水稻水稻 osRACK1osRACK1 蛋白的蛋白的表达纯化及功能研究表达纯化及功能研究

姓名：曹丹丹姓名：曹丹丹导师：梁建生导师：梁建生

一、研究意义一、研究意义• 拟南芥 G 蛋白的 β 亚基参与了多种的细胞

信号转导过程。对 RACK1 蛋白和 G 蛋白的 β 亚基氨基酸序列进行比对发现两者具有很高的同源性 ( 大于 87%) ，并且两者具有类似的空间结构。从拟南芥中筛选到的 rack1突变体具有较高的耐逆性，也暗示着RACK1 蛋白可能参与渗透胁迫信号转导过程，水稻的 RACK1(OsRACK1) 可能与拟南芥 RACK1(AtRACK1) 具有相似的功能。

• 通过本实验来证明水稻的 RACK1(OsRAC

K1) 在抗逆境胁迫中的功能，为培育高产水稻品种提供理论依据。通过分子遗传学和转基因手段，阐明 RACK1 蛋白在水稻响应逆境胁迫过程中作用的分子机理及其在水稻抗逆中的作用。

二、研究内容及目标二、研究内容及目标

１、 OsARCA1 基因过表达和表达受抑制的转基因水稻株系的纯和体的筛选鉴定，以及转基因水稻在干旱和盐胁迫中的生理功能分析，阐明 OsRACK1 基因在植物抗逆境中的作用。

２、表达 OsRACK1 蛋白，测定转基因水稻中 OsRACK1 蛋白的表达量，研究 OsRACK1 蛋白与其它蛋白的相互作用。

三、拟解决的关键问题三、拟解决的关键问题

• OsARCA1基因过表达和

• 表达受抑制的转基因水稻

• 株系的构建和转基因植株

• 的筛选，这是阐明在逆境

• 胁迫条件下 OsARCA1基因

• 作用及其机理的关键。

四、研究方案四、研究方案转基因水稻

纯和体的鉴定 GUS 和潮霉素

的抗性检测 转基因水稻在

干旱和盐胁迫中的生理功能分析

OsRACK1 蛋白的诱导表达

转基因水稻中OsRACK1 蛋白

的表达量的检测

OsRACK1 蛋白与植物其它蛋白

的相互作用分析

Western 杂交

蛋白的纯化 抗体的制备

五、可行性分析五、可行性分析

１、本实验室长期从事水稻抗逆生理生化及分子生物学的机理研究和拟南芥植物的分子遗传学和信号转导机理研究，并且已经构建 OsARCA1 基因过表达和表达受抑制的转基因水稻株系。

２、本实验所涉及的实验方法、关键技术等是目前实验室的常规方法。并且实验室具有完成实验所需要的各种仪器，如 PCR

仪，紫外分光光度计，各种分离纯化层析柱等。

六、研究进展六、研究进展

1 、水稻的种植 T1 代种子经 GUS 检测筛

选出没有性状分离的种子种于大田，按每个品种 10

0 棵种植，采取单株收割的方法收取 T2 代种子以便测定纯和体。

２、蛋白的表达 rack1 基因与 GST 载体的构建 　转入 B

L21 大肠杆菌感受态细胞 　卡那霉素抗性培养基培养过夜 　菌落 PCR 检测 　得到阳性菌落 　含 Amp 的液体培养基培养 ITPG 诱导表达 RACK1 蛋白 　 SDS-PAGE电泳检测表达的蛋白 　蛋白纯化

• 诱导条件• 构建载体的细胞在含 Amp 液体培养液中 37

℃ ， 200rpm 培养 3-4 个小时，使细胞充分分化。

• 菌体达到一定浓度加入 ITPG 诱导表达 RACK1 蛋白， 28℃ ， 120rpm 培养 3-4 小时。

• 不同诱导时间的电泳图

时间从左到右分别为： 1h 2h 3h 4h 5h 6h

结果表明融合蛋白在 4h 时达到最大值

1 2 3 4 5 6

97.4KD

66.2KD43KD

31KD

20.1KD

14.4KD

RACK1/GST融合蛋白 (66kD)

• 上清和沉淀中蛋白含量的电泳图

1 号泳道为破碎上清 2号泳道为沉淀

1 2

• 加入 ITPG 量不同的电泳图

IPTG 浓度从左到右分别为： 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 mol/ml结果表明 pGEX-6P-1/ AtRACK1 融合蛋白和 pET32a 融合蛋白表达量不随 IPTG 浓度变化

1 2 3 4 5 6

• 经过谷光甘肽柱纯化后的电泳图

1 和 3号为没有结合的蛋白 2和 4号为 pGEX-6P-1/

AtRACK1 融合蛋白

1 2 3 4

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