เอนไซม์ (Enzyme)

เอนไซม ์(Enzyme)

To protect the environment.เทคโนโลยชีวีภาพ เพื่อรกัษาสิง่

แวดล้อมwww.zymetec.com

Made in USA.

บรษัิท ไทยเซมเทค จำ�กัด

02-450 6038

http://zymetec.com/enzyme_new0756.html

คว�มเป็นม�ของ เอนไซม์เอนไซมถ์กูนำ�ม�ใชค้รัง้แรก ในปี ค.ศ. 1878 ซึ่งมกี�รใชใ้น

ก�รเรง่ปฏิกิรยิ�ก�รหมกันำ้�ต�ลของยสีต์ พบว�่ส�ม�รถเรง่ปฏิกิรยิ�ใหเ้รว็ขึ้น

คำ�ว�่ Enzyme ม�จ�กภ�ษ�กรกี แปลว�่ In yeast

- เอนไซมเ์ป็นโปรตีนท่ีมลัีกษณะก้อนกลม ท่ีถกูสงัเคร�ะห์ขึ้นเพื่อทำ�หน้�ท่ีตัวเรง่ปฏิกิรยิ�เคมต่ี�งๆในกระบวนก�รเมต�บอลิซมึของสิง่มชีวีติ โดยมกี�รทำ�ง�นท่ีคล้�ยคลึงกันกับก�รทำ�ง�นของคะตะลิสต์

เอนไซม ์(Enzyme) เอนไซม ์คือ สารท่ีเรง่

ปฏิกิรยิาโดยทำาหน้าท่ีเป็น catalyst มคีวามจำาเพาะกับ substrate สงู โดยเอนไซม์ทำางานเรง่ปฏิกิรยิาโดยลดพลังงานกระตุ้น สว่นใหญ่เป็นสารอินทรยีก์ลุ่มโปรตีน แบง่เป็น 2 ชนิด คือ1. เอนไซมท่ี์ทำางานภายในเซลล์ (endoenzyme หรอื intracellular enzyme)2. เอนไซมท่ี์ทำางานภายนอกเซลล์ (exoenzyme หรอื extracellular enzyme)

เอนไซมป์ระกอบด้วยสว่นท่ีเป็น โปรตีน หรอื apoenzyme รวมกับสารอินทรยี ์ท่ีเรยีกวา่ coenzyme จงึเป็นเอนไซมท่ี์สมบูรณ์ หรอื holoenzyme ในบางครัง้อาจมไีอออนท่ีสำาคัญในการทำางานของเอนไซมเ์รยีกวา่ cofactor

การทำางานของเอนไซม์

ลักษณะพเิศษของเอนไซมท่ี์แตกต่�งจ�กคะตะลิสต์1 . มคีว�มจำ�เพ�ะ (selectivity) ต่อปฏิกิรยิ�และซบัส

เตรท โดยท่ีเอนไซมห์น่ึงจะทำ�ง�นได้ขึ้นอยูกั่บโครงสร�้งของซบัสเตรทท่ีจะส�ม�รถจบัได้พอเหม�ะภ�ยในรอ่ง

2. มคีว�มส�ม�รถในก�รเรง่ได้สงูม�ก โดยบอกเป็นค่�หมุนเวยีน (turnover number) ซึ่งหม�ยถึง จำ�นวนส�รตัง้ต้นท่ีทำ�ปฏิกิรยิ�เปล่ียนเป็นผลิตผลของปฏิกิรยิ�ใน 1 หน่วยเวล� เมื่อใชเ้อนไซม ์1 โมเลกลุ โดยเอนไซมต่์�งๆจะมค่ี�น้ีอยูร่ะหว�่ง 10 – 108 ต่อวนิ�ที

โครงสร�้งของเอนไซม ์เอนไซมม์ขีน�ดตัง้แต่ 12,000 ถึง กว�่ 1 ล้�นด�ลตัน

สว่นใหญ่เป็นส�รประกอบโปรตีน โครงสร�้งของเอนไซม์แบง่ได้ 2 ชนิด คือ

1 . โปรตีนธรรมด� (simple protein) เป็นโปรตีนท่ีมีกรดอะมโินเป็นองค์ประกอบอย่�งเดียว เอนไซมพ์วกน้ีมีโครงสร�้งเป็นทรงกลม

