基因工程Gene Engineering

彭银祥等编著

华中科技大学出版社 2008年 2 月第二次印刷

第 4 章 基因工程操作的主要技术及原理

Main Techniques and principles in Gene manipulation

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材

4-2

• 基因工程中操作的主要对象是？DNA

• DNA 通常包括那些？ • 基因组 DNA 、质粒 DNA

• 提取基因组 DNA 做什么用？

4.1 核酸的提取与纯化

4-3

• 获得目的基因，• 构建基因组文库• Southern 杂交• 限制性核酸片段长度多态性分析（ RFL

P ）• 提取质粒 DNA 做什么用？• 用于克隆目的基因的载体• 重组质粒的酶切鉴定分析• 重组质粒保存目的基因，

4-4

由于提取 DNA 的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同， DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

4.1 核酸的提取与纯化

4-5

4-6

大肠杆菌基因组 DNA

4-7

4.1.1 质粒 DNA 的提取

4-8

plasmid DNA

The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than the cell.

Genomic DNA

4-9

闭合环状的质粒 DNA ，在变性后不会分离，复性快；

（ 1 ）原理

1 . 碱抽提法提取质粒 DNA

DNA 双链

变性

DNA 单链

复性

强碱

中性

4-10

染色体线性 DNA 和或有缺口的质粒DNA 变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质— SDS 复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

变性

4-11

（ 2 ） 所用的试剂作用

① 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1， 4 糖苷键。在碱性条件（ pH>8 ）下有活性。

② 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA 受机械力（震荡）的作用而降解。

4-12

③EDTA

Mg2+、 Ca 2+ 的螯合剂，可抑制 DNA 酶的活性，防止 DNA 被酶降解。

④NaOH-SDS

NaOH ：强碱，提供 pH>12 的碱性条件，使 DNA 双链变性。

SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白— SDS” 复合物，使蛋白质（包括 DNA 酶）变性沉淀。

4-13

冰醋酸把醋酸钠溶液的 pH 调到 4.8 。

用来中和 NaOH 变性液，使 DNA 复性。高浓度的 NaAc 有利于变性的大分子（蛋白质、 DNA 、 RNA 等）沉淀。

用于沉淀 DNA 。⑥ 乙醇

DNA 分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去 DNA 分子的水环境。

⑤ NaAc-HAc 缓冲液

4-14

⑦ RNase A

降解 RNA 渣滓。以免提取后的 DNA 中含有小分子的 RNA 。

⑧ TE 缓冲液DNA 保存液。由 Tris-HCl和 EDTA 配制。

Tris-HCl 不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；

EDTA 抑制 DNA 酶，防止 DNA 被酶降解。

4-15

蛋白变性剂，进一步抽提 DNA 溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。

但苯酚会残留在 DNA 溶液中。

（现多用各种商品化的层析柱纯化 DNA) 。

⑨ 酚 - 氯仿 选用

以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。

4-16

（ 3 ）碱抽提法提取质粒 DNA 的步骤

Solution I 的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。

第一步：溶菌

50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0) ，10mM EDTA ，4-5mg/ml 溶菌酶，RNase A

4-17

溶液 II 破坏细胞膜，蛋白质和 DNA 变性。

第二步：破膜，蛋白质和 DNA 变性

Solution II 的配制：

第三步：中和溶液 III使 DNA 复性、并促使蛋白质 -SDS 复合物和染色体 DNA、 RNA 沉淀。Solution III 的配制：

0.2N NaOH， 1.0%SDS

3M 醋酸钠（用冰醋酸调 pH 至 4.8 ）

4-18

上清液中含有闭合质粒 DNA 。

第四步：离心除去沉淀

0.6 倍体积的异丙醇或 2 倍体积的乙醇。

第五步：纯化 DNA

上清液过柱或酚 - 氯仿抽提。

第六步：沉淀 DNA

4-19

最重要的是：

2. 影响质粒 DNA产量的因素

菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。

一般要使用 endA 基因发生突变的大肠杆菌菌株。如 DH5、 JM109、 XL1-Blue等。

（ 1 ）受体菌株

endA 基因编码核酸内切酶Ⅰ，在 Mg2+ 的存在下可将双链 DNA 消化成 7bp 的寡核苷酸片断。

4-20

这是直接决定 DNA产量的重要因素之一。

（ 3 ）质粒大小

分子量大的质粒，拷贝数少。

（ 2 ）质粒拷贝数

质粒本身的性质所决定。

4-21

若干常用质粒的理论产量

质粒名 分子大小 bp 拷贝数 质粒产量 g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101

270027004400450040009000

300-700500-700>25>15≈10≈6

1.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12

4-22

4.1.2 基因组 DNA 的提取

一般过程及原理：

1. 细菌基因组 DNA 的制备

（ 1 ）细胞裂解10%SDS 和蛋白酶 K。 37 oC温育。

不用 NaOH !

