值差异型不对称方法的建立及其在分子诊断中的应用jxmu.xmu.edu.cn/Upload/Park/f1cef7ad-0f50-4752-adb... · TmL)、大量引物(PX)的Tm值(meltingtemperature

第55卷第4期厦门大学学报(自然科学版) Vol.55 No.4

2016年7月 JournalofXiamenUniversity(NaturalScience) Jul.2016

http:∥jxmu.xmu.edu.cn

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201506017

Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

饶华春1,滕继云1,刁勇1,宋沁馨2,3,王立强1,杨会勇1*,周国华2*

(1.华侨大学生物医学学院分子药物研究院,教育部分子药物研究中心,福建泉州 362021;

2.南京军区南京总医院药理科,江苏南京 210002;

3.中国药科大学药物分析教研室,药物质量与安全预警教育部重点实验室,江苏南京 210009)

摘要:多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的,如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一

直是研究热点.以包含BRCA1 基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象,通过调整不对称扩增引物

碱基序列组成(5'-端引入错配或加入锁核苷酸(lockednucleicacid,LNA)),使用相差10倍浓度来增加不对称引物间

Tm值差异,改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液,不同退火温度的二阶循环扩增程序)后,进行不对称扩增来产生

大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(TmdifferenceasymmetricPCR,TDA-PCR)可有效提高单链

DNA分子产率,降低引物设计难度,也扩大了模板序列的适用范围.此外,还针对禽流感病毒 H5N1的血凝素(haemag-

glutinin)HA 基因保守序列进行不对称扩增,用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测,所得结果与参考序列一

致且无明显干扰信号.因此,采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率

更高,具有很好的通用性和实用性.关键词:Tm值差异型不对称PCR;单链DNA模板;单核苷酸多态性;焦磷酸测序;禽流感病毒

中图分类号:Q755 文献标志码:A 文章编号:0438-0479(2016)04-0485-10

收稿日期:2015-06-17 录用日期:2016-01-18 基金项目:国家自然科学基金(31200979,81271691,82170734,30973591);国家国际科技合作项目(2011DFG33320);福建省自然科学基金

(2016Y0063);江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20151445);中国博士后科学基金(2012M512179,2013T6092);中国博士

后科学基金特别资助(2013T60962);药物质量与安全预警教育部重点实验室项目(MKLDP2013MS01);江苏省青蓝工程项目;中央高

校基本科研业务费专项(ZQN-PY319,2015ZD008);华侨大学高层次人才启动项目(09BS624)*通信作者:[email protected](周国华);[email protected](杨会勇)引文格式:饶华春,滕继云,刁勇,等.Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用[J].厦门大学学报(自然科

学版),2016,55(4):485-494. Citation:RAOHC,TENGJY,DIAOY,etal.EstablishmentoftheTmdifferenceasymmetricPCRmethodanditsapplication

inmoleculardiagnosis[J].JournalofXiamenUniversity(NaturalScience),2016,55(4):485-494.(inChinese)