2 . โปรตีนรวมตัวกับส�รอ่ืน (conjugated protein) ประกอบด้วยกรดอะมโินรวมกับส�รอ่ืนท่ีไมใ่ชโ่ปรตีน ท่ีเรยีกว�่โคแฟกเตอร ์(cofactor) จงึจะส�ม�รถทำ�ง�นได้อย�่งสมบูรณ์ เรยีกเอนไซมก์ลุ่มนี้ว่� holoenzyme ถ้�แยกโคแฟกเตอรอ์อกจะทำ�ใหเ้อนไซมก์ลุ่มนี้จะไม่ส�ม�รถทำ�ง�นได้อย�่งสมบูรณ์เรยีกว�่ อะโพเอนไซม ์(apoenzyme)

Apoenzyme + Cofactor = Holoenzyme

Inorganic เชน่ Fe 2+ ion etc.

Organic เชน่ vitamin เรยีก coenzyme

โคแฟกเตอร ์แบง่ได้เป็น 2 พวกคือ1 . ส�รอนินทรยีห์รอืไอออนของโลหะ (metal ions) หรอื

เกลือแรม่โีครงสร�้งง่�ยๆได้แก่ Fe 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ เป็นต้น

2 . ส�รอินทรยีห์รอืโคเอนไซม ์เป็นโมเลกลุอินทรยีม์ีโครงสร�้งซบัซอ้น ท่ีมขีน�ดเล็กและทนต่อคว�มรอ้นได้ดี โคเอนไซมส์ว่นใหญ่จะเป็นวติ�มนิท่ีละล�ยนำ้� ทำ�หน้�ท่ีในก�รย�้ยหมูต่่�งๆ เชน่ หมูไ่ฮโดรเจน อะมโิน ฟอสเฟต

โดยถ้� โคเอนไซมจ์บักับอะโพเอนไซมอ์ย่�งหลวมๆ เรยีก โคเอนไซมก์ลุ่มนี้ว�่ ซบัสเตรทรว่ม (cosubstrate) แต่ถ้�โคเอนไซมจ์บักันอย�่งแน่นหน�กับเอนไซมด์้วยพนัธะโคว�เลนต์ จะถกูเรยีกว�่หมูพ่รอสเทติก (prostetic group)

Active และ Enzyme-substrate complex

เอนไซมท์ี่ผลิตโดยร�่งก�ย แบง่ได้เป็น 2 กลุ่ม คือ1 . เอนไซมย์อ่ยอ�ห�ร (digestive enzyme) ทำ�หน้�ท่ี

ยอ่ยอ�ห�รภ�ยในระบบท�งเดินอ�ห�รเพื่อสง่ส�รอ�ห�รไปยงัเซลล์ต่�งๆในร�่งก�ร ได้แก่1.1 เอนไซมโ์ปรตีเอส (protease) ยอ่ยโปรตีน1.2 เอนไซมไ์ลเปส (Lipase) ยอ่ยไขมนั1.3 เอนไซมอ์ะไมเลส (amylase) ยอ่ยแป้ง

2. เมต�บอลิคเอนไซม ์(metabolic enzyme) มอียูใ่นเซลล์ทกุเซลล์ในทกุอวยัวะ เอนไซมน์ี้จะทำ�หน้�ท่ีเก่ียวกับทกุปฏิกิรยิ�ท่ีเกิดขึ้นในร�่งก�ย มหีน้�ท่ีซอ่มแซมสว่นท่ีสกึหรอ ชว่ยระบบภมูคิุ้มกัน

เอนไซมแ์บง่ได้ 2 ประเภทคือ1 . ไอโซเอนไซม ์หรอื ไอโซไซม ์(isoenzyme หรอื

isozyme) เป็นเอนไซมท่ี์มโีครงสร�้งแตกต่�งกันแต่ส�ม�รถเรง่ปฏิกิรยิ�เดียวกันได้

2 . อัลโลสเตอรกิเอนไซม ์(allosteric enzyme) หรอื เอนไซมค์วบคมุ (regulatory enzyme) เป็นเอนไซมท่ี์ประกอบด้วยหน่วยยอ่ยๆหล�ยหน่วยรว่มกัน เชน่ หน่วยยอ่ยเรง่ (catalytic enzyme) ส�รท่ีมอิีทธพิลต่อก�รควบคมุก�รทำ�ง�นของเอนไซม์เหล่�น้ี เรยีกว�่ ตัวควบคมุ (effector หรอื modulator หรอื regulator)

