ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧС.Н.С. ЛАБОРАТОРИИ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ (БИОТРОН) ФИЛИАЛА ИБХ РАН

• Тема исследований: «Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе растительных экспрессионных платформ (биофарминг)», включая

• Конструирование трансформационных векторов и экспрессионных кассет • Генетическая трансформация объектов исследований для получения трансгенных

растений-продуцентов рекомбинантных протеинов. • Молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений. • Анализ экспрессии целевых протеинов.

Основные направления проводимых исследований: •Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой или субъединицей В рицина в трансгенных растениях табака и ряски малой с целью разработки съедобных вакцин•Экспрессия сверхсладкого белка тауматина II в трансгенных растениях томата•Анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным вирусам

М130 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPLVVAAPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*М122 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*

LB nos β-глюкуронидаза 35S CaMV nos NPT II nos RB ter prom ter prom

XbaIBamHI

84 кДа

К- К+ м1 м2 м3 М

А2A1

Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM130. Рис. А1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис.А2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение трансформированное вектором pBI121, м1, м2 и м3- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.

Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях табака, трансформированных векторами pBIM130 и pBIM122

Структура экспрессионных кассет векторов pBIM130 и pBIM122. Красным шриф-том показана аминокислот-ная последовательность пептида М2е

м1 м2 К- М м3 К+

84 кДа

т1 т2 т3 К- М

Б184 кДа 84 кДа

т1 т2 т4 К1 М т6 т3 К1 М

Б2

Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM122. Рис. Б1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис. Б2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К1 - растение, трансформированное вектором pBI121, т1-т6- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.

Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях ряски малой (Lemna minor), трансформированных вектором pBIM130.

А 71 60 54 51 К+ 50 18 17 13 М

Б50 49 26 18 К+ 17 16 К- М 13

В 72 70 69 К+ 66 65 К- М 54 51

Вестерн-блот анализ трансгенных растений ряски, полученных после трансформации вектором pBIM130. А- с использованием антител к β-глюкуронидазе, Б и В-антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение, трансформированное вектором pBI121, цифрами обозначены различные трансгенные линии ряски. Стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.

Содержание слитого белка М2е- β- глюку-ронидаза в трансгенных растениях ряски малой , % от ОРБ.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

соде

ржан

ие М

2е-

β- гл

юку

рони

дазы

, % О

РБ

K+ K- 13 17 18 50 51 54

Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъединицей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB.

pBI -M2eRTB14026 bp

nptII

T-DNA RB

CBDM2e

RTBPR1 SP

T-DNA LB

Rep Origin 2

promoter NOS

promoter 35S CaMV

Rep Origin 1

terminator NOS

terminator NOS

Схематическая карта вектора pBI-M2eRTB. PR1 SP- сигнальный пептид PR1 белка табака, RTB- субъединица В рицина, M2e- N-концевой фрагмент белка М2 (30 а.к.), включающий пептид М2е, CBD- хитин-связывающий домен хитиназы А.

А Б

Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий табака с использованием антител к RTB (A) и M2e (Б). T1- T14- трансгенные линии, K- не транс-формированное растение табака, R+- рицин, экстрагированный из семян клещевины, M2+- пептид M2e экспрессированный в E. coli в слиянии с интеином (вектор pTYB11). Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е.

M T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 M2+ K-M R+ T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 K-

K- L101 L 83 L60 L57 L48 L 41 L34 M K-

L12 M L88a L59 L46 L43 L36 L24a L7b К-

Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий ряски с использованием антител к пептиду M2e. L- различные трансгенные линии, K- не трансформированные растения ряски, Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

трансгенные линии

мкг

RTB

-M13

0-CB

D/г с

ыро

го в

еса

В

Количественная асиалофетуин-ИФА препаратов общего белка из трансгенных растений табака и ряски. А. Концентрационная зависимость связы-вания рицина с иммобилизованным асиалофе-туином. В, С. Накопление слитого белка RTB-М2е-CBD в трансгенных растениях табака (В) и ряски (С). Использовались антитела к RTB, экви-валент RTB-М2е-CBD был вычислен исходя из графика концентрационной зависимости связыва-ния рицина с иммобилизованным асиалофетуином (А). К- нетрансформированное растение.

R2 = 0,9637

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 20 40 60 80 100 120

ng ricin/well

OD4

05, u

nit

А

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

K- T1 T2 T3 T4 T7 T10 T14 T15

трансгенные линии

мкг

RTB

-M13

0-CB

D/г с

ыро

го в

есаБ

Связывание слитого белка RTB-М2е-CBD с асиалофетуином, иммобилизованным на CNBr-активированной сефарозе (Donayre-Torres et al., 2009). Препарат общего белка из трансгенных растений табака пропускали через колонку с иимобилизованным асиало-фетуином. После промывки связанный с асиалофетуином слитый белок снимали глици-ном (рН4,0). А. Электрофорез двух фракций в 12,5% ПААГ. Б. Вестерн-блот анализ фракций этих же фракций с использованием антител к RTB. Стрелками показан слитый белок RTB-М2е-CBD.

А Б

Анализ экспрессии пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъедини-цей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB.