Д. А. Равчеев

Д. А. Равчеев

Регуляция транскрипции в прокариотахРегуляция транскрипции в прокариотах

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Учебно-научный центр “Биоинформатика”Институт Проблем Передачи Информации РАН

Изучение методами сравнительной геномикиИзучение методами сравнительной геномики

Изучение регуляции методами сравнительной Изучение регуляции методами сравнительной геномикигеномики

Поиск потенциальных регуляторных последовательностей

● Пример: сайты связывания факторов транскрипции

Что дает изучение регуляции с помощью сравнительной геномики

● Полезно для функциональной аннотации и метаболической реконструкции

● Интересно само по себе

Исследование эволюции

Обучающая выборка – набор сайтов (обычно экспериментально определенных), на основании которого строится представление о структуре сигнала.

purL tccACGCAAACGGTTTCGTcagcvpA cctACGCAAACGTTTTCTTttt purC gatACGCAAACGTGTGCGTctg purH gttGCGCAAACGTTTTCGTtac purR taaAGGCAAACGTTTACCTtgc prsA cgcAAGAAAACGTTTTCGCgag codB cccACGAAAACGATTGCTTttt purE gccACGCAACCGTTTTCCTtgc purM gtcTCGCAAACGTTTGCTTtcc

Ген Сайт

Обучающая выборка :

Пример:Пример:

ACGCAAACGTTTGCGTКонсенсусная последовательность :

Поиск потенциального сайта в геномной последовательности :

carA atgcaatcttcttgctgCGCAAgCGTTTtCcagaacaggttagatgatctttttgtcgctt ACGCAAACGTTTGCGT

11 нуклеотидов из 16 совпадают с консенсусом

Поиск потенциальных регуляторных сайтовПоиск потенциальных регуляторных сайтов

Поиск по консенсусуПоиск по консенсусу


Поиск по консенсусуПоиск по консенсусу

Недостатки метода:

1. Не учитывается разная значимость позиций

Абсолютно консервативная позиция

Консервативная позиция с малым числом замен

Слабо консервативная позиция

2. Не учитывается разность частот нуклеотидов в одной позиции А – 11% С – 0%

G – 33% T – 56%

ACGCAAACGGTTTCGTACGCAAACGTTTTCTTACGCAAACGTGTGCGTGCGCAAACGTTTTCGTAGGCAAACGTTTACCTAAGAAAACGTTTTCGCACGAAAACGATTGCTTACGCAACCGTTTTCCTTCGCAAACGTTTGCTT


Матрицы позиционных весовМатрицы позиционных весов

Обучающая выборка :

purL ACGCAAACGGTTTCGTcvpA ACGCAAACGTTTTCTT purC ACGCAAACGTGTGCGT purH GCGCAAACGTTTTCGT purR AGGCAAACGTTTACCT prsA AAGAAAACGTTTTCGC codB ACGAAAACGATTGCTT purE ACGCAACCGTTTTCCT purM TCGCAAACGTTTGCTT

Вес каждого нуклеотида в каждой позиции :

Характеризует встречаемость

данного нуклеотида в данной позиции

Характеризует консервативность

данной позиции

Консенсус : ACGCAAACGTTTGCGT

N (b,k)

позиция A C G T

1 7 0 1 1

2 1 7 1 0

3 0 0 9 0

Матрица (фрагмент)

a c g t

0.32 -0.27 -0.03 -0.03

-0.03 0.32 -0.03 -0.27

-0.16 -0.16 0.48 -0.16


Матрицы позиционных весовМатрицы позиционных весов

Поиск потенциального сайта в геномной последовательности :

carA atgcaatcttcttgctGCGCAAGCGTTTTCCAgaacaggttagatgatctttttgtcgctt

a c g t 0.32 -0.27 -0.03 -0.03 -0.03 0.32 -0.03 -0.27 -0.16 -0.16 0.48 -0.16 0.12 0.35 -0.24 -0.24 0.48 -0.16 -0.16 -0.16 0.48 -0.16 -0.16 -0.16 0.40 0.03 -0.21 -0.21 -0.16 0.48 -0.16 -0.16 -0.16 -0.16 0.48 -0.16 -0.03 -0.27 -0.03 0.32 -0.21 -0.21 0.03 0.40 -0.16 -0.16 -0.16 0.48 -0.06 -0.30 0.13 0.23 -0.16 0.48 -0.16 -0.16 -0.31 0.04 0.17 0.11 -0.21 0.03 -0.21 0.40