如何针对诸如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等难治

性疾病进行防治是当前医药工作领域面临的迫切难

题.目前针对这些难治性疾病的研究越来越多,新的机

制和理论不断被提出,总的认识是这些疾病均与人类

基因相关,在一定程度上可以说这些疾病均属于分子

疾病.因此阐明这类疾病的分子机制成为有针对性制

定治疗方案的前提条件.以人类疾病相关基因序列的

检测与功能研究为主要任务之一的分子诊断学,可为

这些疾病的分子机制研究提供方法和积累数据.其中

焦磷酸测序是当前分子诊断较为常用的手段,是一种

短片段DNA分析检测的理想平台.焦磷酸测序是基

于DNA合成延伸反应的测序技术[1-2],不需要电泳和

荧光标记,可实时分析测序引物相邻的碱基序列,目

前已在分子诊断中如基因特异位点检测[3-4]和大规模

测序[5-6]、疾病相关基因检测[7-8]、病原微生物快速检测

与确定[9]等领域得到广泛应用.因此本研究选择焦磷

酸测序技术来检测通过优化前后不对称扩增获得的

单链DNA样本制备质量,并分析其在分子诊断中的

应用效果.单链DNA样品的获取是众多分子诊断技术的关

键步骤之一[1],如探针杂交[10]、实时荧光定量

PCR[11]、适体筛选[12]、生物传感器[13-14]、疾病诊断与

检测[15],甚至用于基因表达调控[16].单链DNA样品

质量直接关系到以上述检测平台为基础的检测与研

究结果的分析和效果评价.目前单链DNA样品制备

主要采用微球捕获法[1,17],此方法可获得单一的单链

厦门大学学报(自然科学版) 2016年


产物,但制备步骤繁琐,易发生交叉污染.一般不对称

PCR被认为可以产生大量单链DNA样品,但是很多

时候扩增效率并不稳定.指数线性PCR(linear-after-the-exponential-PCR,LATE-PCR)技术针对一般不

对称PCR扩增技术进行了改进,将引物及扩增产物

Tm计算引入到不对称PCR实验设计中[18-21],还发展

为可高效率制备用于焦磷酸测序及其他分子诊断平

台的单链寡核苷酸分子[22-24],可以说LATE-PCR是

一种Tm值差异型不对称扩增PCR.但是LATE-PCR要高效产生单链核苷酸分子,需限制性引物(PL)的Tm值(meltingtemperatureofthelimitingprimer,

TmL)、大量引物(PX)的Tm值(meltingtemperatureoftheexcessprimer,TmX)和扩增产物的 Tm 值

(meltingtemperatureofdouble-strandedamplicon,

TmA)满足TmL-TmX≥5℃和TmA-TmX≤13℃这2个条件[23,25].经过分析和实验表明,对于很多富

含AT碱基的序列以及较长的目的片段,LATE-PCR的引物设计将变得十分困难[22-23].

本研究通过分析不对称扩增体系中引物和扩增

产物的Tm值,研究其与扩增效率和扩增特异性的关

系,通过提高大量引物的Tm值,降低限制性引物的

Tm值,优化引物设计和扩增程序,期望提高长片段和

富含AT碱基的DNA片段单链产生效率,并有效简

化焦磷酸测序等分子诊断方法的操作流程,建立一种

低运行成本的单链DNA模板制备的Tm值差异型不

对称扩增(TDA-PCR)新方法.选择BRCA1 基因中3个与乳腺癌相关单核苷酸多态性(SNP1~3)[22,26-27]和rs2270517(SNP4)[28]的DNA片段为研究对象,通过

对比LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法

的单链扩增效率和焦磷酸测序结果,对其单链模板制

备效果进行考察;同时采用TDA-PCR法制备禽流感

HA 基因单链模板并进行焦磷酸测序检测,以考察其

对实际样品的检测效果以及在不同焦磷酸测序系统

中的通用性.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

EDC-810基因扩增仪(北京东胜创新生物科技有

限公司);PowerPac1000高压电源(美国BIO-RAD公

司);GenGenius凝胶电泳成像仪(美国Syngene公

司);CUV-紫外透射仪(美国Bioimage公司);焦磷酸

测序装置由本实验室按文献[29]自行组装完成;

R6335光电倍增管(日本HamamatsuPhotonicsK.K.

公司);BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理

研究所);N2000色谱工作站(浙江大学智达信息工程

有限公司);PSQ96焦磷酸测序仪器(瑞典 Pyrose-quencingAB公司).

TaqDNA 聚合酶、dNTPs(10mmol/L)、10×Buffer(不含 Mg2+)、MgCl2购自TaKaRa公司(大连

宝生物工程有限公司);FastStarTaqDNA聚合酶

购自Roche公司(上海罗氏制药有限公司);乙烯基

吡咯烷酮(PVP)、重组荧光素酶购自美国Promega公司;牛血清白蛋白(BSA)、5'-磷酸化硫酸腺苷

(APS)和 Apyrase购自美国Sigma公司;α-硫化脱

氧三磷酸腺苷(dATPαS)、dGTP、dTTP和dCTP购

自AmershamPharmaciaBiotech公司.ATP硫化酶、

Klenow片段(无外切酶活性)由本实验室表达.所用其他化学试剂均为分析纯,所有试剂均用去离子

水稀释.本研究所用的血样由本实验室健康志愿者提供,

分别编号为g-1和g-2.血样样品的基因组DNA按照

酚-三氯甲烷法提取.以BRCA1 基因上3个乳腺癌相

关SNPs和rs2270517为对象,分别标记为 SNP1、

SNP2、SNP3、SNP4.禽流感病毒 H5N1 的基因组

DNA从江苏省疾病控制中心获得.本研究所涉及的核苷酸片段序列均来自NCBI网

站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),包含rs2270517位

点相关序列(AC104581.22)、3个 BRCA1 基因的

SNPs相关序列(NT_010755.15)、禽流感病毒H5N1的

HA 基因序列(CY098853.1);引物设计使用Primer5.0软件,Tm 值计算采用在线软件 OligoAnalyzer3.0(http:∥scitools.idtdna.com/calc/analyzer,参数按实际

