การทาบรสทธและลกษณะสมบตของเอนไซม เบตา-กาแลคโตซเดสจากเชอ B 1.2

โดย นายสมยศ โอศรพนธ

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2553

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การทาบรสทธและลกษณะสมบตของเอนไซม เบตา-กาแลคโตซเดสจากเชอ B 1.2

โดย นายสมยศ โอศรพนธ

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2553

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF BETA-GALACTOSIDASE FROM STAIN B1.2

By Somyos Osiriphun

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree MASTER OF SCIENCE

Department of Biotechnology Graduate School

SILPAKORN UNIVERSITY 2010

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การทาบรสทธและลกษณะสมบตของเอนไซม เบตา-กาแลคโตซเดสจากเชอ B 1.2” เสนอโดย นายสมยศ โอศรพนธ เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

……........................................................... (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

คณบดบณฑตวทยาลย วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ผชวยศาสตราจารย ดร.พมพชนก จตรพรย 2. ผชวยศาสตราจารย ดร.พทยา หลวเสร 3. ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (อาจารย ด.ร.สวฒนา พฤกษะศร) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (อาจารย ด.ร.ประกต สขใย) (ผชวยศาสตราจารย ดร.พมพชนก จตรพรย) ............/......................../.............. ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.พทยา หลวเสร) (ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา) ............/......................../.............. ............/......................../..............

ง

50401205 : สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คาสาคญ : เบตา-กาแลคโตซเดส/การทาบรสทธ/จลนทรยทนอณหภมสง สมยศ โอศรพนธ : การทาบรสทธและลกษณะสมบตของเอนไซม เบตา-กาแลคโตซเดส จากเชอ B 1.2 อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : ผศ.ดร.พมพชนก จตรพรย , ผศ.ดร.พทยา หลวเสร และ ผศ.ดร.บษราภรณ งามปญญา. 127 หนา.

เอนไซมเบตา-กาแลคโตซเดสซงผลตภายในเซลลจลนทรยทนอณหภมสงสายพนธ B1.2 ทคดแยกไดจากโปงน ารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอน ประเทศไทย การศกษาและระบชนดสายพนธเชอประกอบดวย การยอมสแกรม การยอมสเอนโดสปอร การทดสอบ Catalase พบวาจลนทรย B1.2 เปนแบคทเรยแกรมบวก มเอนโดสปอร และ การระบสายพนธจลนทรยโดยวธ 16s rDNA sequencing (Partial length) พบวามความใกลเคยงกบ Anoxybacillus kestanbolinensis และ Anoxybacillus flavithermus มากทสด เอนไซมเบตา-กาแลคโตซเดสซงผลตภายในเซลลจลนทรยถกทาใหบรสทธโดยผานกระบวนการ DEAE ion-exchange และ Affinity chromatography ถกทาใหเขมขนขน โดยวธ Ultrafiltration พบวาคณสมบตของเอนไซมบรสทธ ม Specific activity เทากบ 1.1 U/mg protein มความบรสทธประมาณ 3.79 เทา และ Recovery 86.4% นาหนกโมเลกลของเอนไซมหาโดยวธ Native-PAGE และ SDS-PAGE คอ 215 และ 75 kDa ตามลาดบ สอดคลองกบวธ Gel chromatography คอ 215 kDa เอนไซมบรสทธทางานไดดทพเอช 6.5 อณหภม 60 0C เสถยรทอณหภม 40-60 0C และทพเอช 6.0-10.0 คา Km และ Vmax ทหาไดคอ 13.32 mM และ 4.93 ×10-3 mmolL-1min-1 ตามสาดบ เอนไซมเบตา-กาแลคโตซเดสซงผลตภายในเซลลจลนทรยถกยบย งโดยไอออนของ Zn2+, Cu2+ สาร EDTA และการผลต Glucose และ Galactose โดยเอนไซม เมอเอนไซมเบตา-กาแลคโตซเดส มความบรสทธเพมขนสามารถนาไปใชในกระบวนการอตสาหกรรมการผลตอาหารและนมได ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2553 ลายมอชอนกศกษา........................................ ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

จ

50401205 : MAJOR : BIOTECHNOLOGY KEY WORD : -GALACTOSIDASE/PURIFICATION/THERMOPHILIC SOMYOS OSIRIPHUN : PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF BETA - GALACTOSIDASE FROM STAIN B1.2. THESIS ADVISORS : ASST. PROF. PHIMCHANOK JATURAPIREE, Dr.nat.techn., ASST. PROF. PITTAYA LIEWSAREE, Ph.D., AND ASST. PROF BUDSARAPORN NGAMPANYA, Ph.D. 127 pp.

An intracellular -galactosidase was extracted from a thermophile B1.2 strain isolated from Ta Pai hot spring, Maehongson, Thailand. Different identification methods were used to investigate its species including gram staining, endospore staining, catalase test, the direct amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction and the partial sequencing of the 16S rDNA gene. The B1.2 strain was found to be a gram positive bacteria which its endospores located at the terminal end of the vegetative cell. PCR analysis indicated that this isolated strain had a high similarity with Anoxybacillus kestanbolinensis and Anoxybacillus flavithermus. The enzyme -galactosidase was purifiled by ion-exchange and affinity chromatography and concentrated by an ultrafiltration technique. The purified enzyme had a specific activity of 1.1 U/mg proteins, with a purification fold of 3.79 and a recovery of 86.4%. The molecular mass of the purified enzyme as estimated by native PAGE SDS-PAGE and gel filtration was approximately 215, 75 and 215 kDa,respectively. The optimum pH and temperature purified -galactosidase were 6.5 and 60 oC, respectively. This enzyme was thermally stable in the range of 40-60 oC with the pH stability of 6.0 - 10.0. The Km and Vmaxvalues for oNPG were calculated to be 28.85 mM and 8.38 ×10-3 mmolL-1min-1 respectively. The intracellular -galactosidase from B1.2 was strongly inhibited by EDTA and various mono- and divalent cations, such as Zn2+ and Mg2+. This enzyme was also moderately inhibited by its hydrolysis products; glucose and galactose. This purified -galactosidase could be further used in food and milk industry.

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2010 Student's signature ........................................ Thesis Advisors' signature 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

ฉ

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.พมพชนก จตรพรย อาจารยทปรกษาวทยานพนธ, ผชวยศาสตราจารย ดร.พทยา หลวเสร และ ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา อาจารยทปรกษารวมวทยานพนธ อกทง อาจารย ด.ร.สวฒนา พฤกษะศร ประธานกรรมการ อาจารย ด.ร.ประกต สขใย กรรมการภายนอก ทไดใหความร คาปรกษาแนะนาตางๆ และชวยเหลอในการวางแผนงานวจยตลอดจนแกไขวทยานพนธฉบบนใหมความสมบรณยงขน ขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และ อาจารย.ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม ทใหคาปรกษา และ ชวยเหลอในทกๆปญหา ใหวทยานพนธฉบบน

ขอกราบขอบพระคณคณาจารยภาควชาเทคโนโลยชวภาพทกทานทมอบวชาความรทเปนประโยชนตอการศกษาและการวจยในครงน

ขอกราบขอบพระคณพๆ และ นกวทยาศาสตรในสานกงานภาควชาเทคโนโลยชวภาพทกทานทกรณาใหคาแนะนาใหความชวยเหลอ และอานวยความสะดวกในการใชอปกรณ เครองมอและสารเคมทใชตลอดในการทาวจยครงน

ขอขอบพระคณภาควชาเทคโนโลยชวภาพ และ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรรม มหาวทยาลยศลปากรทใหเงนการสนบสนนงานวจยในครงน ขอขอบพระคณ

วทยานพนธฉบบน

ช

สารบญ หนา

บทคดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง บทคดยอภาษาองกฤษ ............................................................................................................... จ กตตกรรมประกาศ ..................................................................................................................... ฉ สารบญตาราง .......................................................................................................................... ฌ สารบญภาพ .......................................................................................................................... ฐ บทท 1 บทนา ............................................................................................................................ 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา ............................................................... 1 วตถประสงค ........................................................................................................ 2 ขอบเขตของงานวจย ............................................................................................ 2 ประโยชนของงานวจย ......................................................................................... 3

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ .................................................................................... 4 แลคโตส (Lactose) ............................................................................................... 4 การจดจาแนกกลมของจลนทรยตามอณหภม ....................................................... 6 เอนไซมททนอณหภมสง ..................................................................................... 7 เอนไซม -galactosidase ...................................................................................... 11 การสรางเอนไซมยอยนาตาล Lactose .................................................................. 13 กลไกในการทางานของ เอนไซม -galactosidase ............................................... 13

กลไกการควบคมการสงเคราะหเอนไซม -galactosidase ................................... 15 อนพนธของ Lactose ............................................................................................ 16 จลนพลศาสตรของเอนไซม ................................................................................. 18 โครมาโตกราฟ (Chromatography) ...................................................................... 20 Ion-exchange chromatography ................................................................. 21

Gel filtration Chromatography ................................................................. 22 Affinity chromatography .......................................................................... 23 การแยกโปรตนโดยวธเจลอเลคโตรโฟรซส (Gel electrophoresis of protein) ..... 24

ซ

บทท หนา 3 วธดาเนนการวจย ......................................................................................................... 29 ตอนท 1. การเตรยมเอนไซม -galactosidase ................................................... 29 ตอนท 2. การศกษาและระบชนดสายพนธของเชอ ........................................... 32 ตอนท 3. การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase ............................................ 35 ตอนท 4. การศกษาคณสมบตของเอนไซม (Characterization) ......................... 37 บทท 4 ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง ..................................................................... 42 ตอนท 1. การเตรยมเอนไซม -galactosidase จาก Stock เชอ ........................... 42 ตอนท 2. ผลการศกษาและระบชนดสายพนธของเชอ ....................................... 43 ตอนท 3. ผลจากการทาบรสทธเอนไซม ........................................................... 48 ตอนท 4. ผลการศกษาลกษณะสมบตเอนไซมบรสทธ ...................................... 51 บทท 5 สรปผลการศกษา ......................................................................................................... 64 บรรณานกรม .......................................................................................................................... 65 ภาคผนวก .......................................................................................................................... 70 ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอจลนทรยและการเตรยมสารเคม ............................ 71 ภาคผนวก ข กราฟมาตรฐาน และการคานวณ ................................................... 88 ภาคผนวก ค ขอมลผลการทดลอง ..................................................................... 96 ประวตผวจย .......................................................................................................................... 127

ฌ

สารบญตาราง ตารางท หนา 1 ขอดของเอนไซมททางานและเสถยรทอณหภมสงในกระบวนการ อตสาหกรรม ............................................................................................... 9 2 ขอเสยของเอนไซมททางานและเสถยรทอณหภมสงในกระบวนการ อตสาหกรรม ............................................................................................... 9 3 คณสมบตบางประการของเอนไซม -galactosidase จากจลนทรย ชอบอณหภมสง .......................................................................................... 10 4 แหลงของเอนไซม -galactosidase ในธรรมชาต ................................................. 12 5 หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธ ............................................................ 20 6 ชนดของสารทตองการแยกกบ ligand จาเพาะทเคลอบบน Stationary phase ......................................................................................... 24 7 ความเหมอนของลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5’ของ 16S rDNA ของแบคทเรยตวอยาง B1.2 เปรยบเทยบกบ Anoxybacillus sp. .................. 50 8 การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase จาก Thermophile B1.2 ......................... 54 9 ผลของไอออนทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ ................... 61 10 ผลของนาตาลทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ .................... 62 11 ผลของรเอเจนตทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ ................. 63 12 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ oNP กบคาการดดกลนแสงท ความยาวคลน 420 นาโนเมตร .................................................................... 90 13 ความสมพนธระหวางความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสงท ความยาวคลน 595 นาโนเมตร .................................................................... 92 14 ความสมพนธระหวางนาหนกโมเลกลของโปรตนกบเวลาทถกชะ ออกจากคอลมน .......................................................................................... 94 15 การหากจกรรมของเอนไซม -galactosidase จากการทาใหเซลลแตก ................. 97 16 ผลการทาบรสทธเอนไซม -galactosidase .......................................................... 97 17 การศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidase Dilute 10 เทา ............................................................................................... 98 18 การศกษา pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidase Dilute 10 เทา ............................................................................................... 99

ญ

ตารางท หนา 19 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 3, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 100 20 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 4, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 100 21 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 5, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 101 22 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 6, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 102 23 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 6.5, Dilute 10 เทา) .................................................................................. 103 24 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 7, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 104 25 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 8, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 105 26 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 9, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 106 27 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 10, Dilute 10 เทา) ................................................................................... 107 28 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (40 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา) ............................................................. 108 29 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (45 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา) ............................................................. 109 30 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (50 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา) ............................................................. 110 31 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (55 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา) ............................................................. 111 32 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (60 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา) ............................................................. 112

ฎ

ตารางท หนา 33 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (65 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา ............................................................... 113 34 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (70 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา ............................................................... 114 35 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (75 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา ............................................................... 114 36 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (80 องศาเซลเซยส, Dilution 10 เทา ............................................................... 115 37 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None, Dilute 10 เทา) .................................................................................... 115 38 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Na+, Dilute 10 เทา) ....................................................................................... 116 39 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (K+, Dilute 10 เทา) ........................................................................................ 116 40 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mg2+, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 117 41 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Fe2+, Dilute 10 เทา) ...................................................................................... 117 42 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mn2+, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 118 43 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Ca2+, Dilute 10 เทา) ...................................................................................... 118 44 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Co2+, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 119 45 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Zn2+, Dilute 10 เทา) ...................................................................................... 119 46 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Cu2+, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 120

ฏ

ตารางท หนา 47 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None, Dilute 10 เทา) .................................................................................... 120 48 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Galactose, Dilute 10 เทา) ............................................................................. 120 49 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Glucose, Dilute 10 เทา)................................................................................ 121 50 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Lactose, Dilute 10 เทา) ................................................................................ 121 51 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Xylital, Dilute 10 เทา) ................................................................................. 122 52 การศกษาชนดของนาตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Xylose, Dilute 10 เทา) ................................................................................. 122 53 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None, Dilute 10 เทา) .................................................................................... 122 54 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (DTT, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 123 55 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (EDTA, Dilute 10 เทา) .................................................................................. 123 56 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Urea, Dilute 10 เทา) ..................................................................................... 124 57 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mercaptoethanol, Dilute 10 เทา).................................................................. 124 58 ผลการหาคาจลศาสตรของเอนไซม -galactosidase ............................................. 125

ฐ

สารบญภาพ ภาพท หนา 1 โครงสรางนาตาล Lactose แบบ Haworth form ........................................................ 5 2 โครงสรางนาตาล Lactose แบบ Chair form ............................................................. 6 3 โครงสราง Alpha-lactose และ Beta- lactose ............................................................ 6 4 ปฏกรยาการยอยสลาย Lactose ดวย เอนไซม -galactosidase ................................. 11 5 กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม -galactosidase ............................................... 14 6 ตวรบและการเกดปฏกรยา Transgalactosylation ของเอนไซม ................................ 15 7 Lac operon ในสภาวะถกยบย งการถอดรหส ............................................................ 16 8 โครงสรางทางเคมของ Isopropyl- -D-thio-galactoside (IPTG) .............................. 17 9 โครงสรางทางเคมของ Allolactose .......................................................................... 17 10 โครงสรางทางเคมของ o-nitrophenyl-3-D-galactopyranoside (ONPG) .................. 18 11 Ion-exchange chromatography................................................................................. 21 12 การแยกสารตามขนาดดวยวธ Gel filtration chromatograph .................................... 22 13 หลกการของ Affinity chromatography แสดงการจบกนระหวาง สารทสนใจ (S) Ligand (L) ขณะอยในคอลมน ............................................. 23 14 การเขาจบของ SDS กบโปรตน ซงจะทาใหโปรตนมรปรางเปนเสนเหยยด และมประจลบ ............................................................................................... 26 15 การวเคราะหโปรตนดวยวธ SDS-PAGE แบบ Discontinuous gel .......................... 27 16 ไอโซเลทจลนทรยทนอณหภมสงสายพนธ B1.2 ทคดแยกไดจาก การแยกเชอจลนทรยจากโปงนารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอน .................. 42 17 สและลกษณะของเชอจลนทรย B1.2 ทยอมตดสมวง ............................................... 43 18 เอนโดสปอรของเชอจลนทรย B1.2 ทบรเวณปลายทงสองดาน ............................... 44 19 ลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5 ของ 16 ของแบคทเรยตวอยาง 1.2 ........................................................................... 45

20 ลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5’ ของ 16S rDNA ของแบคทเรยตวอยาง B1.2 เปรยบเทยบกบ Anoxybacillus sp .......................................................... 47 21 ภาพความสมพนธทางววฒนาการของแบคทเรยสายพนธ 1.2 เปรยบเทยบกบแบคทเรยในสกล ........................................... 48

ฑ

ภาพท หนา 22 ความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร 420 นาโนเมตร และ ความเขมขนของเกลอโซเดยมคลอไรดกบ Fraction number หลงผาน DEAE sepharose column ................................... 50 23 ความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร 420 นาโนเมตร และ ความเขมขนของเกลอโซเดยมคลอไรดกบ Fraction number หลงผาน Affinity column .................................................. 50 24 ผลของอณหภม ทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จาก จลนทรยทนอณหภมสง B1.2 ....................................................................... 52 25 อทธพลของอณหภมตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase .......................... 53 26 ผลของคาพเอชทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จาก จลนทรยทนอณหภมสง B1.2 ....................................................................... 54 27 อทธพลของคาพเอชตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidaseบรสทธ ............... 55 28 Lineweaver Burk plot ของเอนไซม -galactosidase บรสทธจาก ไอโซเลท B1.2 ............................................................................................... 56 29 Michaelis-Menten ของเอนไซม -galactosidase บรสทธจากไอโซเลท B1.2 ......... 57 30 Native PAGE ของเอนไซม -galactosidaseบรสทธทไดจาก ไอโซเลท B1.2 ............................................................................................... 61 31 SDS PAGE ของเอนไซม -galactosidase บรสทธทไดจากไอโซเลท B1.2 ............ 62 32 กราฟแสดงความสมพนธระหวางคา Log ของนาหนกโมเลกลของโปรตน มาตรฐานทง 5 ชนดกบเวลาของโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา ................... 63 33 กราฟมาตรฐานสารละลาย oNP ................................................................................ 91 34 กราฟมาตรฐานโปรตน ............................................................................................. 93 35 กราฟมาตรฐานเจลฟลเตรชน ................................................................................... 94

1

บทท 1

บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา

จลนทรยถอไดวาเปนแหลงผลตเอนไซมทสาคญเนองจากคณสมบตทสามารถเพมจานวน

ไดรวดเรว และสามารถผลตสารชวภาพภายใตสภาวะทควบคมได ซงในปจจบนไดนามาใชในอตสาหกรรมอยางแพรหลาย ไดแก อตสาหกรรมการผลตยา อตสาหกรรมการผลตอาหารและนม (Hung and Lee, 2000) โดยเฉพาะอตสาหกรรมเกยวกบนม ซงองคประกอบสาคญในน านมนนไดแก นาตาลแลคโตส (Lactose) ซงเปนน าตาลทมเฉพาะในนมเทานน อาจเรยกอกอยางหนงวา "นาตาลนม" พบในสตวเลยงลกดวยนม ประโยชนของ Lactose หลายประการ เชน ทางการแพทยและเภสชกรรม ทางอตสาหกรรมอาหาร และใชเปนตวควบคมการหมกของผลตภณฑนมเพราะ Lactose เปนแหลงอาหารอยางดสาหรบจลนทรยทสามารถใช Lactose ในการหมกนมได เชน Lactobacillus และ Bifidobacteria เปนตน ทาใหเกดกรด Lactic ทาใหน านมมรสเปรยว แตอยางไรกตาม Lactose กอใหเกดปญหาทสาคญ 3 ประการ คอ สขภาพ อาหาร และสงแวดลอม ดานสขภาพ คอ การแพน านม อาการ “Lactose intolerance” หรอ สภาวะทรางกายไมสามารถใชน าตาล Lactose ซงเปนน าตาลหลกทพบในน านมได ทาใหมอาการทองเสยหลงจากการดมนมสดเขาไป เนองจากรางกายของเราขาดเอนไซมทเรยกวา Lactase ปญหาดานอาหารพบวา ในผลตภณฑทไดจากนมหลายชนด เชน ไอศครม นมขน นมผง หรอนมคนรป จะเกดการตกผลกของ Lactose ทาใหผลตภณฑทไดเนอไมละเอยด เมอรบประทานจะรสกสากลน (Dziezak, 1991) สวนปญหาดานสงแวดลอม ไดแก ของเสยจากอตสาหกรรมเนยแขงหรออตสาหกรรมผลตเคซน ซงมปรมาณ Lactose สะสมอยในปรมาณมากจนไมสามารถยอยสลายไดทนในสงแวดลอม กอใหเกดปญหาคา BOD และ COD ทสงขน การยอยสลาย Lactose ดวยเอนไซม -galactosidase จงเปนแนวทางหนงในการแกปญหาดงกลาวขางตน (Mahoney, 1998) เอนไซม -galactosidase หรอ Lactase (EC 3.2.1.23) เปนเอนไซมในกลม Glycosidic hydrolase สามารถยอยสลายพนธะ 1-4 glycodisic linkage ของน าตาล Lactose ซงเปนน าตาลโมเลกลค ไดเปนน าตาลโมเลกลเดยว คอ Glucose และ Galactose มการนาเอนไซม -galactosidase มาใชในอตสาหกรรมอาหารและอตสาหกรรมนมเพอ

2

ทาการผลตผลตภณฑอาหารหรอผลตภณฑนมทปราศจาก Lactose หรอม Lactose ตาแกปญหาผมอาการแพนม นอกจากนยงไดสารละลายผสมระหวาง Glucose และ Galactose ซงสามารถนาไปใชประโยชนในทางอตสาหกรรมได ในปจจบนมการสนใจศกษาจลนทรยชอบอณหภมสงมากขน เนองจากความสามารถในหลายๆ ดานทเหนอกวาเอนไซมพวกชอบอณหภมปานกลาง (Mesozyme) ทงการทนและเสถยรทอณหภมสง ทนตอสารเคม ตวทาละลาย และความเปนกรด ดาง ไดดกวาอกดวย แหลงทสามารถพบจลนทรยชอบอณหภมสงในธรรมชาต เชน บนพนดน พนทะเลทมอณหภมสง ลกลงไปใตดน บอนาพรอนหรอจากสวนทมความรอนจากสงมชวต จลนทรยชอบอณหภมสงเปนแหลงของเอนไซมทสาคญ ซงหนงในนน คอ เอนไซมในกลม Glycosidase (Sunna et al., 1997) ซงสามารถยอยคารโบไฮเดรตบรเวณพนธะ Glycosidic การศกษาลกษณะสมบตของเอนไซม

-galactosidase ทไดจากเชอจลนทรยชอบอณหภมสงจากแหลงในประเทศจงเปนประโยชนในการนาไปพฒนาการผลตในอตสาหกรรมการผลตอาหารและนมได

งานวจยนจะมงเนนการทาบรสทธและศกษาสมบตบางประการของเอนไซม -galactosidase ทไดจากเชอจลนทรยชอบอณหภมสงสายพนธ B1.2 เพอนาเอนไซมไปประยกตใชในดานอตสาหกรรมตอไป 2. วตถประสงค

เพอทาบรสทธและศกษาลกษณะสมบตของเอนไซม และสภาวะทมผลตอการทางาน ของ

เอนไซม -galactosidase จากเชอจลนทรยสายพนธ B1.2 3. ขอบเขตของงานวจย 3.1 การเตรยมเอนไซม -galactosidase จาก Stock เชอแชเยนเพอใชสาหรบดาเนนงานวจย

3.2 การระบชนดสายพนธจลนทรย B1.2 โดยวธ 16 srDNA 3.3 การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase โดยวธ Chromatography ดวยเครอง Fast

Protein Liquid Chromatography โดยผาน Ion-exchanger column (DEAE Sepharose fast flow, XK 26) และ Affinity column (Agarose p-aminobenzyl-1-thio- -d-galactopyranoside, XK16)

3.4 การศกษาลกษณะสมบตตางๆของเอนไซม -galactosidase ทไดจากจลนทรยสายพนธ B1.2 ประกอบดวย อณหภมทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม ผลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม คา pH ทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม ผลของคา pH ทมผลตอความ

3

เสถยรของเอนไซม คาทางจลศาสตรของเอนไซมตามทฤษฏของ Michalis-Menten และ Linewaver-Burk ผลของไอออนโลหะตอกจกรรมของเอนไซม ผลของชนดน าตาลตอกจกรรมของเอนไซม ผลของรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม การหานาหนกโมเลกลของเอนไซม 4. ประโยชนของงานวจย

4.1ไดจลนทรยสายพนธทชอบอณหภมสงและมประสทธภาพในการผลตเอนไซม -galactosidase ซงเปนประโยชนตอการผลตในอสสาหกรรม ไดแก อตสาหกรรมการผลตผลตภณฑเกยวกบนม 4.2 ทาใหทราบลกษณะสมบตของเอนไซม -galactosidase และสภาวะทเหมาะสมของจลนทรยชอบอณหภมสงทสามารถผลตเอนไซม -galactosidase เพอนาไปประยกตและใชประโยชนในดานตางๆ

4.3 เพอนาไปสการทาบรสทธ และการผลตของเอนไซม -galactosidase สาหรบงานวจยตอไปในอนาคต

4

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ 1. แลคโตส (Lactose)

Lactose (4p-o- -D-galactopyranosyl-D-glucoyranose) หรอ นาตาลนม (Milk sugar) เปน

คารโบไฮเดรตทสาคญพบไดในนานมเทานน ในนานมม Lactose เฉลยประมาณ 4.6-4.8 เปอรเซนต(Harper 1992) Lactose มความสาคญในอตสาหกรรมนม เนองจาก Lactose ถกทาให สลายตวไดงายโดยแบคทเรย ทาใหเกดกรด Lactic ซงทาใหน านมมรสเปรยว Lactose ซงผลตเปนการคาเตรยมไดจาก เวย (Whey) ซงเปนผลพลอยไดจากการทาเนยแขง น าตาล Lactose เปนน าตาลทประกอบดวย Monosacharide 2 โมเลกล ตอกนดวยพนธะแบบ Glycosidic linleage (Matheus and Van, 1996) มโครงสรางทางเคม 2 รปแบบ คอ Haworth form และ Chair form ดงแสดงในภาพท 1 และ 2 โดย Linkage ระหวาง C-1 ของ กาแลคโตส (Galactose) และ C-4 ของกลโคส (Glucose) ดวยพนธะ 1-,4 glycoside และม Anomeric 2 แบบ คอ แอลฟา และเบตา ( -และ - lactose) (ภาพท 3) ซงขนอยกบ Steric configuration ของ H และ OH ตรงตาแหนง C-1 ของ Glucose

ประโยชนของ Lactose 1. ทางแพทยและเภสชกรรม เชน ชวยในการสรางเซลสมองของเดกออน ใชในการทายา

เมด และยาชนดแคปซล 2. ทางอตสาหกรรมอาหาร เชน เปนตวควบคมกระบวนการหมกในผลตภณฑนม เพราะ

Lactose เปนแหลงอาหารอยางดสาหรบจลนทรย ทาใหเกดสและกลนในผลตภณฑนมและขนมปง เนองจาก Lactose เมอถกความรอนจะใหสน าตาล (Caramel) หรอปฏกรยาทเรยกวา Maillard reaction (Harper, 1992) ใชเปนตวทาให Lactose ในนมขนหวานตกตะกอนไดเรวขน เพราะถา Lactose ตกตะกอนไมหมดเวลานามารบประทานจะรสกสากลน (Sandy) และใชเปนสวนประกอบของ Media ในการเลยงเชอรา Penicill (Holisinger, 1991)

ปญหาทเกดจาก Lactose Lactose เปนสาเหตของปญหาทสาคญ 3 ประการ คอ สขภาพ อาหาร และสงแวดลอม

5

1. ปญหาดานสขภาพ คอ อาการแพน าตาล Lactose (Lactose intolerance) หรอ สภาวะทรางกายไมสามารถใชน าตาล Lactose ซงเปนน าตาลหลกทพบไดในน านม ทาใหมอาการทองเสยหลงจากการดมนมสดเขาไป (Zadow, 1992) สาเหตเนองจากรางกายของเราขาดเอนไซม Lactase ซงทาหนาทสลายน าตาล Lactose ใหเปนสารอนๆทเลกลง และดดซมเขาสกระแสเลอด ซงปกตเซลลทลาไสเลกของเราสามารถผลตได ถารางกายไมสามารถผลตเอนไซม Lactase ได น าตาล Lactose จะถกใชโดยจลนทรยอนๆในลาไสซงจะทาใหเกดกรดจานวนมาก สงผลใหรางกายตองรบขบกรดเหลานนออกมาทางอจจาระ อาการทมกพบบอยคอ วงเวยน ปวดทอง ทองเสย หลงจากการรบประทานอาหารทมน าตาล Lactose เขาไปประมาณ 30 นาท ถง 2 ชวโมง สวนความรนแรงและปรมาณททนไดนนขนอยกบรางกายของแตละคน

2. ปญหาดานอาหารพบวา ในผลตภณฑทไดจากนมหลายชนด เชน ไอศครม นมขน นมผง หรอนมคนรป จะเกดการตกผลกของ Lactose ทาใหผลตภณฑทไดเนอไมละเอยด เมอรบประทานจะรสกสากลน (Dziezak, 1991)

3. ปญหาดานสงแวดลอม กอใหเกดปญหาคา BOD และ COD ทสงขน เกดจากของเสยจากอตสาหกรรมเนยแขงหรออตสาหกรรมผลตเคซน ซงมปรมาณ Lactose สะสมอยในปรมาณมากจนไมสามารถยอยสลายไดทนการยอยสลาย Lactose ดวยเอนไซม -galactosidase จงเปนแนวทางหนงในการแกปญหาดงกลาวขางตน (Mahoney, 1998)

ภาพท 1โครงสรางนาตาล Lactose แบบ Haworth form

6

ภาพท 2 โครงสรางนาตาล Lactose แบบ Chair form

ภาพท 3โครงสราง Alpha-lactose และ Beta-lactose 2. การจดจาแนกกลมของจลนทรยตามอณหภม

จลนทรยซงอาศยอยทกหนทกแหงบนโลกตงแตบนพนดนจนถงใตมหาสมทร ซงมสภาพ

เลวรายยากทสงมชวตใดอาศยอยไดกตามการทจลนทรยอาศยอยไดนนเกดจากการปรบตวอยางยาวนานทงทางดานชวเคมและทางดานพนธกรรม จนกระทงสามารถปรบตวเขากบสภาพแวดลอมบรเวณทอาศยใหอยรอดมาได ปจจยแวดลอมตางๆ ทมผลกระทบตอจลนทรยอยมากมายไดแก ความรอน ความเยน แกส ความเปนกรด-ดาง รงส ความชน แรงดนออสโมตก และแรงดนไฮโดรสตาตก แมกระทงจลนทรยดวยกนเอง (นงลกษณ และปรชา 2547)

ชนดของจลนทรยจะสมพนธกบอณหภมของสงแวดลอมในสถานทน นๆ กลาวคอจลนทรยจะตองเจรญเตบโตไดในชวงอณหภมทเปลยนแปลงขนลงนนเองโดยมสงทจาเปนตองทราบคอ

7

1. MinimumTemperature คอคาอณหภมตาสดทจลนทรยสามารถเจรญเตบโตและดาเนนกจกรรมทางดานเมตาบอลซมตอไปได

2. MaximumTemperature คอคาอณหภมสงสดทจลนทรยสามารถเจรญเตบโตและดาเนนกจกรรมทางดานเมตาบอลซมตอไปไดถาอณหภมสงขนอกเลกนอยการเจรญเตบโตจะหยดลงและถายงคงสงขนอกถงจดหนงเอนไซม และ Nucleic acid จะถกทาใหสญเสยกจกรรมหรอเรยกวา Inactivation อยางถาวร และในทสดจลนทรยจะตายซงเปนหลกการทวไปทนาไปใชในการทาลายจลนทรยดวยความรอน

3. Optimum Temperature คอชวงอณหภมแคบๆ ซงอยระหวาง MinimumTemperature และ Maximum Temperature คอเปนอณหภมทเหมาะสมทสดทจะทาใหจลนทรยเจรญเตบโตและมอตราของเมตาบอลซมสงสดจลนทรยจะแบงออกตามชวงอณหภมทอาศยอยดงตอไปน -Psychrophile เจรญเตบโตไดดทอณหภมตากวา 15 องศาเซลเซยส สามารถเจรญเตบโตไดท 0 องศาเซลเซยส และไมสามารถเจรญทอณหภมสงกวา 20 องศาเซลเซยส เชน กลมจลนทรยทเจรญเตบโตบนทงหมะ นาแขง ใตทะเลลก เปนตน -Mesophile กลมจลนทรยซงมความสาคญทสดทางดานการแพทย เจรญเตบโตในชวงอณหภมปานกลาง โดยอณหภมทเหมาะสมของจลนทรยสวนใหญในกลมนอยระหวาง 20 - 40

องศาเซลเซยส จลนทรยทกอใหเกดโรค (Pathogens) กจดอยในกลมน และบางชนดเปนสาเหตของการเนาเสยของอาหาร โดยเปนชนดทสราง Cyst หรอ Spore เพอใหสามารถทนทานตอความรอน

-Thermophile เจรญเตบโตไดดทอณหภมสงกวา 45 องศาเซลเซยส โดยทวไปเจรญเตบโตไดในชวง 45-80 องศาเซลเซยส บางชนดเจรญเตบโตไดท 250 องศาเซลเซยส หลายชนดเปนจลนทรยประเภทสรางสปอร (Spore-forming bacteria) ดงเชน Bacillus, Clostridium ฯลฯ 3. เอนไซมททนอณหภมสง

ปจจบนในภาคอตสาหกรรมมความตองการเอนไซมททนอณหภมสง (Bruins et al. 2003)

เนองจากความสามารถทเหนอกวาเอนไซมพวกชอบอณหภมปานกลาง (Mesozyme) เชน ทนและเสถยรทอณหภมสง ทนตอสารเคม ตวทาละลาย และความเปนกรด-ดางไดด ขอดทสาคญของเอนไซม -galactosidase ททนอณหภมสงคอเสถยรทอณหภมสงทาใหเกดสมดลสาหรบปฏกรยา Transgalactosylase activity การใชเอนไซมททนตออณหภมสงในการไฮโดรไลซ Lactose และการเกด Galactooligosaccharide ทาไดทอณหภมสงเทากบขบวนการพาสเจอไรซนม เปนการลดปฏกรยาขางเคยง (Side reaction) ทไมตองการทอณหภมสง เชน ลดการตกตะกอนโปรตนของนม

8

ลดการเกดปฏกรยามลลารดหรอการเปลยนรสชาตของนมหลงผานการฆาเชอ (Stutzenberger, 1990) นอกจากนกระบวนการทเกดขนทอณหภมสงยงมขอดอกหลายประการ คอ เพมคาการละลายของสบสเตรท ลดความเสยงตอการปนเปอนของจลนทรยอน ลดการยบย งปฏกรยาเนองจากผลตภณฑ (Kristjansson 1989; Petzelbauer et al. 1999; Stutzenberg 1990; Zeikus et al., 1998) เอนไซม -galactosidase ทเสถยรทอณหภมสงสามารถประยกตใชในอตสาหกรรมเพราะวาใหผลผลตดกวาและทางานทอณหภมสงไดด ดงตารางท 1 และมขอเสย ดงตารางท 2 จลนทรยชอบอณหภมสงมกพบในบรเวณทมอณหภมสง เชน น าพรอน บอน ารอน เปนตนการศกษาเอนไซม -galactosidase จากเชอททนอณหภมสงทมรายงานไว ไดแก Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842 (Vasiljevic and Jelen, 2001), Streptococcus thermophilus (Greenberg and Mahoney, 1982), Sulfolobus solftaricus (Reuter et al., 1999; Petzelbauer et al., 1999), Rhizomucor sp. (Shaikh et al., 1999), Streptococcus thermophilus 11F (Linko et al., 1998), Thermoanaerobium sp. 2905 (Ulezlo et al., 2001), Thermotoga maritime (Kim et al., 2004), Caldareilla acidophila (Pulvin et al., 1990), Pyrococcus feriosus (Splechtna et al., 2002), Sterigmatomyces elviae CBS8119 (Onishi and Tanaka, 1995), Cryptococcus laurentili OKN-4 (Ohtsuka et al., 1990), Fusarium moniliforme (Macris and Markakis, 1981), Thermomyces lanuginosus (Fisher et al., 1995), Thermomyces lanuginosus-SSBP (Lin et al., 1999) นอกจากนยงพบวาเชอในกลม Thermus สวนใหญสามารถผลต -galactosidase ททนอณหภมสงไดดวยเชนกน ไดแก Thermus sp. T2 (Ulrich et al. 1972; Koyama et al., 1990; Ladero et al., 2002), Thermus sp. A4 (Ohtsu et al., 1998), Thermus thermophilus (Macium ska et al., 1998) ตวอยางการศกษาคณสมบตบางประการของเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยชอบอณหภมสง แสดงใน ตารางท 3 และนอกจากไดมรายงานการศกษาวจยเกยวกบจลนทรยชอบอณหภมสงและสามารถผลตเอนไซม -galactosidase เชน การทาบรสทธและศกษาคณสมบตเอนไซม (Fisher et al. 1995; Lin et al., 1999; Kim et al., 2004) การประยกตใชเอนไซมทงในรปแบบของเอนไซมอสระและเอนไซมตรงรป (Petzelbauer et al., 1999; Splechtna et al., 2002; Ladero et al., 2005) การศกษาคณสมบตของยนทเกยวของกบการสรางเอนไซม (Kang et al., 2005)

9

ตารางท 1 ขอดของเอนไซมททางานและเสถยรทอณหภมสงในกระบวนการอตสาหกรรม

คณสมบต ขอดในกระบวนการผลต ความเสถยรทอณหภมสง ทนตออณหภมสง, ทนไดนานกวา อณหภมเหมาะสมตอการทางานสง กจกรรมของเอนไซมนอยทอณหภมตา, Shelf life ยาว ความเสถยรทวไป ทนตอการทาบรสทธทสภาวะรนแรง, ได Yield สงกวา ยนทสามารถโคลนเขาใน E. coli ขนตอนการใหความรอน ทาใหการทาบรสทธงายกวา อตราการเกดปฏกรยาเคม เรงอตราการแพรและกระบวนการทางเคมอนๆ ความสามารถในการละลาย การละลายของสารประกอบดทอณหภมสงขน ความหนด ลดลง,การกวนและการปมสามารถทาไดเรว การทนตอ denaturing rates ทนตอตวทาละลายอนทรย พเอชสงและตา การปนเปอนของจลนทรย ปองกนการเจรญของ Pathogen และ Mesophiles กจกรรมเกยวกบชววทยาวตถดบ Heating kills รบกวนกจกรรมของเอนไซมและจลนทรย

ทมา : (Kristjanson, 1989) ตารางท 2 ขอเสยของเอนไซมททางานและเสถยรทอณหภมสงในกระบวนการอตสาหกรรม

คณสมบต ขอเสยในกระบวนการผลต ความเสถยรทอณหภมสง สารเคม วตถดบและ Cofactor บางตวไดรบอนตรายจาก

การใหความรอน อณหภมเหมาะสมตอการทางานสง อณหภมสงเกนไปสาหรบบางกระบวนการผลต ความสามารถในการละลาย การละลายโดยทวไปลดลงสาหรบกาซ เชน ออกซเจน Thermostability Material stress อปกรณ Stress เพมขนและ Constrains ตอวตถดบทใช

ทมา : (Kristjanson, 1989)

10

ตารางท 3 คณสมบตบางประการของเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยชอบอณหภมสง

Source Mol Mass (kDa) pHOpt

TOpt (oC) Stable temp Reference (s)

