第五章繁殖辅助技术

第五章繁殖辅助技术第五章繁殖辅助技术Assisted reproductive technologyAssisted reproductive technology

第一节人工授精第一节人工授精Artificial Insemination Artificial Insemination （（ AIAI ））

一、人工受精的概述一、人工受精的概述二、采精二、采精三、精液品质检查三、精液品质检查四、精液的稀释四、精液的稀释五、精液的保存五、精液的保存六、输精操作六、输精操作七、精液冷冻保存技术七、精液冷冻保存技术

第一节人工授精第一节人工授精

一、人工受精的概述一、人工受精的概述

（一）定义（一）定义（二）优越性（二）优越性（三）（三） AIAI 主要技术环节主要技术环节


用器械采集公畜（禽）精液，经过检查处理，再用器械将一定量的精液注入到发情母畜生殖道的一定部位，以人工操作代替公母畜本交的一种畜牧技术。

（一）定义（一）定义一、人工受精的概述一、人工受精的概述

在 1780 年意大利生理学家 Spallanzani 将犬的精子注入母犬体内，获得 3 只小犬；1890 年，法国兽医，马人工授精；1914 年，意大利， Amantea 设计了假阴道；1921 年，俄国人 Ivanoff ，扩大到牛、羊、家禽；1937 年，丹麦兽医发明了牛直肠把握输精；1949 年， Polge ，甘油，冷冻精液。中国从 1950 年以后开始。

发展简史发展简史


（二）优越性（二）优越性

公畜利用率节约经济加快改良防病提高受胎率远距离交流和运输

就本交的几种方式而言的优越性有：就本交的几种方式而言的优越性有：


（三）（三） AIAI 主要技术环节主要技术环节

采精采精精液品质检查精液品质检查精液稀释保存精液稀释保存

精液运输精液运输母畜发情鉴定母畜发情鉴定输精输精


二、采精二、采精

（一）采精的方法种类及评价标准（一）采精的方法种类及评价标准（二）采集技术（二）采集技术


（一）采精的方法种类及评价标准（一）采精的方法种类及评价标准

1 假阴道法


2 手握或筒握法



3 电刺激或按摩法



4 阴道收集法

5 海绵、集精袋法

6 外科瘘管法



http://www.ya-wei.com/aiqicai/Prod092.jpg

http://www.ya-wei.com/aiqicai/Prod102.jpg

评价标准

全量

无损伤简便

原质



（二）采集技术（二）采集技术


1 1 采精前准备（以假阴道为例）采精前准备（以假阴道为例）

场地：场地：采精室要求宽畅、明亮、地面平整，安静，清洁，设有采精架、台畜、假台畜和精液操作室等必要设施


台畜1 、健康、温顺、卫生

2 、设计合理、方便

假阴道：

公畜性欲公畜性欲

体况适中

定期检疫定期清洗

饲料全价适当运动


2 2 公畜采精调教法公畜采精调教法

外激素法

偷梁换柱法

榜样示范法


3 3 采精须知采精须知① 采精者在公畜的右后侧（站住）；② 马性反射慢，压力重要；③ 牛、羊性反射快，温度重要，勿触及阴茎，可触包皮；④猪性反射慢，压力为节律性收缩；⑤兔可用羊假阴道，倒向一侧并叫一声，表示射精；⑥鸡按摩手法要准确实在。


4 4 采精频率采精频率马、牛和猪每周 2-6次，鸡每 3 天停 1天，羊在春分之前最差，秋分时可达7 ～14次 / 周。牛：每周牛：每周 22 天采精，当日采天采精，当日采 22 次次猪：隔日一次，最好猪：隔日一次，最好 33 天一次天一次羊：每周羊：每周 33 天，当日采天，当日采 22 次。次。犬：隔日一次犬：隔日一次

主要根据精液品质与公畜的性机能状况而定。


在人工授精技术中，我们要采集公畜的精液，并在体外进行一系列的处理。那么精液的质量必然要受到公畜本身的生精能力、健康状况，以及采集方法、处理方法的影响。因此，检查精液品质是人工授精技术中一个非常重要的技术环节。

三、精液品质检查三、精液品质检查第一节人工授精第一节人工授精

（一）重要性（一）重要性

（二）精液品质检查项目（二）精液品质检查项目

（三）精液品质检查方法（三）精液品质检查方法

三、精液品质检查三、精液品质检查第一节人工授精第一节人工授精

（一）重要性（一）重要性 1 检查种公畜的配种能力 2 公畜的饲养水平和性机能 3 确定精液可稀释的倍数 4 检查精液的处理方法是否正确 5 检查精液产品的质量 6 反映技术操作水平

三、精液品质检查三、精液品质检查

（二）精液品质检查的项目（二）精液品质检查的项目

1 1 直观检查项目直观检查项目 2 2 微观检查项目微观检查项目


1 1 直观检查项目直观检查项目

射精量射精量色泽色泽气味气味云雾状云雾状PHPH值值美兰退色试验美兰退色试验


A 射精量的测定方法B 射精量不正常的原因

射精量射精量



A A 射精量的测定方法射精量的测定方法

概念概念 : : 射精量是指每次射精的体积测定测定 : : 以连续 3 次以上正常采集到的精液

的平均值代表测定方法 : 可用体积测量容器如刻度试管或

量筒 , 也可用电子秤称重近似代表体积



B B 射精量不正常的原因射精量不正常的原因

现象现象原因原因

过少过少采精过频、性机能衰退、睾丸炎、发采精过频、性机能衰退、睾丸炎、发育不良育不良

过多过多副性腺发炎、假阴道漏水、尿潴留、副性腺发炎、假阴道漏水、尿潴留、采精操作不熟练采精操作不熟练



色泽色泽

正常精液特正常精液特征征

依从浓到稀：乳黄依从浓到稀：乳黄 -- 乳白乳白 --白色白色 -- 灰白灰白

淡红（鲜淡红（鲜红）红）

生殖道下段出血或龟头出生殖道下段出血或龟头出血血

淡红（暗淡红（暗红）红）副性腺或生殖道出血副性腺或生殖道出血

绿绿副性腺或尿生殖道化脓副性腺或尿生殖道化脓褐褐混有尿液混有尿液



云雾状分级标准云雾状分级标准

+++ +++ 翻明显而且较快翻明显而且较快++ ++ 翻明显但较慢翻明显但较慢+ + 仔细看才能看到精液的移动仔细看才能看到精液的移动- - 无精液移动无精液移动