值输入,如一价阳离子浓度50mmol/L,PX浓度为1

μmol/L,PL浓度为0.1μmol/L);锁核甘酸(LNA)修饰

的引物设计采用Exiqon公司的在线LNA设计和分析

工具(http:∥lna-tm.com/).LNA修饰的引物由TaKaRa公司合成,其他引物均由Invitrogen公司(上海英骏生

物有限公司)合成.

1.2 实验方法

1.2.1 PCR扩增反应体系与扩增程序

反应体系总体积25μL,包括:3mmol/LMgCl2、

100μmol/LdNTPs、1.5 U Taq DNA 聚合酶、1mmol/L引物PX、100nmol/L引物PL、2.5μL10×PCRbuffer(50mmolKCl、15mmolTris-HCl、pH8.0)、13% (体积分数)甘油、0.48% (质量分

数)BSA.

·684·

第4期饶华春等:Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用


PCR反应程序:95℃5min;87℃10s,58℃10s,72℃20s,30个循环;87℃10s,66℃10s,72℃20s,30个循环;72℃10min;16℃维持.其中第一扩

增循环的退火温度比TmL低1~2℃,第二扩增循环

比TmX的低1~2℃.采用2%~3%(质量分数)琼脂

糖凝胶电泳检测,染料为Goldview(北京赛百盛基因

技术有限公司),用量5μL/100mL.

1.2.2 PCR产物电泳条带面积与强度检测

将PCR产物电泳图在ImageJ软件打开,改变图

片的类型,降低背景的影响;在每个泳道选定待分析

的目的条带,选择相同大小的区域进行分析,生成曲

线图;对特定条带进行积分计算,得该区域的积分面

积后,计算此部分条带的强度.

1.2.3 单链模板制备及焦磷酸测序

焦磷酸测序模板的制备和焦磷酸测序过程均按

照文献[22]进行,包括反应液配制、PCR产物处理、焦磷酸测序3个步骤.

2 结果与讨论

2.1 TDA-PCR反应效率分析与条件优化

2.1.1 TDA-PCR反应机理分析

相对于普遍使用的微球捕获法,不对称PCR曾

被认为是制备 DNA单链分子较为理想的方法,但其产生单链DNA产物的效率很低[18],因为在指数

扩增阶段,限制性引物的消耗降低了其与模板的退

火效率,而使线性扩增阶段用来扩增模板数量较

少;在线性扩增阶段,不断增多的单链扩增产物与

大量引物竞争性结合扩增模板,导致单链产生效率

降低.LATE-PCR方法注意到了引物浓度变化对

Tm值的影响[18],发现只有满足 TmL-TmX≥0℃和TmA-TmX≤18℃2个条件才能获得较好的

单链扩增效率[25].而在已报道的用于焦磷酸测序的

LATE-PCR反应中,这个条件进一步被优化成

TmL-TmX≥5℃和 TmA-TmX≤13 ℃[23];但依据这个条件,浓度低的引物需要较高的 Tm 值,因此要扩增较长的靶片段或引物退火区域富含 AT碱基的靶序列,引物设计十分困难,这限制了

LATE-PCR的应用范围.为了解决这个问题,在充分研究LATE-PCR反

应机制的基础上,尝试并逐步改进这种不对称扩增

方法,改变LATE-PCR中PX和PL的浓度比值,PX

采用高浓度而PL采用低浓度.从表1可以看出:同样序列的引物,按照 LATE-PCR计算 TmL-TmX的值多在1~3℃,而在TDA-PCR体系中其值则可

达5~10℃.在指数扩增阶段,TDA-PCR采用低温

退火温度(比TmL低1~2℃)和充分的循环反应来

增加PL的退火效率和反应效率.由于PX的 Tm值

较高,理论上非特异性扩增的风险将增加,本研究通

过优化PCR增强剂配比以及改进扩增反应程序克服

了这一问题.在线性扩增阶段,扩增产物与引物PX仍会竞争结合扩增模板,则 TmA-TmX≤13℃仍

是高效率扩增单链的必要条件;但在 TDA-PCR中,

PX因浓度高,TmX 比 LATE-PCR 中更易接近

TmA,引物设计时相对容易,相同条件下,对长片段

有较高的单链扩增效率.