Rhizomucor sp. 250 4.5 60 T1/2= 150 min at 70 oC Shaikh et al., 1999

Sulfolobus solfataricus

80 Stable at 75 oC (77%after 24 h) Stable at 65 oC (87% after 24 h)

Reuter et al., 1999

Thermoanaerobium sp. 2905 4.5-5.0 80 Ulezlo et al.,

2001 Thermotoga maritime 120 6.5 80-85

t1/2=16 min at 80o C t1/2= 16 min at 90oC Kim et al., 1994

Thermus sp. T2 550 6.5 Stable at 90oC (2 h) Stable at 80oC (6 h)

Ladero et al., 2002

Thermus sp.4-1A 570 6 Stable at 75oC (75% after 20 h) ,65oC (90% after 36 days)

Cowan et al., 1984

T. aquaticus YT-1 700 5.5 80 Thermostability was enhanced by CaCl2

Berger et al., 1997

Thermus sp. A4 75 6.5 Stable at 70 oC (100% after 20 h)

Ohtsu et al., 1998

Thermus thermophilus

6.6 87 Stable at 75oC (98% after 5 h) Stable at 85oC

Maciunsha et al., 1998

Thermus sp. IB-21 73 5.0-6.0 90 t1/2 = 74 at 70 oC t1/2 = 23 h at 80oC t1/2 = 4.7 h at 90oC

Kang et al., 2005

Sterigmatomyces elviae CBS8119

170 4.5-5.0 80 Stable at 80 oC (1h) Onisshi and tanaka, 1995

Thermomyces lanuginosus 75-80 6.7-7.2

Stable at 47 oC (2h) t1/2 = 191 h at 50 oC

Fischer et al., 1995

Thermomyces lanuginosus-SSBP

200 6 65 Stable 50 oC (30 min) Lin et al., 1999

Cryptococus laurentii OKN-4

1000 4.3 60 Stable below 57.5 oC (10 min) Ohtsuka et al., 1990

Fusarium moniliforme 3.8-5.0 50-60 T1/2= 6 at 50 oC

Macris and Markakis, 1981

11

4. เอนไซม -galactosidase เอนไซม -galactosidase หรอ Lactase (EC 3.2.1.23) เปนเอนไซมกลม Glycoside

hydrolase สามารถยอยสลายพนธะ 1-,4 glycosidic linkage ของน าตาล Lactose ไดเปนน าตาลโมเลกลเดยวคอ Glucose และ Galacose (Gekas and Lopez-Leiva 1985; Nakayama and Amachi 1999) ดงภาพท 4 เอนไซม -galactosidase ในมนษยจะถกผลตขนจากบรเวณเยอบผวลาไสเลก สวนในธรรมชาตสามารถพบไดทวไป ทงในพช สตว ตลอดจนเชอจลนทรย ทง ยสต รา และแบคทเรย ดงตารางท 4

ภาพท 4 ปฏกรยาการยอยสลาย Lactose ดวย เอนไซม -galactosidase

12

ตารางท 4 แหลงของเอนไซม -galactosidase ในธรรมชาต

Plant : Peach, Apricot, Kefir grains, Tips of seed, Coffee berry Animal organs : Intestine, Brain and tissue Bacteria : Aeromonas cavie, Agrobacterium rediobactor, Bacillus acidocaldarius, B. Circulans, B.coagulans, B. Subtilis, B. Stearothermophilus, Bifidobacterium sp., B. Bifidum, B. Longum, Clostridium acetobutylicum, Escherichia coli, Lactobucillus bulgaricus, L. casei, L. helveticus, L. sake, Lactococus lactis, Leuconstoc citrovorum, Streeptococcus thermophilis, Thermus aquaticus, Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes Yeasts : Candida pseudotropicalis, Crytococcus laurentii, Kluyveromyces (Saccharomyces) lactis, K. Fragilis, K. marxlanus, Lipomyces sp., Torulopsis sphaerica, T. Versalttis, Brettanomyces amomalus, Wingea robertsii Fungi or molds : Alternaria alternara, Aspergillus cellulosae, A. flavus, A. foetidus, A. nidulans, A. niger A. oryzae, A. phoeninis, A. terreus, A. wentii, Aspergillus sp., Chaetomium globosum, C. cochiliodies, C. funicola, C. thermophile var. coprophile, Fusarium moniliforme, F. axysporum var. lini, Geolrichum candida, Humicala grisea var. thermoidea, H. lamuginosa, Macrophomina phaseoli, Malbranchea pulchella var. sulfurea, Mucor miehei, M. pusillus, Mucor muccedo, M. javanicus, Neurospora crassa, Paecilomyces varioti, Penicillium sp., P. multicolor, P. canescens, P. citrinum, P. luteum, p. chrysogenum, P. frequntans, P. cycroptium, Phycomyces blakeleeamus, Rhizopus acidus, R. niveus, R. nigricans, R. deemar, R. chinensis, Scopulariopsis sp., Sclerotium tuliparum, Spicaria sp., Sporotrichum sp., S. thermophile, Sterigmatomyces elviae, Thermomyces lanuginosus, Torula thermophila, trichoderma viride Actinomecetes : Actinomyces viscosus, Nocardia sp., Saccharopolyspora rectivirgula, Streptomyces lividans, S. venezuelae, S. Violaceus Archacbacteria : Caldariella acidophila, Sulfolobus solfataricus, Pyrococcus woesei, Haloferex alicantei

ทมา : (Gekas and López-Leiva, 1985; Nakayama and Amachi, 1999)

13

5. การสรางเอนไซมยอยนาตาล Lactose สภาพปกตทมน าตาล Glucose เพยงพอจลนทรย จะดงเอาน าตาล Glucose มาใช ยนทใชใน

การสงเคราะหเอนไซมยอยน าตาล Lactose จงไมจาเปนตองเปดทางาน แตเมอน าตาล Glucose ขาดแคลน แลวในสภาพแวดลอมมน าตาล Lactose เอนไซมกจะถกผลตขนภายในยนทสรางเอนไซมยอยน าตาล Lactose แบงยอยเปนยนโครงสรางอก 3 หนวย คอ 3 Polypeptide ในแบคทเรยโดยมการสงเคราะหสาย Polypeptide หลายสายพรอมกน และมการควบคมรวมกน (Co-Ordinate regulation) เมอมการลอกรหสกจะมการลอกไปทง 3 ยน คอ เบตากาแลคโตซเดส ( -galactosidase) เพอรมเอส (Permiase) และ อะซตลเลส (Acetylase) (สนนทา 2547) โดยทง 3 ยนนมโปรโมเตอรรวมกนนนเอง (Polycistronic)

-galactosidase ม 2 หนาท คอ หนาทในการยอย (Hydrolase) Lactose เปน Glucose และ Galactose อกหนาทนงคอเปลยนโครงสราง (Isomerase) ใหเปน Allolactose ซงเปนตวควบคมในกระบวนการลอกรหส โดย Allolactose เปนน าตาลอกไอโซเมอรหนงของน าตาล Lactose มโครงสรางทจบไดพอดกบ Allosteric site ของ Repressor protein เมอจบเขาไปแลว Repressor protein เสยฟงกชนจบกบโอเปอเรเตอรไมได การลอกรหสกจะเกดขน สรปไดวาการลอกรหสของเอนไซมยอยน าตาล Lactose ถกควบคมดวยการมอยของน าตาล Lactose เอง สวนสารทเปนตวยบย ง Repressor protein เรยกวา Inducer ในระบบนกคอ Allolactose นนเอง 6. กลไกในการทางานของ เอนไซม -galactosidase

เอนไซม -galactosidase จะมกลไกในการเรงปฏกรยา 2 ปฏกรยา คอ เรงปฏกรยาการยอย

สลาย Lactose ไดเปน Galactose กบ Glucose และ ปฏกรยา Transgalactosylation ไดผลตเปน Galactooilgosaccharide (Wallenfels and Malhotra, 1961) จากงานวจยพบวากลไกการทางานของเอนไซมมอยางนอยอย 3 ขนตอน โดยในขนตอนสดทายจะเปนขนตอนทกาหนดอตราการเกดปฏกรยา

ขนท 1 : Lactose + Enzyme --------------> Lactose-enzyme complex ขนท 2 : Lactose-enzyme complex --------------> Galactosyl-enzyme + Glucose

ขนท 3 : Galactosyl-enzyme + Glucose --------------> Galactosyl-acceptor + Enzyme ในปฏกรยาการยอยสลายนาตาล Lactose ทมน าเปนตวรบ (Acceptor) หลงจากนาตาล

Glucose ถกตดออกไป Galactose จะฟอรมตวและถกปลอยออกมาเปน Galactose อสระในกรณทม

14

นาตาลอยในสารละลายและทาหนาทเปนตวรบจะเกดการฟอรมตวเปน Galactooilgosaccharide โดย Transferase activity (Wallenfels and Malhotra ,1961) ดงภาพท 5

Gal-OR E+Gal-OR ROH

E+Lac E-Gal-Glc E-Gal+

Glc Gal H2O

ภาพท 5 กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม -galactosidase E : เอนไซม, Lac :Lactose, Gal:Galactose, Gal+ :Carbonium transition state, Glc :Glucose, ROH : นาตาลตวรบ, Gal-OR : Galactosyl sugar (Galactooligosaccharide) ทมา : (Mahoney, 1998)

(Substrate) Lactose

-galactosidase

(Donor) + (Acceptor) (Product) Gal-E H2O Gal, Glc Gal Gal-Gal Glc Gal-Glc Gal-Glc Gal-Gal-Glc Gal-Gal-Glc Gal-(Gal)2-Glc Gal-(Gal)2-Glc Gal-(Gal)3-Glc Gal-(Gal)3-Glc Gal-(Gal)4-Glc ภาพท 6 ตวรบและการเกดปฏกรยา Transgalactosylation ของเอนไซม -galactosidase ทมา : (Matsumoto et al., 1993)

15

กลไกโดยทวไปของปฏกรยาจะมการยาย Galactose ใหกบ Nucleophile acceptor ทมหมไฮดรอกซล ซงถายายใหตวรบทเปนนาจะได Galactose อสระออกมาถายายให Monosaccharide จะไดผลตภณฑเปน Disaccharide เมอยายใหกบ Disaccharide ผลตภณฑทไดจะเปน Trisaccharide ตอไปเรอยๆจนโมเลกลมขนาดใหญขนกลายเปน Oligosaccharide เรยกวา Galactooligosaccharide โดยจะกลบมาเปนสบสเตรตของเอนไซมอกและถกยอยสลายอยางชา (ภาพท 6) โดยทวไปการเกดปฏกรยาไฮโดไลซสจะเกดขนมากกวาปฏกรยา Transgalactosylation เนองจากความเขมขนของนามมากกวา อตราการเกด Galactooligosaccharide สามารถเพมขนไดโดยการลดปรมาณนาหรอเพมความเขมขนของนาตาลตวรบใหสงขน (Mahoney, 1998) 7. กลไลการควบคมการสงเคราะหเอนไซม -galactosidase

Lac operon เปนทฤษฎ Operon ทฤษฎแรกท Jacques Monod และ Francois Jacob (ค.ศ.

1960) ไดใชอธบายกลไกการควบคมการถอดรหสในโปรคารโอตโดยอาศยโปรตนควบคม โดย Lac operon เปน Operon ทเกยวของกบการสงเคราะหเอนไซม -galactosidase ทใชสาหรบเมแทบอลซม (Metabolism) ของน าตาลแลคโตสซงยนโครงสราง (Structural gene) ทเปนองคประกอบของ Lac operon (สนนทา, 2547) ไดแก

1. -galactosidase (Z) gene สาหรบสงเคราะหเอนไซม -galactosidase เพอทาหนาทยอยสลายนาตาง Lactose ใหเปนนาตาล Galactose และ นาตาล Glucose

2. Galactoside permease (Y) gene สาหรบสงเคราะหเอนไซม Galactoside permease ซงทาหนาทเกยวของกบการนานาตาล Lactose เขาสเซลล

3. Thiogalactoside transacetylase (A) gene ใชสาหรบการสรางเอนไซม Thiogaclactoside transacetylase ซงทาหนาทเตมหม Acetyl (Acetylation) ใหกบ Galactoside ทไมถกยอยและนาสงออกนอกเซลล สวนของ DNA ททาหนาทควบคม Lac operon จะอยตอนตนของยนโครงสราง (ภาพท 7)โดยประกอบดวย โปรโมเตอร ซงเปนบรเวณทเอนไซม RNA polymerase เขาจบเพอเรมตนการถอดรหส และ Operator (O) ซงเปนบรเวณทโปรตนยบย ง (Repressor) เขาจบ โดยในภาวะทเซลลไมมน าตาล Lactose แบคทเรย E.coli ไมจาเปนตองใชกลมเอนไซมใน Lac operon ดงนนการสงเคราะห mRNA สาหรบเอนไซมใน Lac operon จะถกยบย งดวยโปรตนยบย ง Lac repressor ซงสงเคราะหมาจากยนควบคม I โดย Lac repressor จะเขาจบกบ Operator และยบย งการทางานของเอนไซม RNA polymerase ซงการยบย งนไมไดเปนการยบย งอยางสมบรณ ยงมการสงเคราะหเอนไซมใน Lac operon ไดบางในปรมาณตาๆ ซงสามารถเกดขนไดในขณะท Lac

16

repressor หลดออกจาก Operator เปนครงคราว การควบคมการแสดงออกของยนโดย Repressor ไปยบย งการถอดรหสของยน เรยกวา “Negative Regulation” (Nelson and Cox, 2000)

แบคทเรย E.coli เมอถกเลยงในภาวะทมน าตาล Lactose จะมการกระตน Lac operon ใหมการสงเคราะหกลมเอนไซมทจาเปนในการใชน าตาล Lactose โดยโมเลกลของ Lactose ทเขาไปในเซลลสวนหนงจะถกเอนไซม -galactosidase ซงมอยแลวปรมาณตาๆ ในเซลลเปลยนใหเปน Allolactose ซงเปน Isomer ของ Lactose จากนน Allolactose จะเขาจบกบ Lac repressor ทาใหโมเลกลของ Lac repressor เกดการเปลยนแปลงโครงสราง ไมสามารถจบกบ Operator ไดอกตอไป สงผลใหเซลลสามารถสงเคราะหเอนไซม -galactosidase ได และสงเคราะหไดสงถง 1,000 เทา เมอเทยบกบภาวะทไมมน าตาล Lactose ในเซลล ซงกรณนจะเรยก Allolactose วาเปน “Inducer” นอกจาก Allolactose แลวพบวา -galactoside ตวอน เชน Isopropylthiogalactoside (IPTG) กสามารถทาหนาทเปน Inducer ได

ภาพท 7 Lac operon ในสภาวะถกยบย งการถอดรหส; I = ยนควบคมซงทาหนาทสงเคราะห Lac repressor, PI = Promoter ของยน I ทมา: (Nelson and Cox 2000) 8. อนพนธของ Lactose

อนพนธของ Lactose หรอ Lactose analogues เปนสารทมผลตอการทางานของ Lac operon

เชนเดยวกบ Lactase โดยตาแหนง Galactosides ในสวนทเปนน าตาล Glucose จะถกแทนทดวยหมฟงกชนอนตวอยางเชน

17

- Phenyl- -D-galactose (phenyl-Gal) เปนสารตงตนสาหรบเอนไซม -galactosidase แตไมสามารถไปยบย งการทางานของ Repressor ดงนน Phenyl-Gal จงไมเปนตวชกนา (Inducer) ในเซลลปกตทผลตเอนไซม -galactosidase ในปรมาณทนอยมากๆ นนไมสามารถทจะเจรญไดในอาหารทม Phenyl-Gal เปนแหลงคารบอนและแหลงพลงงาน แตเซลลกลายพนธทไมม Repressor นนจะสามารถเจรญไดในอาหารดงกลาว ดงนนในอาหาร Minimal medium ทม Phenyl-Gal เปนแหลงคารบอนและแหลงพลงงานเพยงแหลงเดยวนนจงสามารถใชเปนอาหารคดเลอกสาหรบเซลลทกลายพนธในสวนของ Repressor และ Operator ได

- Isopropyl- -D-thio-galactoside (IPTG) เปนอนพนธของ Lactose ตวหนงทมกถกใชเปนตวชกนา (Inducer) ของ Lac operon IPTG ไมใชสารตงตน (Substrate) สาหรบเอนไซม -galactosidase แตจะทาหนาทในการเขาไปจบกบตาแหนง Repressor และไปยบย งการทางานในสวนน (ภาพท 8)

- Allolactose จดเปนไอโซเมอรของ Lactose กลาวคอ Lactose คอ Galactose-( 1->4)-glucose สวน Allolactose คอ Galactose- ( 1->6)-glucose Lactose สามารถเปลยนไปเปน Allolactose ไดโดยอาศยเอนไซม -galactosidase และ Allolactose ยงเปนตวชกนา (Inducer) ของ Lac operon อกดวย (ภาพท 9)

ภาพท 8 โครงสรางทางเคมของ Isopropyl- -D-thio-galactoside (IPTG) ทมา : (Hansen, 1998)

ภาพท 9 โครงสรางทางเคมของ Allolactose ทมา : (Wells, 1984)

18

สาหรบอนพนธของ Lactose ทใชเปนตวบงชกจกรรมของเอนไซม -galactosidase โดยอาศยปฏกรยาทเกดสารทมสขน ไดแก o-nitrophenyl-3-D-galactopyranoside (ONPG) (ภาพท 10)

ONPG มกถกใชเปนสารตงตนในการวเคราะหเอนไซม -galactosidase โดยหลงการเกดปฏกรยาการยอยสลายได Orthonitrophenol (ONP) ทมสเหลอง โดยปรมาณกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จะแปรผนตรงตามความเขมของสเหลองทเกดขน

ภาพท 10 โครงสรางทางเคมของ o-nitrophenyl-3-D-galactopyranoside (ONPG) ทมา : (Wells 1984) 9. จลนพลศาสตรของเอนไซม

เอนไซมทาปฏกรยากบสบสเตรทเกดเปนเอนไซมสบสเตรทคอมเพลกซแลวจงสลายใน

ขนตอนท 2 ใหผลผลต และเอนไซมกลบคนมา อตราเรวของปฏกรยาในการเปลยน S ไปเปน P ขนอยกบอตราเรวในการ เปลยน ES ไปเปน P และ E นนคอ อตราเรวในการเกด P จะขนอยกบความเขมขนของ ES เมอ k1 k2 k3 และ k4 คอ คาความเรวคงท (Velocity constant) หรอ คาอตราเรวคงท (rate constant) ของปฏกรยาทง 4 ท Steady state อตราเรวในการเกด ES จะเทากบอตราเรวในการสลาย ES ทาให[ES] คงท (กญจนา, 2540) จะได

k1 k2

เอนไซม (E) + สบสเตรท (S) <--> เอนไซม - สบสเตรท คอมเพลกซ (ES) <--> เอนไซม (E) + ผลผลต (P) k2 k4

[S]([E] - [ES]) = k2 + k3 = KM

[ES] k1

19

KM คอ คาคงทไมคลส-เมนเทน (Michaelis-Menten constant) ของปฏกรยาของเอนไซมท Steady state มหนวยเปนโมล/ลตร Vmax คอ ความเรวสงสด (Maximum velocity) ของการทางานของเอนไซม

Vmax= k3 [ES]

การวดปรมาณของเอนไซมในตวอยาง คอ การวดอตราเรวของปฏกรยา ซงเรงโดยเอนไซม

ภายใตสภาวะ ทเหมาะสมเพราะเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณของเอนไซมทมอย ผลทไดออกมาเปน Enzyme unit มหนวยเปนไมโครโมล นาโนโมล หรอ พโกโมล ของสบสเตรททถกใชไปหรอของผลผลตทเกดขนในเวลา 1 นาท (กญจนา, 2540) สมการไมคลส-เมนเทน (Lehninger et al., 1993)

ความสมพนธระหวางอตราเรวของปฏกรยา และความเขมขนของ S เมอทราบ Vmax และ KM คอ

V = Vmax [S]

KM + [S] ท V = Vmax /2 หรอ ครงหนงของความเรวสงสด (Half maximal) จะได KM= [S] แตละระบบของเอนไซมสบสเตรท KM และ Vmax จะไมขนกบ [E] แตจะเปลยนตามโครงสรางของสบสเตรท pH และอณหภม สมการไลนวเวอร -เบอรก (Lehninger et al., 1993)

เปนสมการจากการกลบสมการไมคลส-เมนเทน

1 = KM . 1 + 1 v Vmax [S] Vmax

เมอเขยนกราฟระหวาง 1/v และ [S] จะไดกราฟเสนตรงทมความชน = KM/Vmax และจดตดแกน 1/v คอ 1/Vmax และจดตดแกน 1/[S] คอ -1/KM ทาใหสามารถหาคา KM และ Vmax ทถกตองได

20

10. โครมาโตกราฟ (Chromatography) Chromatography เปนเทคนคทนยมใชในการแยกสารชวโมเลกลเนองจากมหลกการ

ประยกตใชไดหลากหลาย สารทแยกไดนนสามารถนามาวเคราะหหรอวดปรมาณไดทนท แลวยงสามารถเตรยมสารในปรมาณมากได หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธแบงออกไดหลายวธขนอยกบคณสมบตเฉพาะตวของสารแตละชนด (รงสร, 2550) ดงตารางท 5 ตารางท 5 หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธ

คณสมบต วธการ ขนาด ขนาด หรอ มวล

- Centrifugation - Gel filtration - Dialysis , Ultrafiltration

เลก - ใหญ เลก เลก

ประจ

- Ion-exchange chromatography - Electrophoresis - Isoelectric focusing

เลก - ใหญ เลก เลก

ความสามารถในการละลาย

- Change in pH - Change in ionic strength - Decrease in dielectric constant

ใหญ เลก - ใหญ ใหญ

ความจาเพาะกบสารบางชนด - Affinity chromatography - Affinity elution

เลก เลก - ใหญ

ทมา : (Price, 1984)

1. การแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธโดยอาศยคณสมบตในการละลายแบงออกเปน 3 วธ

1.1 การเปลยนแปลงคา pH (Isoelectric Precipitation) 1.2 การเปลยนแปลงคาความแรงอออน (Change in ionic strength) 1.3 การลดคาคงทไดอเลคตรค (Decrease in dielectric constant)

21

2. การแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธ โดยอาศยคณสมบตดานขนาด หรอ มวล 2.1 เจลฟลเตรชน (Gel filtration) 2.2 อตราฟลเตรชน (Ultrafiltration) 2.3 ไดอะไลซส (Dialysis)

3. การแยกและทาเอนไซมใหบรสทธ โดยอาศยคณสมบตดานประจ 3.1โครมาโตรกราฟแลกเปลยนประจ (Ion- exchange chromatography) 3.2 ไอโซอเลคตรคโฟกสซง (Isoelectric focusing)

4. การแยกและทาเอนไซมใหบรสทธ โดยอาศยคณสมบตดานความจาเพาะ 4.1 โครมาโตกราฟจาเพาะ (Affinity chromatography)

10.1 Ion-exchange chromatography วธการ Ion-exchange chromatography สารจะถกดงไวโดยแรงดงดดระหวาง หม บน

Stationary phase ซงมประจตรงขามกบสารทตองการแยก Ion-exchange chromatography ม 2 แบบคอ Anion-exchange (ภาพท 11) และ Cation-exchange ซงเรยกตามประจของสารในคอลมนจะบรรจดวย Stationary phase ทมประจตรงขาม (รงสร 2550) Anion-exchange ทนยมใชไดแก DEAE Sepharose Fast Flow มลกษณะเปน Weak anion exchanger โดยกลมของ Ion exchange คอ Diethylaminoethyl (–O–CH2CH2–N+(C2H5)2H)

ภาพท 11 Ion-exchange chromatography

22

ขนตอนการชะสารทาไดโดย 1. การเปลยนแปลง pH เพอ Neutralize หมทมประจทงทอยบนโมเลกลของสารและบน

Stationary phase 2. เพมความเขมขนของเกลอในบฟเฟอรทใชชะ เพอไปแทนทอออนทจบอย 3. ใช pH หรอ Salt gradient เพอเพมประสทธภาพการแยก Matrix ตวกลางทใชแยกสาร

แบงออกตามประจชวคราว

10.2 Gel filtration Chromatography Gel filtration Chromatography มชอเรยกอกอยางอนวา Gel permeation หรอ Size-

Exclusion Chromatography มหลกการแยกตามขนาด และรปรางโมเลกลของสาร สภาวะทใชในการแยกจะเปนแบบ Non-denaturing conditions ซงเหมาะสมสาหรบการแยกโปรตนทมน าหนกโมเลกลตางกน นอกจากนนยงใชสาหรบการขจดเอาเกลอออก (Desalting)โปรตนทแยกโดยวธนยงคงโครงราง Quaternary อยดงภาพท 13 สามารถใชหา Molecular weight ของสารไดโดยเทยบกบ Standard protein ททราบ Molecular weight ชนดของ Matrix ทใชในการ Form Stationary phase ไดแก Cross-linked dextran polymer (Sephadex G-10 ถง G-200) และ Cross-linked polyacrylamide (Biogel P-2 ถง P-300)

ภาพท 12 การแยกสารตามขนาดดวยวธ Gel filtration chromatograph ทมา : Gerald, Frenkel. Determination of protein molecular weight [Online] Accessed Spring 2008.

Available from http://newarkbioweb.rutgers.edu/bio301s/

23

10.3 Affinity chromatography หลกการและประสทธภาพในการแยกโปรตนทตองการ ขนอยกบคณสมบตของสารจา

เพาะทเรยกวา ลแกนด (Biospecific ligand) ถกเหนยวนา ใหตดอยบนเฟสคงท (Stationary phase) ดวยพนธะโควาเลนท เฟสคงทนเรยกอกชอหนงวา เมทรกซ (Matrix) กลมลแกนด (Ligand) ทยดตดกบ Matrix นเรยกวา ลแกนดตรง( Immobilized ligand ) มความจาเพาะในการจบกบสารทตองการแยก หลงจากทชะไลสารอนทไมจาเพาะกบ Ligand ออกไปจากคอลมนแลวทาการปรบสภาวะเพอใหสารทตองการแยกหลดออกจากการยดจบโดย Ligand (ภาพท 13 ) ( ifton, 1991) สาหรบตวอยางของกลมสารทตองการแยกและชนดของ Ligand แสดงดงตารางท 6

+

Immobilize the ligand + L L

Adsorb sample substance(s)

L S L S + Impurities (Sample)

Desorb bound substance (s) L S L + S ภาพท 13 หลกการของ Affinity chromatography แสดงการจบกนระหวางสารทสนใจ (S) กบ Ligand (L) ขณะอยในคอลมน ทมา : ( ifton, 1991)

24

ตารางท 6 ชนดของสารทตองการแยกกบ Ligand จาเพาะทเคลอบบน Stationary phase

สารทตองการแยก Ligand Enzyme Substrate analogue , Inhibitor , Cofactor Antibody Antigen , Virus , Cell Lectin Polysaccharide , Glycoprotein , Cell surface receptor , Cell Nucleic acid Comprementary base sequence , Histone , Nucleic acid

polymerase , Binding protein Hormone , Vitamin Receptor , Carrier protein Cell Cell surface specific protein , Lectin

ทมา : ( ifton, 1991) 11. การแยกโปรตนโดยวธเจลอเลคโตรโฟรซส (Gel electrophoresis of protein)

การแยกโปรตนโดยวธอเลคโตรโฟรซส (Electrophoresis) สามารถนาไปประยกตใชไดใน

งานตางๆ เชน การเปรยบเทยบและการวเคราะหรปแบบ (Pattern) ของสารตวอยางโปรตนจากเนอเยอหรอเซลลทมาจากแหลงตางๆ การตรวจสอบความผดปกตของโปรตนทอาจเกดจาการผาเหลา (Mutation) การแยกและทาใหบรสทธ การทดสอบคณสมบตของโปรตนทางอมมโนวทยา และการตรวจหาขนาดของโปรตน (Molecular weight) เจลพอลอะครลาไมด (Polyacrylamide Gel) เกดจากปฏกรยาการเชอมตอกนของ Acrylamide monomer จนไดเปนสายโซยาวและเชอมกนเปนโครงขายดวยพนธะโคเวเลนต (Covalent bond) ซงมหมฟงกชน 2 หม (Bi-functional compound) เชน N,N'-methylene bisacrylamide ปฏกรยาดงกลาวทาใหไดโครงสรางทมลกษณะเปนรพรน ซงมขนาดแตกตางกนตามขนาดโมเลกลของโปรตนทตองการแยก ดงนนระหวางการแยกดวยบน Polyacrylamide Gel ดวยกระแสไฟฟา โมเลกลโปรตนจะถกคดกรองดวยตะแกรงสามมต (Sieving effect) จงทาใหโมเลกลขนาดใหญเคลอนทชากวาโปรตนขนาดเลก และการแยกโปรตนททางานไดตามธรรมชาต (Native protein) ดวยกระแสไฟฟาบน Polyacrylamide Gel ในสารละลายบฟเฟอรทไมทาใหโปรตนเสยสภาพ (Non-dissociating buffer หรอ Non-denaturing buffer) เชน ทรสคลอไรด (Tris-HCl) นน ขนอยกบความหนาแนนของประจและขนาดของโปรตนความสามารถในการคดกรองของการแยกดวยวธนขนอยกบวา ขนาดของรพรนของเจล มคา

25

ใกลเคยงกบขนาดของโปรตนทเคลอนทไปบนเจล มากนอยเพยงใด รพรนของ Polyacrylamide Gel จะแปรผกผนกบความเขมขนของ Acrylamide หากความเขมขนของ Acrylamide เพมขน ขนาดของรพรนและสดสวนของตวเชอมโครงขาย Bisacrylamide จะลดลงในทางปฏบต สดสวนของตวเชอมโครงขายจะมคาคงทและประสทธภาพของรพรนจะเปลยนแปลงไปตามการเลอกใชความเขมขนของ Acrylamide การแยกโปรตนสวนใหญใชเจลทมความเขมขนของ Acrylamide อยในชวงรอยละ 5 - 15 ซงเจล ทมรอยละของ Acrylamide ตาจะใหขนาดรพรนใหญทสดซงเหมาะสาหรบแยกโปรตนทมขนาดใหญใหเปนแถบดวยกระแสไฟฟา และการเพมความเขมขนของ Acrylamide จะชวยแยกโปรตนทมขนาดเลกไดดขน (David, 2003)

หลกการทวไปของการแยกโปรตนโดย Gel electrophoresis คอ โปรตนทมประจจะถกบงคบใหเคลอนทในสนามไฟฟาไปยงขวไฟฟาทมประจตรงขาม การเคลอนทนจะถกตานโดยปฏกรยาระหวางสารกบรางแหเจลซงทาหนาทเปน Molecular sieve ดงนนการเคลอนทของโปรตนจงขนอยกบขนาด รปราง และปรจสทธของโปรตน การแยกโปรตนดวย Polyacrylamide Gel ม 2 ระบบคอ

1. ระบบทไมทาใหโปรตนเสยสภาพ (Non-denaturing gel หรอ Native gel electrophoresis) วธนโปรตนอยในสภาพธรรมชาต ซงสามารถนาโปรตนทแยกไดนไปตรวจสอบหา Activity ได แตไมสามารถแยกความแตกตางของรปราง ขนาด หรอประจของโปรตนได คอ โปรตนทมน าหนกโมเลกลตางกนอาจเคลอนทไดเทากนในระบบน ดงนนระบบนจงเหมาะสาหรบใชแยกหรอจาแนกโปรตนชนดตางๆออกจากกนแตไมเหมาะสาหรบใชตรวจหรอยนยนความบรสทธ หรอหาน าหนกโมเลกลของโปรตน

2. ระบบททาใหโปรตนเสยสภาพ (Denature systems) โปรตนทแยกไดไมสามารถนามาทดสอบหา Activity ได แตสามารถบอกขนาดน าหนกโมเลกลของโปรตนตางกนได ระบบนจงนามาใชตรวจสอบความบรสทธและขนาดของโปรตน รวมทงสามารถนาไปตรวจหาคณสมบตของโปรตนทางอมมโนวทยา โดยวธการทา Western blot การแยกโปรตนในระบบนไดแก วธ SDS-PAGE ซง SDS เปนสาร Detergent ทาใหโปรตนเสยสภาพ นอกจากนยงมสาร Acid-urea, Triton-acid-urea เปนตน การแยกดวยกระแสไฟฟาบน Polyacrylamide Gel ทม SDS เปนสวนประกอบ (SDS-PAGE) เปนวธทใชตรวจสอบความบรสทธของโปรตนระหวางขนตอนการทาโปรตนใหบรสทธ นอกจากนยงเปนวธทใชในการศกษาและหาน าหนกโมเลกลของโปรตนหรอหนวยยอย (Subunit) ของโปรตน เมอใชคกบเทคนคทาง Gel filtration chromatography กจะทาใหทราบวาโปรตนนนๆประกอบดวยหนวยยอยกหนวย หลกการของ SDS-PAGE คอ SDS ซงเปน Detergent ทมประจลบไปเกาะกบโปรตนอยางแนนหนามากทาใหโปรตนทงหมดมประจลบ นอกจากน SDS

26

ยงทาใหโปรตนเสยสภาพ เปลยนสภาพจากทรงกลม (Globular) ไปอยในสภาพทเหยยดตรง (ภาพท 14) โปรตนทประกอบดวยหนวยหลายหนวยเกาะกนอยกจะแยกออกเปนแตละหนวยยอย ดงนนการเคลอนทในสนามไฟฟาของโปรตนทกตวในกรณน จงเปนการเคลอนทโดยอาศยความแตกตางในน าหนกโมเลกลเพยงอยางเดยว โดยจะเปนการเคลอนทไปสขวไฟฟาบวกในอตราสวนผกผนกบคา Log ของน าหนกโมเลกล ซงหมายความวาจะสามารถหาน าหนกโมเลกลของโปรตนได จากระยะการเคลอนทของโปรตนทตองการทราบน าหนกโมเลกลกบโปรตนมาตรฐานททราบน าหนกโมเลกลแลว นอกจากนการปรากฏของแถบโปรตนเพยงแถบเดยวใน SDS-PAGE ยงเปนตวบงชถงความบรสทธของโปรตน (David, 2003)

ภาพท 14 การเขาจบของ SDS กบโปรตน ซงจะทาใหโปรตนมรปรางเปนเสนเหยยดและมประจลบ Gibthai. Gel electrophoresis of protein [Online]. Accessed 10 April 2011. Available from http://www.gibthai.com/services/technical_detail.php?ID=20

สาหรบการวเคราะหดวย SDS-PAGE นน ของผสมโปรตนจะถกทาใหเสยสภาพโดยความ

รอนทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 - 5 นาทในสารละลายทม SDS มากเกนพอและมสารประเภทไทออล (Thiol) เปนองคประกอบ เชน 2-เมอรแคปโทเอทานอล (2-mercaptoethanol) เพอทาลายพนธะไดซลไฟด (Disulphide bond) ในโปรตน ภายใตภาวะดงกลาวนโปรตนสวนใหญจะเกาะกบ SDS ในอตราสวนโดยน าหนกทคงท (1.4 กรมของ SDS ตอ Polypeptide 1 กรม) จากนนนาของผสมโปรตนแตละตวอยางใสลงบนเจล ทรงกระบอกแตละแทงหรอแตละชองบนเจลแผน และนาไปแยกดวยกระแสไฟฟา ซงทงเจลและ Buffer ทใชในการแยกม SDS เปนองคประกอบอย

27

โปรตนเทยบเคยงจะใหผลในลกษณะเดยวกบเจลชองอน ๆ โดยโปรตนจะเคลอนทไปตามน าหนกโมเลกลของตวเอง ภายหลงจากการแยกดวยกระแสไฟฟา ตาแหนงของแถบโปรตนทแยกออกจากกนจะปรากฏขนเมอยอมดวยส เชน สคแมซบล (Coomassie Blue) หรอสสารประกอบของเงน (Silver stain) การแยกดวยวธ SDS-PAGE SDS จะจบโปรตนในอตราสวนโดยน าหนกหนกทคงทตลอดทงเจล (ภาพท 15) กลาวคอ โปรตนทมขนาดใหญม SDS เกาะอยมาก ทาใหโปรตนทกชนดมคาความหนาแนนของประจตอนาหนกโปรตนเทากน การแยกโปรตนดวยวธนจงอาศยการแยกโดยขนาดเพยงอยางเดยว โดยไมมจานวนประจมาเกยวของ

ภาพท 15 การวเคราะหโปรตนดวยวธ SDS-PAGE แบบ Discontinuous gel Gibthai. Gel electrophoresis of protein [Online]. Accessed 10 April 2011. Available from http://www.gibthai.com/services/technical_detail.php?ID=20

เนองจากระยะทางทเคลอนทไปของสาย Polypeptide บนเจลมความสมพนธโดยตรงกบ

ขนาดของ Polypeptide เทานน การแยกโปรตนทสนใจบน เจล นทาไดโดยเทยบน าหนกโมเลกลระหวางโปรตนตวอยางกบโปรตนเทยบเคยง สามารถแยกโปรตนบนเจล เพอนาไปศกษาองคประกอบได อตราเรวในการเคลอนทของสารแสดงดวยสมการดงน

V = E.q/f

28

เมอ v = ความเรวในการเคลอนทของโมเลกล E = ความเขมของสนามไฟฟา q = ประจสทธบนโมเลกล f = frictional coefficient ขนอยกบน าหนกและรปรางโมเลกล การเคลอนทของโมเลกลทมประจในสนามไฟฟาแสดงโดยเทอมของ การเคลอนทใน

สนามไฟฟา (u) ซงหมายถงความเรวตอหนวยของความเขมของสนามไฟฟา ซงขนตรงกบ อตราสวนประจ/มวล u = v/E = E.q/f .E เมอ v = E.q/f u = q/f คา f จะแปรตามขนาดไมไดแปรตามรปราง

29

บทท 3

วธดาเนนการวจย

ตอนท 1 การเตรยมเอนไซม -galactosidase 1. การตรวจสอบลกษณะโคโลนเดยวและกจกรรมของเอนไซมของเชอ B1.2

1.1 การตรวจสอบลกษณะโคโลนและการปนเปอนของเชอ B1.2 1. จลนทรยทใชในการดาเนนงานวจย คอ จลนทรยสายพนธ B1.2 ทคดแยกไดจากโปงน ารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอนโดยการศกษาจลนพนธของ นายวษณ ศรลา ในป พ.ศ. 2549

2. Refresh เชอจลนทรยสายพนธ B1.2 โดยนาเชอ B1.2 ทเกบใน Eppendrof อณหภม -80 องศาเซลเซยส ปรมาตร 100 ไมโครลตร ถายลงใน Lactose broth ปรมาตร 1 มลลลตร บมขามคนท 50 องศาเซลเซยส ในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany)

3. นาเชอ B1.2 จากขอ 2 มา Streak บน Lactose agar บมขามคนตอท 50 องศาเซลเซยส ในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany) เพอใหเกดโคโลนเดยว

4. ตรวจสอบลกษณะโคโลนทไดเปนโคโลนเดยวและไมเกดการปนเปอน 1.2 การหากจกรรมของเอนไซมของเชอ B1.2 1. นาโคโลนเดยวของเชอจลนทรยสายพนธ B1.2 มาใสใน Lactose - mineral salt media

ปรมาตร 5 มลลลตร และ บมในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปน เวลา 15 ชวโมง

2. นาเชอทบมจากขอ 1 มาปรมาตร 5 มลลลตร ถายลงใน Flask ขนาด 250 มลลลตร ทมอาหาร Lactose - mineral salt media ปรมาตร 50 มลลลตร นาไปเพาะเลยงในเครองเขยาทควบคม อณหภม (C24 Incubator shake; New Brunswick Scientific, USA.) ทความเรวรอบ 150 rpm และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 ชวโมง

30

3. นาเชอทผานการบมไปหากจกรรมของเอนไซม -galactosidase ดงขอ 3.3 2. การเกบรกษาเซลล

2.1 การเกบใน Lactose agar slant 1. นาโคโลนเดยวของเชอ B1.2 ใสใน Lactose – mineral salt media ปรมาตร 5 มลลลตร

และ บมในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปน เวลา 15 ชวโมง

2. นาเชอ B1.2 จากขอ 1 มา Streak ใน Lactose agar slant และบมขามคนท 50 องศาเซลเซยส

3. นา Lactose agar slant ทบมไวมาเกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 2.2 การเกบในลกษณะของเซลลแชแขง 1. นาโคโลนเดยวของเชอ B1.2 มาใสใน Lactose-mineral salt media ปรมาตร 5 มลลลตร

และ บมในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปน เวลา 15 ชวโมง

2. นาเชอ B1.2 ทไดจากขอ 1 มา 900 ไมโครลตร ใสลงใน Eppendrof ทม 80% Glyceral ปรมาตร 100 ไมโครลตร

3. นาเชอไปเกบในต Freeze ทอณหภม -80 องศาเซลเซยส (Nuaire, Japan)

3. การเลยงเชอ B1.2 ทผลตเอนไซม -galactosidase

3.1 การเลยงจลนทรย 1. นาโคโลนเดยวของเชอ B1.2 มาใสใน Lactose-mineral salt media ปรมาตร 5 มลลลตร

และ บมในตบมควบคมอณหภม (Memmert, Germany) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปน เวลา 15 ชวโมง

31

2. นาเชอทบมไดจากขอ 1 ปรมาตร 5 มลลลตร ถายลงใน Flask ขนาด 250 มลลลตร ทมอาหาร Lactose-mineral salt media ปรมาตร 50 มลลลตร นาไปเพาะเลยงในเครองเขยาทควบคม อณหภม (C24 Incubator shake; New Brunswick Scientific, USA.) ทความเรวรอบ 150 rpm และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 ชวโมง

3. นาน าหมกทไดในขอท 2 ถายลงใน Flask ขนาด 1000 มลลลตร ทมอาหาร Lactose-mineral salt media ปรมาตร 500 มลลลตร นาไปเพาะเลยงในเครองเขยาทควบคม อณหภม (C24 Incubator shake; New Brunswick Scientific, USA.) ทความเรวรอบ 150 rpm และอณหภม 50

องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 ชวโมง 3.2 การหากจกรรมของเอนไซม -galactosidase โดยใหการทาเซลลแตก 1. ปนเหวยงนาหมกทไดจากขอ 3.1 ขอ 3 มาแยกเซลลหลงจากการเพาะเลยงเชอดวยเครอง

ปนเหวยง (Hsiangtai CN 1040; Hsiangtai Machinery, Taiwan) ทความเรวรอบ 4000 rpm เปนเวลา 10 นาท และสะสมตะกอนโดยเกบตะกอนเซลลทง Flask

2. นาตะกอนเซลลทไดจากการปนเหวยงแขวนลอยใน 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) ปรมาตร 15 มลลลตร

3. นาตะกอนเซลลทไดไปแตกเซลลดวยเครอง French Pressure Cell Press (SLM -AMINCO® Spectronic Instrument; USA) ความดน 1500 psi โดยแตกเซลลในแตละตวอยางซ า 3 ครง

4. นาสารละลายทไดจากการแตกเซลลไปปนเหวยงทความเรวรอบ 4000 rpm (Hsiangtai CN 1040; Hsiangtai Machinery, Taiwan) เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนนาสวนใสไปวดปรมาณกจกรรมของเอนไซม -galactosidase และปรมาณโปรตน ตามขอ 3.3 และ 3.4 ตามลาดบ

3.3 การหากจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Nakkharat and Haltrich, 2006) 1. นา 22 mM o-nitrophenyl-3-D-galactopyranoside (oNPG) ปรมาตร 480 ไมโครลตร ใส

ใน Eppendrof และนาไปบมทเครอง Dry bath (Lab net international, USA) บมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท 2. นาตวอยางเอนไซมปรมาตร 20 ไมโครลตร ใสลงใน 22 มลลโมลาร oNPG และนาไปบมตอท 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

32

3. หยดปฏกรยาดวย 0.4 M Na2CO3 ปรมาตร 750 ไมโครลตร 4. วดคาการดดกลนแสง ดวยเครอง UV - spectrophotometer (Spectronic®Genesys™

8.SG8 073930; USA.) ทความยาวคลน 420 นาโนเมตร กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) ของ -galactosidase คอ ปรมาณของเอนไซมททาใหเกด 1

µmole ของ oNP จาก oNPG ในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะททาการทดลอง สามารถคานวณหา Activity ไดจาก

Activity (U/ml) = OD420 x 480 + 20 x 750+500 x 1 x Dilution factor

Slope 20 500 min 3.4 การหาปรมาณโปรตน (Bradford, 1976) 1. ปเปตสารตวอยาง 0.1 มลลลตร ใสในหลอดทดลอง 2. เตม Dry reagent ปรมาตร 5 มลลลตร ทงทอณหภมหอง 5 นาท 3. วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง UV-spectrophotometer (Spectronic®Genesys™ 8.SG8

073930; USA.) ทความยาวคลน 595 นาโนเมตร 4. หาปรมาณโปรตนของสารตวอยางโดยนาคาการดดกลนแสงของสารตวอยางมาหารดวย

คาความชนของกราฟมาตรฐานโปรตน ตอนท 2 การศกษาและระบชนดสายพนธของเชอ 4. การยอมส จลนทรยสายพนธ B1.2 (สวณ สภเวชย, 2540)

การยอมสจลนทรยสายพนธ B1.2 เพอใหเหนรปรางลกษณะ การเรยงตว เพอจาแนก

แบคทเรยออกเปนกลมๆ ไดตามคณลกษณะของการตดส เพอดสวนประกอบบางอยางของเซลล 4.1 การเตรยมอปกรณและ Fix แบคทเรยลงบนสไลด 1. ทาความสะอาดสไลดลางและเชดใหสะอาด นาไปลนไฟจากตะเกยงตรงกลางสไลดเพอ

ไลความชน

33

2. เผา Loop ใหรอนแดง 3. นาจลนทรยสายพนธ B1.2 มาประมาณ 1-2 Loop มาปายบนสไลดแลวทาใหกระจายออกเปนแผน (Film) หรอ หยดลงบนสไลด 1 หยดเลกๆ จากนน เกลยเชอใหเปนฝาบาง ๆ (Smear)

4. วางสไลดไวใหแหงในอากาศ 5. นาสไลดทมเชออยนนไปผานเปลวไฟไปมา 3 ครง เพอใหเชอตดแนนบนแผนสไลด 4.2 การยอมส

4.2.1 Simple staining เปนการยอมสแบคทเรยดวยสเพยงชนดเดยว วธนเหนรปรางโดยทวไปของ

แบคทเรยวากลมหรอเปนแทง เรยงตวกนเปนอยางไร วธการยอมงาย ทาไดรวดเรวสทนยมใชกนมากคอ Methylene blue เหนเซลลแบคทเรยตดสน าเงน เพราะวาการยอมสวธนอาศยหลกการแลกเปลยน Ion ของส และ Ion ของสารประกอบทอยในแบคทเรย Ion ทแลกเปลยนกนเปน Ion ทมประจอยางเดยวกนโดย Ion ของสจะเขาไปแทนท Ion ของสารประกอบในแบคทเรย วธการทดลอง

- Fix เชอลงบนแผนสไลด - วางสไลดท Fix แลว ลงบน Stainning rack - หยดส Methylene blue ลงไปจนทวมบรเวณทละเลง (Smear) เชอทงไว 1 นาท - ลางสออกดวยนาเบาๆใหน าไหลผาน ลางจนกวานาทไหลผานออกมาไมมส - สะบดและทงไวใหแหง - สองกลองดดวย Oil immersion objective - สงเกตและบนทกผล

4.2.2 Gram staining

เปนการยอมสเพอจาแนกแบคทเรยออกเปน 2 พวกใหญ ๆ คอ Gram positive (สน าเงนอมมวง) และ Gram negative (สแดง) แบคทเรยทตดส Crystal violet จะเปนพวก Gram positive สวนพวกทตดส Safranin จะเปน Gram negative พวกทตดส Gram negative จะมปรมาณ Lipid ท Cell wall มากกวา Gram positive ปกต lipid มคณสมบตคอละลายไดใน Alcohol ในการยอมเมอราด

34

Alcohol ลงไป Alcohol จงละลาย Lipid ออก ทาใหเกดรขนาดกวางท Cell wall นน Complex ของสทอยภาย ในเซลลกหลดออกมา เมอยอมทบอกครงดวย Safranin จงทาใหแบคทเรยนนตดสแดง สวนพวกท Cell wall ม Lipid นอยกตรงขาม พวกนหลงจากราด Alcohol แลวรเปดท Cell wall มขนาดแคบ Complex ของสกไมสามารถลอดผานออกมาได ยงคงตดสเดมของ Crystal violet วธการทดลอง

- Fix เชอลงบนแผนสไลด - วางสไลดท Fix แลวลงบน Staining rack - หยด Crystal violet ลงไปจนทวมบรเวณทละเลงเชอทงไว 1 นาท - ลางสออกดวยนา แลวสะบด - หยด Gram iodine (เปน Mordant คอเปนสารทจะไปจบกบ Crystal violet ได Complex ใหญขน) ลงไป ทงไวนาน 1 นาท - ลางออกดวยนาแลวสะบด - Decolorize โดยจบปลายขางหนงของสไลดทามม 45 องศาเซลเซยส แลวคอย ๆ หยด Decolorizer ลงบรเวณทยอมจนสน าเงนจางเกอบหมด สงเกตไดจาก Alcohol ทหยดลงจากขอบสไลด - ลางออกดวยนาแลวสะบด - ยอมทบอกครงดวย Safranin นาน 15 วนาท - ลางออกดวยนาแลวสะบดรอจนสไลดแหง - นาไปสองกลองจลทรรศน ดดวย Oil immersion objective - สงเกตแลวบนทกผล

4.2.3 Endospore staining

ใชยอมด Endospore ของแบคทเรยทสราง Spore ได สงเกตการตดสของ Endospore

vegetative cell ของแบคทเรยเหนเซลลหลายรปแบบ ไดแก เซลลทเปนแทงๆตดสแดงทงเซลลเรยงตอกนเปนสาย เซลลเปนแทงสแดงภายในมสปอรคอนขางกลมสเขยวเซลลเปนแทงสแดงภายในมสปอรสขาว (สปอรยงไมแก) และสปอรคอนขางกลมตดสเขยว วธการทดลอง

- Smear และ Fix เชอลงบนสไลด

35

- หยด Malachite green ลงไปบรเวณทละเลงเชอไว - เอาสไลดไปลนไฟจนสยอมระเหยเปนไอน า เตมสลงไปอก ระวงอยาใหสแหงและระวงไมใหไฟแรงเกนไปจนสไลดแตก ลนไฟนาน 10 วนาท

- ลางนาจนนาทหยดออกมาจากสไลดไมมสเขยวแลวสะบด - หยด Safranin ลงไปทงไวนาน 30 วนาท - ลางนาสะบดเบาๆแลวทงไวใหแหง - นาไปสองกลองจลทรรศนดดวย Oil immersion objective - สงเกตแลวบนทกผล

5. การระบสายพนธจลนทรยโดยวธ 16s rDNA

การระบสายพนธจลนทรย โดยวธ 16s rDNA ทาโดยการสงตวอยางไอโซเลท B1.2 ไปยงหองปฏบตการเกบรกษาสายพนธจลนทรย หนวยปฏบตการกลางวจยไบโอเทค ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต จาแนกโดยวธ 16S rDNA sequencing (Partial length) ผลการแยกดเอนเอของแบคทเรยตวอยาง B1.2 และทาการเพมจานวนดเอนเอบรเวณปลาย 5’ ของ 16S rDNA เพอหาลาดบนวคลโอไทดของบรเวณดงกลาวนามาวเคราะหผลเพอการจาแนกชนดของตวอยาง B1.2 โดยเปรยบเทยบความเหมอนระหวางลาดบนวคลโอไทดของแบคทเรยตวอยางกบสายพนธทมรายงานในฐานขอมลของ Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) กบแบคทเรยตวอยาง B1.2 ตอนท 3 การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase 6. การแยกเอนไซมดวยโครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจ (Ion-exchange chromatography)

การทาบรสทธเอนไซมจะใชวธ Chromatography ดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (ÄKTATM FPLC with Frac-950; Amersham Pharmacia, Sweden) โดยผาน Ion-exchanger column (DEAE Sepharose fastflow, XK 26) (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden)

1. ลางสายของเครองโดยการตงคา Pump wash ไปท A&B เครองจะปม Buffer A (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5) และ Buffer B (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5 + 1 M NaCl) ท 20 มลลลตร/นาท

36

2. ตอขอตอใหแนนแลวใชอตราการไหล 1 มลลลตร/นาท ใหน าเตมขอตอ 3. ตอสาย Column และลางดวย Buffer A ท 2 มลลลตร/นาท ใหได 5 เทา ของ Bedvolume 4. ใสตวอยางเอนไซมโดยใชอตราการไหล 2 มลลลตร/นาท และ เกบตวอยาง Fraction ละ

10 มลลลตร 5. ชะดวย Buffer B โดยตงคาท Set Concentration/Gradient ปรบคา Set Concentration B

เปน 0.0% B และปรบ Set Gradient Target เปน 100% B 6. เกบ Fraction จนถงท 100% B 7. ปรบคา Set Concentration Lenght และ Set Gradient Target ใหเปน 0 จากนนปลอยให

Buffer A ลาง Column ใชอตราการไหล 2 มลลลตร/นาท จนครบ 5 เทา Bedvolume 8. ลางสายของเครองและคอลมนดวย 20% เอธานอล โดย Set Gradient Target เปน 50% B 9. นาสารทไดในแตละ Fraction ทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกนนาไปหากจกรรมของ

เอนไซม และหาปรมาณโปรตน ดงขอ 3.3 และ 3.4 ตามลาดบ 10. เพมความเขมขนของเอนไซมดวยหลอด Amicon (Millipore, USE) ทมขนาดรพรน 10

kDa 10.1 เตมน ากลนลงในหลอด Amicon ดานบน ปดฝาหลอดแลวนาไปปนเหวยงท

ความเรว 4000 rpm 10 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ทาทงหมด 2 ครง 10.2 เทน ากลนทงดานบนและดานลางของหลอด Amicon ออก แลวใสตวอยาง

ของเอนไซมลงดานบนของหลอด Amicon นาไปปนเหวยงทความเรว 4000 rpm เปนเวลา 10 นาท เทตวอยางเอนไซมทอยดานบนของหลอดเกบไว ทาการวเคราะหหากจกรรมของเอนไซม

7. การแยกเอนไซมดวย Affinity chromatography

การทาบรสทธเอนไซมดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (AKTA TM

FPLC with Frac-950; Amersham Pharmacia, Sweden) ผานคอลมนทบรรจ (Agarose p-aminobenzyl-1-thio- -d-galactopyranoside, XK 26 x 3.5 cm)

1. ลางสายของเครองโดยการตงคา Pump wash ไปท A&B เครองจะปม Buffer A (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5) และ Buffer B (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5 + 1 M NaCl) ท 1 มลลลตร/นาท

2. ตอขอตอใหแนนแลวใชอตราการไหล 0.5 มลลลตร/นาท ใหน าเตมขอตอ

37

3. ตอสาย Column และลาง Column ดวย Buffer A ท 0.5 มลลลตร/นาท ใหได 5 เทา ของBedvolume

4. ใสตวอยางเอนไซมโดยใชอตราการไหล 0.5 มลลลตร/นาท เกบตวอยาง Fraction ละ 5 มลลลตร

5. ทาการชะดวย Buffer B โดยตงคาท Set Concentration/Gradient ปรบคา Set Concentration B เปน 0.0% B และปรบ Set Gradient Target เปน 100% B

6. เกบ Fraction จนถงท 100% B 7. ปรบคา Set Concentration Lenght และ Set Gradient Target ใหเปน 0 จากนนปลอยให

Buffer A ลาง Column ใชอตราการไหล 0.5 มลลลตร/นาท จนครบ 5 เทา Bedvolume 8. ลางสายของเครองและคอลมนดวย 20% เอธานอล โดย Set Gradient Target เปน 50% B 9. นาสารทไดในแตละ Fraction ทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกนนาไปหากจกรรมของ

เอนไซม และหาปรมาณโปรตน ดงขอ 3.3 และ 3.4 ตามลาดบ 10. เพมความเขมขนของเอนไซมดวยหลอด Amicon (Millipore, USE) ทมขนาดรพรน 10

kDa 10.1 เตมน ากลนลงในหลอด Amicon ดานบน ปดฝาหลอดแลวนาไปปนเหวยงท

ความเรว 4000 rpm 10 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ทาทงหมด 2 ครง 10.2 เทน ากลนทงดานบนและดานลางของหลอด Amicon ออก แลวใสตวอยาง

ของ เอนไซมลงดานบนของหลอด Amicon นาไปปนเหวยงทความเรว 4000 rpm เปนเวลา 10 นาท เทตวอยางเอนไซมทอยดานบนของหลอดเกบไววเคราะหหากจกรรมของเอนไซม ตอนท 4 การศกษาคณสมบตของเอนไซม (Characterization)

8. อณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมบรสทธ -galactosidase

1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาบมทอณหภม 40-80 องศาเซลเซยส ในเครอง

Dry bath (Lab net international, USA) บมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส 2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3 9. อณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมบรสทธ -galactosidase

38

1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาบมทอณหภม 40-80 องศาเซลเซยส ในเครอง Dry bath (Lab net international, USA) บมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส และเกบผลการทดลองทก 1 ชวโมง จนครบ 12 ชวโมง

2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมทเหลออยเทยบกบกจกรรมของเอนไซมเรมตน

10. pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมบรสทธ -galactosidase

1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาทดสอบในชวง pH 3-10 2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3

11. pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซมบรสทธ -galactosidase

1. เตรยมบพเฟอรทอยในชวง pH 3-10 ไดแก - 50 mM Citrate buffer (pH 3, pH 4, pH 5) - 50 mM Sodium phosphate buffer (pH 6, pH 6.5, pH 7) - 50 mM Tris buffer (pH 8) - 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9, pH 10)

2. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาทดสอบในชวง pH 3-10 ในเครอง Dry bath (Lab net international, USA) บมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส และเกบผลการทดลองทก 1 ชวโมง จนครบ 12 ชวโมง 3. นาไปหากจกรรมของเอนไซมทเหลออยเทยบกบกจกรรมของเอนไซมเรมตน 12. การหาคาจลนศาสตรของเอนไซมบรสทธ -galactosidase

1. หาคาจลศาสตรของเอนไซมโดยใชสบสเตรตเปน oNPG ทความเขมขนในชวง 0-30 mM

2. หากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3.3 ทใชความเขมขน oNPG ตางๆ ดงกลาว 3. เขยนกราฟระหวางปรมาณ oNP ทเกดขนกบความเขมขนของ oNPG ทใชทาปฏกรยา

ตามทฤษฎของ Michalis-Menten เพอหาคา Km และ Vmax

39

4. เขยนกราฟระหวางสวนกลบของปรมาณ oNP ทเกดขนกบ สวนกลบของความเขมขนของ oNPG ทใชทาปฏกรยา ตามทฤษฎของ Lineweaver-Burk เพอหาคา Km และ Vmax

13. ชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมบรสทธ -galactosidase 1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาทดสอบกบไอออนชนดตางๆ คอ NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O, CaCl2.2H2O, CoCl2.6H2O, ZnSO4.7H2O และ CuCl2.2H2O โดยศกษาทความเขมขน 1, 10 และ 100 มลลโมลาร

2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3

14. ชนดของนาตาลทมผลตอกจกรรมของเอนไซมบรสทธ -galactosidase 1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาทดสอบกบน าตาลชนดตางๆ คอ Galactose, Glucose, Lactose, Xylital และ Xylose โดยศกษาทความเขมขน 1, 10 และ 100 มลลโมลาร

2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3 15. ชนดของรเอเจนตทมผลตอกจกรรมของเอนไซมบรสทธ -galactosidase 1. นาเอนไซมบรสทธ -galactosidase มาทดสอบกบรเอเจนตชนดตางๆคอ DTT, EDTA, Urea และ 2- mercaptoethanol โดยศกษาทความเขมขน 0.1, 1 และ 10 มลลโมลาร

2. นาไปหากจกรรมของเอนไซมบรสทธ ดงขอท 3.3 16. การหานาหนกโมเลกลของเอนไซม

16.1 Native-PAGE 1. ประกอบแผนเจลโดยเจลชนบนเปน Polyacrylamide gel 5% และเจลชนลางเปน

Polyacrylamide gel 12% 2. แยกโปรตนแผนเจลดวยสารละลายบฟเฟอร Tris-glycine สาหรบ Native-PAGE

40

3. โหลด Marker ปรมาตร 2 ไมโครลตร และตวอยางเอนไซมปรมาตร 8 ไมโครลตร ลงในแผนเจลทเตรยมไว โดยแบงเปนสองสวน สวนแรกคอ ผสมสสงเคราะหสาหรบผสมโปรตน ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบตวอยางเอนไซมปรมาตร 25 ไมโครลตร เพอใชสาหรบการยอมสดวย Coomassie brilliant blue และสวนทสองคอ ผสมสสาหรบ Native-PAGE 4xgel loading dye No bromophenol blue ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบตวอยางเอนไซมปรมาตร 25 ไมโครลตร เพอใชยอมกจกรรมของเอนไซม

4. ตดตงอปกรณในการแยกวเคราะหดวยกระแสไฟฟาโดยตงกระแสไฟฟา 25 มลลแอมป 3 ชวโมง หรอจนสของโปรตนบอกขนาดวงจนสดแผนเจล

5. สาหรบเจลทยอมสดวย Coomassie brilliant blue จะนาเจลทไดมาแชในสารละลาย Stain ระยะเวลา 1 ชวโมง แชในสารละลาย Destain I ระยะเวลา 1 ชวโมง และแชในสารละลาย Destain II ระยะเวลา 2 ชวโมง หลงจากนนนามาแชในนากลน

6. สาหรบเจลยอมกจกรรมของเอนไซมจะสองดรงส UV โดยนากระดาษกรองมาหยดสาร 4-methylumbelliferyl -D-galactosidase ความเขมขน 3.5 มลลกรม/มลลลตร จนทวมแลวนามาประกบดานบนและลางของเจล ตอมานาไปวางบนเครองควบคมอณหภม 50 องศาเซลเซยส, เวลา 30 นาทหลงจากนนมาหยดตวหยดปฏกรยา 1 M Carbonate-bicarbonate buffer (pH 10) และนาไปสองดรงส UV ทนท (Nguyen et al., 2006)

16.2 SDS-PAGE 1. ประกอบแผนเจลโดยเจลชนบนเปน Polyacrylamide gel 5% และเจลชนลางเปน

Polyacrylamide gel 12% 2. แยกโปรตนแผนเจลดวยสารละลายบฟเฟอร Tris-glycine สาหรบ SDS-PAGE 3. โหลด Marker ปรมาตร 2 ไมโครลตร และตวอยางเอนไซมปรมาตร 8 ไมโครลตร ลงใน

แผนเจลทเตรยมไว โดยแบงเปนสองสวน สวนแรกคอ ผสมสสงเคราะหสาหรบผสมโปรตน ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบตวอยางเอนไซมปรมาตร 25 ไมโครลตร เพอใชสาหรบการยอมสดวย Coomassie brilliant blue และสวนทสองคอ ผสมส สาหรบ SDS-PAGE 4xgel loading dye No bromophenol blue ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบตวอยางเอนไซมปรมาตร 25 ไมโครลตร เพอใชยอมกจกรรมของเอนไซม

4. ตดตงอปกรณในการแยกวเคราะหดวยกระแสไฟฟาโดยตงกระแสไฟฟา 25มลลแอมป 3 ชวโมง หรอจนสของโปรตนบอกขนาดวงจนสดแผนเจล

41

5. สาหรบเจลทยอมสดวย Coomassie brilliant blue จะนาเจลทไดมาแชในสารละลาย Stain ระยะเวลา 1 ชวโมง, แชในสารละลาย Destain I ระยะเวลา 1 ชวโมง และแชในสารละลาย Destain II ระยะเวลา 2 ชวโมง หลงจากนนนามาแชในนากลน

6. สาหรบเจลยอมกจกรรมของเอนไซมจะสองดรงส UV โดยนากระดาษกรองมาหยดสาร 4-methylumbelliferyl -D-galactosidase ความเขมขน 3.5 มลลกรม/มลลลตร จนทวมแลวนามาประกบดานบนและลางของเจล ตอมานาไปวางบนเครองควบคมอณหภม 50 องศาเซลเซยส, เวลา 30 นาทหลงจากนนมาหยดตวหยดปฏกรยา 1M Carbonate-bicarbonate buffer (pH 10) และนาไปสองดรงส UV ทนท (Nguyen et al., 2006)

16.3 เจลโครมาโทกราฟ (Gel chromatography) การหาน าหนกโมเลกลของเอนไซมดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography

(AKTA TM FPLC with Frac-950; Amersham Pharmacia, Sweden) โดยผาน Gel filtration ทคอลมภบรรจ Biogel P-100 (XK 26 x 10 cm)

1. ลางสายของเครองโดยการตงคา Pump wash ไปท A&B เครองจะปม Buffer A (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5) และ Buffer B (50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5 + 1 M NaCl) ท 2 มลลลตร /นาท

2. ตอขอตอใหแนนแลวใชอตราการไหล 2 มลลลตร/นาท ใหน าเตมขอตอ 3. ตอสาย Column และลาง Column ดวย Buffer A ท 2 มลลลตร/นาท ใหได 5 เทา ของ

Bedvolume 4. ใสตวอยางสารมาตรฐานโปรตนความเขมขน 10 มลลกรม/มลลลตร ททราบน าหนก

โมเลกลคอ (Lysozyme, Trypsin, Protenase, Lipase และ Amyloglucosidase) โดยใชอตราการไหล 0.1 มลลลตร/นาทและเกบตวอยาง Fraction ละ 5 มลลลตรจนกระทง Peak ของกราฟตกลงจนสด

5. ลาง Column ดวยบฟเฟอร A โดยตงคาอตราการไหล 1 มลลลตร/นาท Gradient target = 0% และ Gradient length = 0 นาท

6. นาตวอยางเอนไซมมาโหลดลงคอลมนทาเหมอนกบสารมาตรฐาน 7. นาสารมาตรฐานทไดมาสรางกราฟความสมพนธระหวางมวลโมเลกลกบเวลาทโปรตน

ถกชะออกมาเพอหานาหนกโมเลกลของ -galactosidase

42

บทท 4

ผลการทดลอง

ตอนท 1 การเตรยมเอนไซม -galactosidase จาก Stock เชอ

ภาพท 16 ไอโซเลทจลนทรยทนอณหภมสงสายพนธ ทคดแยกไดจากจากการแยกเชอจลนทรยจากโปงนารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอน

1. การเตรยมเอนไซม -galactosidase จาก Stock เชอ

การศกษาจลนทรยทนอณหภมสงสายพนธ ทคดแยกไดจากจากการแยกเชอจลนทรยจากโปงน ารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอน ทเกบไวเปน เชอ ทอณหภม องศาเซลเซยส พบวาสามารถเจรญไดดในอาหารทมแลคโตสเปนแหลงคารบอน และ

มลกษณะโคโลน เลก นน ขาวขน ขอบเรยบ ภาพท 16 ซงเปนลกษณะเดยวกบงานวจยของ วษณ ศรลา ในป พ ศ จากนน นาเชอทเจรญมาแตกเซลลเพอนาเอนไซมมาทดสอบกจกรรมพบวาไอโซเลท สามารถผลตเอนไซม - หยาบไดและมคากจกรรมของเอนไซมทวดไดเทากบ หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา ชวโมง สามารถนามาทาบรสทธและศกษาลกษณะสมบตตางๆ ของเอนไซมบรสทธตอไปได

43

ตอนท ผลการศกษาและระบชนดสายพนธของเชอ

ผลการศกษาลกษณะของจลนทรยโดยทางจลชววทยา

การยอมสแบบแกรม

ภาพท 17 สและลกษณะของเชอจลนทรย ทยอมตดสมวง

การศกษาลกษณะจลนทรยของเชอจลนทรย โดยทางจลชววทยาดวยวธการยอมสแบบแกรมเปนการยอมสเพอจาแนกแบคทเรยออกเปน พวกใหญ ๆ คอ แบคทเรยทตดส

จะเปนพวก สน าเงนอมมวง และ แบคทเรยทตดส จะเปนสแดง พวกทตดส จะมปรมาณ ท มากกวา

ปกต มคณสมบตคอละลายไดใน ในการยอมเมอหยด ลงไปจงละลาย ออก ทาใหเกดรขนาดกวางท ทาให ของสทอยภายในเซลลกหลดออกมา เมอยอมทบดวย จงทาใหแบคทเรยนนตดสแดง สวนแบคทเรยท ม

นอยหลงจากหยด แลวรเปดท มขนาดแคบ ของสกไมสามารถลอดผานออกมาได ยงคงตดสเดมของ สวณ จากภาพท 17 แสดงวาแบคทเรย เปนแบคทเรยแกรมบวก เนองจากตดสนาเงนอมมวงและมรปรางเปนแทง

44

การยอมสเอนโดสปอร

ภาพท 18 เอนโดสปอรของเชอจลนทรย ทบรเวณปลายทงสองดาน

การศกษาลกษณะจลนทรยของเชอจลนทรย ดวยวธการยอมสเอนโดสปอร โดยทางจลชววทยาเพอสงเกตการตดสของ ของแบคทเรยเหนเซลลหลายรปแบบ ไดแก เซลลทเปนแทงๆตดสแดงทงเซลลเรยงตอกนเปนสาย เซลลเปนแทงสแดงภายในมสปอรคอนขางกลมสเขยว เซลลเปนแทงสแดงภายในมสปอรสขาว (สปอรยงไมแก) และสปอรคอนขางกลมตดสเขยว สวณ จากการศกษาพบวาเชอจลนทรย ทผานการยอมสเอนโดสปอรมการสรางสปอรไดภายในเซลลโดยจะพบการตดสเขยวของ ทสปอรทวไปภายในเซลลและสปอรทออกมาอยรอบนอกเซลลดงแสดงในภาพท 18

การระบสายพนธจลนทรยโดยวธ

รายงานการจาแนกชนดแบคทเรย

การรายงานการจาแนกชนดแบคทเรย ทาโดยการสงตวอยางไอโซเลท 1.2 ไปยงหองปฏบตการเกบรกษาสายพนธจลนทรย หนวยปฏบตการกลางวจยไบโอเทค ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต จาแนกโดยวธ 16

ผลการแยกดเอนเอของแบคทเรยตวอยาง 1.2 และเพมจานวนดเอนเอ

45

บรเวณปลาย 5 ของ 16 เพอหาลาดบนวคลโอไทดของบรเวณดงกลาว ภาพท 19 และนามาวเคราะหผลเพอการจาแนกชนดของตวอยางโดยการเปรยบเทยบความเหมอนระหวางลาดบนวคลโอไทด ของแบคท เ ร ยตวอย างกบสายพน ธ ท ม ร า ยง านในฐานข อม ลของ

กบแบคทเรยตวอยาง 1.2 แสดงในภาพท 20 และ พบวามความใกลเคยงกบ และ มากทสด ซงสอดคลองกบการศกษาลาดบความสมพนธทางววฒนาการและการเปรยบเทยบความเหมอนของลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5 ของ 16 ซงพบวาแบคทเรยตวอยางนมลาดบความสมพนธทางววฒนาการอยในกลมเดยวกบ และ

แตมววฒนาการทแตกตางออกไป โดยเมอวเคราะหความเหมอนกนของลาดบนวคลโอไทด พบวาแบคทเรยตวอยางมลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5 ของ 16

เหมอนกบ ของและ เทากบ 97.3% 98.1% และ 98.0% แสดงในตารางท ดงนนจงไมสามารถจาแนกสปชสของแบคทเรยสายพนธนไดแนชด โดยแบคทเรยตวอยางอาจเปนแบคทเรยสายพนธใหมทใกลเคยงกบ และ

หากตองการผลการจาแนกในระดบสปชส ทแนชดจะตองทาการศกษาลกษณะอนๆ ประกอบดวย เชน การเปรยบเทยบความเหมอนกนของดเอนเอทงหมดเทยบกบ หรอศกษาลกษณะอนๆ เพมเตม

>BTGAGTTTGATTCCCCTGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACGAATCAAAAGCTTGCTTTTGATTCGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGTAGACGGGGATAACACCGAGAAATCGGTGCTAATACCGGATAACACGAATGTCGCATGACGTTTCGTTGAAAGCGGCGCAAGCTGTCGCTACAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTAGCGCAGTAACTGGCGTTACTGTGACGGTACCTAACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATT

ภาพท 19 ลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5 ของ 16 ของแบคทเรยตวอยาง 1.2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 B.12 GTGCCTAATA CATGCAAGTC GAGCGGACGA ATCAAAAGCT TGCTTTT-GA An. Flavothermus GTGCCTAATA CATGCAAGTC GAGCGGACGA ATCGAAAGCT TGCTTTT-GA An. kestanbolinensis GTGCCTAATA CACGCAAGTC GAGCGGACGA ATTGAAAGCT TGCTTTT-GAAn. pushchinoensis GTGCCTAATA CATGCAAGTC GAGCGGACGA TTCGAAAGCT TGCTTTTCGA Conserve ********** ** ******* ********** * ****** ******* **

46

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 55 65 75 85 95 B.12 TTCGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGCAACCT GCCCTGTAGA An. flavothermus TTCGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGCAACCT GCCCTGTAGA An. kestanbolinensis TTCGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGCAACCT GCCCTGTAGAAn. pushchinoensis ATCGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGCAACCT GCCCTGTAGA Conserve ********* ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 105 115 125 135 145 B.12 CGGGGATAAC ACCGAGAAAT CGGTGCTAAT ACCGGATAAC ACGAA-TGTC An. flavothermus CGGGGATAAC ACCGAGAAAT CGGTGCTAAT ACCGGATAAC ACGAAATGTC An. kestanbolinensis CGGGGATAAC ACCGAGAAAT CGGTGCTAAT ACCGGATAAC ACGAAATGCCAn. pushchinoensis CGGGGATAAC ACCGAGAAAT CGGTGCTAAT ACCGGATAAC ACGAAATGTC Conserve ********** ********** ********** ********** ***** ** *

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 155 165 175 185 195 B.12 GCATGACGTT TCGTTGAAAG -CGGCGCAAG CTGTCGCTAC AGGATGGGCC An. flavothermus GCATGACGTT TCGTTGAAAG ACGGCGCAAG CTGTCGCTAC AGGATGGGCC An. kestanbolinensis GCATGACGTT TCGTTGAAAG ACGGCGCAAG CTGTCGCTAC AGGATGGGCCAn. pushchinoensis GCATGACGTT TCGTTGAAAG GCGGCGCAAG CTGCCGCTAC AGGATGGGCC Conserve ********** ********** ********* *** ****** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 205 215 225 235 245 B.12 CGCGGCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGATG An. flavothermus CGCGGCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGATG An. kestanbolinensis CGCGGCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGATGAn. pushchinoensis CGCGGCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGATG Conserve ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 255 265 275 285 295 B.12 CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC An. flavothermus CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC An. kestanbolinensis CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCCAn. pushchinoensis CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC Conserve ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 305 315 325 335 345 B.12 CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG An. flavothermus CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG An. kestanbolinensis CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAGAn. pushchinoensis CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG Conserve ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 355 365 375 385 395

B.12 TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGCGAAGA AGGCCTTCGG GTCGTAAAGC An. flavothermus TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGCGAAGA AGGCCTTCGG GTCGTGAAGC An. kestanbolinensis TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGCGAAGA AG-CCTTCGG GTCGTAAAGCAn. pushchinoensis TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGCGAAGA AGGCCTTCGG GTCGTAAAGC Conserve ********** ********** ********** ** ******* ***** ****

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 405 415 425 435 445 B.12 TCTGTTGTTA GGGAAGAACA AGTAGCGCAG TAACTGGCGT TACTGTGACG An. flavothermus TCTGTTGTTA GGGAAGAACA AGTAGCGCAG TAGCTGGCGT TACCTTGACG An. kestanbolinensis TCTGTTGTTA GGGAAGAACA AGTAACGCAG TAACTGGCGT TACCGTGACGAn. pushchinoensis TCTGTTGTTA GGGAAGAACA AGTAACGTAG TAACTGGCGT TACTATGACG Conserve ********** ********** **** ** ** ** ******* *** *****

47

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 455 465 475 485 495 B.12 GTACCTAACG AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT An. flavothermus GTACCTAACG AGAAAGCCAC GGCTAAATAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT An. kestanbolinensis GTACCTAACG AGAAAGCCAC GGTTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAATAn. pushchinoensis GTACCTAACG AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT Conserve ********** ********** ** *** *** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 505 515 525 535 545 B.12 ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG An. flavothermus ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG An. kestanbolinensis ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCCCAGAn. pushchinoensis ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG Conserve ********** ********** ********** ********** ****** *** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 555 565 575 585 595 B.12 GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCA CGGCTCAACC GTGGAGGGTC An. flavothermus GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCA CGGCTCAAC- GTGGAGGGTC An. kestanbolinensis GCGGTTC-TT AAGTCTGATG TGAAAGCC-A CGGTTCAACC GTGGAGGGTCAn. pushchinoensis GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCA CGGCTCAACC GTGGAGGGTC Conserve ******* ** ********** ******** * *** ***** **********

... B.12 ATT An. flavothermus ATT An. kestanbolinensis ATTAn. pushchinoensis ATT Conserve ***

ภาพท 20 ลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5’ ของ 16S rDNA ของแบคทเรยตวอยาง B1.2 เปรยบเทยบกบ Anoxybacillus sp. ตารางท 7 ความเหมอนของลาดบนวคลโอไทดบรเวณปลาย 5’ ของ 16S rDNA ในแบคทเรยตว อยาง B1.2 เปรยบเทยบกบ Anoxybacillus sp.

