Введение в кристаллографию макромолекул Лекция 3 Владимир Юрьевич ЛУНИН

Введение в кристаллографию макромолекул

Лекция 3

Владимир Юрьевич ЛУНИН

Институт Математических Проблем Биологии РАНПущино

http://www.impb.ru/lmc

1

0 2sin2cos2h

hh xhBhxAAx

1

0

2cos dxhxxAh 1

0

2sin dxhxxBh

Вычисление коэффициентов ряда Фурье

Любая функция на отрезке [0,1] может быть разложена, при этом единственным образом, в ряд Фурье.

hhhh hxFxhBhxA 2cos2sin2cos

coshh FA

sinhh FB

22hhh BAF

h

hh A

Btg

hhF , модуль и фаза коэффициентов Фурье, отвечающих частоте h

-

max

10 2cos2

h

hhh hxFFx

hkl

hklhkl lzkyxhBlzkyhxAAzyx 2sin2cos2,, 000

1,,0,, zyxzyx

hkl

hklhkl lzkyhxFFzyx 2cos2,, 000

V

hkl dxdydzlzkyhxzyxA 2cos,,

V

hkl dxdydzlzkyhxzyxB 2sin,,

22hklhklhkl BAF

hkl

hklhkl A

Btg

Ряды Фурье для функций нескольких переменных

V

hkl dxdydzlzkyhxzyxA 2cos,,

V

hkl dxdydzlzkyhxzyxB 2sin,,

22hklhklhkl BAF

hkl

hklhkl A

Btg

Вклады в амплитуду и фазу рассеянной волны, зависят от распределения электронной плотности в элементарной ячейке и могут быть рассчитаны по формулам

l

kh

cσσ

bσσ

aσσ

,

,,,,

0

00

h,k,l - целые

cbar zyx

Рентгеновский эксперимент с монокристаллом позволяет измерить интенсивность волн, рассеянных в направлениях, определяемых условиями

1. Рентгеновский дифракционный эксперимент с эксперимент с монокристаллом позволяет измерить модули коэффициентов в разложении функции распределения электронной плотности в ряд Фурье.

2. Знание значений модулей и фаз дает возможность рассчитать "синтез Фурье электронной плотности"

hkl

hklhkl lzkyhxFFzyx 2cos2,, 000

Shkl

hklhklS lzkyhxFFzyx 2cos2,,~000

3. Наличие модели структуры дает возможность рассчитать гипотетические значения модулей и фаз и сравнить модули с экспериментальными значениями

Подходы к решению фазовой проблемы

SIR - Single Isomorphous ReplacementОднократное изоморфное замещение;

MIR - Multiple Isomorthous ReplacementМножественное изоморфное замещение;

AD - Anomalous DispersionАномальное рассеяние;

MAD - Multiwavelength Anomalous DiffractionМноговолновое аномальное рассеяние;

MR - Molecular ReplacementМолекулярное замещение;

Direct Methods (ab initio methods)"Прямые" методы.

Подходы к решению фазовой проблемы

SIR - Single Isomorphous ReplacementОднократное изоморфное замещение;

{FP} {FPH}

{P}

"нативный" белок изоморфное производное

• метод позволяет решать фазовую проблему;

• наличие каналов в кристаллах белка позволяет получать производные;

• изоморфизм имеет место лишь приближенно;

• проблема определения мест присоединения тяжелых меток;

• проблема создания тяжелых меток для больших макромолекулярных комплексов

• фазы определяются неоднозначно; необходимо несколько производных.

MIR - Multiple Isomorthous ReplacementМножественное изоморфное замещение;

AD - Anomalous DispersionАномальное рассеяние

Из кинематической теории рассеяния следует, что ss FF

(закон Фриделя). При наличии аномально рассеивающих атомов (а.р.а.) закон нарушается. Измерения F(-s) и F(s) становятся независимыми. Их сравнение позволяет решать фазовую проблему.

