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过氧化氢（H2O2）比色法测试盒

货号： E-BC-K102-S 方法：比色法

仪器：紫外 - 可见分光光度计（405 nm）

规格：50 assays(48 samples)/ 100 assays(96 samples)



基本信息

本试剂盒适用于检测血清、血浆、培养液、动植物组织及培养细胞样

本中的 H2O2 含量。

检测范围：1.5-150 mmol/L灵敏度：1.5 mmol/L

用途

检测范围及灵敏度

背景介绍

检测原理

过氧化氢（H2O2）是一种活性氧代谢副产物，既是细胞内的信号分子，

又是氧化应激源。H2O2 是参与细胞增殖、分化、迁移过程的真核信号

转导的重要调节因子 [1-3]。然而，异常的 H2O2 会导致氧化细胞损伤和

疾病的发生，如癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松和神经退化性疾病 [4,5]。

H2O2 与钼酸铵反应生成稳定的黄色络合物且在 405 nm 处有最大吸收，

黄色络合物的颜色深浅与 H2O2 的浓度在一定范围内具有线性关系。故

可以通过比色计算出 H2O2 的含量。

本试剂盒检测组织和细胞样本时，需测定总蛋白浓度，推荐使用考马

斯亮蓝法（货号：E-BC-K168-S）。


耗材：

枪头（1000 μL，200 μL）、EP 管（5 mL，2 mL）、吸水纸、擦镜纸。

仪器：

紫外 - 可见分光光度计（405 nm）、涡旋混匀仪、微量移液器（1000 μL，200 μL）、37℃恒温箱。

所需自备物品

提供试剂和物品

编号名称规格 1(size 1)（50 assays）

规格 2(size 2)（100 assays）

保存方式 (storage)

试剂一 (Reagent 1)

缓冲液 (Buffer Solution) 60 mL×1 瓶 60 mL×2 瓶 2-8℃保存 6 个月

试剂二 (Reagent 2)

钼酸铵试剂 (Ammonium

Molybdate Reagent)60 mL×1 瓶 60 mL×2 瓶 2-8℃保存 6 个月

试剂三 (Reagent 3)

1 mol/L H2O2 标准品(1 mol/L H2O2

Standard)12 mL×1 瓶 12 mL×1 瓶 2-8℃保存 6 个月

注：试剂严格按上表中的保存条件保存，不同批次试剂盒中的试剂不能混用。

配制试剂之前，请穿戴好防护装备。试剂盒中部分试剂含有危险性物

质。禁止食入，吸入，直接接触眼睛、皮肤和衣物。使用完后的试剂

瓶经彻底清洗后再处理。

安全提示

试剂：

双蒸水、生理盐水（0.9% NaCl）或 PBS（0.01 M，pH 7.4）。



实验准备

由于过氧化氢非常不稳定，使用前需对其实际浓度进行校准，将试

剂盒中浓度约为 1 mol/L 的过氧化氢标准品贮备液用双蒸水稀释 100倍，使其浓度约为 10 mmol/L，在 240 nm 处，1 cm 光径石英比色皿，

用双蒸水调零，测定 A240，根据公式，试剂三的实际浓度（mol/L）

=22.94×A240×100 倍 ÷1000，计算出实际浓度，再配制标准品进行实验。

① 实验开始前将所有试剂平衡至室温。

② 试剂一使用前，放入 37℃恒温箱中，预热 10 min。

③ 60 mmol/L 标准品的配制：

根据公式计算，试剂三的实际浓度（mol/L）=22.94×A240×100 倍 ÷1000，将其用双蒸水稀释至 60 mmol/L。若试剂三的实际浓度为 1 mol/L，则按试剂三：双蒸水为 3:47 的体积比混匀，如取 60 μL 的试剂三，加 940 μL 的双蒸水中，混匀，即为 1 mL 的 60 mmol/L 的过氧化氢。（标准品使用前，先校准，见实验关键点。）

实验关键点

试剂准备

① 样本处理具体操作请参见附录 2。

② 样本的稀释在正式检测前，需选择 2-3 个预期差异大的样本稀释成不同浓度进行预实验，根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围（1.5- 150 mmol/L），请参考下表稀释 :

