БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА

др Марко Н Живановић *#

*Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Czech Republic

#Институт за биологију и екологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Центар за преклиничка испитивања биоактивних супстанци, Крагујевац, Р. Србија

БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА

Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула

Одређивање протеина и угљених хидрата



Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди




Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди




Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди

Хистон H2A – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди


Полиамино киселине (poly(aa)s) доприносе катализованој реакцији издвајања водоника на живиним електродама (CHER) дајући хронопотенциометријски (CPS) пик (peak H) или волтаметријски одговор

По први пут показана је специфична биоелектрохемијска улога сваке појединачне амино киселине у протеинима/пептидима

Базне poly(aa)s дају peak H, док киселе poly(aa)s (као polyGlu) не дају биоелектрохемијски сигнал

PolyLys се може посматрати као модел систем протеина хистона PolyLys је коришћен за изучавање основних принципа важних у анализи интеракција

ДНК са базним хистонима Овај рад први је покушај изучавања хистона методама биоелектрохемије peak H се може успешно користити у изучавању интеракције хистона и ДНК

Увод

18. век – Luigi Galvani 20. век century – prof. J. Heyrovský, „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ Чешки добитник Нобелове награде, 1959

„Father of electroanalytics“ – Polarography

Увод

Систем три електроде:

- Радна електрода – HMDE(Hanging Mercury Drop Electrode)

- Референтна електрода – Silver Chloride Electrode

- Помоћна електрода – платина

Увод

Методе:

- Циклична волтаметрија (CV)

Увод

Методе:

- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)

Увод

Методе:

- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)

Увод

Методе:

- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)- „AC“ волтаметрија (ACV)

Увод

Методе:

- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)- „AC“ волтаметрија (ACV)- Хронопотенциометријска стрипинг анализа при константној

струји (CPSA)

Увод

Адсорпциони стрипинг, AdS

- Анодни адсорпциони стрипинг

Увод

Адсорпциони стрипинг, AdS

- Анодни адсорпциони стрипинг

- Катодни адсорпциони стрипинг

Увод

Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг (AdTS)

Увод


- E. Paleček – DNA studies

Увод


- E. Paleček – DNA studies- ex situ мерења

Увод


- E. Paleček – DNA studies- ex situ мерења- Потребно 3-10 µl раствора узорка

Увод

Heyrovský, Brdička, Frumkin – Catalytic effect of organic bases on CHER at mercury

Cat–H+ + e– [Cat–H]2[Cat–H] H2 + Cat

CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER)

CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER)

Ad(T)S CPSA on HMDE

peak H Редукциони

процес

CHER – peak H

123

4

Heyrovský1930Brdička 1933

Tomschik1998

Поларографски сигнал HSA1. Електролит2. 400x разређен HSA presоdium wave3. Co(III) редукција4. Brdička каталитичка реакција

Ad(T)S CPSA on HMDE


процес

CHER – peak H

123

4


Tomschik1998


Presodim wave

Ad(T)S CPSA on HMDE


процес

CHER – peak H

123

4


Tomschik1998


Brdička double wave

Порекло имена сигнала PEAK H

CHER – peak H


High sensitivity

CHER – peak H


High sensitivity Hydrogen evolution

CHER – peak H


High sensitivity Hydrogen evolution Heyrovský

CHER – peak H

Предности Аналогија са поларографским “presodium wave”, који је преблизу

позадинског сигнала peak H је одлично одвојен од позадинског сигнала Одређивање биомакромолекула у суб-наномоларним

концентрацијама Анализа структура биомакромолекула

Нативна форма vs. денатурисана агрегована Wt vs. Mut Оксидована/Редукована …

CHER – peak H

Предности

CHER – peak H

α-synuclein

Предности CHER – peak H

Предности CHER – peak H

Анализа полиамино киселина

Poly(AA)s – Интермедијерни модел систем између једноставнијих пептида и комплексних протеинаБазне poly(AA)s могу се сматрати модел системима базних хистонских протеина

Амино киселине укључене у катализу

Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21

Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1

1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система



1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система2. Улога појединачних AA остатака у сигналу



1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система2. Улога појединачних AA остатака у сигналу3. Прво испитивање интеракције polyLys са ДНК



1. 0.1 M McIlvaine пуфер, pH 6

2. PolyGlu, 22.2 µM3. PolyArg,Trp, 22.2 µM4. PolyLys, 22.2 µM



AdS CPSA/ HMDE 5.7 µM polyLys peak HIstr= −50 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V

Background electrolyte:McIlvaine buffer, pH 6



AdS CPSA/ HMDE polyLys peak H

A) Istr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V 50 mM McIlvaine buffer, pH 6

B) 11.5 nM (1.5 ng/ml) polyLys Istr= −10 µA, tA=60 s; Ei=EA= − 0.1 V 100 mM McIlvaine buffer, pH 6Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21


AdTS CPSA/ HMDE polyLys/DNA interaction

1) 100 mM McIlvaine, pH 62) 5.7 µM polyLys3) polyLys/DNA complex 5.7 µM polyLys/5 µM dsDNAIstr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= −0.5 V



Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21


1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав



1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав2. CV такође показује значајан потенцијал у испитивању

polyAA



1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав2. CV такође показује значајан потенцијал у испитивању

polyAA3. Базне poly(AA)s доприносе биоелектрохемијском

сигналу CHER




polyLys

polyArg

polyHis

AdTS CPSA/HMDEAdTS CV/HMDE

Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A

Људски геном садржи ~ 3x109 парова база, чија укупна дужина износи преко 1 m

Међутим, људски геном спакован је у нуклеусу пречника 10−5 m Боље разумевање структуре и функције хромозома и даље су у