ตัวควบคมุ ม ี2 ชนิด คือ 2.1 ตัวเรง่ (activator) ทำ�ใหเ้อนไซมท์ำ�ง�นได้ดีขึ้น เรยีก positive modulator2.2 ตัวยบัยัง้ (inhibitor) ทำ�ใหเ้อนไซมท์ำ�ง�นได้ช�้ลง เรยีกว�่ negative modulator

บรเิวณของเอนไซมท่ี์มตัีวควบคมุ เรยีก บรเิวณควบคมุ (regulatory site หรอื allosteric site)

เรยีก เอนไซมท่ี์มทัีง้บรเิวณเรง่และบรเิวณควบคมุว�่ อัลโลสเตอรกิเอนไซม ์

ก�รเรยีกชื่อต�มแบบส�มญั (recommended name)มหีลักเกณฑ์ดังน้ีคือ1 . เรยีกต�มชื่อของซบัสเตรทท่ีเอนไซมเ์รง่ปฏิกิรยิ� แล้ว

ลงท้�ยด้วยคำ�ว�่ “ase” เชน่ เอนไซมเ์รง่ปฏิกิรยิ�ก�รสล�ยยูเรยี เรยีกว�่เอนไซมยู์รเีอส (Urease)

2. เรยีกต�มชนิดของปฏิกิรยิ�แล้วลงท้�ยด้วยคำ�ว�่ “ase” เชน่เอนไซมอ์อกซเิดส (oxidase) เรง่ปฏิกิรยิ�ออกซเิดชนัของซบัสเตรทท่ีม ีO2

3. เรยีกต�มขอ้ท่ี 1 และ 2 รวมกัน เชน่ ไกลซนีดีค�รบ์อกซิเลส (glycinedecarboxylase)

4. เรยีกต�มชื่อเฉพ�ะไมส่มัพนัธกั์บซบัสเตรทหรอืปฏิกิรยิ�ท่ีเก่ียวขอ้ง เชน่เพปซนิ (pepsin) เป็นเอนไซมย์อ่ยโปรตีน เป็นต้น

ก�รเรยีกชื่อเอนไซมต์�มระบบ (systemic name)ต�มขอ้ตกลงของกรรม�ธกิ�รเอนไซมน์�น�ช�ติ ได้มกี�ร

เรยีกชื่อต�มตัวเลข โดยมลัีกษณะคือ

EC xx.xx.xx.xx (อักษร x คือตัวเลข)

Enzyme functional class

subclass

Sub sub

class

ลำ�ดับท่ี

เชน่ EC 2.7.3.2

2 = ชนิดเอนไซม ์transferase

7 = ชนิดยอ่ยของรหสัตัวท่ี 1 หม�ยถึงก�รย�้ยหมูฟ่อสเฟต

3 = ชนิดยอ่ยของรหสัตัวท่ี 2 หม�ยถึงก�รแบง่ยอ่ยของหมูฟ่อสเฟต

2 = รหสัเฉพ�ะตัวของเอนไซมช์นิดนัน้

การแบง่เอนไซมต์ามชนิดของปฏิกิรยิา1. oxidoreductase ปฏิกิรยิ�ออกซเิดชนั-รดีักชนั ก�ร

ถ่�ยทอดอิเล็กตรอน

2. transferase ย�้ยหมูฟ่งัก์ชนัจ�กส�รหนึ่ง ไปอีกส�รหน่ึง

3. hydrolase ไฮโดรไลซสิ แยกพนัธะด้วยนำ้�4. lyases เติมพนัธะคู่5. isomerase ไอโซเมอรไ์รเซชนั6. ligases สร�้งพนัธะโดยสล�ย ATP