样本准备


H2O2 浓度（mmol/L）样本与稀释液的体积比稀释倍数

<150 不稀释 1

150-1500 1:9 10

注：稀释液为生理盐水或 PBS（0.01 M，pH 7.4）。



操作过程

① 移液器取试剂前，请用该试剂平衡枪头（缓慢吸液，反复吹打三次）。

② 不能将枪头外壁上的液体加入到反应体系

微量移液器的注意事项

检测环境室内温度 25-30℃，最佳检测波长 405 nm。

操作步骤

① 向空白管、标准管和样本管中，各加入 1 mL 试剂一于 5 mL EP 管

中，置于 37℃恒温箱中，预热 10 min。

② 向空白管中加入 0.1 mL 双蒸水；

向标准管中加入 0.1 mL 60 mmol/L 过氧化氢标准品；

向样本管中加入 0.1 mL 的待测样本。

③ 向步骤②中的各管加入 1 mL 试剂二，涡旋混匀。

④ 405 nm，1 cm 光径石英比色皿，双蒸水调零，测定各管 OD 值。

操作表

非酶管酶管酶管

试剂一（mL） 1 1 1

37℃预热 10 min

双蒸水（mL） 0.1 -- --

60 mmol/L H2O2 标准品（mL） -- 0.1 --

待测样本（mL） -- -- 0.1

试剂二（mL） 1 1 1

混匀，405 nm，1 cm 光径石英比色皿，双蒸水调零，测定各管 OD 值。


结果计算

血清（浆）、细胞上清 H2O2 浓度计算公式：

H2O2 浓度（mmol/L）= ∆A1 ÷ ∆A2 × c × f

细胞、组织 H2O2 浓度计算公式：

H2O2 浓度（mmol/gprot）= ∆A1 ÷ ∆A2 × c × f ÷ Cpr

注：

ΔA1：测定管 OD 值 - 空白管 OD 值

ΔA2：标准管 OD 值 - 空白管 OD 值

C： H2O2 标准品浓度（60 mmol/L）

f：样本加入检测体系前的稀释倍数

Cpr：待测样本的蛋白浓度（g/L）



例如检测人血清：

取 0.1 mL 人血清，按说明书操作，结果如下：空白管平均 OD 值为 0.051，

标准管平均 OD 值为 0.422，测定管平均 OD 值为 0.445，计算结果为：

H2O2 浓度（mmol/L）=(0.445 - 0.051)÷(0.422 - 0.051)× 60 × 1 =63.72（mmol/L）按照说明书操作，测定人血清（加样量 0.1 mL）、小鼠肝脏组织（2% 组

织匀浆的蛋白含量 1.82 g/L，加样量 0.1 mL）、青椒（10% 组织匀浆的蛋白

含量 1.99 g/L，加样量 0.1 mL）中 H2O2 含量（如下图）。

实例分析


参考文献

1. Neill S J, Desikan R, Clarke A, et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants. Journal of Experimental Botany, 2002, 53(372): 1237-1247.

2. Veal E A, Day A M, Morgan B A. Hydrogen peroxide sensing and signaling. Molecular Cell, 2007, 26(1): 1-14.

3. Marinho H S, Real C, Cyrne L, et al. Hydrogen peroxide sensing, signaling and regulation of transcription factors. Redox Biology, 2014, 2(2): 535-562.

4. Carnevale R, Nocella C, Pignatelli P, et al. Blood hydrogen peroxide break-down activity in healthy subjects and in patients at risk of cardiovascular events. Atherosclerosis, 2018, 274: 29-34.

5. Moloney J N, Cotter T G. ROS signalling in the biology of cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2018, 80: 50-64. opportunities. Antioxidants & Redox Signaling , 2011, 15(7): 1957- 1997.



附录 1 关键数据

技术参数

检测范围 1.5-150 mmol/L 平均批间差 2.7%

灵敏度 1.5 mmol/L 平均批内差 1.3 %

平均回收率 98%

用三个不同生产批号的试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中

浓度样本和低浓度样本，每个批号每个浓度的样本重复测 3 次（n=3），

分别计算每个批号各浓度样本的均值，并按公式计算出各浓度样本的

相对偏差，最后得出平均批间差 2.7%

批间差

批内差

用一个试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中浓度样本和低浓

度样本，各个浓度的样本重复检测 6 次 (n=6)，计算出平均批内差 1.3%

CV= × 100%sx s---Standard deviation


标准曲线（数据仅供参考）

灵敏度

回收率

标准品加样量 0.1 mL，按照试剂盒操作规程测定标曲和 20 个空白的 OD值。绘制标准曲线，算出空白 OD 值的标准差。根据 IUPAC 公认的公式

3 倍的标准差除以标曲斜率计算出灵敏度 1.5 mmol/L

向样本中添加高、中、低三个浓度的标准品，每个浓度样本重复检测

3 次（n=3），做回收率实验，得出平均回收率 98%

①将 1 mol/L 的标准品稀释成以下不同浓度：

标准品浓度（mmol/L） 0 20 40 60 80 100 150

1 mol/L H2O2 (μL) 0 20 40 60 80 100 150

双蒸水 (μL) 1000 980 960 940 920 900 850

② 标准品加样量 0.1 mL，按照操作表步骤进行操作，读取数据，绘制标

曲 ( 如下图 )