жижи научног интересовања Фокус даљег рада био је усмерен ка испитивању хистона и

нуклеозома


Entire mitoticchromosome


Већина других испитиваних протеина је киселог карактера:Riboflavin-binding protein (pI 5.1), Thioredoxin (pI 4.7), MutS protein (pI 5.5), α-Synuclein (pI 4.7), Serum albumin (pI 5.9), Concanavalin (pI 5.5), tumor suppressor p53 (pI 6.3)

Brdička catalytic reaction – DP voltammograms; B) Cyclic voltammograms and C) Chronopotentiograms of 1.5 µM histone H2A (Cys non-containing) and 1.5 µM H3 (Cys containing). Background electrolyte 0.05 M sodium phosphate, pH 7.3


H3H3

H3

H2AH2AH2A

Са изузетком H3, ниједан други хистон не продукује BCR, због недостатка Cys

peak H хистона H2A снажно зависи од услова мерења

A) AdTS CV scan rate зависност иB) AdTS CPSA stripping current зависност 1.5 μM хистона H2A


Лимит детекцијеAdTS CPSA/HMDE peak H35.7 nM H2A (500 ng/ml); tA 5 min, Istr = –15 μA, EA =Ei = –0.1 V, Ef = –1.825 V. Sample adsorbed from 5 μl sample solution and transferred to 5 mlof background electrolyte of 0.05 M acetate buffer, pH 5.6. No baseline correction was applied.


ДНК-H2A интеракција

AdTS CPSA of H2A (black line), and H2A-DNA complex (red line) 2 μM H2A and 50 μM DNA were mixed in A. 50 mM or B. 1 M NaCl. After 15 min incubation at room temperature, analyte was adsorbed at HMDE (EA = Ei −0.5 V; tA =120 s) and modified HMDE was washed and transferred into the blank background electrolyte 50 mM Na-phosphate, pH 7. Istr = –18 μA.


H2AH2A/DNA

50 mM NaCl 1 M NaCl

Е. Paleček – 1960 „Nucleic acids are electroactive“Palecek, E., (1960). Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid. Nature 188, 656.

Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата

Око 30 година од открића електроактивности нуклеинских киселина, ова научна област давала је скромних (у просеку) 10 радова годишње

У последње две деценије ова област доживела је снажну експанзију са око 750 радова годишње




Одређивање нуклеинских киселина

ДенатурацијаПолиморфизам – dsDNAПротеински трагови у ДНК и РНКДНК биосензориДетекција bp mismatches


Одређивање нуклеинских киселина

ДенатурацијаПолиморфизам – dsDNAПротеински трагови у ДНК и РНКДНК биосензориДетекција bp mismatches

Протеин – ДНК интеракција


До скоро угљени хидрати сматрани су електронеактивнима

Модификација УХ комплексима осмијума са азотним лигандима (L), Os(VI)L омогућила је биоелектрохемијско одређивање УХ помоћу AdTS волтаметријом

M. Trefulka and E. Palecek, "Voltammetry of Os(VI)-modified polysaccharides at carbon electrodes," Electroanalysis, pp. 1763-1766, 2009.


Хемијска модификација поли- и олигосахарида Os(VI)L комплексима. Пример: Део молекула декстрана, који формира адукт са Os(VI)L комплексом. L - азотни лиганди: pyridine или 2,2’-bipyridine (bipy).

Palecek E., Ostatna V., Trefulka M., Bartosik M., Cernocka H., Kurzatkowska K., Zivanovic M., Electrochemical Sensing of Proteins and Carbohydrates. IEEE SENS J. 833-836, 2010.


Циклични волтамограми манана модификованог A, са Os(VI)temed (плаво) или B, са Os(VI)bipy (црвено). A, 5 μM mannan-(VI)temed, accumulation time, tA 120 s, scan rate, v 2V/s; B, 500 nM mannan-Os(VI)bipy, tA

60 s, v 0.1 V/s. AUTOLAB, HMDE, 80 mM Britton-Robinson buffer, pH 6.0.



End-labeling РНК молекула помоћу Os(VI)L

комплекса DP voltammograms of 10 nM Os(VI)L-modified dA21rA (green), 250 nM free Os(VI)L (magenta) and 10 nM unmodified dA21rA (red) in 0.2 M phosphate buffer, pH 6.7 (black). Inset: Comparison of 10 nM modified dA21rA (green) and 10 nM modified 24-mer ODN with sequence (CCA)8 (blue). DPV: EA 0 V, tA 60 s, purging time 180 s, interval time 0.5 s, step potential 5 mV, amplitude 50 mV, Ei 0 V, Ef -1.6 V. Modification: 200 uM dA21rA (or ODN) + 5 mM Os(VI)L, overnight, 37 °C.


Будући изазови

Интеракције ДНК-протеин


Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин


Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин Посттранслационе модификације протеина, посебно

хистона


Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин Посттранслационе модификације протеина, посебно

хистона miRNA истраживање (miRNA као потенцијални тумор

маркери)


Special thanks to:

Masaryk UniversityFaculty of Science

Institute of Biophysics, Academy of SciencesMinistry of Education, Youth and Sports

of the Czech Republic

IBP, BrnoCPCTAS, PMF Kragujevac

Special thanks to:

prof. Emil Palečekprof. Michael Heyrovskýprof. Snežana Marković

prof. Mara AleksićDr. Veronika Ostatná

Хвала!

Documents

БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА