メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響

明治大学農学部 早瀬 文孝

１．メイラード反応とは

２．食品中のメイラード反応生成物

３．メラノイジンの生成メカニズムと制御

４．メイラード反応生成物の生体への影響

メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響

１．メイラード反応とは

２．食品中のメイラード反応生成物

３．メラノイジンの生成メカニズムと制御

４．メイラード反応生成物の生体への影響

アミノカルボニル反応カルボニルアミン反応非酵素的褐変反応メイラード反応（＝アミノカルボニル反応：

狭義にはアミノ化合物と還元糖の反応）グリケーション=非酵素的糖化反応

グリコキシデーション

R-NH2 + R'-CO-R''アミンアミノ酸ペプチドタンパク質核酸の塩基リン脂質

還元糖アルデヒドケトンポリフェノールアスコルビン酸ステロイド

１．メイラード反応とは

血糖（グルコース）

アマドリ化合物

(AGEｓ)

アミノ化合物（タンパク質、核酸、脂質）

カルボニル化合物

Advanced Glycation End products

カルボニル活性酸素

メイラード反応

N

OHC

Lys

OHLys

ＮＨ

CH2COOＨ

AGE（advanced glycation end products）とは？

◎非酵素的な糖化によってアミノ化合物（糖化タンパク質、糖化アミノ酸など）に生じた修飾構造のうち、後期段階生成物

（アマドリ、ジカルボニル類などは含まない）

◎非酵素的糖化とは糖類（グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒド、還元糖など）が関与するメイラード反応

NN

N

NHH

Arg

Lys

メラノイジンとは？◎メイラード反応後期段階生成物◎含窒素難分解性高分子化合物◎褐色を呈する

類似化合物メラニン、リグニン、カラメル（一部メラノイジン含有）、

フミン（一部メラノイジン様物質）など

O

O

O

N

O CHO

NH O

NH

O

R’R

OO

OO

OO

N

O CHO

NHNH O

NH

OO

R’R

(Hofmann et al.)

N

R

N

R

N

R++

++

n

(Hayase et al.)

NRNR

NRNR

n(Ｔｒｅssl et al.)

低分子メイラード反応生成物の影響

変色フレーバーの生成変異原性物質の生成活性酸素種の生成タンパク質の劣化

ー栄養価や消化性の低下ー物性の変化ー重合、褐変、蛍光物質の生成

メラノイジンの生理作用

活性酸素消去作用抗菌作用抗化学発ガン作用降コレステロール作用食物繊維用作用腸内細菌増殖作用

抗酸化機構？アレルギー抑制作用？

メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響

１．メイラード反応とは

２．食品中のメイラード反応生成物

３．メラノイジンの生成メカニズムと制御

４．メイラード反応生成物の生体への影響

松石昌典,食肉の科学,36,183-198,1995

加熱した食肉で検出された肉様香気物質

(+)-(S)-Alapyridaine – Taste Enhancer

T.Soldo et al.,Chem.Senses,28,371-379,2003

斉藤知明,日本味と匂学会誌11巻別冊11,165-174 (2004). *K.Shima et.al. J. Agric. Food Chem., 46,1465 (1998).

食品のこくと、こく味

イミダゾリノン（クレアチンとメチルグリオキサール）

食品中のメイラード反応生成物

アマドリ化合物 3-DG リジルピラリン メラノイジン(mmol/kg) (mmol/kg) (μmol/kg) (g/100ml)

醤油 3.5 0.2-1.2 - 0.7味噌 5.5 0.6-2.5 - -日本酒 0.022 0.031 - -ワイン 0.055 - - -レモンジュース - 0.154 - -チーズ グレービー - - 50 -粉乳 - - 8 -ホットココアミックス - - 27 -黒ビール - - - 0.1

はちみつ中のメイラード反応生成物

(mg/kg)

ＨＭＦ(5-hydroxymethyl-2-furfural) 0.6-443-DG 79-1,266グリオキサール 0.2-2.7メチルグリオキサール 0.4-5.4

K.U. Weigel et.al., Eur. Food Res. Technol. 218, 147 (2004).

メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響

１．メイラード反応とは

２．食品中のメイラード反応生成物

３．メラノイジンの生成メカニズムと制御

４．メイラード反応生成物の生体への影響

メイラード反応に与える要因

ｐＨ温度 (10°Cで3~5倍の反応速度)溶媒時間アミノ化合物とカルボニル化合物の濃度

（１Ｍグリシン-０．５Ｍキシロースは０．５Ｍグリシン-０．２５Ｍキシロースに比べ６倍褐変する）

水分活性（乾燥食品を保存する場合には０．６-０．８

で最も褐変しやすい）酸素遷移金属

Ｈ．Ｋａｔｏ， １９５６

Ｍ．Ｌ．Ｗｏｌｆｏｒｍ et.al, 1953

水分含量として３０％

K.Eichner, 1972

H. Hashiba, 1976

D.L.Ingles, 1964

D.J. McWeeney, 1962

D.J. McWeeney, 1963

B.Lindberg et al, 1964

Glc-SO2Xyl-SO2

T.M. Leynolds, 1965

ＣＨ２ＳＨ

ＨＣＮＨ２

ＣＯＯＨ

ＣＨ２ＳＨ

ＣＯＯＨ

ＣＨ２ＳＨ

ＣＨ２

ＣＯＯＨ

ＣＨ２ＳＨ

ＣＨ２ＯＨ

ＳＨ

システイン メルカプト酢酸 ３－メルカプトプロピオン酸

メルカプトエタノール チオフェノール

加藤博通、食品の変色の化学、１９９５

M. Brownlee et al, 1986

Maillard Reaction

Sugars

Amino Compounds

Functions

Radical Scavenging Activity

Anti Oxidative Activity etc

Formation Pathway & Structure

Little Knowledge・・・

-CHO(Carbonyl groups)

-NH2

(Amino groups)

Melanoidins (Mel)

MelanoidinsBlue-M2

Blue-M3

Yel

Yel

？

R1=CH2COOH

R2=(CHOH)CH2OH

CHOOH

R2

CCHO H

H R1 NH2＋

Antioxidative activity by POV test

Scavenging activity ofOH and DPPH radicals

Mechanism of Antioxidative activity

Blue-M1

Yellow compounds

●Viability and Lipidperoxidation in COS-1cell Exposure in Blue-M1

D-Xylose (1M)Glycine (0.1M）

Incubation in 60%Ethanol(pH8.1)Under N2 at 26.5℃ for 48h and 2℃ for 96h

DEAE Sephadex A-25

Sephadex G-15

Bio-gel P-2

Sephadex G-15 ×2

Blue-M1Structure of Blue-M1

N

CH

N

HC

HC

N CH

NCHOHCHH2CCHOH

CH2CH2

CH2CH2

CHOH

COOH

COOH

CH2OHCH2OH

COOH

COOH

D-Xylose（1M）Glycine（0.1M）NaHCO3（0.1M）・60%Ethanol・pH8.1・Placed under N2

（Incubation）

・26.5℃（48 h）and 2℃（96 h）

RP-HPLC separation of Blue-M2

Demineralization

Anion Exchange Chromatography

Gel permeation Chromatography

Demineralization

RP-LC purification of Blue-M2

Demineralization

RP-HPLC、UV/VIS、

Fluorescence、MS、NMR

Lyophilization

H2NH2C C OH

O

CHOHC OH

CHHOHC OH

CH2OH

D-Xylose Glycine

Gel permeation Chromatogram of Blue fraction by Biogel P-2.

Blue-M2 fraction Blue-M1

10 20 30 40

Fraction No.(2ml/fr)

1.0

2.0

Abs

at 6

40nm

Solvent : 1M NaCl

15 23

N

CH

N

HC

HC

N CH

NCHOHCHH2CCHOH

CH2CH2

CH2CH2

CHOH

COOH

COOH

CH2OHCH2OH

COOH

COOH

Identified structure of Blue-M2.

C

CCH

C

NHC

C

N

HCC

HC

C

CN

N

C

CH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

H2CCH

OH

H2C

OH

CH

CHO

CHC

CH2

OH

HC OH

HC OH

H2C OH

N

CH2

COOH

H2C C

CHCH

CH2O

HO OHHO

HO

1 2

3

1612

4

5

6

10

17

7

8

919

2218

13

14

11

15

23

21

25

26

24

2039

3837

3635

27282930

3132

3334

H-HCOSYHMBC

(A) (B)

900800700600500400300200100 Da

30000

20000

10000

Cou

nts

940:M+

881:a851:a+b+H

807:(c)

791:2a+b

746:c+l

735:(e)+H

675:a+e645:(f)

295:(g)

309:(h)+H 529:(i)413:(j)

588:d+k

605:d+k+H2O

574:a+k

0190:(m)-O

C

CCH

C

NHC

C

N

HCC

HC

C

CN

N

C

CH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

H2CCH

OH

H2C

OH

CH

CHO

CHC

CH2

OH

HC OH

HC OH

H2C OH

N

CH2

COOH

H2C C

CHCH

CH2O

HO OHHO

OH

(a)

(a)

(a)

(a)

(a)

(b)

(b)

(d)

(d)

(d)(b)

(k)

(l) (i)

(j)(f)

(g)(h)

(c)

(e)

(m)

MALDI-TOF-MS PSD mode fragmentation pattern of Blue-M2.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 40 80 100

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Anion exchange chromatogram of Maillard reaction products obtained from D-Xylose-Glycine model system

NaC

l con

c.

Abs

at 6

25nm

Fraction number (16ml/fraction)

52 63

Redfractions

Abs

at 5

50nm

20

Abs

orba

nce(

550n

m)

0 10 20 30 40 50 60

Red-M1 Red-M2

HPLC profile of Red fractions

Retention time (min)

200 300 400 500 600 700nm

Red-M1

Red-M2

Abs

orba

nce

554.5nm

564.0nm

UV/VIS spectra of Red-M1 and Red-M2

C

HC

NC

C

N

C

CCH

NCH

C

CHC

CN

CH2OH

H2C

CHOH

CH2OHCH2

COOH

CH2 H2C

CH2

COOH

COOH

COOH

CHOH

CHOH

CHOH

CH2OH

Identified structure of Red-M1

HMBC correlationH-H COSY correlationfrom Amadori compound

Xylulose-Glycine；XG

Xylose(1M)

Glycine(0.1M)

Browning(Abs 420nm)

Blue(Abs 625nm)

＋

Amadori Compound（Xylulose-Glycine;XG)

(0～100mM)

0

1

2

3

0 10 25 50 100

Rat

io(6

25nm

/420nm

)

0 10 25 50 100

XG (mM)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 10 25 50 100

XG (mM)

Bro

wnin

g (A

bs 4

20nm

)

0

0.5

1

1.5

0 10 25 50 100

XG (mM)

Blu

e (

Abs

625nm

)

XG

H 2C NH

C

C HHO

C OHH

CH 2OH

O

CH 2

COOH

Incorporation of XG in Blue-M1 & M2

XG(3.2mM)

Blue-M1

Blue-M2

Xylose(1M)

Glycine(0.1M)

Blue Soln

MALDI-TOF-MS

H 2C NH

C

C HHO

C OHH

CH 2OH

O

CD 2

COOH

d2-XG(25mM)

d2-XG

H→DH→D

Incorporation of d2-XG in Blue Compounds

Blue-M1

Blue-M2

H 2C NH

C

C HHO

C OHH

CH 2OH

O

CD 2

COOH

d2-XG

CH

N

N

HC

HC

N

HC

CH

N

HC

CHO

HCC

NH2C C

HCHC

CH2O

H2C

CHOH

CH2OH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2OH

CH2

COOH

CHOH

CHOH

CH2OH

HO

HO

HO OH

Incorporation of d2-XG in Blue-M1

Blue-M1m/z 619 m/z 619

Cont d2-XG (+)

Xyl

Gly

XG Intermediatecompounds

Blue-M1Glycinefrom XG

N

N

HC

N

N

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2HOC

CHOH

CH2OHCHOH

CH2OH

Blue-M1

× ×

××

Incorporation of d2-XG in Blue-M2

Blue-M2m/z 940

Blue-M2+2Dm/z 942

d2-XG (+)Cont

Blue-M2

Blue-M1

CH

N

N

HC

HC

N

HC

CH

N

HC

CHO

HCC

NH2C C

HCHC

CH2O

H2C

CHOH

CH2OH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2OH

CH2

COOH

CHOH

CHOH

CH2OH

HO

HO

HO OH

× ×

××From XG

CD2

Xylose & XG

Schiff base

Blue-M1

Pyrrolopyrrolealdehyde

Red-M1Red-M2

Blue-M2

Amadori compound

Melanoidins

GlycineXylose

メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響

１．メイラード反応とは

２．食品中のメイラード反応生成物

３．メラノイジンの生成メカニズムと制御

４．メイラード反応生成物の生体への影響

100

34.6

22.4

30.1

5.3

21.7

0 20 40 60 80 100 120

Tocopherol

BHA

Mel(Xyl-Gly)

Mel(Glc-Gly)

Blue-M1

Control

POV(%)

The Effect of Blue-M1 and Melanoidin,BHA,Tocopherol on Peroxide Value of Linolenic acid.Mel(Glc-Gly),Glucose incubated with glycine at 95℃ for 7h.Mel(Xyl-Gly),Xylose incubated with glycine at 95℃ for 7h.POV(%)=(POV with sample/ POV without sample)×100Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol and Melanoidin is 230μM and 0.025%

Structure of Blue-M1

N

CH

N

HC

HC

N CH

NCHOHCHH 2 CCHOH

CH 2CH 2

CH 2CH 2

CHOH

COOH

COOH

CH 2 OHCH 2 OH

COOH

COOH

100

84.1

63.7

5.2

0 20 40 60 80 100 120

Blue-M11000μl

Blue-M1 250μl

Blue-M1 50μl

Contro l

POV(%)

The Effect of Concetration of Blue-M1 on Peroxide Value of Linolenic acid.Concentration of Blue-M1 is 195μM

ESR spectra of DMPO-OH adducts with or without sample

ControlBlue-M1

Mel(Glc-Gly)0.2%Mel(Glc-Gly)0.4%

BHATocopherol

100

31.3

45.8

16.6

0

0

0 20 40 60 80 100 120

Tocopherol

BHA

Mel(Glc-Gly)0.4%

Mel(Glc-Gly)0.2%

Blue-M1

Control

Relative ESR signal intensity(%)

100

68.2

61.2

60.7

48.9

37.5

32.8

0 20 40 60 80 100 120

Blue 100μｌ

Blue 80μｌ

Blue 60μｌ

Blue 40μｌ

Blue 20μｌ

Blue 10μｌ

Control

Rerative ESR signal intensity(%)

Relative signal intensity of DMPO-OH adducts with or without sampleRelative ESR signal intensity(%)=(ESR signal intensity with sample/ESR signal intensity without sample)×100Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM

The Effect of Concentration of Blue-M1 on Relative signal intensity of DMPO-OH adducts. Concentration of Blue-M1 is 3mM

100

33.9

42.4

8.1

11

0

0 20 40 60 80 100 120

Tocopherol

BHA

Mel (Glc-Gly)0 .4%

Mel(Glc-Gly) 0 .2%

Blue-M1

Control

Relative ESR signal intensity(%)

Relative ESR signal intensity of DPPH radicals with or without sampleConcentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM.

ESR spctra of DPPH radical with or without sample

ControlBlue

Mel(Glc-Gly)0.2%Mel(Xyl-Gly)0.4%

BHATocopherol

100

88.7

56.3

41.1

33.9

0 20 40 60 80 100 120

Blue50μｌ

Blue40μｌ

Blue20μｌ

Blue5μｌ

Control

Relative ESR signal intensity(%)

The Effect of Concentration of Blue-M1 on Relative signal intensity of DPPH radicals with or without sample.Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM.

Incubated at 37℃ for 24h (A)6h(B)

Medium 100μl WST-8 10μl

Incubated at 37℃ for 1h

Absorbance at 450nm

Experiment Condition of Cell Viability(A) and Lipid peroxidation of cell membrane (B) in COS-1 cell Exposure in Blue-M1

Fluorescence at Ex.305nm,Em.450nm

A BCOS-1 cell 1×104cells/100μl/well

0.01,0.05,0.1% of Blue-M1 50μl

15mM(A) or 10mM(B) of AAPH 50μl

50μM DPPP solution 100μl

Incubated at 37 ℃for 15min

0

20

40

60

80

100

120

140

160

10mMAAPH

0.01% 0.05% 0.10%

Blue-M1

% o

f contr

ol

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

15mM AAPH 0.01% 0.05% 0.10%

Blue-M1

% o

f contr

ol *

*p<0.01

*

*

**

**p<0.01

Cell Viability(A) and Lipid peroxidation of Cell membrane (B) in COS-1 cell Exposure in Blue-M1