4-23

（ 3 ）沉淀DNA

0.6 倍体积的异丙醇。

（ 2） DNA 纯化

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 ) 除去多糖，酚 - 氯仿 - 异戊醇除去蛋白。

4-24

一般过程及原理：

动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。

组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。

（ 1 ）组织粉碎

2. 哺乳动物细胞基因组 DNA 的抽提

4-25

0.5%SDS和 0.1mg/ml 蛋白酶 K。 50 oC温育。（ 2 ）细胞裂解

（ 3） DNA 提取

用苯酚和酚 - 氯仿抽提除去蛋白质污染。

SDS 是离子型去垢剂（ detergent ），可以使细胞膜崩解。

CH3—(CH2)11—O—S—ONa

O

O

（ 5 ）除去 RNA污染 用 RNase A 。

用 2 倍体积的无水乙醇。

（ 4 ）沉淀DNA

（可以加入 1/10体积的 3M醋酸氨辅助沉淀）

4-26

一般过程及原理： （ 1 ）组织粉碎

用液氮冷冻后研磨成细粉末。

3. 从植物组织中制备 DNA

（ 2 ）细胞裂解用 2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵 /2巯基乙醇）。

或 1% SDS 和蛋白酶 K 。 65 oC温育。

4-27

用 0.6 倍体积的异丙醇（ -20 oC ）。

（ 3） DNA 提取

用苯酚和酚 - 氯仿抽提除去蛋白质。（ 4 ）沉淀DNA

（ 5 ）除去 RNA污染

用 RNase A 。

（可以加入 1/10 体积的 3M 醋酸氨辅助沉淀） 。

4-28

4. DNA 的定量和纯度测定1. 紫外光谱

法

DNA （或 RNA ）在 260nm波长处有特异的紫外吸收峰。

用微量比色杯（ 10l ）在紫外分光光度计直接测定。

原理：

蛋白质在 280nm处有吸收峰

4-29

4-30

溴化乙锭（ EB ）能插入 DNA 分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。

原理：

与已知浓度的 DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出 DNA 含量。

2. 凝胶电泳估计

4-31

一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的 DNA标准混合液对比得知。

DNA 分子量 Marker 有许多公司的商品，使用非常方便。如 DNA 的 HindⅢ酶切物等。

2 DNA 分子量的估计

MarkerMarker

4-32

1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。

2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。

3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

4.2.1 电泳的基本原理

4.2 DNA 的凝胶电泳

4-33

4. 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。

如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：

分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。

形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关 : 分子量越大，移动越慢。

5.

4-34

Relaxed supercoiled

Increasing degree of supercoiling

相同分子量的 DNA:

闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。

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4-36

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4.2.2 琼脂糖凝胶电泳1. 琼脂

糖

2. 琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。

是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂中提取而来。

琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。 浓度高 空隙小

4-38

琼脂糖的浓度（ % ） 分离 DNA 的片断大小（ bp ）

0.30.71.4

50000—100020000—1000

6000—300

空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过；

空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。

3. 琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。

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优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。

聚丙烯酰胺凝胶浓度（% ）

分离 DNA 片断大小（ bp ）

4.010.020.0

1000—100500—25

50—1

4.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳： 1000—50000bp

聚丙烯酰胺凝胶电泳： 1—1000bp

4-40

4.2.4 凝胶染色

1. 染料

溴化乙锭。

Ethidium bromide （ EB ）

4-41

EB 是扁平分子，能插入 DNA 碱基之间，但不与琼脂糖结合。

EB在 300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示 DNA泳带在凝胶中所处的位置。

荧光强度与 DNA 含量及大小成正比。

2. 原理

4-42

4-43

4-44

UVP 全自动凝胶成像分析系统

4-45

OMEGA8-LOGO 全自动凝胶成像分析系统

4-46

DNA-DNA或 DNA-RNA 链杂交。用放射性同位素（ 32P或 125I ）标记的 DNA或 RNA探针。

4.3 核酸的分子杂交

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4.3.1 Southern blot

用 DNA （或 RNA ）探针检测 DNA样品。

4-48

4-49

Southern blot 筛选结果

4-50

4.3.2 Northern blot

用 DNA （或RNA ）探针检测 RNA样品。

4-51

4.3.3 Western blot

用特定的一抗和二抗检测蛋白质样品。

4-52

4.4 基因 扩增技术

基因扩增（ gene amplification)

指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有两种方式：

PCR扩增

基因工程扩增

4-53

PCR扩增

应用聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction， PCR ）技术，在体外特异性地扩增某个基因。

基因工程扩增

载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。

4-54

• PCR 是模拟体内 DNA 复制条件，应用 DNA 聚合酶反应，特异性扩增某一 DNA 片段的技术。

• 体外程序化的 DNA 合成技术。

Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

1983年 Cetus公司的科学家Kary.B. Mullis发明了 PCR ，由此获得 1993年诺贝尔化学奖。

4.4.1 聚合酶链式反应 （ polymerase chain reaction,PCR ）

4-55

4-56

1. PCR 技术的原理

模板 DNA 变性94ºC

引物 DNA 复性

55ºC

引物 DNA 延伸

72ºC

4-57

双链 DNA 在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。

（ 1） DNA模板变性 92~94oC

TGCATGCATATCTTGAAC

TAGAACTTG ACGTACGTA

TGCATGCATATCTTGAAC

3’

5’5’3’

3’5’

5’3’ TAGAACTTG ACGTACGTA

模板

模板（ template ）

92~94oC

4-58

人工合成的单链 DNA 小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板 DNA 双链的 5‘端相同。

（ 2） DNA模板与引物复性

TGCATGCATATCTTGAAC 3’5’

5’TAGAACTTG ACGTACGTA3’

模板

模板

ATCTTGAAC5’ 3’

ACGTACGTA 5’3’引物 引物

引物（ primer） :

40-65oC

4-59

DNA 聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸 DNA 链。

（ 3） DNA 链的延伸 72oC

TGCATGCATATCTTGAAC 3’5’模板

ACGTACGTA 5’Taq

5’TAGAACTTG ACGTACGTA3’ 模板

ATCTTGAAC5’Taq

4-60

理论上 25-30 次循环就可以合成 225-230 条 DNA 。

变性—复性—延伸。

（ 4） 1个循环的结果

（ 5 ）新一轮循环开始

4-61

但不能有蛋白质变性剂、 DNA 酶、 Mg2+

的螯合剂等影响 DNA 聚合酶的活性。

（ 1 ）模板（ template)

② 模板的量：不能太多， 100l反应体系中 100ng足够。

① 纯度：PCR 对模板 DNA 的纯度要求不高。

2. PCR 体系的组要成分

4-62

与待扩增的模板 DNA区段的两 3’端序列互补（ 5‘端相同）的短 DNA 。

（ 2 ）引物（ primer)

① 位置

3’3’

4-63

即 2.751011 bp 的基因组中有一次完全与 19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约 2×10-11 ）。

② 引物的长度

理论计算：

419=2.751011 。

一般引物设计为长 15—30bp 。

4-64

③ 引物的碱基序列

5’ 端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、 RNA 聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。

5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必须与模板正确配对， 5’端可以不配对。

template

primer

4-65

尽可能提高 G+C 含量，以提高引物与模板的结合力

④ 引物的碱基组成

避免连续相同碱基排列或内部回文序列

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构

1 ）

2 ）

4-66

3 ）避免形成引物二聚体（ dimer ）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。

Upstream primer vs Downstream primer

Sense primer vs Antisense primer

Primer1 vs Primer2Forward primer vs Reverse primer

5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1

primer2

4-67

⑤ 引物的 Tm值

Tm=（ G+C)4 + (A+T)2

当引物中的（ G+C ）含量低于 50% 时，复性温度低于 55 oC 。

适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。

实际复性温度选择低于 Tm值 5 oC 。

手工计算：

一般估计：

4-68

⑥引物的浓度一般使用终浓度各 0.5mol/L 。

⑦简并引物

如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。

需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。

4-69

设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。

引物设计现在多用专业软件

⑧ 套嵌引物（ nested primers)