2 2 微观检查项目微观检查项目

精子活力估测精子活力估测密度测定密度测定 :: 计数板计数、比色计测定畸形率：畸形率：形态畸形率、顶体畸形率


（（ 11 ）活力的估测）活力的估测

A 概念 :37℃下 ,精液中前进运动精子占总精子数的百分率

B 主要测定方法 : 估测法


活力测定时精液的稀释用品活力测定时精液的稀释用品


例：牛精子活力检查的程序例：牛精子活力检查的程序

载玻片预温精液稀释取样检查镜检

活力估测活力记录

将恒温加热板放在载物台上，打开电源并调整控制温度至37℃，然后放在载玻片

将生理盐水与精液等温后，按 1:10

稀释

取 10ul放在预温后载玻片中间，盖上盖玻片用 100倍和 400倍观察

判断视野中前进运动精子占的百分

率

按 10级制评分和记录


（（ 22 ）密度测定）密度测定A A 密度的概念及表示方法密度的概念及表示方法单位体积精液中所含的精子数表示方法 :个 /ml 或亿 /ml,也可以用个 /ul表示B B 各种家畜精液的精子密度各种家畜精液的精子密度

畜种畜种牛牛羊羊猪猪鸡鸡

密度亿密度亿//mlml

8-128-12 20-3020-30 2-32-3 30-5030-50


C C 精子密度的测定方法精子密度的测定方法

a.精子密度计数板 ( 器 ) 简介b.精液的稀释c. 精液注入计数室d.精子计数e.精子密度计算

（（ 22 ）密度测定）密度测定三、精液品质检查三、精液品质检查

aa 精子密度计数精子密度计数

a)精子计数室长宽各 1mm, 面积 1mm2 高度 0.1mm, 体积0.1mm3

b)由双线或三线组成 25个 (5X5) 中方格c)每个中方格内有 16个小方格 (4X4)

d)共计 400个小方格


精子计数室及一个中方格精子计数室及一个中方格


bb、精液的稀释、精液的稀释a)将精液注入计数室前必须对精液进行稀释 ,以

便于计数b)稀释的比例根据动物精液的密度范围确定c)稀释方法 :用 5-25ul移液器和 100-1000 ul移液器 ,在小试管中进行组合不同的稀释 . 如牛精液稀释 100倍 ,为 5ul原精 +500ul 稀释液

d)稀释液 :3%氯化钠溶液 ,用以杀死精子 ,便于计数


注入计数室前各种家畜精液建议稀释比例注入计数室前各种家畜精液建议稀释比例

畜种畜种牛牛羊羊猪猪马马鸡鸡稀释倍数稀释倍数 1010

00200200 4040 4040 400400

3%3%氯化钠氯化钠ulul

原精液原精液 ulul

505000

55

10010000

55

200-200-55

55

200-200-55

55

20020000

55


cc 、精液注入计数室、精液注入计数室

a)将洁净的计数板放在载物台上固定好 ,盖上干净的盖玻片

b)取 25ul 稀释后的精液 ,将吸咀放于盖玻片与计数板的接缝处

c)缓慢注入精液 , 使精液依靠毛细作用吸入计数室


注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行吸入！

用吸管稀释后精液注入计数室

共有两个对称的计数室

用用移移液液器器注注入入精精液液


dd、精子计数、精子计数

a)将计数板固定在显微镜的推进器内，用 100倍放大找到计数室，再用 400倍找到计数室的第一个中方格。

b)计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依数上不数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精子。


进行精子计数的中方格数可以是四角一中心共 5个中方

格也可以是从左角到右下角五个中方格

以图示次序计数，精子的头部为准，依数上不数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精子。白色精子不计数


计算精子密度计算精子密度

精子密度精子密度 =5=5 个中方格总精子个中方格总精子 ××5×105×10××1000 × 1000 × 稀释倍数稀释倍数


例：牛精子密度测定程序例：牛精子密度测定程序

放计数板于载物台上

取样稀释精液

精液注入计数室镜检

精子计数密度计算计数板和盖玻片一定要清洁

取 500ul 3% 氯化钠于小试管中 , 加入 5ul 原精液 , 混合均匀

取 25ul 小心地从计数板与盖玻片的接缝中加入 , 使其自行吸入计数室

中用 100 倍和 400

倍观察

计数五个中方格的总精子数 , 计数以头部为准 , 在格线上的数上不

数下 , 数左不数右

精子密度 = 5 个中方格总精子数 5×10×1000 × 100

将载玻片放在 400 或 600倍的显微镜下进行观察，共记录若干个视野 100-200个左右的精子。

附图，正常精子的结构模式图

畸形率畸形率 ==畸形精子畸形精子数数 //总精子数总精子数

(3) (3) 畸形率畸形率三、精液品质检查三、精液品质检查

畸形精子（右）畸形精子（右）(3) (3) 畸形率畸形率


视野中的畸形精子

四、精液的稀释四、精液的稀释


（一）精液稀释的目的（一）精液稀释的目的精液稀释是向精液中加入适宜于精子存精液稀释是向精液中加入适宜于精子存活的稀释液。其目的有两个：活的稀释液。其目的有两个：

1 扩大精液容量，从而增加输精头数，提高公畜利用率。

2 延长精子的保存时间及受精能力，便于精液的运输，使精液得以充分利用。


（二）精液稀释液的成分及作用（二）精液稀释液的成分及作用 1 营养物质 2 保护性物质 (1) 缓冲剂：柠檬酸盐，磷酸盐(2)防冷抗冻物质：卵黄，甘油 (3)抗菌物质：短期保存，青霉素，链霉素；长

期，庆大霉素，先锋，头孢3 稀释剂：氯化钠4 其它添加剂 (1)酶类 (2)激素类 (3)维生素类：

VB12， VB6， VE (4)有机酸、二氧化碳等


（三）稀释液的配制方法（三）稀释液的配制方法1.用品的清洗与消毒2.药品的称量、水的量取3.基础液的配制：溶解—过滤—消毒（水浴或

直接加热）—放凉4.稀释液的配制：基础液按比例加入抗生素、卵黄

Ⅰ 液：按比例加入卵黄和抗生素的稀释液 Ⅱ 液：按比例加入抗冻剂


（四）稀释倍数和稀释方法（四）稀释倍数和稀释方法


11 稀释倍数确定稀释倍数确定

精液适宜稀释倍数与家畜种类和稀释液种类有关。确定稀释倍数应根据原精液的质量，尤其是精子的活率和密度、每次输精所需的精子数、稀释液的种类和保存方法。一般牛 4-6 倍，猪 1-3倍，兔 3-5 倍，鸡 5-10倍。


正确的表示方法：正确的表示方法：

N 倍稀释：即 1份精液 :N 份稀释液

1:N 稀释：意思同上

实际应用表示方法：实际应用表示方法：

稀释后体积是原精液体积的多少倍。因此所谓的 N倍稀释，实际上是 1:(N-1) ，但这种方法有利于进行相关计算。如 N 倍稀释后，精子密度为原来的 1/N ，体积为原精液体积的 N 倍，可分装的份数为：

原精液体积原精液体积××稀释倍数稀释倍数 // 每份精液体积每份精液体积

11 稀释倍数确定稀释倍数确定四、精液的稀释四、精液的稀释

2 2 普通稀释倍数的计算普通稀释倍数的计算

稀释倍数稀释倍数 ==

原精液精子密度×原精液活力×稀释后每份精液的体积 /稀释后每份精液中所含的有效精子数


3 3 冷冻精液稀释倍数的计算冷冻精液稀释倍数的计算

的有效精子数稀释后每份精液中所含稀释后每份精液的体积解冻后预测活力原精液精子密度稀释倍数


44 稀释方法稀释方法（ 1 ）精液经检查合格后应立即进行稀释，越快越好。（ 2 ）稀释时，稀释液的温度和精液的温度必须调整一致，以 30-35℃ 为宜。

（ 3 ）稀释时，将稀释液沿精液瓶或插入的灭菌玻璃棒缓慢倒入，防止剧烈震荡。

（ 4 ）若作高倍稀释，应先低倍后高倍，分次进行稀释。（ 5 ）稀释后立即镜检，活力应和稀释前一样。（ 6 ）稀释后精液立即进行分装（一般按一头母畜的输

精量）保存。


55 冷冻精液稀释冷冻精液稀释第一次稀释倍数的计算：第一次稀释倍数的计算：应为最终稀释后体积的 50% 。第二次稀释为第二次稀释为 1:11:1 稀释稀释

意义：意义：总稀释倍数受总有效精子密度的影响，第二次稀释时，稀释液中含有防冻剂，而防冻剂应在稀释后在精液中含有固定的浓度。最后一次稀释时， 1:1 稀释，可以保证稀释后防冻剂的浓度为Ⅱ液的 1 半。这样无论总稀释倍数是多少，最终精液中含的防冻剂浓度是不变的。


五、精液保存五、精液保存


（一）精液的保存方法（一）精液的保存方法现行精液保存的方法按保存的温度分：现行精液保存的方法按保存的温度分：常温保存（ 15-25℃）低温保存（ 0-5℃）冷冻保存（ -79- -196℃）三种。

按精液的状态分：按精液的状态分：液态保存：液态保存：常温保存和低温保存温度都在 0℃以上，故称液态精液保存

冷冻保存：冷冻保存：超低温保存精液以冻结形式作长期保存，故称冷冻精液保存。


（二）低温保存（二）低温保存原理：原理：低温能抑制精子的代谢和微生物的繁殖，但迅速降温会使精子遭受冷休克，加低温保护剂和缓慢降温并保持较低温度，可使精液保存数天。

稀释液主要成分：稀释液主要成分：抗生素、 15-25% 的卵黄、基础液

保存方法：保存方法：用纱布包数层于装冰块的保温瓶中或冰箱中保存。

保存温度：保存温度： 2-5℃


低温保存的关键性环节低温保存的关键性环节

1 、含卵磷脂、抗生素的稀释液2 、等温稀释3 、缓慢降温4 、保持恒温（ 2-4 ℃ ）5 、在保质期内使用，用前进行活力检查

（二）低温保存（二）低温保存五、精液保存五、精液保存

（三）常温保存（三）常温保存

原理：原理：精子自身所产生的酸性物质和稀释液中的酸性物质使精液的 pH降低到一定的水平，能够抑制精子的代谢，从而延长精子的存活时间。抗生素能够抑制微生物的繁殖。

稀释液成分：稀释液成分：抗生素、单糖、缓冲剂保存温度：保存温度： 15-25℃


常温保存的关键常温保存的关键1 　含缓冲剂、营养、抗生素的稀释液2 　等温稀释及缓慢降温3 　保持恒温（ 15-25℃ ）4 　防止精子沉淀堆积时间过久5 　在保质期内使用，用前进行活力检查

（三）常温保存（三）常温保存五、精液保存五、精液保存

六、输精操作六、输精操作


（一）输精前的准备（一）输精前的准备


1 1 输精器械的准备输精器械的准备与精液接触的用品，必须经过清洗、消毒灭菌，并且不能有任何不利于精子存活的化学物质残留。用前最好用稀释液或生理盐水冲洗，确保对精液无毒害作用。

最好一头母畜准备一个输精枪或枪头，一次性输精器只能一畜一支。

开膣器最好一畜一个，用前在消毒剂中浸过，用凉开水冲过后，放入干燥箱中干燥后，放凉使用（冬季应防止过冷）。


2 2 精液的准备精液的准备输精前应将精液准备好，应确定精液品质符合

要求方可用输精大剂量低温或解冻后精液，应将温度升至

20-30℃ 后输精常温保存精液不须要升温小剂量冷冻精液也应正确解冻后输精


3 3 母畜的准备母畜的准备牛、马、羊等家畜输精前应进行保定，以确保顺利输精。

大家畜可保定在输精栏内或六柱保定架内，羊也可倒提保定。

猪输精前应对母猪进一步发情检查，并刺激相应部位，以促进母猪产生宫缩，有利顺利输精。

由助手将动物的尾部拉向一侧，马输精前应将尾毛用绷带扎好，防止带入阴道内。

输精前应将母畜外阴部用肥皂水清洗后，用清水洗净，擦干。母猪的外阴可用干纸巾擦净即可。


4 4 输精人员准备输精人员准备输精人员可戴一次性长臂或 PE 手套操作，也可洗净双

手即可。操作人员应指甲剪短，锉光马输精时手要伸入阴道内，手臂应用 75%酒精消毒凉干后，涂少量石蜡油

牛输精时，手臂要伸入到直肠内，应清洗双手，戴长臂手套醮少量水或石蜡油或肥皂水，也可不戴手套操作。


（二）输精操作（二）输精操作

1 1 牛的输精牛的输精2 2 羊的输精羊的输精3 3 猪的输精猪的输精


1 1 牛的输精牛的输精

（（ 11 ）开膣器法）开膣器法

（（ 22 ）直肠把握子宫颈深部输精法）直肠把握子宫颈深部输精法


子宫颈口

尿道口

膀胱

卵巢

子宫颈

子宫体


1 1 牛的输精牛的输精对母牛进行发情鉴定，母牛发情结束，不再爬跨其它母牛，精神趋于稳定时输精。

将母牛保定，尾部拉向一侧，外阴用高锰酸钾水棉球擦拭，并擦干。

将冷冻精液解冻，剪去封口端，剪口端向前放外套管中，输精器通针向后拉出 15厘米。将外套管套在输精器上。

分开外阴，将套管连同外塑料膜向前上方伸入阴道 10厘米，将输精器捅透外膜。


1 1 牛的输精牛的输精左手（或右手）戴上长臂手套涂少量石蜡油伸入直肠，排出宿粪。

手伸至直肠狭窄部后，将直肠向后移，向骨盆腔底下压，找到子宫颈（棒状，质地较硬有肉质感，长约10-20厘米）。

手移至子宫颈后端（子宫颈阴道部），使子宫颈呈水平方向，并用力将子宫颈向前推，使阴道壁拉直，方便输精器向前推进。

右手将输精器前端伸到子宫颈外口附近，左手配合，使前端对准子宫颈外口。左右手配合，上下调整，使输精器前端进入子宫体内。


1 1 牛的输精牛的输精等确认输精器到达子宫体时（短距离前后移动时，没有明显阻力），不要再向前推送输精器。

将精液缓慢注入，并慢慢抽出输精器。注意：输精器插入阴道时，应向前上方。当遇到阻

力时，切忌用蛮力。输精器插入子宫颈管时，推进力量要适当，以免损伤子宫颈、子宫体粘膜。如果输精器后端为胶头，将精液压子宫内后，不要松开胶头，以免精液流回输精器内。



牛直肠把握子宫颈输精示意图牛直肠把握子宫颈输精示意图


直把输精示意图直把输精示意图


（（ 11 ）羊输精前准备）羊输精前准备

用试情公羊对发情母羊进行发情鉴定，发现允许试情公羊爬跨的母羊应进行标记，并安排输精时间

在母羊允许公羊爬跨后的 6-12 小时第一次配种

将母羊保定在保定架内或着将其倒提，前肢着地。

消毒外阴部，开膣器上涂以石蜡油。


2 2 羊的输精羊的输精

（（ 22 ）羊输精操作）羊输精操作将开膣器侧扁方向与阴道呈同一方向，插入母羊阴道

内，向下转动开膣器，并保持打开状态。将准备好的输精器前端对准子宫颈外口，伸入 1 厘米或更深。将精液缓慢注入后抽出。

注意：开膣器应保持开张状态，以免夹伤阴道粘膜。如果无法找到子宫颈口，应拨动粘液，使子宫颈口暴露。如果仍无法确认，可将精液注入颜色较深的区域。


2 2 羊的输精羊的输精

羊的输精羊的输精

（（ 11 ）输精时间掌握）输精时间掌握

用种公猪试情的，后备母猪发现发情， 24 小时后作第一次输精，间隔 12 小时第二次输精；经产母猪发现发情 12 小时后第一次输精， 12 小时后第二次输精。地方品种均推迟 6 小时。

无种公猪试情的，后备猪压背反应后 6-12 小时，经产猪立即输精，地方品种均推迟 6 小时。


3 3 猪的输精猪的输精

（（ 22 ）输精清单）输精清单拿到消毒过的输精导管存储精液在 16-20℃ 的恒温箱中每天都用公猪检查发情２次在出现静立发情的当天进行第 1 次输精清洗双手清洁母猪阴户、润滑输精导管，将输精导管向上、向

前插入阴道并按逆时针方向旋转直到锁定摇动输精瓶几次，充分混合精液，剪掉输精瓶的顶端慢慢地向输精瓶加压：输精将要持续 5-10分钟



精液流出阴户时，要重新锁定输精导管使用后，立即用清水和去离子水清洗输精导管记录公母猪耳号间隔 12-24 小时后重复输精蒸煮 10分钟消毒输精导管避免使用洗涤剂和消毒剂来清洗人工授精设备将输精导管头部向上挂在有热空气处使其干燥当输精导管内外部干燥后，保存在清洁的输精导管袋

中第二次输精时要用不同的、清洁的、干燥的输精导管


（（ 22 ）输精清单）输精清单3 3 猪的输精猪的输精

（（ 33 ）输精操）输精操作作

擦擦拭拭外外阴阴部部



在在输输精精器器上上涂涂润润滑滑剂剂



分开外阴分开外阴将输精器将输精器前端向上前端向上呈呈 4545 度度角向左旋角向左旋转插入母转插入母猪阴道内猪阴道内



（（ 44 ）输精过程）输精过程




七七精液冷冻保存技术精液冷冻保存技术


（一）精液冷冻概述（一）精液冷冻概述 1950年英国科学家 Polge和 Smith 采用卵黄和甘油作保护剂，用干冰作冷源进行精液的冷冻，解冻后授精成功，开创了世界人工授精的新时代。

到 90年代，发达国家的全部奶牛和绝大多数肉牛采用冻精输精。精液冷冻保存成为最可靠的保存方法。

精液冷冻保存是目前精液保存最有效的方法。

七、精液冷冻保存技术七、精液冷冻保存技术

（二）精液冷冻的原理（二）精液冷冻的原理1 超低温使精子处于零代谢状态，升温后能使精子复苏并且不失去受精能力。

2 但精子冷冻过程会由于形成冰晶使精子受到损害，这些损害包括：精子外的水分先形成冰晶，而形成精子内外的渗透压差，导致精子水分外渗，精子内渗透压增高，电解质浓度提高，酸碱失去平衡。

冰晶的形成造成：•产生机械压力，导致细胞表层破坏• 精子内部冰晶，破坏精子结构


3 如果在冷冻过程只形成微小冰晶，即玻璃化状态，则精子就不容易受到损伤，解冻后能恢复活力。

44 形成玻璃化状态的条件：形成玻璃化状态的条件：• 防冻剂干扰晶格排列，不形成“过冷溶液”• 快速降温，使水分子来不及移动和排列，就失去

了能量，不形成“过冷溶液”• 快速降温使液体只能形成极微小的“微晶”

（二）精液冷冻的原理（二）精液冷冻的原理七、精液冷冻保存技术七、精液冷冻保存技术

55 保存和解冻过程的变化：保存和解冻过程的变化：冰晶很微小，所以表面能很高，微晶总是力图合并成大冰晶。

一旦吸收一定的能量，冰晶就会合并成大冰晶，从而使精子受到破坏。

保存过程中，即使冻精温度只升高到 -60℃，也可能使精子死亡。

冻精在解冻时也需要快速升温，才能保证防止微晶在解冻过程中形成大冰晶。

（二）精液冷冻的原理（二）精液冷冻的原理七、精液冷冻保存技术七、精液冷冻保存技术

（三）精液冷冻的稀释液（三）精液冷冻的稀释液低温保护剂：低温保护剂：糖类：蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖卵黄、奶类

