低,电子传递受阻
电子传递媒介体、促进剂、特殊电极材料电子传递媒介体、促进剂、特殊电极材料
加速加速 HbHb 的电子传递的电子传递
33 、血红蛋白结构类似于辣根过氧化物酶,有很高的类、血红蛋白结构类似于辣根过氧化物酶,有很高的类似过氧化物酶的催化活性。似过氧化物酶的催化活性。
22 、血红蛋白直接电子转移的意义:、血红蛋白直接电子转移的意义:
获得有关蛋白质或酶的热力学和动力学性质等重要信息。获得有关蛋白质或酶的热力学和动力学性质等重要信息。
HbHb 结构已知、价廉,被选作探讨生物大分子电化学行为的结构已知、价廉,被选作探讨生物大分子电化学行为的理想模型,用于开发新型生物传感器和生物反应器。理想模型,用于开发新型生物传感器和生物反应器。
了解其在生命体内的电子转移机理和生理作用机制。了解其在生命体内的电子转移机理和生理作用机制。
二、实验目的 二、实验目的 11 .了解.了解模拟生物膜 Hb-MWNT-Nafion 的制备方法的制备方法
2.2. 实现血红蛋白 (Hb) 直接电子传递
22 ..学习 Hb-MWNT-Nafion 膜修饰玻碳电极对过氧
化氢的电催化行为和催化机理
44 .掌握.掌握测定血红蛋白催化过氧化氢的米氏常数的测
定方法
将 Hb 直接吸附固定在经羧基化处理的多壁碳纳米管( MWNT )和聚四氟乙烯( Nafion )薄膜中
Hb 在一般固体电极的电子传递速率很低,电子传递受阻Hb 在一般固体电极的电子传递速率很低,电子传递受阻
三、实验原理三、实验原理
实现 Hb 的直接电子转移
1 、 Hb 的直接电子转移
22 、血红蛋白对、血红蛋白对 HH22OO22 的催化的催化
2Fe2Fe2+2+ (( ferroferro ) ) + H+ H22OO22 → 2Fe → 2Fe3+3+ (( ferroferro ) ) + +
2OH2OH--
FeFe3+ 3+ (( ferroferro )) + e → + e → FeFe2+ 2+ (( ferroferro )) ferro-ferro- 卟啉卟啉
3 、米氏常数的测定 米氏常数 (Km)
等于酶促反应达到其最大速率一半时的底物浓度 [S]
米氏常数 (Km)
等于酶促反应达到其最大速率一半时的底物浓度 [S]
表示酶和底物之间的亲和能力, Km 值越大,亲和能力越弱 表示酶和底物之间的亲和能力, Km 值越大,亲和能力越弱
稳态条件下,类似于酶促反应的电催化过程,根据Lineweaver-Burk 方程可得 稳态条件下,类似于酶促反应的电催化过程,根据Lineweaver-Burk 方程可得
1 1
[ ]
1m
m mi S
K
i i 以 1/i~1/[S] 作图,利用斜率和
截距可以计算出米氏常数以 1/i~1/[S] 作图,利用斜率和截距可以计算出米氏常数
1 、玻碳电极的预处理和循环伏安表征
预处理:玻碳电极用 0.05μm 的 Al2O3 粉抛光成镜面, 依次用无水乙醇及蒸溜水超声洗净,晾干。
预处理:玻碳电极用 0.05μm 的 Al2O3 粉抛光成镜面, 依次用无水乙醇及蒸溜水超声洗净,晾干。
循环伏安表征 循环伏安表征
电解质: 1.0mM K3Fe(CN)6
0.1M KCl 混合液(通氮除氧 15min 以上)工作电极:玻碳电极参比电极:饱和甘汞电极对电极:铂丝电极
扫描速率: 100 mV/s
电位范围: +0.6 ~ −0.20 V
方法:线性扫描法扫描方式:循环灵敏度: 3
要求:峰峰距 ΔEp,<80mV
扫描速率: 100 mV/s
电位范围: +0.6 ~ −0.20 V
方法:线性扫描法扫描方式:循环灵敏度: 3
要求:峰峰距 ΔEp,<80mV
四、实验步骤四、实验步骤
2 、纳米组装血红蛋白修饰电极的制备
0.5mg 羧基化的 MWNT 、4mg Hb 中加入 500μL 水以溶解 Hb ,
100μL 0.5%Nafion 溶液,再加入 500 μL
无水乙醇,超声 1h 。(由老师完成由老师完成)
10μL 分散液滴涂于电极表面,晾干,得 Hb-MWNT-GCE 。
超声分散 超声分散
不加 MWNT 以相似方法制得 Hb-GCE。Hb-GCE 为对照电极(对照电极每大组每种各 1支)