1 3

24

如 Primer 5.0 等

4-70

Primer 5.0

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4-83

dNTPs 是 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP 的总称。

（ 3） dNTPs

一般反应体系中 dNTP混合液终浓度用 0.2mmol/L 。

浓度过高会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性并增加错配率。

4-84

自从 H.A. Erilish 分离出耐高温的 Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow片断（ 37 oC )， PCR 技术才进入实用阶段。

（ 4） Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合 PCR过程的反复高温变性要求。

① 热稳定性

4-85

最适温度： 75-80 oC 延伸速度： 约 35-150nt/s. 酶分子最长延伸长度： 6.7kb

② 最适温度高

③ Taq 酶的功能缺点

具有 5’3’ 聚合酶活性和 5’3’外切酶活性，但没有 3‘5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！合成超过 600bp 长度的 DNA 就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。

4-86

金属离子敏感（尤其是 Mg2+ ）。

当 dNTP （能结合 Mg2+ ）的浓度为 0.7-0.8mmol/L 时， MgCl2 的最佳浓度应是2.0mmol/L 。

④ Taq DNA 聚合酶的激活剂

50mmol/L KCl 也能激活 Taq DNA 聚合酶的活性。

4-87

（ 2 ）其它耐热的 DNA 聚合酶

①Tth DNA 聚合酶无 3’ 5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录 cDNA ，又能扩增 DNA 。

②VENT DNA 聚合酶有 3‘5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受 100oC 高温。

4-88

③ Pfu DNA Polymerase

④ Taq Plus DNA Polymerase

有 3 ’-5’ 的外切酶活性， 5’-3’外切酶活性。

但 PCR产物为平端！

是目前已发现的所有耐高温 DNA 聚合酶中出错率最低的。

是 Taq和 Pfu DNA 聚合酶的混合物。 Taq的 PCR产物 3’端往往带有一个 A 。

4-89

Taq DNA 聚合酶要求有游离的 Mg2+ 。

（ 6）Mg 2+ 的浓度

所以 Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。

一般用 1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。

4-90

3. PCR 的条件（ 1 ）第一步 变性（ denature ）

94-95 oC下 5 分钟，模板 DNA 双链完全变性成单链。

（ 2 ）第二步 复性（ anneal ）

50-60 oC下 1 分钟，引物优先与模板复性。① 引物的浓度高，② 引物的链短。

4-91

94 oC下 1 分钟，新合成的 DNA 双链又变性成单链模板。

（ 4 ）第四步 变性（ denature ）

72 oC下 1-2 分钟， Taq DNA 聚合酶在引物的 3‘端上加上核苷酸。

（ 3 ）第三步 延伸（ extend ）

（ 5 ）第五步 重复（ repeat ）

4-92

第二步——第三步——第四步

复性 延伸

变性

95oC 5min

50oC 1min

72oC 2min94oC 1min

温度循环

4-93

4-94

需要的模板量极低。

4. PCR 的特点（ 1 ）特异性强

① PCR 使用专门合成的 DNA引物。② 延伸过程是在高温下进行。

（ 2 ）敏感性高

这就避免了一般 DNA 聚合酶污染和非引物延伸形成的 DNA 。提高了反映的特异性。

理论上只要一条模板链， 32 次循环就可合成约 109 条！

4-95

RT-PCR ：

对模板的纯度要求低。

（ 5 ）可以扩增 mRNA

（ 4 ）简便

先用逆转录酶将 mRNA 合成 cDNA ，再以cDNA为模板进行扩增。

（ 3 ）快速 整个 PCR过程约 4 小时即可完成。

不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。

4-96

5. PCR 技术的类型

（ 1 ）常规 PCR （ 2 ）逆转录 PCR （ 3 ）锚定 PCR （ 4 ）反向 PCR （ 5 ）巢式 PCR （ 6 ）多重 PCR （ 7 ）非对称 PCR （ 8 ）免疫 PCR （ 9 ）定量 PCR (荧光实时定量 PCR)

4-97

借助于荧光信号来检测 PCR产物。可以做到 PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 Ct值，从而根据 Ct值确定起始 DNA 的拷贝数，做到真正意义上的 DNA 定量。