пози

ция

Вес найденного сайта : 4,57

Вес сайта :

Недостаток метода :

ложные предсказания сайтов, вызванные случайным сходством последовательностей


Распознающее правилоРаспознающее правило

Матрица позиционных весов

Область поиска сайтов

1.

2.

3.

как привило, в потенциальной реуляторной области гена: - 400 … +100 п.н. от старта трансляции.

Пороговое значение для веса сайта

а) Минимальный вес сайтов из обучающей выборки

6,23 5,945,945,815,795,785,555,535,32

cvpApurLpurHpurCpurMpurEcodBpurRprsA

ACGCAAACGTTTTCTTACGCAAACGGTTTCGTGCGCAAACGTTTTCGTACGCAAACGTGTGCGTTCGCAAACGTTTGCTT ACGCAACCGTTTTCCTACGAAAACGATTGCTTAGGCAAACGTTTACCT AAGAAAACGTTTTCGC

Ген Сайт Вес

пороговое значение

Сайты из обучающей выборки, оцененные по матрице весов

б) В соответствии с ожидаемым размером регулона

Сравнительный подход к изучению регуляцииСравнительный подход к изучению регуляции

Метод проверки соответствияМетод проверки соответствия

Базовый геномгены

сайты



Другие геномы

Ген регулируется

Базовый геном


Ген регулируется Ген НЕ регулируется





Ген регулируется Ген НЕ регулируется ?





Ключевые понятияКлючевые понятия

Регулон (Regulon)

— группа генов, непосредственно регулирующихся одной регуляторной системой в одном организме

Обобщенный регулон (Regulog)

— группа генов, непосредственно регулирующихся одной регуляторной системой в группе родственных организмов



Геном 1 Регулон 1

Геном 2

Геном 3

Геном 4

Регулон 2

Регулон 3

Регулон 4




Геном 2

Геном 3

Геном 4

Регулон 2

Регулон 3

Регулон 4

Обобщенный регулон




Геном 2

Геном 3

Геном 4

Регулон 2

Регулон 3

Регулон 4

Обобщенный регулон

Ядро обобщенного регулона

Открытие Открытие BioYBioY, транспортера биотина, транспортера биотина

Исследование обобщенного Исследование обобщенного BirA-BirA-регулонарегулона

Биотин (витамин Н) – кофактор ферментов карбоксилаз и декарбоксилаз, служит переносчиком карбоксильных групп

BirA – фактор транскрипции, репрессор, регулятор генов биосинтеза биотина

Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2002) Conservation of the biotin regulon and the BirA regulatory signal in Eubacteria and Archaea. Genome Res. 12 (10). 1507-1516.

Исследование BirA-зависимой регуляции в прокариотах :

● Бациллы

● Клостридии

● Актинобактерии

● Зеленые серные бактерии

● Цианобактерии

-протеобактерии

- протеобактерии



● Археи

●

●

●

●


Исследование обобщенного Исследование обобщенного BirA-BirA-регулонарегулона

● имеет консервативные сайты связывания BirA во всех исследованных геномах

● не имеет гомологов с известной функцией

● в белках семейства BioY обнаружено шесть потенциальных трансмембранных сегментов

bioY – новый член обобщенного BirA-регулона


Дополнительные соображенияДополнительные соображения

Хромосомные кластеры

1. cbiO-cbiQ – предполагаемые компоненты ABC-транспортной системы

( Указывает на то, что BioY может выполнять транспортную функцию )

2. Гены биосинтеза жирных кислот.