2.1.2 TDA-PCR的引物设计与PCR条件的优化

为了能使限制性引物有效地与模板退火,本研究

选取了先低温(比TmL低3~5℃)、后高温(比TmX低1~2℃)的扩增程序;先使PL在线性扩增基本消

耗完全,再在线性扩增阶段增高温度以增加反应特异

性,且使Tm值低的PL无法再与模板退火,从而产生

大量单链产物.有关循环数的选择,LATE-PCR方法

在指数循环阶段选择25个循环[25],本研究对循环数

进行了优化,发现在所建立的TDA-PCR反应中30个

循环效果更好;根据研究发现TaqDNA聚合酶在55个循环后还有一半活性,通过降低变性温度和增添

PCR增强剂来保持其活性,线性扩增阶段反应也优化

为30个循环.为了进一步优化扩增效率,本研究在引物设计中

还引入了可有效增加Tm值的LNA.LNA是新型的

核酸类似物,适用于所有的4种核苷酸,且能够显著

提高双链稳定性.研究认为寡核苷酸序列中每增加1个单体LNA分子将使Tm升高2~8℃[30],而引物与

模板结合的特异性却不会因为碱基数增加而降低,因此特别适合TDA-PCR反应.本文所设计的LNA修饰

引物长度和相应Tm值见表1.

2.1.3 TDA-PCR的单链扩增效率分析

为了验证LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法对不同片段的扩增效率,设计了包含不同

SNP位点的不同长度DNA片段进行扩增,结果见图

1(2%琼脂糖凝胶,Goldview荧光染料).该荧光染料

结合单链呈现淡红色,结合双链为绿色.从结果可以看

出,对于不同长度目的片段的扩增,TDA-PCR产物可

以看到绿色双链条带和淡红色单链条带(泳道1~7),

·784·



表1 TDA-PCR和LATE-PCR所用的引物和焦磷酸测序引物

Tab.1 PrimersforTDA-PCR,LATE-PCRandpyrosequencing

引物

名称引物序列(5'→3')

引物浓度/

(μmol·L-1)Tm/

℃TmL-TmX/

℃

产物长度/

bp

产物

名称

TmA/

℃

用于TDA-PCR

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 1.0 68.88.8 171 Fs1 75.2

S1-PX taaggaccgagagtgggcagagaat 0.1 60.0

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 1.0 68.87.7 260 Fsa1 75.5

S1-PX3 cgttctgaccaaccacaggaaagcc 0.1 61.1

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 1.0 68.89.2 360 Fsb1 76.6

S1-PX4 cgtcggagtaaagagtccagtttcgttg 0.1 59.6

S2-PL acgccgccaaggtccaaagcgagcaagag 1.0 70.410.7 102 Fs2 74.8

S2-PX gtggaatacagagtggtggggtgag 0.1 59.7

S3-PL ctagccgagcggagcagaatggtcaagtg 1.0 66.78.4 123 Fs3 71.6

S3-PX cctttgcgagtggttctattgggtt 0.1 58.3

S4-PXb0 gcgggagtttggtaatggtcagcg 0.1 61.27.7 99 Fsa4 80.0

S4-PLb0 ggggggatgggtggagcttgtcttgagg 1.0 68.9

S4-PXb0 gcgggagtttggtaatggtcagcg 0.1 61.27.8 95 Flsa4 79.0

S4-LNA gGatgGgtggagcttgtcttgagg 1.0 69.0

S4-PXb1 ggtttccgactgctgtgtgccgag 0.1 63.15.9 152 Flsb4 82.0


S4-PXb1 ggtttccgactgctgtgtgccgag 0.1 63.15.8 156 Fsb4 82.7


QLG-hafx caccaccaagtgtcaaactccaataggggcg 1.0 66.58.5 197 FHA1 74.6

QLG-hafl ctgtaaaccctgcgatagctccaaatag 0.1 58.0

用于LATE-PCR

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 0.1 66.53.8 171 Ls1 75.2

S1-PX taaggaccgagagtgggcagagaat 1.0 62.7

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 0.1 66.52.9 260 Lsa1 75.5

S1-PX3 cgttctgaccaaccacaggaaagcc 1.0 63.6

S1-PL gcggtcacccacagtcgggaaacaagcat 0.1 66.54.6 360 Lsb1 76.6

S1-PX4 cgtcggagtaaagagtccagtttcgttg 1.0 61.9

S2-PL acgccgccaaggtccaaagcgagcaagag 0.1 68.15.7 102 Ls2 74.8

S2-PX gtggaatacagagtggtggggtgag 1.0 62.4

S3-PL ctagccgagcggagcagaatggtcaagtg 0.1 64.43.4 123 Ls3 71.6

S4-PX cctttgcgagtggttctattgggtt 1.0 61.0

S4-PXb0 gcgggagtttggtaatggtcagcg 1.0 63.92.5 99 Lsa4 80.0


S4-PXb0 gcgggagtttggtaatggtcagcg 1.0 63.92.1 95 Llsa4 79.0


S4-PXb1 ggtttccgactgctgtgtgccgag 1.0 65.80.2 152 Llsb4 82.0


·884·



续表

引物

名称引物序列(5'→3')

引物浓度/

(μmol·L-1)Tm/

℃TmL-TmX/

℃

产物长度/

bp

产物

名称

TmA/

℃

S4-PXb1 ggtttccgactgctgtgtgccgag 1.0 65.80.6 156 Lsb4 82.7


用于焦磷酸测序

S1-PX taaggaccgagagtgggcagagaat 0.3 61.3 Fs1

S2-PX gtggaatacagagtggtggggtgag 0.3 61.0 Fs2

S3-PX cctttgcgagtggttctattgggtt 0.3 59.6 Fs3

S4-PXa gatgggtggagcttgtcttgagg 0.3 59.9 Fs4

QLG-hafl ctgtaaaccctgcgatagctccaaatag 0.3 FHA1

S1-PX taaggaccgagagtgggcagagaat 0.3 61.3 Ls1

S2-PX gtggaatacagagtggtggggtgag 0.3 61.0 Ls2

S3-PX cctttgcgagtggttctattgggtt 0.3 59.6 Ls3

S4-PLa ggtcagcgccgggctgcaagtgtaga 0.3 68.5 Ls4

注:1)在引物S4-LNA中,大写字母表示的碱基为LNA,小写字母表示正常碱基;2)部分引物中下划线标示的碱基为引入的突

变碱基(引突变碱基目的主要是调整引物Tm值,使PL的Tm值尽可能高些,使TmL与TmX以及TmX与TmA的差值尽可

能大些,从而能够更符合高效进行不对称扩增的条件,增大这些扩增方法的适用范围);3)产物名称中F开头的表示本文所建立

的TDA-PCR方法扩增,L开头的表示LATE-PCR方法扩增;4)测序引物部分,产物名称一栏表示用此扩增片段制备的单链

DNA为测序模板,对应的引物为测序引物.

泳道1~7为采用新建立的TDA-PCR方法扩增目的

片段的结果,泳道8~11为采用LATE-PCR方法扩增目的片段的结果.M为DNA分子质量标准.

图1 包含SNP1~4的不同长度产物的LATE-PCR和TDA-PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测

Fig.1 AgarosegelelectrophoretogramresultsoftheampliconscontainingSNP1-4respectivelyusing