รูปรา่งโมเลกลุของเอนไซม์

กลไกก�รทำ�ง�นของเอนไซม์ให ้E = Enzyme S = Substrate P = Product ES = Enzyme เมื่อจบักับ Substrate EP = Enzyme เมื่อผลิต Product และยงัคงจบักัน

อยู่

ขัน้ตอนแรก : เอนไซม ์E รวมตัวกับสารต้ังต้น S ได้เป็นสารประกอบ ES E + S ES


ขัน้ตอนท่ีสอง : สารประกอบ ES เกิดการเปลี่ยนแปลงเป็น ES*

ES* EP


EPES*

ขัน้ตอนท่ีสาม :เกิด สารประกอบ ระหวา่งเอนไซมกั์บผลผลิต

ขัน้ตอนท่ีสดุท้าย :ได้ผลผลิตออกมา และได้เอนไซมก์ลับมาเหมอืนเดิม

EP E + P

จลน์ศ�สตรข์องเอนไซม ์

E + S ES E + P k1

k 3

k2

k 4

จลนศาสตรข์องเอนไซม์ เอนไซมท์ำ�ปฏิกิรยิ�กับสบัสเตรท เกิดเป็นเอนไซม์-สบัส

เตรทคอมเพลกซก่์อนแล้วจงึสล�ยในขัน้ตอนท่ี 2 ให้ผลผลิต และเอนไซมก์ลับคืนม� อัตร�เรว็ของปฏิกิรยิ�ในก�รเปล่ียน S ไปเป็น P ขึ้นอยูกั่บอัตร�เรว็ในก�ร เปล่ียน ES ไปเป็น P และ E นัน่คือ อัตร�เรว็ในก�รเกิด P จะขึ้นอยูกั่บคว�มเขม้ขน้ของ ES

เมื่อ k1 k2 k3 และ k4 คือ ค่�คว�มเรว็คงท่ี (velocity constant) หรอื ค่�อัตร�เรว็คงท่ี (rate constant) ของปฏิกิรยิ�ทัง้ 4

ท่ี steady state อัตร�เรว็ในก�รเกิด ES จะเท่�กับอัตร�เรว็ในก�รสล�ย ES ทำ�ให ้[ES] คงท่ี จะได้

สมก�รไมคีลิส-เมนเทน (Michaelis-Menten constant) แสดงถึง ความสมัพนัธร์ะหวา่งอัตราเรว็ของปฏิกิรยิา และความ

เขม้ขน้ของ S เมื่อทราบ Vmax และ KM

Vmax คือ คว�มเรว็สงูสดุ (maximum velocity) ของก�รทำ�ง�นของเอนไซม์

KM คือ ค่�คงท่ีไมคีลิส-เมนเทน (Michaelis-Menten constant) ของปฏิกิรยิ�ของเอนไซมท่ี์ steady state มหีน่วยเป็นโมล/ลิตร

V = Vmax[S] KM + [S] ท่ี V = Vmax /2 หรอื ครึง่หนึ่งของความเรว็สงูสดุ (half

maximal) จะได้ KM = [S]

สมการไลน์วเีวอร-์เบอรก์ เป็นสมก�รจ�กก�รกลับสมก�รไมคีลิส-เมนเทน 1 = KM .

1 + 1 v Vmax

[S] Vmax

เมื่อเขยีนกราฟระหวา่ง 1/v และ [S] จะได้กราฟเสน้ตรงท่ีมคีวามชนั = KM/Vmax และจุดตัดแกน 1/v คือ 1/Vmax และจุตัดแกน 1/[S] คือ -1/KM ทำาให้สามารถหาค่า KM และ Vmax ท่ีถกูต้องได้

Enzyme Kinetics

Increase the substrate concentration,observe the change of enzyme activity

Substrate concentrationExam Chapters

Score

Enzym

e activity

Student A

Student B

Student C

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

Juang RH (2004) BCbasics

Increase Substrate C

oncentration

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Substrate (mmole)

Product

80

60

40

20

0

S+E↓P

(in a fixed period of time)


Essential of Enzyme Kinetics

E S+ P+

Steady State Theory

In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.