6. PCR 技术的扩展（ 1 ）荧光实时定量 PCR

Real—time  PCR （或 TaqMan  PCR ）

Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。

4-98

扩增两个引物外侧的未知序列

（ 2 ）反向 PCR

把线性 DNA模板转变成环形分子。

templatetemplate

3’ 5’

5’ 3’

（传统 PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。

技术关键：

4-99

使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。

4-100

低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链 DNA 。最后产物中 99% 是单链 DNA 。

（ 3 ）不对称PCR

3’ 5’

5’ 3’引物少

用于扩增单链 DNA ，单链 DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差 100 倍。

4-101

扩增 RNA模板。如mRNA或 RNA病毒。

（ 4 ）反转录 PCR（ RT-PCR)

Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖

技术关键：

利用反转录酶，把 RNA反转录成 cDNA ，再以 cDNA为模板进行 PCR扩增。

4-102

RNA template 3’5’下游引物

cDNA first strand3’ 5’上游引物

cDNA first strandcDNA second strand

3’ 5’3’5’

反转录酶

Taq 酶

PCR

Reverse transcription (RT)

下游引物

上游引物

Taq 酶

4-103

7. PCR 技术的应用

（ 1 ）扩增某一段 DNA

从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留 DNA扩增；分析模板序列；

4-104

在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。

（ 2 ）基因的体外诱变

技术关键：利用引物的 5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。

4-105

设计引物定点诱变

4-106

利用 6bp 长度的随机序列引物扩增细胞中的总 DNA ，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。

（ 3 ）基因组的比较研究

比较不同物种之间的基因组特征和相似性。

类似于限制性内切酶片断长度多态性（ RFLP ）分析，因而也称为随机扩增多态性 DNA （ RAPD ）分析。

RAPD (Random amplified polymorphism DNA)

4-107

1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速 DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：1.当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。

2.当时的分析思路局限于 RNA序列分析法。

4.5 DNA序列技术

（ 1965 年 Cornell 大学的 S.W. Holley 等首次测定了 75bp 的酵母丙氨酸 tRNA全序列。使用的是降解片断法）。

4-108

Walter Gilbert Frederick Sanger• 1977 DNA sequencing developed: Walter Gilbert and Allan

Maxam of Harvard University and Fred Sanger of Cambridge University simultaneously come up with two techniques for determining the exact sequence of bases that make up a gene. Gilbert and Sanger share the 1980 Nobel Prize (also with Paul Berg).

4.5 DNA序列技术

4-109

Sanger等 1977年发明。

4.5.1 双脱氧链终止法

Frederick Sanger, 1980年 Nobel Prize 化学奖

4-110

（ 1） DNA 复制是以一条链为模板，按碱基 配对的原则进行的。

（ 2 ）脱氧核糖的连接是以 3’5’磷酸二脂键。

（ 3 ）复制反应可以在体外进行。

（ 4） 2’和 3’ 双脱氧的 ddNTP 会使复制反应终 止。

1. 原理

4-111

4-112

4-113

（ 1 ）制备单链 DNA模板

2. 技术要点

就是待测序的 DNA 链。

① 不能有 5’3’和 3’5’ 的外切酶活性；② 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。

（ 2 ）特殊的 DNA 多聚酶

dNTP / ddNTP = 100 / 1

（ 3 ）制备 2’和 3’ 双脱氧的ddNTP

时 , DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。

4-114

4-115

4-116

二、二、 DNADNA 序列的自动测定的基本原理和操作方法序列的自动测定的基本原理和操作方法

2.1 基本原理 由英国剑桥分子生物学实验室生物化学

家 Sanger等人 1977年创建的利用 DNA

聚合酶和双脱氧核苷酸末端终止法测序已成为现今自动测序的最佳选择方案。

4-117

2.2 其独特性在于：带 4 种不同荧光染料的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，而替代了手工测序的同位素标记。

采用聚丙烯酰胺区分长度仅差 1 个碱基的单链DNA。

一个样品的 4 个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。

电泳之后，就可以通过全自动激光激发以及荧光检测而直接“读出”碱基顺序。

4-118

2.3 组成 包括电泳系统、激光检测装置、电脑、彩色打印机、 DNA 序列分析软件及 DNA 片段大小和定量分析软件。

该系统采用电脑单点控制整个 DNA测序仪，包括电泳参数设置、数据收集、分析及结果输出。电脑可在电泳过程中对仪器运行状态进行同步检测，电泳结果可以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