冷冻保护剂：冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜、乙二醇

抗生素类：抗生素类：庆大霉素、青霉素、链霉素等


（四）冷冻精液稀释液的组成（四）冷冻精液稀释液的组成基础液：基础液：由糖类和盐类、水配制的等渗液第一液：第一液：由基础液和卵黄（ 15-20% ）组成的低温保存稀释液。用于在 33℃下稀释和逐步降温。

第二液：第二液：由第一液和甘油或其它防冻剂组成。甘油含量通常比稀释后浓度高一倍。用于精液的第二次稀释（ 2-4 ℃ ）


（五）解冻液的配制（五）解冻液的配制一般采用 2.9%的柠檬酸钠作解冻液猪的冻精解冻液用常温保存稀释液 BTS

也可用 VB12 注射液作解冻液如果解冻液中加入 2mmol 的咖啡因有利于提

高受胎率


(( 六六 )) 冷冻精液的程序冷冻精液的程序11 采集精液。采集精液。22 品质检查：品质检查：精液的密度和活力都必须符合要

求。33 稀释前处理：稀释前处理：羊、猪的精液在稀释前进行离心或清洗（羊）有利于提高解冻后活力。

44 稀释：稀释：可采用一次稀释也可采用二次或三次稀释。最常用的是二次稀释。


55 稀释稀释– 第一次稀释：在 30℃温度下，根据计算的

稀释倍数进行第一次稀释，放在 500毫升的烧杯中与第二液一起缓慢降温至 2-5 ℃。

– 第二次稀释：在 2-5 ℃下进行66 平衡：平衡：是精液与防冻剂（甘油）相互作用的时间。一般 2-4小时。

77 分装：分装：冻精的剂型有细管（ 0.25ml、 0.5ml），安瓿（ 2.5ml、 5ml) 、颗粒（ 0.1ml）、袋装等。

(( 六六 )) 冷冻精液的程序冷冻精液的程序七、精液冷冻保存技术七、精液冷冻保存技术

88 冷冻：冷冻：冷源：冷源：干冰（ -79 ℃）、液氮（ -196 ℃）冷冻用品：冷冻用品：

• 冷冻面：冷冻面：铜网、氟板（聚四氟乙烯）、铝板• 冷冻槽：冷冻槽：广口液氮罐、液氮槽•钢匙、镊子、低温温度计钢匙、镊子、低温温度计

冷冻方法：冷冻方法：•干冰埋藏法• 液氮熏蒸法

(( 六六 )) 冷冻精液的程序冷冻精液的程序

99 解冻检查：解冻检查：活力 0.3 以上


精液冷冻仪精液冷冻仪


（七）颗粒冻精的制作（七）颗粒冻精的制作


1 1 冷冻条件冷冻条件冷源：冷源：液氮或干冰冷冻面：冷冻面：可以用铜网、聚四氟乙烯板、铝板等冷冻温度：冷冻温度： -98—-110 ℃液氮槽


2 2 颗粒冻精制作流程颗粒冻精制作流程冷冻面的预冷：将冷冻面放入液氮中浸数分钟，待不再有大量气体放出时，取出，架在液氮面上 1.5cm 高处，数分钟后即可冷冻。

冻前精子活力检查：平衡的精液应进行活力检查，如果活力合格方可滴冻。

滴冻：预冷至 2-4 ℃的滴管吸取精液，均匀地滴在冷冻板上，并使之间距为一个颗粒直径。每个颗粒 0.1ml 。


2 2 颗粒冻精制制作流程颗粒冻精制制作流程滴冻练习：每次用取样器取 1ml 精液，将其滴成 10个大小相等的颗粒。

熏蒸：一块冷冻板滴满后，可将冷冻板面加盖（也可不加）。

将冷冻板浸入液氮：并用预冷后的不锈钢勺将颗粒铲下，倒入下面的网面上。

将纱布袋浸入液氮中，将一塑料漏斗口插入纱布袋中。取出液氮中的纱网将颗粒冻精倒入漏斗中。


2 2 颗粒冻精制制作流程颗粒冻精制制作流程取样解冻检查精子活力。将纱布袋口抽紧，在袋口的线上作好标记。将提漏从液氮罐中取出，放入液氮槽中，将纱布袋放入提漏中。

将提漏迅速放入液氮罐中。


3 3 颗粒冻精液制作要求颗粒冻精液制作要求形状一致，不连片，大小均匀，体积0.1ml无气泡（在液氮中不漂浮）解冻后活力 0.3 以上总有效精子数 1200万个（牛）每ml 中不得检出大肠杆菌