TDA-PCRandLATE-PCRmethods

而LATE-PCR产物同样可以看到红色和绿色条带

(泳道8~11),但TDA-PCR与相对应的LATE-PCR扩增产物相比红色条带更亮.为了验证TDA-PCR的

单链扩增效率是否高于LATE-PCR,用ImageJ软件

对图1中目的条带强度进行了分析,结果见表2,除Fs2和Ls2较接近外,其他均是TDA-PCR的条带强度

高于LATE-PCR,这也证明了本研究建立的TDA-PCR

表2 采用ImageJ软件对图1目的

电泳条带进行强度分析结果

Tab.2 Theresultsofintensityanalysisofthetarget

electrophoresisbandsinFig.1byImageJtool

泳道产物名称条带强度

1 Fs1 134.698

2 Fsa1 1465.903

3 Fsb1 3350.489

4 Fs2 573.861

5 Fs3 844.962

6 Fsa4 438.770

7 Fsb4 513.891

8 Ls1 53.314

9 Lsa1 549.569

10 Lsb1 1313.589

11 Ls2 624.104

体系扩增效率较高,特异性较好.通过对TDA-PCR条件进行优化,包括DNA聚

合酶的选择(非热启动DNA聚合酶),退火温度(指数

扩增比 TmL低1~2℃,线性扩增比 TmX低1~2℃)、变性温度(比TmA高5~10℃)、循环数(指数

·984·



扩增阶段30个循环,线性扩增阶段30个循环)、延伸

时间的估算(根据1000bp/min)以及添加PCR增强

剂(13%(体积分数)甘油,0.48%(质量分数)BSA),建立了一种可以使用非热启动 DNA 聚合酶进行

TDA-PCR扩增的体系.

2.2 TDA-PCR扩增产物的焦磷酸测序检测

(a)用PSQ96焦磷酸测序系统对Fs3片段部分序列的测序结果,dNTP加入的顺序是:GATCGATCGATCGATC;(b)用自制

焦磷酸测序仪对Fs3片段部分序列的测序结果,dNTP加入的顺序是:GTCATGCAATACGAA;(c)和(d)包含SNP2的DNA片段的焦磷酸测序结果,dNTP加入的顺序是:TGAGCTCGAGATCATG(对Ls2)和GGAACGTCCTTCTT(对Fs2);(e)和(f)包含

SNP3的DNA片段的焦磷酸测序结果,dNTP加入的顺序是:AGTCTGATTCGAGAAG(对Ls3)和GTACTCGATAGG(对Fs3).

图2 包含SNP2和SNP3扩增产物的焦磷酸测序结果

Fig.2 ComparativeresultsofpyroseuquencinganalysisoftheampliconscontainingSNP2andSNP3

2.2.1 包含BRCA1基因SNP目的序列的焦磷酸测序

首先检测了采用TDA-PCR制备的模板在不同仪

器上的适用性,对包含SNP3的目的片段进行不对称

扩增,然后按照文献[22]步骤制备焦磷酸测序模板,准备焦磷酸测序用试剂,在商品化的PSQ96焦磷酸测

序仪和自制磷酸测序仪上同时进行测序,结果如图2所示.从图中结果可以看出,PSQ96焦磷酸测序系统

(图2(a))与自制焦磷酸测序仪(图2(b))结果一致,采用自制焦磷酸测序仪所获得的结果信号要好于

PSQ96系统,说明采用TDA-PCR方法制备的单链可

以在不同焦磷酸测序平台上使用,具有很好的通用性.然后又分别采用 LATE-PCR法和本研究所建立的

TDA-PCR法对包含SNP2和SNP3的序列分别进行

不对称扩增,并用自制焦磷酸测序仪进行检测,均能

获得较为理想的结果(图2(c)~(f)).所获得的SNP基因型结果一致,SNP2附近序列的LATE-PCR产物

Ls2测得结果为AATCCCAGGACAG,AA后无C插

入(noinsC);TDA-PCR产物Fs2测得结果为GGG-ATTCTCTT,A后无G的插入(noinsG).SNP3附近

序列的LATE-PCR产物Ls3测得结果为TCTATT-CAGAAG,基因型为CC;TDA-PCR产物Fs3测得结

果为GGGATTCTCTT,基因型为GG.为了检测不同长度扩增片段对焦磷酸测序效果

的影响,本研究扩增了包含SNP1的不同长度片段产

物(见图1),然后分别对这些产物进行焦磷酸测序检

测,图3结果显示TDA-PCR和LATE-PCR法扩增获

得单链产物,对SNP1测得的基因型一致,其中不同样

品检测到了SNP1的GG纯合型(样品g-1,图3(a)、(c)、(d)和(f))和 A/G杂合型(样品g-2,图3(b)和(e))的样本.结果显示在对短片段扩增产物进行焦磷

酸测序时,2种方法均能获得较为理想的结果;但是对

于长片段的产物,TDA-PCR法获得的产物测序信号

没有明显衰减,而LATE-PCR法获得的产物则出现

明显衰减,这也证明了TDA-PCR法扩增对于焦磷酸

测序检测较长DNA片段时具有优势.