Seq-> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 B1.2 100 93 96.8 95.3 96.8 98.1 97.1 92.3 97.3 98 91.3 86.5 2 An. Amylolyticus 93 100 93.3 96 93.8 92.5 94 96.1 92.3 92.2 96.1 89.7 3 An. ayderensis 96.8 93.3 100 95.1 98 97.1 98.5 92.2 95.6 96.6 91.7 87.1 4 An. Contaminans 95.3 96 95.1 100 95.6 95.1 95.8 96.3 94.6 94.8 93.2 87.4 5 An. gonensis 96.8 93.8 98 95.6 100 96.5 98.8 92.7 95.8 96.8 92 87.1 6 An. flavothermus 98.1 92.5 97.1 95.1 96.5 100 96.6 92 97.5 97.8 90.8 86.4 7 An. Kamchatkensis 97.1 94 98.5 95.8 98.8 96.6 100 92.8 96 97 92.2 87 8 An. voinovskiensis 92.3 96.1 92.2 96.3 92.7 92 92.8 100 91.6 91.7 93.3 87.5 9 An. kestanbolinensis 97.3 92.3 95.6 94.6 95.8 97.5 96 91.6 100 97.1 90.5 85.9 10 An. pushchinoensis 98 92.2 96.6 94.8 96.8 97.8 97 91.7 97.1 100 90.8 86.9 11 An. rupiensis 91.3 96.1 91.7 93.2 92 90.8 92.2 93.3 90.5 90.8 100 91.3 12 Bacillus subtilis 86.5 89.7 87.1 87.4 87.1 86.4 87 87.5 85.9 86.9 91.3 100

48

ภาพท 21 ภาพความสมพนธทางววฒนาการของแบคทเรยสายพนธ 1.2 เปรยบเทยบกบแบคทเรยในสกล

ตอนท ผลจากการทาบรสทธเอนไซม การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยทนอณหภมสง B1.2 ทาโดยนา

เอนไซมหยาบ B1.2 ทผานการทาใหเซลลแตกมาผานขนตอนการทาใหบรสทธ โดยการนาเอนไซมผาน คอลมน DEDA sepharose ทาการชะคอลมนโดยใชสารละลายบฟเฟอรพบวาโปรตนทงหมดในสารละลายเอนไซมจะออกมาจากคอลมนในชวงหลอดท 3-80 เมอชะไล (Elute) เอนไซมโดยการเพมความเขมขนของเกลอแบบเสนตรง พบกจกรรมของเอนไซม -galactosidase ทความเขมขนของเกลอ 0.330 โมลาร - 0.450 โมลาร ในชวงหลอดท 53-65 และไมพบกจกรรมของเอนไซม -galactosidase ในสวนอน แสดงวาการผานคอลมน DEDA sepharose เอนไซมสามารถจบไดดกบตวแลกเปลยนประจ นาเอนไซมทไดไปวดคากจกรรมเอนไซมทคาการดดกลนแสง 420 นาโนเมตร วดคาโปรตนท 280 นาโนเมตร และพลอตกราฟความสมพนธกบ Fraction ตางๆ แสดงใน ภาพท 22 นาหลอดทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกนและเพมความเขมขนดวย Amicon Ultra-4 ขนาด 10 KDa จากนนนาเอนไซมมาผาน คอลมน Affinity ทาการชะคอลมนโดยใชสารละลาย

49

บฟเฟอรพบวาโปรตนในสารละลายเอนไซมจะออกมาจากคอลมนในชวงหลอดท 5 - 60 เมอชะไล (Elute) เอนไซมโดยการเพมความเขมขนของเกลอแบบเสนตรง พบกจกรรมของเอนไซม -galactosidase ทความเขมขนของเกลอ 0.100 โมลาร - 0.170 โมลาร ในชวงหลอดท 24-30 แสดงวาคอลมนมความจาเพาะในการจบกบเอนไซมจากนนนาหลอดทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกนและนาเอนไซมบรสทธทไดไปเพมความเขมขนดวย Amicon Ultra-4 ขนาด 10 KDa วดคากจกรรมเอนไซมทคาการดดกลนแสง 420 นาโนเมตร วดคาโปรตนท 280 นาโนเมตร และพลอตกราฟความสมพนธกบ Fraction ตางๆ แสดงใน ภาพท 23

ผลการทาเอนไซม -galactosidase ใหบรสทธ แสดงในตารางท 8 พบวาการทาบรสทธเอนไซมดวยวธ DEAE chromatography และ Affinity chromatography และถกทาใหเขมขนขน โดยวธ Ultrafiltration จะทาใหคากจกรรมของเอนไซมเพมขนและปรมาณโปรตนลดลงเมอเทยบกบ Crude extract คา Purification (Fold) มคาเพมขนเปน 2.24 และ 3.79 ตามลาดบ คา Recovery (%) มคา 94.1 และ 86.4 % ตามลาดบ จากการทดลองจะเหนวาเอนไซม -galactosidase หลงจากผานการทาบรสทธ มคา Specific activity มากกวากอนการทาบรสทธ แสดงใหเหนวาประสทธภาพของคอลมนแบบแลกเปลยนไอออนชนด DEAE Sepharose และคอลมนแบบ Affinity มประสทธภาพในการจบโปรตนในคอลมนไดด คา Specific activity ทไดจงมคาสงขน และปรมาณโปรตนมคาลดลง แตถอไดวาเปนระดบความบรสทธทเพมขนในระดบตา เมอเทยบกบรายงานการทาบรสทธเอนไซม -galactosidase จากแบคทเรยทนรอน Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmannii ทมระดบความบรสทธของเอนไซมเมอผาน DEAE cellulose chromatography และ Affinity column เพมเปน 3.95 และ 11.99 เทา ตามลาดบ (Gul-Guvene et.al., 2006) การศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Lactobacillus reuteri 2 สายพนธ คอ L103 และ L461 มระดบความบรสทธของเอนไซมเมอผาน Affinity column เพมเปน 16.5 เทา และ 54 เทา ตามลาดบ (Nguyen et al., 2006) การศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Talaromyces thermophilus CBS 236.58 มระดบความบรสทธของเอนไซมเมอผาน DEAE cellulose chromatography และ Affinity column เพมเปน 3.1 และ 10.2 เทา ตามลาดบ (Nakkharat and Haltrich, 2006) การศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Thermotoga maritime มระดบความบรสทธของเอนไซมเมอผาน DEAE cellulose chromatography และ Affinity column เพมเปน 3.5 และ 10.4 เทา ตามลาดบ (Li et al., 2009)สงเกตไดวาเอนไซม -galactosidase จาก จลนทรยทนอณหภมสง B1.2 เปรยบเทยบกบงานวจยอนเมอผาน DEAE cellulose chromatography ใหผลการทาบรสทธทดแตเมอผาน Affinity column จบกบ Affinity column ไดไมแนนมากจงถกชะออกมา ท NaCl ความเขมขนตา (Gul-Guven et al., 2006)

50

ภาพท 22 ความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร 420 นาโนเมตร และ ความเขมขนของเกลอโซเดยมคลอไรดกบ Fraction number หลงผาน DEAE sepharose column โดย ( ) Absorbance 280 nm; ( ) Absorbance 420 nm ; ( ) ความเขมขนเกลอโซเดยมคลอไรด

ภาพท 23 ความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร 420 นาโนเมตร และ ความเขมขนของเกลอโซเดยมคลอไรดกบ Fraction number หลงผาน Affinity column โดย ( ) Absorbance 280 nm; ( ) Absorbance 420 nm ; ( ) ความเขมขนเกลอโซเดยมคลอไรด

00.20.40.60.81

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66

Absor

bance

280,42

0nm

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56

[NaCl]

(M)

Absor

bance

280,42

0nm

Fraction number

51

ตารางท 8 การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase จาก Thermophile B1.2

Purification steps

Total Activity

Toatal Protein

Specific Activity Purification Recovery

(U) (mg) (U/mg) (Fold) (%) Crude extract 25.8 89.6 0.29 1 100

DEAE + Ultrafiltration 24.3 37.1 0.65 2.24 94.1 Affinity + Ultrafiltration 22.3 20.3 1.1 3.79 86.4

ตอนท 4 ผลการศกษาลกษณะสมบตเอนไซมบรสทธ 4. การศกษาคาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidaseบรสทธ

การศกษากจกรรมของเอนไซม -galactosidase ทอณหภมตางๆ คอ 40, 45, 50, 55, 60, 65,

70, 75 และ 80 องศาเซลเซยสโดยใช oNPG ละลายในฟอสเฟตบฟเฟอร 50 มลลโมลาร พเอช 6.5 เปนสบสเตรท กจกรรมของเอนไซมจะมคาสงในชวงอณหภม 50 – 60 องศาเซลเซยส ทอณหภม 60

องศาเซลเซยส กจกรรมของเอนไซมจะมคาสงทสดเทากบ 2.17 U/ml เมออณหภมสงกวา 65 องศาเซลเซยส กจกรรมของเอนไซมลดลงอยางรวดเรว ดงแสดงในภาพท 24 ทงนอาจเปนเพราะอณหภมทเพมขนนนทาใหโครงสรางของโปรตนถกทาลาย ดงนนอณหภมทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม -galactosidase จาก B1.2 เทากบ อณหภม 60 องศาเซลเซยส ซงมคาอณหภมทใกลเคยงกบเอนไซม -galactosidase จาก Rhizomucor sp. มอณหภมเหมาะสมเทากบ 60 องศาเซลเซยส (Shaikh et al., 1999), Cryptococus laurentii OKN-4 มอณหภมเหมาะสมเทากบ 60 องศาเซลเซยส (Ohtsuka et al., 1990), Streptococcus thermophilus มอณหภมเหมาะสมเทากบ 55 องศาเซลเซยส (Lin et al., 1999) และ Fusarium moniliforme มอณหภมเหมาะสมเทากบ 50-60 องศาเซลเซยส (Macris and Markakis, 1981)

52

ภาพท 24 ผลของอณหภมทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยทนอณหภมสง B1.2 5. การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธ

การศกษาผลของอณหภมทมตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธ ทาโดยการบมเอนไซมทอณหภมตางๆคอ 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 และ 80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง ทอณหภม 40, 45, 50, 55 และ 60 องศาเซลเซยส เอนไซม -galactosidase มความเสถยรด (ภาพท 25) กจกรรมของเอนไซมจะคอยๆ ลดลงอยางชาๆ และยงมกจกรรมของเอนไซมมากกวารอยละ 50 ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส กจกรรมของเอนไซมเรมลดลงอยางรวดเรวกจกรรมของเอนไซมนอยกวารอยละ 40 แตสาหรบอณหภม 70, 75 และ 80 องศาเซลเซยส นน กจกรรมของเอนไซมลดลงอยางรวดเรวตงแตชวโมงท 1 ของการบมเอนไซม ผลการทดสอบพบวาเอนไซมมความเสถยรในชวง 40-60 องศาเซลเซยส ในการศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Thermus sp. 4-1A มความเสถยรท 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 36 วน และท 75 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 ชวโมง (Cowan et al., 1984) ในการศกษาการแยกและคณลกษณะสมบตของเอนไซม -galactosidase ทงสามชนดจาก Bacillus circulans พบวา เอนไซม -galactosidase ชนดท I และชนดท III จะมความไวตออณหภมมาก โดยกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จะลดลงทอณหภมสงกวา 35 องศาเซลเซยส ในขณะทเอนไซม -galactosidase ชนดท II จะเสถยรทอณหภม

30 40 50 60 70 80 90

53

ระหวาง 25 ถง 50องศาเซลเซยส (Vetere and Paoletti , 1998) การศกษา Cryptococus laurentii OKN-4 จะเสถยรทอณหภมตากวา 57.5๐C เปนเวลา 10 นาท (Ohtsuka et al., 1990), Thermus sp. T2 จะเสถยรทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมงและ 80องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง (Ladero et al., 2002), Rhizomucor sp. จะเสถยรทอณหภม 70 องศาเซลเซยส (Shaikh et al., 1999) นนคอเอนไซม -galactosidase ทไดจากจลนทรยตางๆ ชนดกนมความเสถยรทอณหภมแตกตางกนออกไป

ภาพท 25 อทธพลของอณหภมตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธโดย ( ) 40 ºC; ( ) 45 ºC; ( ) 50 ºC; ( X ) 55 ºC; ( ) 60 ºC; ( ) 65 ºC; ( ) 70 ºC; ( ) 75 ºC; ( ) 80oC 6. การศกษาคาพเอชทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidase

การศกษากจกรรมของเอนไซม -galactosidase ทพเอชตางๆ คอ สารละลายซเตรทบฟเฟอร พเอช 3.0-6.0 สารละลายฟอสเฟตบฟเฟอร พเอช 6.0-10 พบวา พเอชทตางกนมผลตอการทางานของเอนไซม -galactosidase ดงแสดงในภาพท 26 โดยคาพเอชทเหมาะสมจะอยในชวง 6.0-7.0 กจกรรมของเอนไซม -galactosidase จาก B1.2 จะมคาสงสดท พเอช 6.5 โดยมคากจกรรมของเอนไซมเทากบ 1.68 U/ml ดงนน พเอช ทเหมาะสมในการทางาน คอ พเอช 6.5 ซงมความใกลเคยงกบเอนไซม -galactosidase จาก Thermotoga maritime, Thermus sp. T2 และ Thermus

0.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0

100.0110.0

Relat

ive ac

tivity

(%)

54

sp. A4 มพเอช ทเหมาะสมเทากบ 6.5 (Kim et al., 1994, Ladero et al., 2002, Ohtsu et al., 1998) Thermus thermophilus ม พเอช ทเหมาะสมเทากบ 6.6 (Maciu ska et al., 1998) และ Sulfolobus solfataricus ม พเอช ทเหมาะสมเทากบ 6 (Kim et al., 2006) อธบายไดวาท พเอช สงมากหรอตามากมผลทาใหประจของเอนไซมหรอสบสเตรทเปลยนแปลงไปจนไมเหมาะสมทจะทาปฏกรยากนได หรออาจทาใหโครงสรางของเอนไซมเสยสภาพไดตลอดจนโครงสรางสามมตของบรเวณตวเรงเปลยนแปลงไปดวย เพราะพเอชมผลโดยตรงตอโครงสรางทตยภม ตตยภมและจตรภมของโปรตน(สนนทา, 2547) ซงเหลานเปนสาเหตหลกของการลดลงของกจกรรมของเอนไซม

ภาพท 26 ผลของคาพเอชทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยทนอณหภมสง B1.2 7. การศกษาคาพเอชทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธ

การศกษาผลของพเอชทมตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธ โดยการบมเอนไซมทพเอชตางๆคอ สารละลาย 50 mM Citrate buffer (pH 3-5), สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 50 mM (pH 6-7), สารละลาย 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8), สารละลาย 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9-10) เปนเวลา 12 ชวโมง พบวาท พเอช 3.0-4.0 กจกรรมของเอนไซมลดลงอยางรวดเรวคากจกรรมของเอนไซมนอยกวารอยละ 10 ทพเอช 5.0 กจกรรมของเอนไซมลดลงเรวในชวงแรกคากจกรรมของเอนไซมนอยกวารอยละ 50 แตทพเอช 6-10 พบวาเอนไซมม

0.020.040.060.080.0

100.0120.0

Relat

ive ac

tivity

(%)

pH

55

กจกรรมมากกวารอย 60 เมอผานไป 12 ชวโมง (ภาพท 27) เมอเปรยบเทยบกบการศกษาคณสมบตของเอนไซม -galactosidase จาก Bacillus circulans พบวาเอนไซม -galactosidase ทงสามชนดของ Bacillus circulans มความเสถยรตอคาพเอชดงน คอ เอนไซม -galactosidase ชนดท I จะเสถยรทพเอชระหวาง 5.5 ถง 9.5 สาหรบเอนไซม -galactosidase ชนดท II จะเสถยรทพเอชระหวาง 4.5 ถง 9.0 ในขณะท เอนไซม -galactosidase ชนดท III จะเสถยรทพเอชระหวาง 4.5 ถง 8.5 (Vetere and Paoletti, 1998) การศกษา Aspergillus oryzae พบวาเอนไซมมความคงตวทดทสดในชวงพเอช 4.0-9.0 (Tanaka et al., 1991), การศกษาเชอ Lactobacillus acidophilus พบวาพเอชทเอนไซมเสถยรอยในชวงพเอช 5.8-8.0 (Gupta et al., 1994), การศกษา Lactobacillus reuteri พบวามความเสถยรทพเอช 8 (Nguyen et al., 2006) โดยการทชวงพเอชตาๆ จะทาใหเอนไซมมความเสถยรต าน นเนองมาจากเอนไซมทกชนดเปนโปรตนซงเปนโมเลกลทมประจ ดงน นการเปลยนแปลงพเอช จงมผลตอสถานะของไอออนทเปลยนไปน สงผลตอคอนฟอรเมชนของเอนไซม และโครงสรางสามมตของบรเวณเรงดวย (สนนทา, 2547)

ภาพท 27 อทธพลของคาพเอชตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase บรสทธโดย ( ) พเอช 3.0; ( ) พเอช 4.0; ( ) พเอช5.0; ( X ) พเอช 6.0; ( ) พเอช 6.5; ( ) พเอช 7.0; ( ) พเอช 8.0; ( ) พเอช 9.0; ( ) พเอช 10.0

56

8. การหาคาจลศาสตรของเอนไซม จากการศกษาหาคาพารามเตอรทางจลศาสตรของเอนไซม โดยการหาปรมาณ oNP ทเกดขนทอณหภม 60 องศาเซลเซยส และพเอช 6.5 โดยใช oNPG เปนสบสเตรท จากการทดลองพบวาอตราเรวสงสดของปฏกรยา (Vmax) เทากบ 4.93×10-3 mmolL-1min-1 และคาคงท Michaelis-Menten (Km) เทากบ 13.32 มลลโมลาร ดงภาพท 28 และ 29 เมอเทยบจากการศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Lactobacillus reuteri สายพนธ L461 พบวาเอนไซมใหคา Km เทากบ 0.98 mM และ Vm เทากบ 190×10-3 mmolL-1min-1 (Nguyen et al., 2006), Thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii ทแยกไดจาก Antarctica พบวามคา Km เทากบ 8.9 mM (Gul-Guven et al., 2007), การศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Aspergillus oryzae มคา Km เทากบ 7.2 X 10-4 M (Tanaka et al., 1991), Bacteroides polypragmatus มคา Km เทากบ 0.43 mM (Girishchandra B.P. et al., 1984), Aspergillus oryzae มคา Km เทากบ 12 mM และ Vm เทากบ 35 µmol min−1mg−1 (Fraguas. et al., 1999) ตามลาดบ การดประสทธภาพของเอนไซมนน ถา Vmax มคาสงมากๆ และ Km มคาตามากๆ แสดงวาเอนไซมนนจะสามารถเรงปฏกรยาใหดาเนนไปโดยเรวมาก (เจรญศร, 2536)

ภาพท 28 Lineweaver Burk plot ของเอนไซม -galactosidase บรสทธจากไอโซเลท B1.2

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

-0.50 -0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

1/(mm

ol oNP

/min)

1/mM oNPG

57

ภาพท 29 Michaelis-Menten ของเอนไซม -galactosidase บรสทธจากไอโซเลท B1.2 9. การศกษาผลของไอออนโลหะตอกจกรรมของเอนไซม

การศกษาผลของไอออนโลหะทงหมด 9 ชนดตอกจกรรมของเอนไซม (ตารางท 9) พบวา

ไอออน Na+และ K+ ทความเขมขน 1, 10 และ 100 มลลโมลาร มผลเพยงเลกนอยตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ สาหรบไอออน Zn2+และ Cu2+ มผลเปนตวขดขวางกจกรรมของเอนไซม แต Fe3+ นนจะสงเสรมกจกรรมของเอนไซมใหเพมขนทความเขมขน 1 mM เทานน สวน Mg2+, Mn2+, Co2+และ Ca2+ ทความเขมขน 1 และ 10 มลลโมลาร มผลเปนตวสงเสรมกจกรรมของเอนไซม แตทความเขมขน 100 มลลโมลาร มผลยบย งกจกรรมของเอนไซม ซงสอดคลองกบการศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Thermotoga maritime (Kim et al., 1999) พบวา Zn2+ เปนตวขดขวางกจกรรมของเอนไซม และ การศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Talaromyces thermophilus CBS 236.58 พบวา ไอออน Zn2+และ Cu2+ ทความเขมขน 1, 10 และ 100 มลลโมลาร มผลเปนตวขดขวางกจกรรมของเอนไซม แต Fe3+ นนจะสงเสรมกจกรรมของเอนไซมใหเพมขนทความเขมขน 1 มลลโมลาร เทานน (Nakkharat and Haltrich, 2006) โดยผลการทดลองนใหแนวโนมไปในทางเดยวกบการศกษา เอนไซม -galactosidase ทตางๆ กนไปมกจะมพวก Mono และ Divalent เปนตวสงเสรมกจกรรมเอนไซม เกยวกบกลไกของการกระตนของมนทงนจากการศกษาลาสดพบวาโครงสรางของบรเวณเรงปฏกรยาของ Na+ และ Mg2+ มลกษณะใกลเคยงกบบรเวณเรงปฏกรยาของ lacZ ซงเปนสวนททาใหเกดความเสถยรของเอนไซม (Nguyen et al., 2006)

y = 0.001ln(x) - 0.000R² = 0.991oN

P (mm

ol/min)

58

ตารางท 9 ผลของไอออนทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ

ประเภทของโลหะ Relative galactosidase activity (%) 1 mM 10 mM 100 mM

None 100 100 100

Na+ 98 93 93

K+ 101 102 96

Mg2+ 97 112 0

Fe2+ 247 0 0

Mn2+ 111 317 0

Ca2+ 91 107 0

Co2+ 103 196 0

Zn2+ 90 58 0

Cu2+ 61 67 0

10. การศกษาผลของชนดนาตาลตอกจกรรมของเอนไซม การศกษาผลของน าตาลทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ (ตารางท 10) พบวา น าตาลทกประเภท นน จะเปนตวยบย งกจกรรมของเอนไซม ทงทความเขมขนตาและความเขมขนสง สอดคลองกบการศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Talaromyces thermophilus CBS 237 พบวาน าตาล Glucose และ Lactose มผลยบย งกจกรรมของเอนไซม (Nakkharat and Haltrich, 2006) การศกษา Asperqillus terreus varieties MRU-26 และ Asperqillus terreus varieties MLU-3 พบวานาตาล glucose มผลยบย งการทางานของเอนไซม (Zaidi N.,1986) การศกษาเอนไซม