（八）细管冻精的制作（八）细管冻精的制作


11 细管冻精的优点细管冻精的优点

封闭包装，卫生安全：封闭包装，卫生安全：保存、输精时不与外界接触

便于标记便于标记取出方便：取出方便：直接用镊子夹取解冻方便：解冻方便：直接投入水浴中解冻输精方便：输精方便：可安装在专用的输精枪内输精


22 细管冻精的缺点细管冻精的缺点

• 制作成本高• 必须进行大规模生产才有意义


33 细管分装细管分装常温分装：常温分装：一次性稀释后进行分装标记，然后进行精液降温与平衡优点：优点：不需要低温操作台缺点：缺点：对精子损害较大

低温分装：低温分装：在第二次稀释后进行分装标记，然后进行平衡，最后冷冻。优点：优点：对精子损伤小，解冻后活力大缺点：缺点：对设备要求高


44 细管冻精的冷冻细管冻精的冷冻11 、大口径液氮罐冷冻、大口径液氮罐冷冻将平衡后的细管用毛巾擦净，放入铜网上，

将铜网降至距液氮面 10cm 的高度 10分钟后沉入液氮中，取出分装在提漏内，放入液氮罐中。

22 、程序冷冻仪冷冻、程序冷冻仪冷冻


55 细管冻精的要求细管冻精的要求细管上要对供精者的场家、号码、生产日期进行标记

容量 0.25,0.5,5ml不等，牛细管冻精一般为 0.25ml

每剂有效精子数 1000万个活力 0.3 以上其它同颗粒冻精


（九）冻精的解冻（九）冻精的解冻解冻温度：有冰水解冻， 30-40 ℃解

冻，高温（ 50-75 ℃）解冻，以第二种方法最常用

解冻后温度： 5-8℃解冻后保存：在 2-5℃下或冰瓶中可保

存 12 小时以上。


1 1 解冻方法解冻方法①湿解冻法：在试管中加入 0.5-1ml解冻液，升温到 30-40 ℃，投入一粒冻精，摇动并取出

②干解冻法：先将试管预热至 30-40 ℃，投入冻精颗粒后，至融化一半时，取出加入 20-30 ℃的解冻液

③细管冻精解冻：将细管从液氮罐或液氮槽中取出，投入 30-40 ℃的水中至融化一半时取出用手搓至完全融化或用体温解冻


22 细管冻精的解冻细管冻精的解冻

① 将水浴温度调整到 40 ℃② 将提漏提至罐口下 3-5cm 处，用镊

子夹住细管的超声波封口端迅速移入水浴中

③ 不断摇动， 3-4秒后全部变色后取出，用手搓动使之全部解冻


3 3 颗粒冷冻精液的解冻颗粒冷冻精液的解冻① 取 2.9%的柠檬酸钠0.5ml放入灭菌的

平底试管中② 将试管放入 40 ℃的水浴中预温 1分钟③ 将液氮倒入广口保温瓶或泡沫塑料槽中④ 将液氮罐的提漏提至罐口下 3-5cm 处，看清标记后，将纱布袋取出放液氮槽中

⑤ 将镊子放入液氮中预冷片刻，夹取颗粒冻精后，迅速投入试管中，并摇动试管，至冻精解冻至绿豆大小时取出，摇动至全部融化。


（十）冷冻精液的保存（十）冷冻精液的保存① 冻精（颗粒）应进行标记：公畜名（号）、采精日

期、容量。② 保持液氮罐中液氮面高度。③ 接触冷冻精液的用品都要进行预冷。④ 在冻精进行转移时，应尽可能减少在空气中暴露的时间。如果是颗粒冻精应先移入液氮槽中再解冻。

⑤ 液氮罐应放在凉爽通风处，避免放在高温或通风不畅的地方。

⑥ 液氮罐在运输中应防止暴晒和碰撞。


Embryo transferEmbryo transfer

第二节胚胎移植第二节胚胎移植

一、胚胎移植概述二、胚胎移植的原理三、胚胎移植的技术程序四、牛的胚胎移植五、羊胚胎移植


一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述

（一）胚胎移植的历史（一）胚胎移植的历史（二）胚胎移植技术的意义（二）胚胎移植技术的意义

（一）胚胎移植的历史（一）胚胎移植的历史一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述

1 1 初始阶段：初始阶段： 1890-1900 W.Heape 将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔 2 只。

2 2 初级阶段：初级阶段： 1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率 35%左右。


3 3 发展阶段：发展阶段： 1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达 70-80% 。


4 4 实用化初始阶段：实用化初始阶段： 1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司， 1973 年牛冻胚移植成功（英）。


5 5 实用化研究阶段：实用化研究阶段： 1982 大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。


（二）胚胎移植技术的意义（二）胚胎移植技术的意义一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述

从低产母畜得到高产后代。加速引进品种的繁殖和新品种的培育，比用现有品种进行长期杂交育种更为经济有效。

加速家畜改良进度，通过超数排卵和胚胎移植技术可使供体繁殖的后代增加 7-10倍。

增加双胎率，加速繁殖。

使不孕母畜获得生育能力，对因解剖或内分泌缺陷而不能妊娠的母畜，可以根据具体情况专门作为供体或受体，继续发挥其繁殖作用。

促进基础理论方面的研究，为繁殖生理学、生物化学、遗传学、细胞学、胚胎学、免疫学、动物育种和进化等方面开辟了新的试验研究途经。

满足畜牧业现代化的需要。


挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。

胚胎移植技术是许多现代技术的基础：如克隆技术、试管婴儿、转基因及动物生物反应器研究。


二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理

（一）胚胎移植的生理学基础（一）胚胎移植的生理学基础（二）胚胎移植的基本原则（二）胚胎移植的基本原则


（一）胚胎移植的生理学基础（一）胚胎移植的生理学基础成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在

外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个。

早期胚胎处于游离状态。胚胎发育不存在免疫问题。胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织上的联系。

胚胎的遗传性不受受体的影响。


（二）胚胎移植的基本原则（二）胚胎移植的基本原则胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性；受体和供体在发情时间上的同期性动物解剖位置上的一致性；空间环境的一致性

胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程

中不受不良因素的影响


三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序

（一）供体和受体的选择（二）供体的超数排卵（三）同期发情（四）供体母畜的配种（五）收集胚胎（六）胚胎的保存与培养（七）移植胚胎


（一）供体和受体的选择（一）供体和受体的选择供体应具有相当高的育种价值。供体生殖机能应处于较高的状态：产后 60天以上，无生殖系统疾病，体质强健。

受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种。

受体健康状况良好，已进入发情季节。供受体发情时间应接近或一致。


（二）供体的超数排卵（二）供体的超数排卵通常用于单胎家畜，其主要目的是让优良母

畜排出大量卵子，充分发挥繁殖潜能。通常采用 PMSG或 FSH ，以促进卵泡的发育。第一次配种后静脉注射 hCG或 LH ，可排出多数卵子。


（三）同期发情（三）同期发情为了胚胎移植成功，使供体受体发情同期化，让两者的生殖器官处于相同的生理阶段是必须的步骤。发情时间应该控制在 12h之内。

诱发同期发情的首选理想药物为PGF2α 及其类似物。


（四）供体母畜的配种（四）供体母畜的配种必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔 8-12 小时进行一次配种，直到发情结束。

配种前应对种公畜的精液进行质量检查。当优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本

交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。


（五）收集胚胎（五）收集胚胎胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液 PBS ，布林斯特液 SOF 合成输卵管液。

手术法收集胚胎– 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚– 子宫角冲胚

非手术法收集胚胎– 二路法– 三路法


收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。


胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间。

体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育。

胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中。

（六）胚胎的保存与培养（六）胚胎的保存与培养三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序

手术法移植非手术法移植

（七）胚胎移植（七）胚胎移植三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序

（一）供体牛的选择（一）供体牛的选择（二）超数排卵处理（二）超数排卵处理（三）采卵（三）采卵（四）检卵（四）检卵（五）胚胎的鉴定和分级（五）胚胎的鉴定和分级（六）胚胎的移植（六）胚胎的移植


四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植

应符较高的生产性能。 1.5～ 8 岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。

产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。生殖器官正常，无繁殖疾病。重复超数排卵间隔 60d 左右。最多连续处理 4 次后，自然繁殖后再使用。凡 2次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。

