第十七章 基因重组与基因工程

(genetic recombination and genetic engineering)

基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的 DNA 进行切

割、连接，组成一个新的 DNA 分子的过程，又称DNA 重组。

基因克隆 将重组 DNA 分子导入到合适的受体细胞中，使其

扩增和繁殖，以获得大量的同一 DNA 分子，称此为基因克隆、 DNA 克隆或分子克隆。

基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重

组 DNA 技术或基因工程。

本章主要内容

重要的工具酶

基因克隆常用的载体

重组 DNA 基本原理

重组技术在医学和制药 工业中的应用

第一节 重要的工具酶

工具酶

基因工程中的工具酶主要是指用于 DNA和 RNA 分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。

一、限制性核酸内切酶 (RE)

是一类由细菌产生的能专一识别双链 DNA

中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。

根据限制酶的作用特性，一般分为三类：

——Ⅰ 、Ⅱ和Ⅲ型，

其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 特异识别及切割 48 个 bp 长度且具有回文序列的 DNA 片断，主要产生 3种缺口： 5ˊ－粘性末端 3ˊ －粘性末端 平端或钝端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈 180O 旋转对称 ; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的 5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。

⑴ 产生 5'- 粘性末端

⑵ 产生 3'- 粘性末端

-CTGCA-G

5'3'

G-ACGTC-

3'5'

-CTGCA-G

5'3'

G-ACGTC-

+Pst I

3'5'

⑶ 产生平 (头末 )端 /钝端

5'-CCC3'-GGG

GGG-3'CCC-5'

+Sma I

5'-CCC3'-GGG

GGG-3'CCC-5'

其它特殊性质

的Ⅱ型限制酶

同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶

同裂酶

又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。

在切割 DNA 时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；

切割点也可以是不同的，产生 3ˊ 或 5ˊ 粘性末端，称为同识异切。

同裂酶——同识同切

5'-TTT3'-AAA

AAA-3'TTT-5'

+Aha Ⅲ

Dra Ⅰ

5'-TTT3'-AAA

AAA-3'TTT-5'

同裂酶——同识异切

GCCATG

GTACCG

GGTACCCCATGG

GGTACC

CCATGG

+Kpn I

5'-G3'-CCATG

GTACC-3'G-5'+

Asp718 I

5'-3'-

-3'-5'

5'-3'-

-3'-5'

5'-3'-

-3'-5'

同 尾 酶

GCCTAG

GATCCG

GATCCTAG

GATCCTAG

5'-3'-

-3'-5'

Mbo¢ñ BamH¢ñ Bgl¢ò

5'-3'-

-3'-5'

5'-A3'-T

T-3'A-5'

同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。

可变酶

可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过 6个碱基对。

如， BstpⅠ，其识别顺序为 GGTNACC 。

常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称 酶名称 识别顺序 同裂酶 同尾酶

Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌

BamHⅠ GGATCC BstⅠ Bgl ⅡMboⅠ

Bacillius globigil球芽孢杆菌

Bgl Ⅱ ACATCT

Escherichia coli RY13

大肠杆菌EcoRⅠ GAATTC

Haemophilus influenzae流感嗜血菌

Hind Ⅲ AAGCTT HsuⅠ

Providencia stuartii 164普罗威登细菌

PstⅠ CTGCAG SalpⅠ

Streptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌

SalⅠ GTCGAC AvaⅠXhoⅠ

二、 DNA 聚合酶

（最常用的 DNA 聚合酶有以下 4种） DNA 聚合酶Ⅰ

DNA 聚合酶Ⅰ大片段——Klenow 片段

Taq DNA 聚合酶

T4 噬菌体 DNA 聚合酶

㈠ DNA 聚合酶Ⅰ E.Coli DNA 聚合酶Ⅰ（ DNA pol Ⅰ） 是一个具有

3 种酶活性的多功能性酶。

包括：

5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性

5ˊ→3ˊ 核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ 核酸外切酶活性

DNA pol Ⅰ应用⑴ 催化 DNA 缺口平移反应，制备高比活性 DNA

探针；

⑵ 第二条 cDNA 链的合成；

⑶ 对 DNA3’突出末端进行标记；

⑷ DNA 序列分析。

E. coli DNA pol. Ⅰ 催化切口平移

㈡ Klenow 片段（ DNA pol. 大片断）

Klenow 片段用途

⑴ 补齐双链 DNA的 3ˊ末端；⑵ 用标记碱基补 齐 3ˊ 末端 ；

聚合酶Klenow DNA [ -32P]dNTPα

双链DNA

粘端5'-

Ⅲ外切酶

变性

+

5'3'

3'5'

3'

5'

3'

5'

3'

3'

5'

5'

5'

5'3'

3'

标记探针

标记末端⑶ 在 cDNA 克隆中，

用于第二股链

的合成；

⑷ DNA 序列分析。

㈢ Taq DNA pol （耐热 DNA 聚合酶）

作用特点

1） Taq DNA pol 催化 DNA合成的最适温度范围

70 75℃，

2） 95℃以上高温，半小时不失活，

3） 最适合用于聚合酶链反应（ PCR）。

三、逆转录酶 特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下 3种酶活性：

⑴ 以单链 RNA 为模板， 催化合成 cDNA 单链

⑵ 具有 RNase H 活性，能水解 RNA:DNA杂交链中的 RNA

⑶ 以 DNA 为模板，催化合成 cDNA 双链。

逆转录酶的应用：

⑴ 将 mRNA 逆转录成 cDNA ，构建 cDNA 文库；

⑵ 补平和标记 5ˊ- 末端突出的 DNA 片段；

⑶ 代替 Klenow 酶用于 DNA 序列分析；

⑷ 制备杂交探针等。

四、 DNA连接酶 (DNA ligase)

DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链 DNA 中一条链的 3ˊ－ OH与另一条链的 5ˊ－ PO3

H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的 DNA长链。

DNA连接酶的用途（ 1） 两个双链 DNA 片段连接起来5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ

3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ

（ 2） 修补带有缺口的双链 DNA 分子T4DNA连接酶

五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 (BAP) 能够催化水解去除 DNA 或 RNA5ˊ- 端的磷酸基团。

用途

⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5ˊ －端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。

⒉ 用 32P 标记 5'- 端前，去除 5'-P ，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到 5'- 端进行标记。

六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶 (TdT)

作用 将标记或未标记的 dNTP加到 DNA 的 3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的 DNA 片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。

应用① 探针标记

P32-α.dGTPG32G32G32G32 G32G32G32G32

② 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接

重要的工具酶工具酶 活性

限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割 DNA T4 DNA连接酶 催化 DNA5ˊ- 磷酸与 3ˊ-羟基

形成磷酸二酯键 DNA 聚合酶 以 DNA 为模板合成 DNA 逆转录酶 以 RNA 为模板合成 DNA

碱性磷酸酶 切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸 5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶 催化 3'- 端合成同聚体尾

第二节 基因克隆常用的载体

载体 (vector)

是将外源 DNA(目的 DNA) 片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为 DNA 。

本节主要内容 载体必须具备的基本条件

载体的种类

常用的载体

一、载体必须具备的基本条件

⒈ 有自身的复制子，能独立复制

⒉ 具备多个限制酶的识别位点 (多克隆位点 )

⒊ 具有遗传表型或筛选标记

⒋ 有足够的容量以容纳外源 DNA 片段。

⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动

子、前导序列、增强子等调控元件。

⒍ 载体 DNA 中均有一段非必需区，将外源基因插入

该非必需区，而载体本身不受影响。

二、载体的种类 *（一） 克隆载体 用来克隆和扩增 DNA 片段的载体，具有 3点共性： ⑴ 能够在受体细胞复制； ⑵ 带有药物抗性基因，便于筛选； ⑶ 可导入受体细胞。

（二）表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的 DNA 顺序。

三、常用的载体 （一） 质粒 (plasmid) ：

是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状 DNA 分子。

作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数 2. 具有 1个以上的遗传标志，便于筛选 3. 具有多克隆位点

总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。

广泛应用的质粒：

pBR32 质粒、 pUC系列等

pBR322 质粒① 4363 bp② 含一个复制点③ 含一个抗氨卞青霉素标 记 (ampR)④ 一个抗四环素标记 (te

tR)⑤ ampR和 tetR基因内各

有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入

当外原基因插入抗药基因位点时， AmpR→Amp敏感 (AmpS ) 、 TetR→Tet敏感 (TetS).

pUC系列质粒

由 pBR322和 M13 噬菌体构建而成的双链质粒载体；

（ 1） 2674bp ；

（ 2 ） 有 ampr和与 M13 噬菌体

相同的多克隆位点（ MCS）

（ 3）有一个来自大肠杆菌的 LacZ 操纵子的 DNA 片断 , 编码半乳糖苷酶

( 二 )λ噬菌体

组成特点：

双链线状 DNA 分子，

全长 50kb ，

含 65 个基因，

在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为 COS位点。

λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长

溶菌性生长（ lytic pathway）

噬菌体感染细菌后，借助其 2 个 COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。

溶源性生长 (lysogenic pathway)

噬菌体感染细菌后，可将自身 DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。

λ 噬菌体两种生长途径（示意图）

第三节 重组 DNA 基本原理

（ DNA重组基本程序包括下列过程）

分—获取目的基因和载体

接—目的基因与载体的连接

转—重组 DNA导入宿主细胞

筛—重组 DNA 的筛选与鉴定

1 、获取

TTT

TAAA A

质粒外源DNA分子

TTAA TTAA

AATT

EcoR I EcoR I

AATT

DNA重组基本过程

2 、重组T

TTTAAA A

ligase

TTAA TTAA

AATT

“ ”退火

AATT

3 、转化

(转化到宿主细胞中 如E. coli)

宿主细胞染色体DNA

重组质粒

重组质粒

4 、筛选

筛选含有重组质粒的菌株

宿主细胞染色体DNA

重组质粒

含有外源DNA “ ”的 工程菌

5 、克隆含有外源DNA “ ”的 工程菌

/繁殖 扩增

6 、表达

表达产物分离纯化表达产物分离纯化

一、目的基因的获取（分）目的基因

是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

目的基因来源 1 ） 制备基因组 DNA

2 ） 制备 cDNA

3 ） 聚合酶链反应

4 ） 人工合成基因

（一）制备基因组 DNA （基因文库）分离、纯化基因组 DNA 条件：温和，在 EDTA 或 SDS 等存在下

↓RE 用蛋白酶 K消化细胞、酚抽提

大小不同酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离

↓

分别与同样 RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体

↓ DNA连接酶连接。

导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。

↓

筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳

等方法鉴定。

（二）制备 cDNA （ cDNA 文库）（ 1 ）合成 cDNA 第一条链

反应体系只有 mRNA 、逆转录酶、 4 种 dNTP 、引物。

引物是与 mRNA3ˊ 端 polyA 互补的寡聚 dT （ 12 ～ 18dT 片段）

（ 2 ）合成 cDNA 第二条链

RNase 去掉模板 mRNA

（ 3 ）构建 cDNA 文库

① 　 cDNA 两端加接头或衔接头

接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。

衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。

② 　 cDNA 与载体相连。

③ 　导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存 cDNA 集合体便是 cDNA 文库。

（二）制备 cDNA （ cDNA 文库） 分离目的基因 的 mRNA

逆转录生成 cDNA 单链

水解去除 mRNA ，

合成 cDNA 双链

水解回折处单链得到平端双链 cDNA

导入宿主细胞克隆 , 构建 cDNA 文库

（三）聚合酶链反应 ( PCR) 在模板 DNA 、引物、 dNTP 、 TaqDNA 聚合酶等条件下，体外经 94℃ 变性、 54℃退火及 72℃延伸 3 个步骤的反复多次循环（ 2530次），扩增目的基因（见 18章）。

（四）人工合成基因

引用 DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用 DNA 合成仪通过化学合成原理合成目的基因。