( Биотин является кофактором карбоксилаз, ферментов данного метаболического пути )

3. birA.

гены располагаются в одном опероне или просто рядом на хромосоме такое расположение сохраняестя в различных геномах

bioY кластеризуется с :

Цинк-зависимая регуляция Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белковпаралогов рибосомных белков

Паралоги рибосомных белковПаралоги рибосомных белков

L36, L33, L31, S14 – единственные рибосомные белки, дуплицированные более, чем в одном геноме

L36, L33, L31, S14 – четыре из семи рибосомных белков, содержащих мотив цинковой ленты: четыре эволюционно консервативных цистеина (в некоторых случаях один из них может быть заменен на гистидин)

В случае наличия нескольких паралогов, одна одна из копий L36, L33, L31, S14 содержит мотив цинковой ленты, тогда как другие – нет

Makarova K.S., Ponomarev V.A., Koonin E.V. (2001) Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genome Biology. 2 (9). RESEARCH 0033.


Паралоги рибосомных белковПаралоги рибосомных белков

Makarova K.S., Ponomarev V.A., Koonin E.V. (2001) Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genome Biology. 2 (9). RESEARCH 0033.

Белки

L. lactisYersinia pestis, Vibrio cholerae

Klebsiella pneumoniae

Escherichia coli

S14L31L33L36

Геном Белки

L. lactisYersinia pestis, Vibrio cholerae


Escherichia coli

S14L31L33L36

Геном

- есть цинковая лента

- нет цинковой ленты

Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2003) Comparative genomics of bacterial zinc regulons: enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17). 9912-9917


Исследование цинк-зависимой регуляции:

nZUR – в - и -протеобактериях (грам-отрицательные)

pZUR – в бактериях Bacillus subtilis, Staphylococcus spp., Listeriaspp. и Enterococcus faecalis (грам-положительные, класс Bacilli)

AdcR – в бактериях Streptococcus spp. и Lactococcus lactis (грам-положительные, класс Bacilli)


Обнаружены паралоги рибосомных белков в других геномах (выделены жирным)

Найдены потенциальные сайты связывания регуляторов метаболизма цинка перед паралогами, не имеющими цинковой ленты.

Белки

S. pyogenes, L. lactis

Streptococcus pneumoniae, S. mutans

Enterococcus faecalis

Listeria monoocytogens, L. innocula

Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis Yersinia pestis, Vibrio cholerae


Escherichia coli, Salmonella typhi

S14L31L33L36

ГеномРегулятор

nZUR

pZUR

AdcR

Белки

S. pyogenes, L. lactis

Streptococcus pneumoniae, S. mutans

Enterococcus faecalis

Listeria monoocytogens, L. innocula

Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis Yersinia pestis, Vibrio cholerae


Escherichia coli, Salmonella typhi

S14L31L33L36

ГеномРегулятор

nZUR

pZUR

AdcR

- есть цинковая лента

- нет цинковой ленты

, , , - перед геном найдены потенциальные сайты для соответствующего регулятора


Зачем Zn-зависимым регуляторам контролировать синтез рибосомных белков?Гипотеза

Известно, что Zn является необходимым компонентом ряда ферментов

Достаточно Достаточно ZnZn Недостаток Недостаток ZnZn

Рибосомныебелки

Ферменты

В случае недостатка Zn часть в рибосому включаются белки, не содержацие цинка: рибосома «отдает» часть цинка ферментам


Гипотеза

Достаточно Достаточно ZnZn Недостаток Недостаток ZnZn

Рибосомныебелки

Ферменты

Экспериментальное подтверждение для L31L31 Bacillus subtilis

Nanamiya H., Akanuma G., Natori Y., Murayama R., Kosono S., Kudo T., Kobayashi K., Ogasawara N., Park S.M., Ochi K., Kawamura F. (2004) Zinc is a key factor in controlling alternation of two types of L31 protein in the Bacillus subtilis ribosome. Mol. Microbiol. 52 (1). 273-283.