应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。


（一）供体牛的选择（一）供体牛的选择


1 FSH1 FSH 法法


放栓发情鉴定配种

0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 207:00 FSH 4ml

18:00 FSH 4 ml

7:00 FSH 2.5ml

18:00 FSH 2.5ml

7:00 FSH 2ml

14:00 PG6ml

18:00 FSH 2ml

7:00 FSH 1.5ml

14:00 取栓18:00 FSH 1.5ml

配种

配种

检查黄体

冲胚移胚

（二）超数排卵处理（二）超数排卵处理


1 FSH1 FSH 法法

处理时间 18 19 20 21 22 23 24

7: 00FSH2. 4ml 7: 00FSH1. 4ml 7: 00FSH1. 2ml

2: 00PG0. 8ml 2: 00取栓 6: 00FSH2. 4ml

6: 00FSH1. 4ml 6: 00FSH1. 2ml

发情鉴定配种

发情鉴定配种

冲胚移胚


2 PMSG2 PMSG 法法孕马血清促性腺激素 (PMSG) 处理法在情期的 11～ 12d ，一次肌注 PMSG2500～

3000IU， 48h 后宫注 PGF2α2.4mg 。发情后约 18h肌注等量的抗PMSG。

放栓发情鉴定配种

0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

12:00

PMSG

2500IU

12:00宫注氯前列烯醇 4ml

12:00

取栓抗血清

配种

配种

检查黄体

冲胚移胚



3 3 发情观察和配种发情观察和配种

PGF2α 处理后 40～ 48h ，大部分处理牛发情。通常要求从注 PG 第 2天傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后 4～6h 进行第一次输精，间隔 12h 后第二次输精。每次有效精子数不得少于 50×106，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。



（三）采卵（三）采卵


1 1 采卵时间采卵时间

以发情日为第 0d，在第 5～ 6d 检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体头数。第7d(或第 6～ 8d)非手术回收卵。


2 2 器械和冲卵液的准备器械和冲卵液的准备

灭菌处理过的冲卵管用 PBS液冲洗2～ 3次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入 PBS液的吊瓶在 37℃水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、

酒精棉球和冲洗消毒剂等。


3 3 供体牛的保定和麻醉供体牛的保定和麻醉供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用 2% 普鲁卡因 3 ～5ml作硬膜外麻醉，或肌注 2%静松灵l ml 。


4 4 外阴清洗、消毒外阴清洗、消毒麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。


5 5 冲卵管的插入和冲卵部位冲卵管的插入和冲卵部位助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指

和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持 30ml 注射器一次推入 10ml空气，然后按术者要求，以 1ml 计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气 14～ 16ml ，经产牛为 18 ～ 25ml 。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。


6 6 灌流方法灌流方法将吊瓶挂在距外阴部 1.0m 高处，接通三通管 (Y型 )和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌注 30～ 50ml，由少到多，每侧总量为 300～500ml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲 8～ 10次。或者用 50ml注射器，每次注入 30～50ml的 PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。全过程需在室温 (20℃左右 )操作。



7 7 术后处理术后处理两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液 (3g 土霉素粉溶于 100ml灭菌双蒸水或生理盐水 )或 10ml青霉素 (80万 u)和链霉素 (100万 u)，拔出冲卵管。


（四）检卵（四）检卵


1 1 过滤集卵杯过滤集卵杯 (( 日本产日本产 ))法法

回收结束后，用带 4G 针头的注射器冲洗滤网 2～ 3次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。


2 2 过滤杯过滤杯 (( 美国产美国产 ))法法滤去冲卵液，将过滤杯中留下的 30～50ml倒入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯2～ 3次，一并倒入平皿，置镜下检查。


3 3 沉淀法沉淀法 ((或滤网吸液或滤网吸液法法 ))

将回收的冲卵液注入 1000ml 量筒，在20～ 25℃下静置 20～ 30min ，用导管吸去上层液体。或者按好滤网，用导管在滤网上吸去上部冲卵液，将残留的 80～ 100ml倒入平皿内检卵。


4 4 检卵前的准备检卵前的准备在酒精灯上拉好内径为 200～ 300um 的玻璃吸管和玻璃棒，在吸管上连接乳胶管 ( 也可用 1ml 一次性注射器与一支采血管接一起 )。在小培养皿内做好含 10%或 20%牛血清的 PBS 保存液液滴 3～ 5个，覆盖

上液体石蜡油，作好编号，放入培养箱待用。


5 5 检卵检卵用玻璃棒清除卵外围的粘液、杂质。用吸管

将卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的 PBS 保存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵 3～ 5 次。室温 20～ 25℃，需 2 人进行检卵及胚胎鉴定。


（五）胚胎的鉴定和分级（五）胚胎的鉴定和分级


1 1 胚胎的鉴定胚胎的鉴定

在 100～ 200 倍实体解剖镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。

凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均为未受精卵。


二细胞至四细胞胚胎二细胞至四细胞胚胎


胚胎的早期发育过程胚胎的早期发育过程



通常受精后通常受精后 66～～ 88dd 非手术回收的正常受精卵发育情非手术回收的正常受精卵发育情况如下：况如下：

桑椹胚：桑椹胚：发情后第 5～ 6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，并占据透明带内腔的大部分。

致密桑椹胚：致密桑椹胚：发情后第 6～ 7d 回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔 60%～ 70%。


早期囊胚：早期囊胚：发情后第 7～ 8d 回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔 70%～ 80%，难以分清内细胞团和滋养层。囊胚：囊胚：发情后第 7～ 8d 回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。扩大囊胚：扩大囊胚：发情后第 8 ～ 9d 回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的 1.2～ 1.5 倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的 1/3 。


孵育胚：孵育胚：一般在发情后9～11d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。

1.1. 一细胞一细胞 2.2. 二细胞二细胞 3.3. 四细胞四细胞 4.4.八细胞八细胞 5.5.密集桑葚胚密集桑葚胚 6.6.桑葚配桑葚配 7.7.囊胚囊胚 8.8. 扩张囊胚扩张囊胚