• метод позволяет решать фазовую проблему;• в белках встречаются а.р.а.; можно

использовать производные с тяжелыми атомами;

• проблема определения мест нахождения аномально рассеивающих атомов;

• фазы определяются неоднозначно;

MAD - Multiwavelength Anomalous DiffractionМноговолновое аномальное рассеяние;

В основе подхода лежит изменение интенсивности аномального рассеяния при изменении длины волны.

• один из активно используемых методов решения фазовой проблемы;

• возможность использования селен-метиониновых производных;

• проблема определения мест нахождения аномально рассеивающих атомов;

• не всегда получается.

Methionin

C

S

N

O

Se

Синтез Фурье электронной плотности для белка альдоз-редуктазы. Разрешение 0.9Å.Фазы определены методом MAD.


Комбинированные синтезы Фурье

NM rrrr ,...,...,, 21

Mrrr ,...,, 21

модель структурные факторыfullhkl

fullhklF ,

parthkl

parthklF ,

Синтез Фурье Mrrr ,...,, 21 NM rr ,...

fullhkl

fullhklF ,

parthkl

fullhklF ,

parthkl

parthklF ,

+ ++ -? ?


NM rrrr ,...,...,, 21

Mrrr ,...,, 21


fullhklF ,

parthkl

parthklF ,


fullhkl

fullhklF ,

parthkl

fullhklF ,

parthkl

parthklF ,

+ +++

-1/2


NM rrrr ,...,...,, 21

Mrrr ,...,, 21


fullhklF ,

parthkl

parthklF ,


fullhkl

fullhklF ,

parthkl

fullhklF ,

parthkl

parthklF ,

+ +++

-1/2

Luu ,...1

Luu ,...1

-+

1/2 1/2


План действий:

А. Найти в банке белок с известными координатами (пробную модель), чья структура ожидается быть похожей на структуру исследуемого белка.

Б. Разместить пробную модель в элементарной ячейке так, чтобы получить максимальное соответствие этой модели исследуемой структуре.

В. Рассчитать по оптимально размещенной пробной модели значения фаз структурных факторов.


?

В общем случае положение твердого тела определяется шестью параметрами (, , , tx, ty, tz).

пробная модель

углы вращения вектор трансляции


Для каждого допустимого набора параметров (, , , tx, ty, tz) можно рассчитать соответствующие значения модулей структурных факторов

Хотим иметь наилучшее совпадение с экспериментально определенными модулями

Оптимальное размещение пробной модели

zyxcalchkl tttF ,,,,,

obshklF

min,,,,,2

hkl

obshklzyx

calchkl FtttF

Задачу можно разделить на два этапа: поиск углов вращения ("функция вращения") и поиск трансляции ("функция трансляции").


С нахождением оптимальной ориентации и положения пробной модели работа не кончается!

Надо откорректировать модель.


• один из наиболее используемых методов решения фазовой проблемы;

• чем больше белков исследовано, тем шире возможности метода;

• необходимо наличие гомологичной пробной модели;

• результат зависит от обоснованности гипотезы о гомологии между пробной моделью и исследуемой структурой.


Где взять гомологичную пробную модель?

• среди структур, определенных РСА;• среди структур определенных ЯМР;• электронная микроскопия;• теоретическое предсказание модели.

"Прямые" методы

Основаны на информации общего типа:• атомность;• неотрицательность функции распределения

электронной плотности;• разделенность атомов в пространстве;• связность областей высокой электронной

плотности;• гистограммы синтезов Фурье.

Низкомолекулярные структуры - рутинное использование;

Небольшие белки, высокое разрешение -ряд успешных попыток;

Большие комплексы, среднее разрешение -в процессе разработки, отдельные успешные попытки.