2.2.2 LNA修饰引物扩增产物的焦磷酸测序

为了能够更好地通过焦磷酸测序对扩增获得单

链模板质量进行检测,分别采用LATE-PCR和TDA-

·094·



dNTP加入的顺序:TCAGAGTCAT(对Fs1和Fsb1)和TCGTTGCAA(对Ls1和Lsb1).

图3 采用LATE-PCR和TDA-PCR制备包含SNP1的不同长度扩增产物的焦磷酸测序结果

Fig.3 ThepyrogramsofthedifferentlengthproductscontainingSNP1amplifiedbyLATE-PCRandTDA-PCR

PCR法扩增包含SNP4的不同长度目的片段,然后采

用同一测序引物进行焦磷酸测序检测,图4是将

LATE-PCR、TDA-PCR、LNA修饰引物的TDA-PCR扩增产物分别进行焦磷酸测序的结果.

dNTP加入顺序:GCAGCAGCGTAGATG.

图4 采用不同不对称扩增方法制备包含SNP4位点的单链DNA产物的焦磷酸测序结果

Fig.4 ThepyrogramsofthessDNAproductscontainingSNP4amplifiedbydifferentasymmetricamplificationmethods

由图4结果可知,样品g-1测得序列为 AGC(A/G)TGGTAGGAG,SNP4可明显判读为杂合

型,而且3种方法处理样品获得的结果一致.在扩

增产物长度为99bp时,TDA-PCR和 LATE-PCR产物信号强度相差不大(图4(a)和(b));但是在

156bp时,TDA-PCR 信号要远好于 LATE-PCR(图4(d)和(e));经过 LNA修饰后,95或152bp产物的信号均较高,且扩增片段长度增加时信号并

没有明显下降(图4(c)和(f)).结果表明含有2个

LNA的24bp引物能获得和28bp长序列引物相

当的效果,在焦磷酸测序样品检测中甚至优于长引

物的扩增产物.由于 LNA修饰引物会引起成本的

增加,因此只有在 TDA-PCR无法扩增出较好结果

时才考虑使用.

·194·



2.3 禽流感HA 基因保守序列的检测

禽流感病毒H5N1致病性很强,能在极短的时间

内使大量禽畜死亡,并有可能致人类死亡.其大规模的

流行,不仅造成了相关产业的巨大损失,而且由于可

传染人而造成人们极大心理恐慌,因此发展一种准确

快速诊断方式对这种病毒的防治具有很大意义.本研

究选择禽流感 H5N1的 HA 基因中一段保守序

列[31],采用TDA-PCR法扩增制备单链并进行焦磷酸

测序,以期望建立一种较为快速和准确高效的 H5N1病毒检测方法.

(a)采用TDA-PCR扩增 H5N1的 HA 基因部分DNA片段序列(FHA1)的电泳结果;(b)TDA-RCR扩增产物制备单链

DNA模板后采用自制的焦磷酸测序仪进行测序分析结果;(c)采用经典的磁珠单链制备法和商品化PSQ96焦磷酸

测序仪对 HA 基因特征序列的焦磷酸分析结果.焦磷酸分析时2种方法dNTP加入顺序均为:ATCCTACGTCTTAGCTC.

图5 禽流感病毒 H5N1的 HA 基因TDA-PCR扩增产物的电泳及焦磷酸测序结果

Fig.5 AgarosegelelectrophoretogramandpyrogramresultsoftheHAgeneconservedsequenceoftheH5N1avianinfluenzavirusamplifiedbyTDA-PCRandsequencedbypyrosequencing

首先根据H5N1的 HA 基因序列设计引物(见表

1)并进行 LATE-PCR 扩增,结果如图5(a).采用

TDA-PCR扩增出的 HA 基因目的片段(FHA1,197bp)仅有一条目的带,可以用来进行焦磷酸测序反应.为了验证TDA-PCR法制备单链的质量和通用性,同时采用自制焦磷酸测序仪和商品化的PSQ96焦磷酸

测序系统对目的片段进行了测序.从结果(图5(b)和(c))看,2种焦磷酸测序系统所获得的结果一致,根据

测得序列可判定所扩增的目的片段为禽流感的 HA基因.本研究采用TDA-PCR法制备的单链DNA模板

获得的焦磷酸测序结果,与用当前通行的磁珠捕获法

得到的效果相近,但制备流程大大简化,成本也大为

降低,除检测禽流感病毒特异性基因外,还可应用于

单细胞等实际样本的检测[32].