Биосинтез лейцина в дрожжахБиосинтез лейцина в дрожжах

Начинается в митохондрии, заканчивается в цитоплазме

Транспортер промежуточного продукта, изопропилмалата, не известен

Кандидат: YOR271cp

Локализован в митохондрии

Предсказаны 4 трансмембранных сегмента

Имеется консервативный сайт связывания лейцинового регулятора Leu3p

Регуляторная область YOR271c связывает Leu3p в ChIP-chip эксперименте

Гомологичен транспортеру трикарбоксилатов крысы

(хотя чувствительность и специфичность эксперимента ~50%, других кандидатов с консервативными сайтами нет)

Однажды Гегель ненароком

И, вероятно, наугад

Назвал историка пророком,

Предсказывающим назад

Изучение эволюции регуляцииИзучение эволюции регуляции

Б. Пастернак

Историк - это вспять обращенный пророк

Г. Гегель

Предсказание новых членов регулонаспособствует пониманию устройства прокариотической клетки

Изучение эволюции регуляторных систем

Регуляция биосинтеза Регуляция биосинтеза NADNAD

Экспериментальные данныеЭкспериментальные данные

Escherichia coli и Salmonella spp.

Структура белка NadR :

ДНК-связывающий

никотинамид-нуклеотидаденилтрансферазный

рибозилникотинамидкиназный

NadR-регулон :


Данные сравнительной геномикиДанные сравнительной геномики

Отсутствует ДНК-связывающий домен

Enterobacteriales

Pasteurellales



Исчезновение регулона

Enterobacteriales

Pasteurellales



En

tero

bac

teri

ales

Ген nadA регулируется у всех предствителей порядка Enterobacteriales



Гены nadB и pncB регулируются у близких родственников E. coli а также у S. marcescens

En

tero

bac

teri

ales



En

tero

bac

teri

ales

Авторегуляция nadR обнаружена у ряда организмов, формирующих отдельную ветвь на филогенетическом дереве


Модель эволюцииМодель эволюции

I. Появление нового регулятора

1. Pasteurellales – регулон отсутствует, иногда белок не имеет ДНК-связывающего домена

2. Enterobacteriales – белок используется в качестве фактора транскрипции

a) Регуляция гена nadA

b1) Регуляция генов nadB и pncB b2) Авторегуляция гена nadR

Регуляторные взаимодействия могут менятся даже в близкородственных геномах и даже в случае регуляции важных метаболических путей

Gerasimova A.V., Gelfand M.S. (2005) Evolution of the NadR regulon in Enterobacteriaceae.J. Bioinform. Comput. Biol. 3(4). 1007-1019.

Эволюция Эволюция FruR-FruR-регулонарегулона


FruR (Cra) Escherichia coli K-12

Фактор транскрипции, относится к LacI-семейству

Связывается с ДНК в отсутствии лигандов, в присутствии лигандов диссоциирует от ДНК

Может являться как репрессором, так и активатором

Координирует потоки метаболизма углеводов

активация транскрипции репрессия транскрипции

лиганды


Предсказанная регуляцияПредсказанная регуляция

Enterobacteriales

Pasteurellales

Vibrionales

Pseudomonadales

исследован 21 геном из 4х порядков предсказана регуляция 7 оперонов

активация транскрипции репрессия транскрипции

Экспериментальные данные

предсказанная регуляция

Предсказан регуляторный

каскад

-п

рот

еоба

кте

ри

и



регуляция оперона fruBKA сохраняется в большинстве геномов

FruR – изначально регулятор единственного оперона fruBKA



Регулон отсутствует

Pasteurellales :

● в ряде геномов не найдено ортологов для FruR● в других геномах отсутствуют консервативные сайты перед предполагаемыми членами регулона





Enterobacteriales :

● FruR регулирует гены фосфотрансферазных систем, гликолиза/глюконеогенеза, цикла Кребса, NADH-дегидрогеназы, а также глобального регулятора CRP


Расширение регулона, FruR – глобальный регулятор




Escherichia coli и Salmonella spp. :