SE E


Constant ES Concentration at Steady State

S P

EES

Reaction Time

Concentration


An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Double reciprocal Direct plot

1) Use predefined amount of Enzyme → E 2) Add substrate in various concentrations → S (x ,y)

3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y, y)

4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax

5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Juan

g R

H (2

004)

BC

basi

cs

A Real Example for Enzyme KineticsD

ata

no

1234

0.250.501.02.0

0.420.720.800.92

Absorbance v (mmole/min)[S]0.210.360.400.46

(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min

VelocitySubstrate Product Double reciprocal

1/S 1/v421

0.5

2.081.561.351.16

→→ → →

1.0

0.5

0

v

Dire

ct p

lot

Dou

ble

reci

proc

al 2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Juan

g R

H (2

004)

BC

basi

cs

ปัจจยัท่ีควบคมุการทำางานของเอนไซม์1.คว�มเขม้ขน้ของเอนไซม์2.คว�มเขม้ขน้ของส�รตัง้ต้น หรอืซบัสเตรต (substrate)3.ค่�คว�มเป็นกรด-เบส (pH)4.อุณหภมู ิ(optimum temperature) การยบัยัง้การทำางานของเอนไซม์- การยบัยัง้แบบถาวรInhibiter ทำ�ใหส้ว่น active site เปล่ียนแปลงไป เอนไซมไ์มส่�ม�รถกลับสูใ่นสภ�พท่ีทำ�ง�นได้อีก- การยบัยัง้ท่ีกลับคืนได้ 1.ก�รยบัยัง้แบบแขง่ขนั โดยตัวยบัยัง้มโีครงสร�้งคล้�ยกับซบัสเตรตทำ�ให ้ส�ม�รถแยง่จบักับเอนไซมไ์ด้ 2.ก�รยบัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั โดยส�รเคมบี�งชนิดไปจบักับสว่น cofactor ทำ�ใหเ้อนไซมไ์มส่�ม�รถทำ�ง�นได้

การยบัยัง้แบบถาวร

การยบัยัง้แบบแขง่ขนั การยบัยัง้แบบไม่แขง่ขนั

ปัจจยัท่ีมผีลต่อการทำางานของเอนไซม์ 1. อุณหภมู ิเมื่ออุณหภมูสิงูขึ้น แอกติวตีีของเอนไซมจ์ะเพิม่ขึ้น

เรื่อยๆ จนถึงจุดสงูสดุหน่ึง (temperature optimum) แล้วจะลดลง ซึ่งจำ�เพ�ะต�มชนิดของเอนไซม ์สว่นใหญ่อยูใ่นชว่งอุณหภมู ิ25–40 oC แต่ท่ีอุณหภมู ิสงูกว�่จุดน้ีม�กๆ เอนไซมจ์ะเกิดก�รเสยีแอกติวตีีท�งชวีภ�พ

2. pH จุดท่ีทำ�ใหเ้อนไซมม์แีอกติวตีีสงูสดุ เรยีกว่� pH optimum ซึ่งสว่นใหญ่อยูใ่นชว่ง pH 6-7.5 ถ้� pH สงู หรอืตำ่�เกินไปจะทำ�ใหเ้กิดก�รสญูเสยีแอกติวตีีท�งชวีภ�พ

3. ความเขม้ขน้ของเอนไซม ์ ท่ีคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทม�กเกินพอ (excess) อัตร�เรว็ของปฏิกิรยิ� จะเพิม่ขึ้น เมื่อคว�มเขม้ขน้ของเอนไซมเ์พิม่ขึ้น

4. ความเขม้ขน้ของสบัสเตรท เมื่อคว�มเขม้ขน้ของเอนไซมค์งท่ี ท่ีคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทน้อยๆ ปฏิกิรยิ�จะ เกิดขึ้นด้วยอัตร�เรว็ม�กจนกระทัง่ถึงคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทจุดหนึ่งท่ีอัตร�เรว็ของ ปฏิกิรยิ�จะคงท่ี คว�มเรว็ของปฏิกิรยิ�ท่ีสงูสดุ เรยีกว�่ คว�มเรว็สงูสดุ (Vmax)