2 2 胚胎的分级胚胎的分级 A 级胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。


B 级轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占 10%～ 30% 。


C 级轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达 30%～ 50%。


（六）胚胎的移植（六）胚胎的移植


1 1 受体牛的选择标准受体牛的选择标准

年龄在 3～ 8岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。

繁殖性能正常，产后 60d 以上，并有两次以上的正常自然发情记录。

泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精未孕的牛。


2 2 受体牛的饲养管理受体牛的饲养管理●做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲

料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。

●组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。

●农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。

● 防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激反应。


3 3 供体牛、受体牛的同期发情供体牛、受体牛的同期发情

自然发情自然发情根据受体牛的发情观察，与供体牛发

情前后相差一天内的牛，可作为受体。


使用使用 PGF2α(PGF2α( 一次宫注一次宫注 ))诱发发情诱发发情一般在供体牛注射 PGF2α 前一天，给处于情期 8～ 1

5d 且直检黄体好的受体牛一次宫注 PGF2α2mg诱发发情。

两次两次 PGF2αPGF2α 处理处理

在不考虑发情周期的情况下，可间隔 11d ，前后两次宫注 PGF2α ，受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。


4 4 发情观察发情观察原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察

30min 发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。

若在发情后 36h以后排卵的牛不能用作受体。


供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差

移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体牛的发情日比供体牛早一天为 +1 ，晚一天为 -1 ，同日发情为 0。超过 2d 不能用于移植。


按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差

可将致密桑椹胚移植给发情 6d 的受体牛，将早期囊胚移植给发情 7d 的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情 8d 的受体牛。


5 5 器械准备器械准备

仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时，先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。


6 6 移植前胚胎装管移植前胚胎装管

胚胎移植时可用 0.25ml细管分三段吸入PBS 保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用于移植。


胚胎装管示意图胚胎装管示意图


7 7 受体牛的准备受体牛的准备将受体牛保定，清除粪便，肌注 2%静松灵 lml 或用 2%的普鲁卡因 3ml在 1、2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经

酒精棉球消毒。


8 8 移植移植

术者用左手压开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移

植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。


冲胚冲胚


胚胎移植产出的犊牛胚胎移植产出的犊牛


五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植第二节胚胎移植第二节胚胎移植

（一）优质羊的品种（一）优质羊的品种（二）供体羊超数排卵（二）供体羊超数排卵（三）供体、受体同期化（三）供体、受体同期化（四）供体羊的配种（四）供体羊的配种（五）胚胎回收（五）胚胎回收（六）胚胎质量评价（六）胚胎质量评价（七）胚胎的移植（七）胚胎的移植

波尔羊：原产于南非，意为农民。头颈部为棕色，有白色流星。体形成长筒形。生长快，耐粗饲，成年体重公 80-100 公斤，母 60-70 公斤。

（一）优质羊的品种（一）优质羊的品种五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植

杜泊羊是由有角陶赛特羊和波斯黑头羊杂交育成，最初在南非较干旱的地区进行繁殖和饲养，因其适应性强、早期生长发育快、胴体质量好而闻名。杜泊羊分为白头和黑头两种。

五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植

萨福克 [Suffolk] 羊属肉用羊品种，世界上最好的终端杂交父本品种，公羊体重 90-120kg ，母羊体重 80-90kg ，产羔率 150% 。


无角陶塞特 [Poll Dorset] 羊。属肉用羊品种。公羊体重 90-110kg ，母羊体重 65-75kg ，产羔率 170% ，常年发情。


夏洛来 [harolais] 羊。属肉用羊品种。公羊体重 100-150kg ，母羊 75-95kg ，产羔率 180% 。


特克塞尔羊。属长强毛型肉毛兼用羊。公羊体重 110－ 140kg ，母羊 70-90kg ，产羔率 200% 。


萨能奶山羊：原产于瑞士，是世界上最优秀的奶山羊品种之一，是奶山羊的代表型。现有的奶山羊品种几乎半数以上都程度不同的含有萨能奶山羊的血缘。


1 1 绵羊的超排技术基本原理是：绵羊的超排技术基本原理是：在发情周期接近结束时（周期 11-13天）或在采用孕激素处理进行发情调控结束时注射促进卵泡发育的药物。

（二）供体羊超数排卵（二）供体羊超数排卵五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植

2 2 超排激素：超排激素： eCGeCG ：：绵羊超排中应用最广泛的促性腺激。主

要发挥 LH和 FSH 生物活性。能够促进卵泡生长、雌激素产生、排卵、黄体化和孕酮合成。

FSH-pFSH-p：： FSH-P是垂体制剂。在注射 FSH-P时需要进行一些列的注射以启动卵巢反应。

hMGhMG ：：超排效果与 eCG相当。


（二）供体羊超数排卵（二）供体羊超数排卵

3 3 超排处理方法：超排处理方法：单次 FSH 处理：绵羊在同期发情撤出海绵前 36 小时一次注射 FSH ，期排卵率与多次注射 FSH效果相同。

FSH-P与 eCG 合用：主要用于解决有些绵羊不出现超排反应。

PGs与Gn ：用 eCG 处理后 24-72 小时，注射 100微克PGs ，大多数绵羊可在处理后 36 小时发情。

孕激素与Gn ：在撤出孕激素海绵前 48 小时、 24 小时或在撤出海绵的同时一次注射 eCG 。



超排后的卵巢超排后的卵巢


重复超排：重复超排：绵羊可在 6-9个月的时间内进行三次超排，超排可在乏情的季节进行，也可以在繁殖的季节进行，对超排效果没有明显影响。且对以后受孕也没有影响。



进行绵羊胚胎移植时供体与受体之间的生殖状态必须同期化。如果供体与受体同期化程度相差 12小时之内，则可获得较高的怀孕率。

采用一套可行的超数排卵方案同时对供体母羊进行超排。供体母羊发情后对其配种。

（三）供体、受体同期化（三）供体、受体同期化五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植

自然交配自然交配

（四）供体羊的配种（四）供体羊的配种五、羊的胚胎移植五、羊的胚胎移植

人工受精人工受精

（五）胚胎回收（五）胚胎回收可采用手术收集子宫角冲洗液。（将绵羊全身麻醉，通过腹中线切口暴露卵巢、输卵管和子宫，然后在靠近输卵管端插进导管，轻压子宫收集冲洗液。）

也可采用腹腔镜技术或实时超声技术辅助进行微创冲胚。


冲卵冲卵


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捡卵捡卵


（六）胚胎质量评价（六）胚胎质量评价绵羊在受精后 48h ，产生 4 细胞胚胎；第 5 天为 24-32细胞桑葚胚；第 6 天时大多数胚胎发育到致密晚期桑葚胚或囊胚；第7 天时大多数为囊胚。


（七）胚胎的移植（七）胚胎的移植将胚胎移入发育的相应部位

受体羊两个子宫角各移植一枚胚胎受体羊两个子宫角各移植一枚胚胎


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胚胎移植产出的羔羊胚胎移植产出的羔羊


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第五章 繁殖辅助技术

第五章繁殖辅助技术