Расширение регулона, FruR – глобальный регулятор

● FruR также регулирует опероны mtlADR, fbp, pckA и aceBAK

Дальнейшее расширение регулона

Новые тенденции в сравнительной геномикеНовые тенденции в сравнительной геномике

1. Исследование нескольких функционально связанных регуляторных систем

Восстановление оксидов азота в различных группах бактерий

Rodionov D.A., Dubchak I.L., Arkin A.P., Alm E.J., Gelfand M.S. (2005) Dissimilatory metabolism of nitrogen oxides in bacteria: comparative reconstruction of transcriptional networks. PLoS Comput. Biol. 1. e55.

Ravcheev D.A., Gerasimova A.V., Mironov A.A, Gelfand M.S. Complex comparative genomic analysis of respiration regulation in gamma-proteobacteria. Genome Biol. [in press]

2. Изучение таксон-специфической регуляции

Сравнение геномов организмов, относящихся к одной таксономической группе

Развитию методики способствует увеличение количества полных геномных последовательностей

Регуляция дыхания в протеобактериях

Изучение таксон-специфической регуляцииИзучение таксон-специфической регуляции

Enterobacteriales базовый геном

Pasteurellales

Классическая методика


Классическая методика


Pasteurellales

Проведена стандартная процедура проверки соответствия

Таксон-специфичнаярегуляция


Классическая методика - недостатки


Pasteurellales

Ни в базовом геноме, ни в геномах родственных видов не найдено сайтов

Потеря данных о таксон-специфичной регуляции


Модифицированная методика

Базовый геном не рассматривается

В центре внимания – геномы организмов из исследуемого таксона

Pasteurellales

Поиск сайтов во всех геномах

Попарное сравнение

Ген регулируется Ген НЕ регулируется

P. multocida

A. actinomycetemcomitans

H. influenzae

H. ducreyi


Escherichia coli

Стимул

Сенсор

Регулятор

Анаэробные условия Нитрат / Нитрит

Регуляция транскрипции

РегуляцияРегуляция дыхания дыхания --протеобактерийпротеобактерий

Данные сравительной геномикиДанные сравительной геномики

Yersinia spp., Pasteurellales, Vibrionales

Стимул

Сенсор

Регулятор

Анаэробные условия Нитрат / Нитрит

Регуляция транскрипции

Нитрат-нитритное дыхание регулируется лишь одной регуляторной системой


Исследованные геномыИсследованные геномы

Enterobacteriaceae

Pasteurellaceae

Vibrionaceae

Попарное сравнение всех геномов из одного таксона

Исследование сразу трехтрех регуляторных систем :

● Fnr

● ArcA

● NarP


Регуляторные каскадыРегуляторные каскады

Escherichia coli

- репрессия- активация

- предсказанная активация

экспериментальные данные- амбивалентная регуляция

Fnr – главный регулятор, контролирующий экспрессию генов других регуляторов Сложная система регуляторных каскадов для регуляторов нитрат-нитритного

дыхания



Yersinia spp.

Fnr – главный регулятор

NarP не участвует в регуляторных каскадах● Редукция NarP регулона



Vibrionales

Fnr – главный регулятор

Увеличение роли ArcA в регуляторных каскадах● Увеличение ArcA регулона



Pasteurellales

Снижение роли Fnr в регуляторных каскадах

Увеличение роли ArcA и NarP в регуляторных каскадах● Увеличение NarP регулона

Существенные изменения в иерархии регуляторов


ВыводыВыводы

1. В ходе эволюции регуляторные взаимодействия могут существенно изменяться

2. Данные изменения носят таксон-специфичный характер

3. Изменения в структуре регуляторных каскадов коррелируют с изменениями в структуре регулонов


БлагодарностиБлагодарности

Гельфанд М.С.

Миронов А.А.

Рахманинова А.Б

Герасимова А.В.

Родионов Д.А.

Панина Е.М.

Закирзянова В.

Спасибо за внимание !

Documents

Д. А. Равчеев