All values represent the mean ± S.D(n=9)

A

B

N

CH

N

HC

HC

N CH

N

CH CHOH

CHOH

CH2OH

H2C

CHOH

CH2OH

CH2

COOCH3

CH2

COOCH3

CH2CH2

COOCH3 COOCH3

Blue-M1 0.5mgMethanol 0.8mlBenzene 2.8ml

Incubated at Room temperature for 30min

Trimthylsilyldiazomethane 200μｌ

Structure of Methylated Blue-M1(M.W.=675)

MALDI-TOF-MS Spectra of Mathylated Blue-M1

618.

82 [B

lue]

+

660.

79 [B

lue+

3Met

]+

674.

77[B

lue+

4Met

]+

632.

64 [B

lue+

1Met

]+

HPLC Pattern of Methylated Blue-M1

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Blue-M1Met-Blue-M1

R.T(min)0 nm300 400 500 600 700

626

% of ESR signal intensity

*Met-Blue 1.21mM・50μｌBlue-M1 1.31mM・40μｌ

63.6

100

60.7

0 50 100 150

Met-Blue-M1

Blue-M1

control

Hydroxyl radical Scavenging Activity of Methylated Blue-M1

Blue-M1 5mM 80μl30% H2O2 20μl

Incubated at Room temperature for 3h HPLC,MS,NMR

HPLC Pattern of Blue-M1 Incubated without H2O2 (A) and with H2O2 for 3h (B)

AU

- 0 .0 0 5

0 .0 0 0

0 .0 0 5

0 .0 1 0

0 .0 1 5

分1 0 .0 0 2 0 .0 0 3 0 .0 0 4 0 .0 0 5 0 .0 0 6 0 .0 0

AU

0 .0 0

0 .0 2

0 .0 4

0 .0 6

0 .0 8

0 .1 0

0 .1 2

0 .1 4

分1 0 .0 0 20 .0 0 3 0 .0 0 40 .0 0 5 0 .0 0 60 .0 0

A

Bnm

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

627.6625nm230nm

nm250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

627.6232.1min

min

636.

53[B

lue+

OH

+H]+

658.

46 [B

lue+

OH

+Na]

+

618.

53[B

lue]

+

MALDI-TOF-MS Spectra of Blue-M1 Incubated with H2O2 for 3h65

2.58

[Blu

e+O

OH

+H]+

de

a’

b’

c’

d’ e’

N

CH

N

HC

HC

N CH

NCHOHCHH2CCHOH

CH2CH2

CH2CH2

CHOH

COOH

COOH

CH2OHCH2OH

COOH

COOH

OOH

a’ b’c’

d’e’

c

abA

B

123456789

a bcN

CH

N

HC

HC

N CH

NCHOHCHH2CCHOH

CH2CH2

CH2CH2

CHOH

COOH

COOH

CH2OHCH2OH

COOH

COOH

de

ppm

7 68NMR Spectrum of Blue-M1 Incubated without H2O2 (A) and with H2O2 for 3h (B)

abc

de

Added H2O2

IL-4IL-5IL-6

naiveCD4+T cell

Th1 cell

Th2 cell

B cell

IL-4

IgE

IL-12

IL-4 IFN-γ

IFN-γ

activation

inhibition

Th1／Th2 Cytokines in IgE production

Physiological effects of melanoidins

*

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

1 2 3

rela

tive inte

nsi

ty

IL-4IFN-γβ-actin

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1 2 3re

lative inte

nsity

Effects of melanoidins on IFN-γ and IL-4 mRNA expression in splenocytes. Values are the mean±SD. n=3 *p<0.05 vs control

1.Control2.NDMEL 0.0001%3.NDMEL 0.001%

1 2 3

IFN-γ IL-4

Effect of melanoidins on IL-12 p40 mRNA expression in J774.1. Values are the mean±SD n=3 p<0.05 vs control

NDMEL （μg/ｍｌ）

IL-12β-actin

0102030405060

0 0.1 １

＊re

lativ

e in

tens

ity