不加 MWNT 以相似方法制得 Hb-GCE。Hb-GCE 为对照电极(对照电极每大组每种各 1支)
3 、可溶性(即羧基化的)多壁碳纳米管的制备及表征
20mg MWNT
30mL 30% HNO3
170 4h ℃170 4h ℃
冷却至室温 冷却至室温
1000~2000 rpm
离心 3min
去离子水洗涤到pH 值 5~6
110℃ 烘箱干燥 1h 。(由老师完成)红外灯下恒重
红外表征 ,与未处理的 MWNT 对照。
在电解池中放入 25.00mL (或 10.00mL ) 0.1M pH=7.0 的 磷酸缓冲溶液,通氮除氧 15min 以上。 分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极,为工作电极, 记录循环伏安曲线。 观察底液中是否有氧化还原峰
参数:扫描速率: 100 mV/s电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法扫描方式:循环灵敏度: 3
在电解池中放入 25.00mL (或 10.00mL ) 0.1M pH=7.0 的 磷酸缓冲溶液,通氮除氧 15min 以上。 分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极,为工作电极, 记录循环伏安曲线。 观察底液中是否有氧化还原峰
参数:扫描速率: 100 mV/s电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法扫描方式:循环灵敏度: 3
44 、血红蛋白的直接电化学、血红蛋白的直接电化学
加入 25 μL 1mol/L H2O2 溶液 ,
使电解池中 H2O2 的浓度为 1.0 mmol/L 。
分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极,为工作电极, 记录循环伏安曲线。 观察氧化峰和还原峰哪个更大。参数:(扫描速率: 100 mV/s 电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法 扫描方式:循环 灵敏度: 3 )
分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE
为工作电极,为工作电极,记录阴极线性扫描伏安曲线。测出阴极峰电流 ipc ,比较 3 条曲线 ipc 的大小。参数:(扫描速率: 100 mV/s 电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法 扫描方式:单向 灵敏度: 3 )
加入 25 μL 1mol/L H2O2 溶液 ,
使电解池中 H2O2 的浓度为 1.0 mmol/L 。
分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极,为工作电极, 记录循环伏安曲线。 观察氧化峰和还原峰哪个更大。参数:(扫描速率: 100 mV/s 电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法 扫描方式:循环 灵敏度: 3 )
分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE
为工作电极,为工作电极,记录阴极线性扫描伏安曲线。测出阴极峰电流 ipc ,比较 3 条曲线 ipc 的大小。参数:(扫描速率: 100 mV/s 电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法 扫描方式:单向 灵敏度: 3 )
5 、过氧化氢的催化
6 、米氏常数的测定 在电解池中加入 25.00mL 0.1M pH=7.0 的磷酸缓冲溶液, 通氮除氧 15min 以上。 以以 Hb-MWNT-GCE 为工作电极,依次依次加入 25 μL