4-119

4-120

4-121

• When the desired product is obtained, it will be sequenced by

the Central Services Lab

4-122

4.6 基因文库构建

4.6.1 基因文库（ gene library)

基因文库包含基因组文库和 cDNA 文库。

是指在一种载体群中，随机地收集着某一种生物 DNA 的各种克隆片段，理想地包含着该物种的全部遗传信息。

4-123

基因组文库（ genomic library ）：包含某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA 克隆群体称为基因组文库。

cDNA 文库（ cDNA library ）：包含细胞的全部mRNA 的信息的重组 cDNA 克隆群体称为 cDNA 库。

4-124

克隆文库：由克隆载体所构建的文库。载体包含包复制子、多克隆位点、筛选标志。主要目的是扩增含有目的基因片段的载体。

表达文库：是用表达载体构建的文库（ cDNA

库）。载体包含复制子、启动子、 SD序列、 ATG 、终止子、筛选标志等。主要目的是表达目的基因的编码产物—蛋白质

4-125

1 、基因文库构建的基本程序

① DNA 的提取及片段化，或 cDNA 的合成；② 载体的选择及制备；③ 载体与 DNA 片段或 cDNA连接；④ 重组体转化宿主细胞；⑤ 转化细胞的筛选；

4.6.2 基因文库的构建

基因克隆所用的载体载体 (宿主菌 ) 特征 插入大小范围

质粒（细菌、酵母） 小的环形 DNA <5 - 10 kb 噬菌体（细菌） 线性病毒 DNA up to ~20 kb 粘粒（细菌） 质粒和噬菌体的杂交体 up to ~50 kb

酵母人工染色体 YAC DNA 含有酵母着丝粒、端粒 ~200 to ~1000 kb （酵母） 和复制起始区

4-127

λ 噬菌体构建基因组文库的基本步骤

(1) 准备载体 DNA 。(2) 提取高分子量真核细胞 DNA ：并选择合适的限制性内切酶进行部分降解。(3) 分离大小合适的真核 DNA 片段。(4) 载体 DNA 与外源DNA连接。(5)连接产物在体外进行包装。(6)检测重组噬菌体的滴度，扩增、分装保存。

限制性内切酶切割 DNA

1. 特异性切割 DNA序列，不完全切割；

2. 内切酶识别 4-8 bp 核苷酸序列；

3. 片段大小与限制性内切酶位点出现频率有关

• 4-base cutter 44 = 256 bp• 5-base cutter 45 = 1,024 bp• 6-base cutter 46 = 4,096 bp• 8-base cutter 48 = 65,536 bp

• 分离约 ~20 kb的 DNA 片段 限制性内切酶部分消化， 产生的覆盖片段 ;• 分离 20kb大小的片段，能包含所有基因组 DNA 的遗 传信息 ;• 要有足够的克隆数 ; 如 : 人基因组 (3 X 109 bp) ~20 kb 基因片段

理论最小值 = ~150,000 99% probability that every sequence is represented = ~800,000

部分限制性内切酶消化

NNG GATCCNN

NNCCTAG GNN

internal fragment

cut with Bam HI (6-base cutter)

remove internalfragment

“left arm” “right arm”

cut with Sau 3A (4-base cutter) which has ends compatible with Bam HI:

NNN GATCNNN

NNNCTAG NNN

isolate ~20 kb fragments

human genomic DNA (isolated from many cells)Bam HI sites:

combine and treatwith DNA ligase

“left arm” “right arm”

“left arm” “right arm”

package into bacteriophage and infect E. coli

1

2 3

4

5 6

• genomic library of human DNA fragments in which each phage contains a different human DNA sequence

7

4-132

EcoR I

Genomic LibraryInfect cells

4-133

由于 mRNA 含有某种细胞的各种 RNA 分子，因而反转录合成的 cDNA将代表各样mRNA拷贝，将其和载体 DNA 重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。每个克隆只含一种 mRNA 的信息，足够数目克隆的总和则包含细胞的全部mRNA 的信息，这样的克隆群体叫 cDNA 库。