Модель структуры

ATOM 30 N SER 2 13.117 9.840 39.210 1.000 12.49

YX

Z

абсолютные координаты(X,Y,Z)Ортогональная система координат, единица измерения Å.

ab

c

относительные координаты(x,y,z):r=xa + yb +zc

CRYST1 49.430 66.790 47.400 90.00 92.40 90.00SCALE1 0.020231 0.000000 0.000848 0.000000SCALE2 0.000000 0.014972 0.000000 0.000000SCALE3 0.000000 0.000000 0.021116 0.000000

xfrac = S11X + S12Y + S13Z + U1 yfrac = S21X + S22Y + S23Z + U2

zfrac = S31X + S32Y + S33Z + U3

S

U

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

Температурный фактор(temperature factor / Atomic Displacement Parameter /

ADP)

5

1

2223

4exp

4

j jjj BB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях

температурного фактора B.

5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

10

15

20

25

30

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20

B=50



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20

B=50

B=100



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

0

5

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20

B=50

B=100



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)

228 uB u - смещение атома

0

5

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20

B=50

B=100



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)


B2 0.16

5 0.25

10 0.36

20 0.50

50 0.80

100 1.13

2u

0

5

-3 -2 -1 0 1 2 3

B=0

B=2

B=5

B=10

B=20

B=50

B=100



5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

(e/Å3)

r (Å)


B2 0.16

5 0.25

10 0.36

20 0.50

50 0.80

100 1.13

2u

ATOM 30 N SER 2 13.117 9.840 39.210 1.000 12.49

Изотропный температурный фактор

5

1

2223

4exp

4

j jjj BBBB

Cr

r

4exp

2sBsfsf

Анизотропный температурный фактор

ATOM 30 N SER 2 13.117 9.840 39.210 1.000 12.49ANISOU 30 N SER 2 1510 2105 1130 447 -393 -1019

Коэффициент заполнения / заселенность / occupancy

Идеальный кристалл - содержимое всех элементарных ячеек идентично.


"Реальный" кристалл - молекула "воды" присутствует только в 73% элементарных ячеек.


ATOM 6626 O HOH 4951 21.882 15.425 26.797 0.500 8.74

X Y Z T B

Для данных координат атома коэффициент заполнения показывает какой процент элементарных ячеек кристалла содержат атом в указанной позиции.

4exp

2sBsfTsf jjjj


Альтернативные конформации

ATOM 5490 N ATRP 295 29.848 2.643 16.199 0.499 7.13ATOM 5514 N BTRP 295 30.271 2.787 16.200 0.501 6.52

Уточнение параметров модели

jjjjj TBzyx ,,,, - параметры модели

jjjjjcalchkl TBzyxF ,,,, - рассчитанные по модели модули

структурных факторовcalchklF - экспериментально определенные модули

структурных факторов

Хотим иметь min

2

hkl

obshkl

calchklrayX FFR

Получили задачу на минимизацию (нелинейный "метод наименьших квадратов" / least squares / LSQ).

Типичная задача:endonuclease SmЧисло неводородных атомов 3 694Число независимых параметров 36 940Число независимых ограничений (1.1Ǻ set) 108 000

Проблемы:

• много локальных максимумов; возможно только локальное уточнение; радиус сходимости ~ 0.7Å;

• модель "рассыпается".

Стандартный фактор достоверности / R-factor

%100

hkl

obshkl

hkl

obshkl

calchkl

F

FFR

Стереохимические ограничения


calcijd - расстояние между i-ым и j-ым

атомами в модели

exactijd - идеальное расстояние между

i-ым и j-ым атомами в модели

1.46Å

1.37Å1.24Å

1.52Å1.02Å

1

2 3

4

5

Хотим иметь

min24.152.137.146.12

35

2

34

2

23

2

12 calccalccalccalc dddd



calcijd - расстояние между i-ым и j-ым

атомами в модели

exactijd - идеальное расстояние между

i-ым и j-ым атомами в модели

1.46Å

1.37Å1.24Å

1.52Å1.02Å

1

2 3

4

5


min24.152.137.146.12

35

2

34

2

23

2

12 calccalccalccalc dddd

min2

ij

exactij

calcijdist ddR

min2

hkl

obshkl

calchklrayX FFR

min2

ij

exactij

calcijdist ddR

Составной критерий

min22

ij

exactij

calcijdist

hkl

obshkl

calchklrayX ddwFFw

distdistrayXrayX RwRwR

А как выбрать веса wX-ray, wdist ?



calcijk - угол между i,j,k -ыми атомами

в модели

exactijk - идеальный угол между i,j,k -

ыми атомами в модели

1

2 3

4

5


min5.1205.123.1222

534

2

235

2

123 calccalccalc

min2

ijk

exactijk

calcijkangleR

angleangledistdistrayXrayX RwRwRwR

123.5

120.5

122.