ตัวยบัยัง้เอนไซม์แบง่ออกได้เป็น 2 ประเภท1. ตัวยบัยัง้แบบผันกลับไมไ่ด้ (irreversible

inhibitor) เก่ียวกับก�รทำ�ล�ยหรอืเปล่ียนแปลง functional group 1 หมูห่รอืม�กกว�่ท่ีจำ�เป็นสำ�หรบัแอกติวตีีบนโมเลกลุของเอนไซม ์ซึ่งตัวยบัยัง้แบบน้ีจะจบั กับเอนไซมอ์ย�่งแน่นทัง้แบบโคว�เลนท์และนอนโคว�เลนท์ เชน่ ก�รยบัยัง้เอนไซมไ์ซโคลออกซจิเินส (cyclooxygenase) โดยย�แอสไพรนิ (aspirin หรอื acetyl salicylate)

2. ตัวยบัยัง้ แบบผันกลับได้ (reversible inhibitor) แบง่เป็น 3 ชนิด

2.1 ตัวยบัยัง้แบบแขง่ขนั (competitive inhibitor) หม�ยถึง ส�รท่ีส�ม�รถเข�้ ไปแยง่สบัสเตรทจบัท่ีบรเิวณแอกตีฟบนโมเลกลุของเอนไซม ์แล้วทำ�ใหแ้อกติวตีีในก�รเรง่ปฎิกิรยิ� ของเอนไซมล์ดลง โดยค่� KM เปล่ียน แต่ Vmax คงท่ี เชน่ กรดม�โลนิกส�ม�รถจบัเอนไซมซ์กัซนิิก ดีไฮโดรเจเนส (succinic dehydrogenase) ในปฏิกิรยิ�ก�รออกซไิดสก์รดซกัซินิกไปเป็นกรด ฟูม�รกิ เพร�ะมโีครงสร�้งคล้�ยกับกรดซกัซนิิก

2.2 ตัวยงัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั (noncompetitive inhibitor) หรอืตัวยบัยัง้ แบบผสม (mixed inhibitor) โดยตัวยบัยัง้ชนิดน้ีจะเข�้ไปจบัท่ีบรเิวณอ่ืนบนโมเลกลุของ เอนไซมท่ี์ไมใ่ชบ่รเิวณเรง่ เชน่บรเิวณควบคมุ ทำ�ใหโ้ครงร�่งของเอนไซมเ์ปล่ียนแปลงไป ทำ�ให้บรเิวณเรง่เปล่ียนไปจงึทำ�ง�นไมไ่ด้ เชน่ Cu2+ Hg2+ และ Ag+ หรอือนุพนัธ ์(derivative) ของมนัส�ม�รถทำ�ปฏิกิรยิ�กับ หมู-่SH ของซสิเตอีนทำ�ใหโ้ครงรูปส�มมติิ (three dimensional conformation) ท่ีจำ�เพ�ะของเอนไซมเ์สยีไป ในกรณี noncompetitive inhibitor ค่� Vmax เปล่ียนแปลง(ลดลง) สว่น KM ไม่เปล่ียนแปลง

2.3 การยบัยัง้แบบอันคอมเพติตีฟ (uncompetitive inhibition) ก�รยบัยัง้ แบบนี้เกิดขึ้นเมื่อตัวยบัยัง้เข�้รวมเฉพ�ะกับเอนไซมส์บัสเตรทคอมเพลกซเ์ท่�นัน้แบบไมผั่นกลับ เกิดเป็น ESI คอมเพลกซ ์ซึ่งจะไมไ่ด้ผลผลิตเกิดขึ้น ลักษณะเหมอืนกับก�รยบัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั โดยไมเ่กิดก�ร ผันกลับ (reversible) เมื่อเพิม่คว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรท ค่� Vmax ลดลง และค่� Km ลดลง แต่คว�มชนัไม่เปล่ียนแปลง

Enzyme Inhibition (Mechanism)

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitive Non-competitive Uncompetitive

EE

Different siteCompete for

active siteInhibitor

Substrate

Car

toon

Gui

deEq

uatio

n an

d De

scrip

tion

[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [I].

[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.

[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].