附录 2 样本制备

样本要求

① 在测试之前选择 2-3 个预期差异大的样本进行预实验。

血清样本

血浆样本

取新鲜血液，在 25℃条件下静置 30 min 使血液凝结。4℃，2000×g 离

心 15 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测，若

不能当天检测，于 -80℃保存，可储存一个月。

取新鲜血液加入盛有抗凝剂的试管中，颠倒混匀，4℃，700-1000×g 离

心 10 min，取上层淡黄色透明液体即为血浆，不能吸取中间白色干扰

层（白细胞和血小板）。将血浆置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80℃保存，可储存一个月。

注：抗凝剂种类及浓度

肝素：

常用的肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐，其中以肝素锂最好。

通常肝素抗凝剂量为 10.0-12.5 IU/mL 血液。

枸橼酸盐：

主要是枸橼酸钠，通常以二水合枸橼酸钠配置成 3.8% 或 3.2% 的水溶液，

与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。

乙二胺四乙酸盐（EDTA 盐）：

常用的 EDTA 盐有钾、钠、锂盐，推荐使用 EDTA 钾盐（溶解度最高、

抗凝速度最快），通常配成 15% 的水溶液（质量分数），每 5 mL 血

液加 0.04 mL 15% EDTA 溶液抗凝。


取 0.020-1 g 新鲜组织块，用 2-8℃的 PBS（0.01 M，pH 7.4）漂洗，去除血液，

滤纸吸干，称重，放入匀浆容器中，按照重量（g）：体积（mL）=1:9的比例加入 2-8℃的匀浆介质，进行匀浆，4℃，10000×g 离心 10 min，

取上清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80℃保存，可保存一个月。

细胞样本

悬浮细胞：

4℃，1000×g 离心 10 min 收集细胞，按照 106 个细胞加入 300-500 μL 匀

浆介质的比例加入匀浆介质，进行机械匀浆，充分破碎（无明显的细

胞沉淀，可在显微镜下观察），4℃，10000×g 离心 10 min，取上清置

于冰上待测，若不能当天检测，于 -80℃保存，可保存一个月。

贴壁细胞：

吸弃培养液，用 PBS（0.01 M，pH 7.4）将细胞洗一遍。用细胞刮刮下

细胞（不能用胰酶和 EDTA 处理），加入 2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4），

收集细胞悬液，后处理方法见悬液细胞处理方法。

10% 组织匀浆



匀浆介质 : PBS（0.01 M，pH 7.4，含有 0.1 mM EDTA）。

匀浆方式 : 手工匀浆、机械匀浆、超声破碎

a. 手工匀浆：

将组织称重，剪碎呈 1 cm3 大小，倒入玻璃匀浆管中，加入匀浆介质，

左手持匀浆管将下端置于冰浴中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下

转动研磨数十次（6 ～ 8 min），组织充分匀浆；或者倒入研钵中，加

入液氮进行研磨，充分研磨后，加入匀浆介质，再将制好的匀浆吸取

到 EP 管中备用。

b. 机械匀浆：

将已称重的组织装入 EP 管，加入匀浆介质，用组织匀浆机，在冰水

浴条件下，60 Hz，90 s 研磨制成组织匀浆，皮肤、肌肉组织及植物组

织等可适当延长匀浆时间。

c. 超声破碎：

冰水浴条件下，用超声波发生器以振幅 14 μm 超声处理 30 s，破碎细胞；

或者用超声波破碎仪，200 W，2 s/ 次，间隙 3 s，总时间 5 min


附录 3 问题答疑

问题可能原因建议解决方案

测值不稳定，复孔差异大

微量移液器使用不熟练小心加样，避免液体溅到其它测样管中

未严格按照说明书操作严格按照说明书操作

样本测不出值

样本稀释倍数太大选择合适稀释倍数，重新检测

样本保存时间过长或者保存不当

取新鲜样本，重新检测

样本测量结果>150 mmol/L 样本浓度太高选择合适稀释倍数，重新检测

标准品的值较低过氧化氢部分分解使用前对过氧化氢的实际浓度进行校准

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