1mol/L H2O2 溶液,使电解池中 H2O2 的浓度分别为 0 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 6.0 、 7.0 、 8.0 、 9.0 、 10.0 mmol/L , 每加一次分别记录阴极线性扫描伏安曲线,测出阴极峰电流 ipc 。参数:扫描速率: 100 mV/s电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法扫描方式:单向灵敏度: 3
在电解池中加入 25.00mL 0.1M pH=7.0 的磷酸缓冲溶液, 通氮除氧 15min 以上。 以以 Hb-MWNT-GCE 为工作电极,依次依次加入 25 μL
1mol/L H2O2 溶液,使电解池中 H2O2 的浓度分别为 0 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 6.0 、 7.0 、 8.0 、 9.0 、 10.0 mmol/L , 每加一次分别记录阴极线性扫描伏安曲线,测出阴极峰电流 ipc 。参数:扫描速率: 100 mV/s电位范围:从 +1.0 ~ −1.5 V方法:线性扫描法扫描方式:单向灵敏度: 3
1 、比较分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极时,为工作电极时,阴极线性扫描伏安曲线 ipc 的大小。
22 、以、以 1/i1/ipcpc 对对 11/[H2O2] 作图,求出米氏常数。
1 、比较分别以分别以 Hb-MWNT-GCE 、 Hb-GCE 为工作电极时,为工作电极时,阴极线性扫描伏安曲线 ipc 的大小。
22 、以、以 1/i1/ipcpc 对对 11/[H2O2] 作图,求出米氏常数。
五、数据处理五、数据处理
1 、 玻碳电极表面要处理干净,否则会阻碍修饰膜的 电子传递 。
1 、 玻碳电极表面要处理干净,否则会阻碍修饰膜的 电子传递 。
2 、 缓冲溶液中的空气要彻底排除,防止氧气对过氧 化氢的催化干扰。
2 、 缓冲溶液中的空气要彻底排除,防止氧气对过氧 化氢的催化干扰。
六、注意事项六、注意事项
1 、比较处理前后多壁碳纳米管的 FT-IR谱图并解释 水溶性原因
1 、比较处理前后多壁碳纳米管的 FT-IR谱图并解释 水溶性原因
3 、 Hb-MWNT-CS 和 Hb-CS 修饰电极对过氧化氢催化 电流大小的比较及讨论
3 、 Hb-MWNT-CS 和 Hb-CS 修饰电极对过氧化氢催化 电流大小的比较及讨论
2 、血红蛋白修饰电极上的直接电化学行为讨论 2 、血红蛋白修饰电极上的直接电化学行为讨论
4 、探讨血红素蛋白质对过氧化氢的催化机理 4 、探讨血红素蛋白质对过氧化氢的催化机理
七、结果与讨论七、结果与讨论
1 、纳米材料在电极表面修饰层内作用和原因是什么 1 、纳米材料在电极表面修饰层内作用和原因是什么
2 、试说明米氏常数 Km 的生物学意义 2 、试说明米氏常数 Km 的生物学意义
八、思考题八、思考题
[2] 吴益华 . 血红蛋白固定在 Ti0.865O2 纳米片层间的直接电化学和电催化 [J]. 上海第二工业大学学报 . 2010, 27(1): 1-6.
[2] 吴益华 . 血红蛋白固定在 Ti0.865O2 纳米片层间的直接电化学和电催化 [J]. 上海第二工业大学学报 . 2010, 27(1): 1-6.
[3] 张敏,程发良,蔡志泉,姚海军 . 血红蛋白在纳米金修饰电极上的电化学研究 [J]. 化学研究与应用, 2008, 20(7):872-875.
[3] 张敏,程发良,蔡志泉,姚海军 . 血红蛋白在纳米金修饰电极上的电化学研究 [J]. 化学研究与应用, 2008, 20(7):872-875.
[4] 冶保献 , 周性尧 . 血红蛋白在裸银电极上的直接电化学及其分析应用 [J]. 高等学校化学学报 ,1996,(1)
[4] 冶保献 , 周性尧 . 血红蛋白在裸银电极上的直接电化学及其分析应用 [J]. 高等学校化学学报 ,1996,(1)
九、参考文献九、参考文献 [1] 李燕,高艳芳,刘俞辰,周宇,刘进荣 . 血红蛋白在二氧化铈修饰电极上的直接电化学 [J]. 化学学报, 2010,68(12):1161-1166.