E + S → ES → E + P + I↓EI

←

↑

E + S → ES → E + P + + I I↓ ↓EI + S →EIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P + I ↓ EIS

←

↑

EI

S X


Km

Enzyme Inhibition (Plots)

I II Competitive Non-competitive Uncompetitive

Dire

ct P

lots

Dou

ble

Rec

ipro

cal

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

I I

Km [S], mM

Vmax

I

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax unchangedKm increased

Vmax decreasedKm unchanged

Both Vmax & Km decreased

I

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

I

Two parallellines

I

Intersect at X axis

1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

Intersect at Y axis

= Km’


หน่วยวดัก�รทำ�ง�นของเอนไซม์1 . หน่วยเอนไซม ์หม�ยถึง จำ�นวนเอนไซมท่ี์ทำ�ใหป้รมิ�ณ

ของผลิตภัณฑ์เกิดขึ้นหรอืปรมิ�ณของซบัสเตรทลดลง มค่ี�เป็น ไมโครโมลต่อน�ที หน่วยส�กล (international unit, IU หรอื U)

1.0 IU คือ แอคติวตีิของเอนไซมห์รอืปรมิ�ณของเอนไซมท่ี์เรง่ก�รเปล่ียน 1.0 ไมโครโมลของซบัสเตรทใน 1 น�ทีท่ีอุณหภมู ิ25 º Cค�ท�ล (katal : kat) หม�ยถึง ปรมิ�ณของเอนไซมท่ี์เรง่ก�รเปล่ียนแปลง 1

โมลของซบัสเตรทใน 1 วนิ�ที หน่วยท่ีนิยมใช ้คือ µkat , nkat, pkat

1 kat = 1/60 U = 1.67 x 10 -2 U

2. หน่วยแอคติวตีิเฉพ�ะ (specific activity) หม�ยถึง หน่วยเอนไซม ์ต่อ 1 มลิลิกรมัของโปรตีน ใชใ้นก�รห�คว�มบรสิทุธิข์องเอนไซม์

Enzyme Kinetics

vo=Vmax [S]Km + [S]

Km Vmax &E1E2E3

1st order

zero order

Competitive

Non-competitive

Uncompetitive

Direct plot

Double reciprocal

Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other

Affinity withsubstrate

Maximumvelocity Inhibition

Activity

Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km

k3 [Et]

kcatTurn overnumber

kcat / Km

Activity Unit1 mmole

min

Specific Activity

unitmg

Significance


Significance of Enzyme Kinetics

vo =Vmax [S]Km + [S]

Obtain Vmax and Km

[S] = Low → High [S] = Fixed concentration

zero order

1st order

E3E2E1

Proportional toenzym

e concentrationv0 = Vmax × K = k3 [Et] × K


Km = [S]

Km + [S] = 2 [S]

Vmax

2 =Vmax [S]Km + [S]

Km: Affinity with Substrate

If vo =Vmax

2

S2S1 S3

S1 S2 S3

Vmax

1/2

When using different substrate

Affinity changesKm


Juan

g R

H (2

004)

BC

basi

cs

Km: Hexokinase Example

Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP

123456

Glucose Allose Mannose Substratenumber

Km = 8 8,000 5 mM

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH


Turn Over Number, kcat


(vo)E + S ES E + P

k2

k1 k3

When substrate excess, k3 = kcat, turn over number (t.o.n)

When [substrate] is low

= k3 [E][S]Km + [S]= Km

k3 [E][S]

Omit the [substrate] Substrate specificityStart from M-M eq.

Second order(IV)


Turn Over Numbers of Enzymes

Catalase H2O2

Carbonic anhydrase HCO3-

Acetylcholinesterase Acetylcholine

40,000,000

400,000

140,000

b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000

Fumarase Fumarate 800

RecA protein (ATPase) ATP 0.4

Enzymes Substrate kcat (s-1)

The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

Enzyme Activity Unit

Reaction time (min)P

rodu

ct [P

]0 10 20 30 40

Slopetan

S → P mmole

vo = [P] / min

Unit =

Activity Units

Protein (mg)

t

mmole/min

yx

yx = tan

Juan

g R

H (2

004)

BC

basi

cs

Specific Activity =

Documents

เอนไซม์ (Enzyme)