2 cDNA 文库（ cDNA library ）

4-134

2.1 按照筛选方式不同 cDNA 库可分为：表达型 cDNA 文库 : 采用表达型载体。插入的cDNA 片段可表达产生融合蛋白，不能采用核苷酸探针筛选的目的基因，可采用能与表达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛选。

非表达型 cDNA 文库：适用于那些采用核苷酸探针进行杂交筛选的基因。

4-135

根据载体的不同将 cDNA 库分为：

质粒 cDNA库 : 包含的 cDNA 克隆数目较少，适于较高丰度的 mRNA

噬菌体 cDNA库 : 包含的 cDNA 克隆数目非常多，适用于那些低丰度和极低丰度的 mRNA

4-136

2.2 构建 cDNA 库主要包括以下几个步骤：• ① mRNA 的分离；• ② cDNA 第一链的合成；• ③ cDNA 第二条链的合成；• ④ cDNA 与载体的连接；• ⑤ 噬菌体的包装及转染或质粒的转化。• ⑥ 检测重组噬菌体的滴度，扩增、分装保

存。

4-137

The Central Dogma

DNA

mRNA

Protein

Single-stranded

Double-stranded

Precursor RNA

exon

intron

AAAAAAAAAAn

AAAAAAAAAAn Single-stranded

AAAAAAAAAAn

double-stranded

Reverse transcription

cDNA

4-138

AAAAAA AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

Infect cellscDNA library

4-139

2.2 筛选 cDNA 库方法

• ① 核酸探针原位杂交筛选法；• ② 免疫球蛋白结合筛选法；

4-140

4-141

EcoR I

Subcloning of the cDNA insert

+EcoR I EcoR I

Is there a better way to subclone the insert?

amplify

4-142

4.7 DNA 与蛋白质相互作用研究策略

• 生物大分子之间的相互作用；• 凝胶阻滞电泳• DNaseI 足迹法

4-143

• 生物大分子之间的相互作用；

• DNaseI 足迹法

凝胶阻滞实验（ Gel retardation assay ） 又叫DNA迁移率变动实验（ DNA mobility shift assay ）

是在 80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，也是当前被选作分离纯化特定 DNA 结合蛋白质的一种典型的实验方法。

4.7.1 凝胶阻滞电泳

4-145

凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的 DNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质 BB 结合，于是在凝胶电泳结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带

AA CCBB

放射自显影放射自显影

** **

** **

凝胶电泳凝胶电泳

放射性标记的放射性标记的DNADNA 细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物

蛋白质与蛋白质与 DNADNA 结合结合

** ** ** **** **

BB DNA-DNA- 蛋白质结合蛋白质结合物电泳迁移缓慢物电泳迁移缓慢

滞后带表明滞后带表明 DNADNA 与蛋与蛋白质结合白质结合

4-146

(a)(a) (b)(b) (c)(c)

在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA之间的竞争作用之间的竞争作用（（ aa ）没有加入竞争）没有加入竞争 DNADNA 的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针 DNADNA 与特异蛋白质结合，与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（出现阻滞条带；（ bb ）加入的超量竞争）加入的超量竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA 竞争结合同一种蛋白质，竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（阻滞条带消失；（ cc ）竞争）竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA 分别结合不同的蛋白质，出现同分别结合不同的蛋白质，出现同（（ aa ）一样的阻滞条带。）一样的阻滞条带。

**

** ** ** ** ** ****** **

蛋白质与未蛋白质与未标记的竞争标记的竞争DNADNA 结合结合

凝胶电泳凝胶电泳

放射自显影放射自显影

蛋白质与标蛋白质与标记的探针记的探针DNADNA 结合结合

** **

** **

** **

** **

** **

DNaseⅠ足迹实验（ footprinting assay ）是用于检测与特定蛋白质结合的 DNA序列的部位及特性的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA 片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA 片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争 DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。

4.7.2 DNaseⅠ足迹实验

4-148

1 5 101 5 10

1 4 8 101 4 8 10

加入蛋白质 加入蛋白质 XX

加入加入DNaseIDNaseI 凝凝

胶电泳放射胶电泳放射自显影自显影

11

55

1010

A BA B

足迹足迹

(a)(a)

(c)(c)

(b)(b)

DNaseI 足迹实验

3232p p **

3232p p **

4-149

4.8 蛋白质与蛋白质相互作用研究策略

• 生物大分子之间的相互作用；• 酵母双杂交技术• 噬菌体表面展示技术

4-150

4.8.1 酵母双杂交技术

酵母 GAL4 转录因子 是一个含有 DNA 结合结构域（ DNA binding domain ， BD) 和转录激活结构域 （trans-activation domain AD) 的蛋白。它的结合到 GAL1 UAS 元件，激活相邻启动子转录 RNA.