一般先合成短片断 DNA ，然后再拼接成长片段。

二、 目的基因与载体的连接（接）

（主要有以下 4种连接方式）

1) 粘性末端连接

2 ） 平头末端连接

3 ） 人工接头法

4 ） 同源多聚尾连接法

（一） 粘性末端连接

将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生

相同粘性末端，再通过 DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组 DNA 分子。

（二）平头末端连接

某些限制酶只能将目的基因和载体 DNA 切割成

平端，此时在 T4DNA连接酶的作用下同样能连接起

来。

（三） 人工接头法

合成连接子→与 DNA 平头末端连接→限制酶切割 ,产生粘性末端→连接，构建重组 DNA 。

（四）同源多聚尾连接法

三、重组 DNA导入宿主细胞（转） 无性繁殖 体外重组后的 DNA导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组 DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。

克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的 DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。

宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞 .

重组 DNA导入宿主细胞的类型转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。

感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源 DNA 的能力， 这种细胞称感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。

四、重组 DNA 的筛选与鉴定（筛）

（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）

1 ） 平板筛选

2 ） 限制酶切图谱筛选

3 ） PCR筛选重组体

4 ） 原位杂交技术

插入失活

蓝－白筛选

（一） 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方

法。

如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能

在含抗生素（ Amp 或 Tet ）的培养平板上生长；未转

化的则不能生长。

1. 插入失活

当外源 DNA 序列插入质粒中某一抗药基因内，使

该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的

培养平板上。

抗生素平板筛选（插入失活）

（ 2）蓝 - 白筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码 β- 半乳糖苷酶的基因。 载体：编码 β- 半乳糖 宿主： 编码 β- 半乳糖 苷酶 N 端序列 苷酶 C端序列

α- 互补

细菌表达： β- 半乳糖苷酶活性蛋白↑

5-溴 -4-氯 -3-吲哚（ X-gal ） → 形成蓝色菌落

当在质粒中插入外源 DNA→β- 半乳糖苷酶的 N端基因失活→不能与宿主 β- 半乳糖苷酶的 C 端进行 α- 互补→产生白色菌落。

（ IPTG 存在下）

蓝－白筛选示意图

2. 限制性内切酶图谱鉴

3. PCR筛选重组体 抽提少量重组 DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。

4. 原位杂交技术

五、重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 克隆基因表达有三个条件⑴ 基因的编码区不能被插入序列所中断 ;⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的 RNA 聚合酶有效地识别 ;⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。

第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用 一、疾病基因的发现

1990年美国科学家首先启动人类基因组计划（ HGP ），计划历时 15年，至 2005年完成；

2001年 2月 12日由 Since和 Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组 3X109bp 的最新图谱，约含 34万个基因；

整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类 4万个基因功能的任务将更为艰巨。

人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部

基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。

如，已知人类遗传性疾病约有 3000 种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。

产品名称 治疗功能与医药范围 1. 人胰岛素 治疗糖尿病 2. 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3. α干扰素 治疗癌症、病毒感染 4. β干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. γ干扰素 治疗癌症、病毒感染 6. 人组织纤溶酶原激活因子 (tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死

9. 凝血因子Ⅷ 治疗 A 型血友病 10. 乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11. 神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12. 脑啡肤 镇痛 13. 降钙素 治疗骨质疏松症

二、 生产蛋白质和多肽类活性物质

基因工程生产胰岛素的原理（示意图）

三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（ 1） 乙型肝炎病毒疫苗（ HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（ HCV）等；（ 2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T 细胞免疫缺陷病毒（ HITV-1 ）等；（ 3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（ 4） 制备一些多价疫苗等。

四、改良物种特性

动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因

　　　↓把 YFG放在 β—乳球蛋白的启动子下

　　　　↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内

　　↓YFG 在乳腺中表达

　　↓乳汁中提纯 YFG蛋白。

1. 分离体细胞

（ 先 处 于 “ 饥饿”的“静止状态”） →使“关闭”的基因全部“打开”。

2. 植入去核的卵细胞中→胚胎细胞

3. 将胚胎细胞植入寄养母体内。

五、动物克隆

六、其他应用（略）