3 结论

自从 LATE-PCR扩增用于焦磷酸测序制备以

后,即被认为是一种很有效的寡核苷酸单链制备方

法,与当前通行的磁珠法相比,操作流简单,效率高;

但是由于引物设计要求较高,使得其在某些富含 AT碱基的片段和长片段扩增中的应用受到限制.本研究

在LATE-PCR 基础上,通过改进引物设计和优化

PCR方法,建立了新的TDA-PCR方法,能够有效地

提高不对称扩增效率,特别是对于较长的目的片段.焦磷酸测序结果表明TDA-PCR扩增的片段能获得较高

的测序信号,可清晰判读目标序列;而相同条件下,

LATE-PCR产物的焦磷酸测序信号则出现了明显下

降甚至出现判读困难.通过进一步检测验证,TDA-PCR方法所制备的单链可用于不同焦磷酸测序系统,也可用于实际样品的检测,证明这种方法具有良好的

通用性和实用性.

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EstablishmentoftheTmDifferenceAsymmetricPCRMethodandItsApplicationinMolecularDiagnosis

RAOHuachun1,TENGJiyun1,DIAOYong1,SONGQinxin2,3,WANGLiqiang1,YANGHuiyong1*,ZHOUGuohua2*

(1.EngineeringResearchCenterofMolecularMedicine,MinistryofEducation,InstituteofMolecularMedicine,

SchoolofBiomedicalSciences,HuaqiaoUniversity,Quanzhou362021,China;2.DepartmentofPharmacology,JinlingHospital,

NanjingUniversity,SchoolofMedicine,Nanjing210002,China;3.KeylaboratoryofDrugQualityControlandPharmacorigilance,DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract:Detectionofsingle-strandedDNA(ssDNA)isthebasisofmanymoleculardiagnosticmethods,andhowtoobtainenoughandhighqualityssDNAhasbeenoneofthehotresearchtopics.Inthispaper,severalsectionsofDNA(containingoneofthethreeSNPsofBRCA1generespectively)wereastheresearchsubjects,wecarefullyoptimizedthesequencesofprimers(introducingmis-matchbasesatthe5'-endoftheprimersorintroducinglockednucleicacid(LNA)intoexcessprimers)andadjustedtheconcentra-tionoftheprimers(10timesdifferencebetweentheexcessprimerandthelimitingprimer)togeneratethedifferenceofTmbetweentheexcessprimerandthelimitingprimer(3-8℃),andtheamplificationprogramwasalsoimproved(somePCRenhancerswereaddedintothereactionmixtureandatwo-stageamplificationprocedurewithtwoannealingtemperatures),thentheTmdifferenceasymmetricPCR(TDA-PCR)methodwasusedandalargenumberoftargetssDNAmoleculeswereproduced.TheresultsshowedthatTDA-PCRcouldsteadilyincreasetheproductivityofthessDNAmolecules,anditbecameeasierthanlinear-after-the-exponen-tial-PCR(LATE-PCR)fortheeasierprimerdesigningandthemoretargetDNAproducing.Thisassayamplifiedtheconservedse-

quenceoftheinfluenzaHAgeneusingTDA-PCR,andpyrosequencingmethodwasusedtodetecttheconservedsequence.Thepyro-

gramsobtainedwereofhighqualityandconsistentwiththereferencesequence,indicatingthatTDA-PCRnotonlypreparesssDNAtemplatesforpyrosequencingmoreeasilyandmoreefficiently,butalsohasgoodpracticalityandversatility.

Keywords:TmdifferenceasymmetricPCR(TDA-PCR);single-strandedDNAtemplate;singlenucleotidepolymorphism;pyrose-quencing;Avianinfluenzavirus

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值差异型不对称 方法的建立 及其在分子诊断中的应用jxmu.xmu.edu.cn/Upload/Park/f1cef7ad-0f50-4752-adb... · TmL)、大量引物(PX)的Tm值(meltingtemperature

值差异型不对称方法的建立及其在分子诊断中的应用jxmu.xmu.edu.cn/Upload/Park/f1cef7ad-0f50-4752-adb... · TmL)、大量引物(PX)的Tm值(meltingtemperature