GAL4DNA-BD

GAL1 UAS promoter lacZ (or HIS3 etc) reporter gene

GAL4AD

Promoter activation

酵母双杂交系统就是把编码两个结构域的序列分别克隆在不同的质粒中进行表达。

报告基因

4-151

报告基因

表达两个融合蛋白的质粒被共转入含有报告基因的酵母细胞，该细胞有 GAL4 报告基因启动子上游识别序列。

如， HIS3 基因 (which will confer prototrophy on a his3– auxotroph) and β–galactosidase (which will convert X–GAL into a blue product in the yeast colonies).

4-152

相互作用蛋白的筛选

共转化酵母细胞 Y190 (his3–)

在同一个细胞中表达两个融合蛋白

DNA-BD / “bait” protein AD / cDNA library protein+

在选择平板上观察含有相互作用蛋白的转化子

assay for -galactosidase reporter gene activity(lacZ expression: blue colonies)

assay for HIS3 reporter gene activity (growth on histidine-deficient medium)

表达质粒 pBD: GAL4 DNA 结合结构域编码序列融合“饵蛋白”的编码序列 .

表达质粒 pTA: GAL4转录激活编码序列融合 cDNA 文库的编码序列

4-153

酵母双杂交系统

XGAL4DNA-BD

GAL1 UAS promoter lacZ (or HIS3 etc) reporter gene

1. GAL4 DNA- 结合结构域与 X 蛋白的融合蛋白能结合在 GAL1 UAS ，但不能激活转录。

没有激活结构域？

4-154

2. GAL4 DNA- 激活结构域与 Y 基因 cDNA 的融合蛋白不能结合在 GAL1 UAS ，故不能激活转录。

GAL1 UAS promoter lacZ (or HIS3 etc) reporter gene

GAL4AD

Y

酵母双杂交系统

4-155

3.只有当 X与 Y 存在相互作用时，才能激活启动子 .即： HIS3 报告基因表达。即： β-半乳糖苷酶表达，是底物 X-GAL 或ONPG显色。

XGAL4DNA-BD

GAL1 UAS promoter lacZ (or HIS3 etc) reporter gene

GAL4AD

Y Promoter activation

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactoside5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 --D- 半乳糖苷

O-nitrophenyl- -D-galactopyranosideO- 邻硝基苯 --D- 半乳吡喃糖苷

酵母双杂交系统

4-156

4.8.2 表面展示技术

1 、噬菌体表面展示技术

2 、酵母表面展示技术

4-157

1 噬菌体展示技术

噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物开发的强有力工具。

4-158

（ 1 ）噬菌体展示（ Phage display ）

将外源蛋白（多肽、酶、抗体、 DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。

G. P. Smith1985年发明。

丝状噬菌体（ M13 、 f1 等）外壳颗粒的一端，有 3-5 个基因Ⅲ编码的蛋白质（ g3p ），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。

4-159

M13

4-160

（ 2 ）噬菌体展示载体的构建把外源 DNA 片断插入基因Ⅲ的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。

启动子 外源 DNA M13 基因Ⅲ

ori

M13 display vector

外源多肽

4-161

• 利用筛选技术能从噬菌体文库中筛选出目的多肽

• 利用磁珠能固定靶蛋白 / 多肽

• 利用 DNA测序的优势，很容易就能鉴定目的蛋白 / 多肽的序列

（ 3 ）噬菌体展示文库的筛选

4-162

免疫棒固相筛选 免疫棒

用抗原包被

用链亲合素和生物素标记抗原包被

v

B BBB B B

v

B

4-163

生物素

抗原

生物素抗原液相筛选

4-164

结合链亲合素包被的微孔板

4-165

去除未结合的噬菌体病毒粒子

4-166

洗脱结合的噬菌体

4-167

扩增洗脱的噬菌体

重复筛选

分析a) ELISAb) 抗体特异性c) 测序d) 亲和性e) 活性 E.coli

感染和扩增

4-168