Двугранные углы

Плоские группы

Хиральность

R-free

все рефлексы

рабочие

контрольные

уточнение модели

только контроль

R-free

Вода, водороды.

Частичная модель "Потерянные" атомы

obshkl

truek

lostcalchkl

truej

partcalchkl

truefullhkl FF uFrF ,,,

obsF

partcalc,Flostcalc,F

Mjj 1

r N Mkk 1u

Подгонка Fcalc,part к Fobs может сдвигать координаты атомов с их правильных значений.

Обычное уточнение

Максимизацияправдоподобия

Likelihood-basedrefinement

raw (partial) model {rj}

randomly added‘solvent’ atoms {uk}

calculated magnitudes for ‘mixed’ (real and imaginaryatoms) model

Fhcalc ({rj}+{uk})=

|Fhpart({rj})+Fh

sol({uk})|

Fhobs

L({rj})=Probability{Fh

calc({rj}+{uk})=Fhobs for all h}

maximum

Likelihood- based refinement

Fhpart({rj})

Fhsol({uj})

Pyrobaculum aerophilum A pilot project in structural genomics

A test case to find the bottlenecks: summary of results from all laboratories in the project

Step

ClonedExpressed in E. coliPurifiedCrystallizedX-ray structuresNMR structures

Number of genes

2741684324101

Next: how to increase the success rate?

T.Terwilliger

?

h k l F σ0 0 6 46.09 2.740 0 8 212.95 5.000 0 20 98.75 3.150 1 6 188.33 5.060 1 7 14.88 8.000 1 8 226.02 7.9

crystal

Intensities Is of diffracted beams

X-ray experiment

X-ray sourceregistration

Kinematic theory of diffraction

X-ray structure analysis

X-ray structure analysis

h k l F σ0 0 6 46.09 2.740 0 8 212.95 5.000 0 20 98.75 3.150 1 6 188.33 5.060 1 7 14.88 8.000 1 8 226.02 7.9

X Y Z T BATOM 6 CA MET A 1 0 1.530 3.431 5.646 1.00 9.39 ATOM 7 C MET A 1 0 1.452 4.960 5.500 1.00 7.10 ATOM 8 O MET A 1 0 1.808 5.574 4.503 1.00 10.54 ATOM 9 CB THR A 2 0 -0.430 7.045 7.578 1.00 23.54 ATOM 10 OG1 THR A 2 0 -1.549 7.435 6.701 1.00 27.09 ATOM 11 CG2 THR A 2 0 -0.265 7.733 8.906 1.00 21.71

ProteinDataBank

The phase problem

preliminary modelrefined model

The solving of the structure ={r: S(r) > }

1. Дж.Гласкер, К.Трублад. Анализ кристаллической структуры. "Мир", Москва, 1974

2. М.А.Порай-Кошиц. Основы структурного анализа химических соединений. Москва, "Высшая школа", 1989

3. Т.Бландел, Л.Джонсон. Кристаллография белка. "Мир", Москва, 19794. Ч.Кантор, П.Шиммел. Биофизическая химия, том 2. Москва, "Мир", 19845. International Tables for Crystallography, vol. F. Crystallography of biological

macromolecules. by Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2001

X-RAY CRYSTALLOGRAPHYFrom : “Nobel Prizes for X-Ray science”. Published by the Advanced Photon Source at Argonne National Laboratory on the occasion of the Centennial Meeting of the American Physical Society. «A Century of Physics», March 20-26, 1999

Documents

Введение в кристаллографию макромолекул Лекция 3 Владимир Юрьевич ЛУНИН