-galactosidase ทไดจาก Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii (Gul-Guven et al., 2006) กพบวานาตาล Lactose เปนตวสงเสรมใหเอนไซมมกจกรรมทเพมขนแตเมอเวลาผานไป การ

59

ทางานของเอนไซมจะทาให Lactose จะกลายเปน Glucose และ Galactose ซงเปนตวยบย งกจกรรมของเอนไซมเชนเดยวกบการทดลองครงน ตารางท 10 ผลของนาตาลทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ

ประเภทของนาตาล Relative galactosidase activity (%) 1 mM 10 mM 100 mM

oNPG 100 100 100

Galactose 76 58 20

Glucose 81 77 59

Lactose 86 68 27

Xylitol 90 83 74

Xylose 91 84 76 11. การศกษาผลของรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม

การศกษาผลของรเอเจนตทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ (ตารางท 11) พบวา EDTA และ 2-Mercaptoethanol จะเปนตวยบย งกจกรรมของเอนไซม ทงทความเขมขนตาและความเขมขนสง สวน DTT และ Urea มผลยบย งกจกรรมของเอนไซมเพยงเลกนอยเอนไซมมความเสถยรมากทสด สวน EDTA มผลยบย งกจกรรมของเอนไซมมากทสด สอดคลองกบการศกษาเอนไซม -galactosidase จาก Lactobacillus reuteri พบวา DTT ทาใหเอนไซมเสถยรทสดสวน EDTA มผลยบย งกจกรรมของเอนไซมมากทสด (Nguyen et al., 2006) กจกรรมของเอนไซมลดลงนอาจเปนเพราะสารพษนนทาใหโครงสรางของโปรตนถกทาลาย (สนนทา, 2547)

60

ตารางท 11 ผลของรเอเจนตทมตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase บรสทธ

ประเภทของ รเอเจนต

Relative galactosidase activity (%) 0.1 mM 1 mM 10 mM

None 100 100 100

DTT 95 96 99

EDTA 95 95 16

Urea 99 100 96

2-Mercaptoethanol 96 89 83 12. การหานาหนกโมเลกลของเอนไซม

การหาน าหนกโมเลกลของเอนไซม -galactosidase โดย Native PAGE และ SDS-PAGE

พบวา Native PAGE ใหคาอยทแถบประมาณ 215 kDa และจาก SDS-PAGE ใหคาอยทแถบประมาณ 75 kDa ภาพท 30 และ 31 อาจเปนไปไดวาเอนไซม -galactosidase จากจลนทรยสายพนธ B1.2 ประกอบดวยหนวยยอย 3 หนวย คอ 75 kDa 3 หนวยประกอบกนเปนโครงสรางของเอนไซม จากการศกษาน าหนกโมเลกลของ -galactosidase จาก Lactobacillus reuteri 2 สายพนธ คอ L103 และ L461 พบวาทง 2 สายพนธมน าหนกโมเลกลทหาโดย Native PAGE เทากบ 105 kDa ประกอบดวยหนวยยอยเทากบ 35 kDa กบ 75 kDa ตามลาดบ (Nguyen et al., 2006) การศกษา Rhizomucor sp. มน าหนกโมเลกล 250 kDa (Shaikh et al., 1999), Thermus sp. T2 มน าหนกโมเลกล 550 kDa (Ladero et al., 2002), Thermus sp. A4 มน าหนกโมเลกล 75 kDa (Ohtsu et al., 1998) แสดงใหเหนวาเอนไซมแตละชนดมโครงสรางและน าหนกโมเลกลทแตกตางกนออกไปเปนลกษณะเฉพาะของเอนไซม

61

12.1 Native Polyacryamide Gel Electrophoresis (Native PAGE)

A

ภาพท 30 Native PAGE ของเอนไซม -galactosidaseบรสทธ ทไดจากไอโซเลท B1.2 โดยแถวท 1 เปนโปรตนบอกขนาด (Maker) แถวท 2 และ 5 เปนเอนไซม -galactosidase แบบหยาบ แถวท 3 และ 6 เอนไซม -galactosidase ทผาน DEAE sepharose chromatography และ แถวท 4 และ 7 เปนเอนไซม -galactosidase ทผานAffinity column แถวท 1-4 เปนการยอมเจลโดยใชสารละลายยอมโปรตน Coomassie Brilliant blue R-250 แถวท 5-7 เปนการยอมสารเรองแสง 4-Methylumbelliferyl -D-galactoside

62

12.2 Sodium Dodecyl sulfate - Polyacryamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE)

B

ภาพท 31 SDS PAGE ของเอนไซม -galactosidase บรสทธ ทไดจากไอโซเลท B1.2 โดยแถวท 1 เปนโปรตนบอกขนาด(Maker) แถวท 2 และ 5 เปนเอนไซม -galactosidase แบบหยาบแถวท 3 และ 6 เอนไซม -galactosidaseทผาน DEAE sepharose chromatography และแถวท 4 และ 7 เปนเอนไซม -galactosidaseทผาน Affinity column แถวท1-4 เปนการยอมเจลโดยใชสารละลายยอมโปรตน Coomassie Brilliant blueR-250 แถวท 5-7 เปนการยอมสารเรองแสง 4-Methylumbelliferyl -D-galactoside

12.3 เจล โครมาโทกราฟ (Gel chromatography)

เมอนาสารละลายเอนไซม B1.2 ทผานการทาบรสทธมาหาน าหนกโมเลกลของเอนไซมดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (AKTA TM FPLC with Frac-950; Amersham Pharmacia, Sweden) โดยผาน Gel filtration ทคอลมนบรรจ Biogel P-100 เปรยบเทยบกบสารมาตรฐานคอ Lysozyme; MW 14600, Trypsin; MW 23800, Protenase K; MW 28900, Lipase; MW 45000 และ Amyloglucosidase; MW 97000 ไดผลดงภาพท 32

63

ภาพท 32 กราฟแสดงความสมพนธระหวางคา Log ของน าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนดกบเวลาของโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา

จากผลการทดลองเมอนาสารละลายเอนไซมบรสทธผานคอลมนบรรจ Biogel P-100

โปรตนทแยกไดมกจกรรมของเอนไซม ในชวง Fraction ท 7-8 นาหนกโมเลกลของโปรตนตวอยาง B1.2 ทไดมขนาดใหญเนองจากโปรตนถกชะออกมาจากคอลมนในชวงเวลาแรกเมอเปรยบเทยบกบกราฟมาตราฐาน การหานาหนกโมเลกลของเอนไซมทแยกไดโดยวธ Gel filtration ดวยคอลมภบรรจ Biogel P-100 เมอนาผลการทดลองมาเทยบกบกราฟแสดงความสมพนธระหวางคา Log ของน าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนด กบเวลาทโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา พบวาสารละลายเอนไซมมน าหนกโมเลกล 215 KDa ซงสอดคลองกบการหาน าหนกโมเลกลของเอนไซมโดยวธ native PAGE ใหคาอยทแถบประมาณ 215 kDa เมอเปรยบเทยบกบการศกษา Lactobacillus reuteri 2 สายพนธคอ L103 และ L461 พบวามน าหนกโมเลกลของเอนไซม -galactosidase คอ 105 KDa (Nguyen et.al., 2006) การศกษา Kluyveromyces lactis ซงใหคาน าหนกโมเลกลคอ 200 kDa (Cavaille and Combes, 1995) ซงใหผลการวจยทใกลเคยงกนกบการวจยของ Hussein L. และคณะ ในป 1988 คอ 230 kDa และยงมงานวจยอนๆอกทเกยวของ เชน การหาน าหนกโมเลกลของเอนไซม -galactosidase ของ Bacillus megaterium, strain KM (Pollard H.B. and Steers E.Jr., 1973) มคาน าหนกโมเลกลคอ 230 kDa แสดงใหเหนวาเอนไซมแตละชนดมโครงสรางและน าหนกโมเลกลทแตกตางกนออกไปเปนลกษณะเฉพาะของเอนไซม

64

บทท 5

สรปผลการศกษา เอนไซม -galactosidase ทนอณหภมสงมประโยชนตอกระบวนการอตสาหกรรมการผลต

อาหารและนมเนองจากสามารถทางานและเสถยรทอณหภมสงอกทงยงทนตอสารเคมหรอตวทาละลายไดอกดวย (Sundaram, 1988) ซงในกระบวนการทอณหภมสงจะมขอดคอ เพมคาการละลายของสบสเตรตทาใหเพมผลไดของผลตภณฑ ลดการยบย งปฏกรยาเนองจากผลตภณฑและ ลดการปนเปอนจากจลนทรยอน (Kristjansson, 1989 ; Zeikus et al., 1998) เอนไซม -galactosidase ซงผลตภายในเซลลจลนทรยทนอณหภมสงสายพนธ B1.2 ทคดแยกไดจากจากการแยกเชอจลนทรยจากโปงนารอนทาปาย จงหวดแมฮองสอน ประเทศไทย วษณ ถกนามาใชในการศกษา การระบชนดสายพนธเชอประกอบดวย การยอมสแกรม การยอมสเอนโดสปอรพบวาจลนทรย B1.2 เปนแบคทเรยแกรมบวกมการสรางเอนโดสปอร และการระบสายพนธจลนทรยโดยวธ 16s rDNA มความใกลเคยงกบ Anoxybacillus kestanbolinensis และ Anoxybacillus flavithermus มากทสด การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase จากเชอ B1.2 ดวยวธ DEAE chromatography และ Affinity chromatography จะทาใหคากจกรรมของเอนไซมเพมขนและปรมาณโปรตนลดลงเมอเทยบกบ Crude extract คา Specific activity มคาเพมขน คา Purification (fold) มคาเพมขนเปน 2.24 และ 3.79 ตามลาดบ คา % Recovery มคา 94.1% และ 86.4 % ตามลาดบ เอนไซม -galactosidase หลงจากผานการทาบรสทธ มคา Specific activity มากกวากอนการทาคณสมบตของเอนไซมบรสทธ เทากบ 1.1 U/mg protein มความบรสทธประมาณ 3.79 เทา และ Recovery 86.4%. น าหนกโมเลกลของเอนไซมหาโดยวธ Native-PAGE และ SDS-PAGE คอ 215 และ 75 kDa ตามลาดบ สอดคลองกบวธ Gel chromatography คอ 215 kDa เอนไซมบรสทธทางานไดดทพเอช 6.5 อณหภม 60 องศาเซลเซยส เสถยรทอณหภม 40-60 องศาเซลเซยส และทพเอช 6.0-10.0 คาทางจลพลศาสตรคอ Km = 13.32 mM และ Vmax = 4.93 ×10-3 mmolL-1min-1 ตามสาดบ เอนไซม -galactosidase ซงผลตภายในเซลลจลนทรยถกยบย งโดยไอออนของ Zn2+, Cu2+ สาร EDTA และการผลต Glucose และ Galactose โดยเอนไซมมความบรสทธเพมขน % Recovery ลดลงไมมากสามารถทนอณหภมไดสงและทางานไดในชวง pH ทเหมาะสมสามารถนาไปใชในกระบวนการอตสาหกรรมการผลตอาหารและนมได

65

บรรณานกรม

ภาษาไทย กญจนา บณยเกยรต. (2540). การคานวณขนตนในวชาวศวกรรมเคม. (พมพครงท 4) สานกพมพ

จฬาลงกรณมหาวทยาลย. เจรญศร มงกรกาญจน. (2336). ชวเคม. คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล เลม 1. กรงเทพฯ :

บรษท พร-ประเสรฐพรนตง จากด รงสร โชตปฏเวชกล. (2550). กระบวนการวชาเทคนคทางหองปฏบตการชนสตร 2 .คณะเทคนค

การแพทย, มหาวทยาวยเชยงใหม. หนา 1-8. วษณ ศรลา. (2549). การศกษาลกษณะสมบตของเอนไซม -galactosidase จากแบคทเรยชอบ

อณหภมสงทแยกไดจากบอนาพรอนบอทาปาย. จลนพนธ สาขาเทคโนโลยชวภาพ มหาวทยาลยศลปากร. 2549.

นงลกษณ สวรรณพนจและปรชา สวรรณพนจ. (2547). จลชววทยาทวไป. (พมพครงท 7). กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย. หนา 85-88.

สนนทา ภญณาวธน. (2547). ชวเคม 2. (พมพครงท 7). กรงเทพฯ: สานกพมพมหาวทยาลยรามคาแหง. หนา 376-380.

ภาษาองกฤษ Akiyama, K., Takase,M., HoriKOshi, K., and Okonogi, S. (2001). Production of

galactooligosaccharide from lactose using a -galactosidase from Thermus sp. Z-1. Bioscince Biotechnology and Biochemistry, 65, 438-441.

Bruins, M. E., Thewessen, A. J. H., Janssan, A. E. M., and Boom, R. M. (2003). Enzyme Inactivation due to Millard reaction during oligosaccharide synthesis by a Hyperthermophilic glycosidase: influence of enzyme immoblilization. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 21, 31-34.

Clifton E, Meloan. (1991). Affinity Chromatography. Pharmacia Fine Chemicals AB. Sweden, 303-313.

66

Cowan, D. A., Daniel, R. M., Martin, A. M., and Morgan, H. W. (2004). Some properties of a -galactosidase from an extremely thermophilic bacterium. Biotechnology and Bioengineering, 10, 1141–1145.

Dzeizak, J. D. (1991). Enzyme: catalysts for food processes. Food Technology, January, 78-85. Fisher, L., Scheckermann, C., and Wagner, F. (1995). Purification and characterization of a

thermotolerant -galactosidase from Thermomyces lanuginosus.Applied and Environmental Microbiology, 61, 1497-1501.

Gekas, V., and Lopez-Leiva, M. (1985). Hydrolysis of lactose: a literature review. Process Biochemistry, 20, 2-12.

Greenberg, N. A., and Mahoney, R. R. (1982). Production and characterization of -galactosidase from Streptococus thermophilus. Journal of Food Science, 47, 1824-1835.

Gul-Guven, R. G., Guven, K., Poli, A., and Nicolaus. B. (2007). Purification and some properties of a -galactosidase from the thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.rittmannii isolated from Antarctica. Enzyme Microbiol Technol, 40, 1570–1577.

Hansen L.H; Knudsen S and Sørensen S.J. (1998) The effect of the lacY gene on the induction of IPTG inducible promoters, studied in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens Curr. Microbiol. 36 (6) June : 341.

Harper, W. J. (1992). Lactose and lactose derivatives. In: Whey and lactose processing, Elsevier, New York, 317-360.

Holsinger, V. H. and Kligerman, A. E. (1991). Applications of lactase in dairy foods and other foods containing lactose. Food Technology, 45, 92-95.

Kang, S. K., Cho, K. K., Ahn, J. K. Bok, J. D., Kang, S. H., Woo, J. H., Lee, H. G., You, S. W., and Choi, Y. J. (2005). Three froms of thermostable lactose-hydrolase from Thermus sp. IB-21: coining , expression and characterization. Journal of Biotechnology, 116, 337-346.

67

Kim, C. S., Ji, E. S., and Oh, D. K. (2004). Characterization of thermostable recombinant -galactosidase from Thermotoga maritime. Journal of Applied Microbiology. 97, 1006-1014.

Kristjansson, J. K., (1989). Thermophilic organisms as sources of thermostable enzymes. TIBTECH. 7, 349-353.

Ladero, m., Perez, M. T., Santos, A. and Garcia Ochoa, F. (2004). Hydrolysis of lactose by free and immobilized -galactosidase from Thermus sp. strain T2. Biotechnology and Bioengineering, 81, 241-252.

Lehninger, A.L., Nelson, D.L., and Cox M.M. (1993). Principles of biochemistry. (2nd ed.) New York: Worth Publishers.

Lin, J., Pillay, B. and Singh, S. (1999). Purification and biochemical characteristic of -D-galactosidase from a thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus-SSBP. Biotechnology and Applied Biochemistry, 81, 81-87.

Linko, S., Enwald, S., Zhu, Y. H., and Mayra-Makinen. (1998). Production of -galactosidase by Streptococcus salivarius subsp thermophilus 11F. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 20, 215-219.

Macris, B. J. and Markakis, P. (1981). Characterization of extracellular -D-galactosidase from Fusarium moniliforne grown in whey. Applied and Environmental Microbiology, 41, 956-958.

Maciu ska, J., Czyz, B. and Synowiecki, J. (1998). Isolation and some properties of -galactosidasefrom the thermophilic bacterium Thermus thermophilus . Food Chemistry, 63, 441-445.

Mahoney, R., R. (1998) Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chemistry. 64: 137-154.

Matsumoto, K., Kobayashi, Y., Ueyama, S., Watanabe, T., Tanaka, R., Kan, T., Kuroda, A. and Sumihara, Y. (1993). Oligosaccharides: Production, properties and application. In: T. Makakuki (ed) Jananese Technology Reviews Section E: Biotechnology, Gordon and Breach Science, Yverdon, Vol. 3, No. 2, 90-106.

68

Nakayama, T., and Amachi, T. (1999). -Galactosidase, enzymology. In: Flickinger MC, Drew SW (cds) Encylopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, Wiley, New York, Vol. 3, pp. 1291-1305.

Nakkharat, P., & Haltrich, D. (2006). Purification and characterization of an intracellular enzyme with -glucosidase and -galactosidase activity from the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus CBS 236.58. Journal of Biotechnology, 123, 304-313.

Nelson DL and Cox MM.( 2000). Lehninger Principles of Biochemistry. (3 rd ed). 1078. Nguyen T., Splechtna B. Steinbock, Kneifel W., Lettner P. H., Kulbe D. K., and Haltrich D.

(2006).Purification and Characterization of Two Novel -galactosidases from Lactobacillus reuteri. Agricultural Food Chemistry, 54, 4989-4998.

Ohtsu, N., Motoshima, H., Goto, K., Tsukasaki, F., and Matsuzawa, H. (1998). Thermostable -Galactosidase from an Extreme Thermophile, Thermus sp. A4: Enzyme Purification and Characterization, and Gene Cloning and Sequencing. Biochimica et Biophysica Acta, 1380, 223-231.

Onishi, N., and Tanaka, Y. (1995). Purification and properties of a novel thermostable galactooligosaccharide producing -galactosidase from Sterigmatomyces elviae CBS8119. Applied and Environmental Microbiology. 61, 4026-4030.

Petzelbauer, I., Nidetzdy, B., Haltrich, D., and Kulbe, K.D. (1999). Development of an ultra-high-temperature process for the enzymatic hydrolysis of lactose. I. The properties of two thermostable -glycosidases. Biotechnology and Bioengineering. 65, 322-332.

Pulvin, S., Friboulet, A., and Thomas, D. (1990). Substrate inhibition and activation kinetics of the -galactosidase from the extreme thermoacidophile archaebacterion Caldariella acidophila. Biochimica et Biophysica Acta, 1041, 97-100.

Reuter, S., Nygaard, A. R., and Zimmermann, W. (1999). -Galactooligosaccharide synthesis with -galactosidases from Sulfolobus solfataricus, Aspergillus oryzae, and Escherichia coli. Enzyme and Microbial Technology, 25, 509-516.

Shaikh, S. A., Khire, J. M. and Khan, M. I. (1999). Characterization of a thermostable extracellular -galactosidase from a thermophilic fungus Rhizomucos sp. Biochemica et Biophysica, 1472, 314-322.

69

Splechna, B., Petzelbauer, I., Kuhn, B., Kulbe, K. D., and Nidetzky, B. (2002). Hydrolysis of lactose by -glycosidase CelB from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. Applied Biochemistry and Biotechnology, 98-100, 738-488.

Stutzenberger, F. (1990). Thermostable fungal -glucosidases. Letters in Applied Microbiology, 11, 173-178.

Ulezlo, I. V., Tsereteli, A. K., Portnaya, I. B., and Bezborodov, A. M. (2001). -Galactosidase of the extreme thermophilic anaerobic bacterium Thermoanaerobium sp. 2905 and its immonilization. Applied Biochemistry and Microbiology, 37, 41-44.

Ulrich, J. T., Mcfeters, G. A., and Temple, K. L. (1972). Induction and Characterization of - galactosidase in an Extreme Thermophile. Bacteriology, 110, 691-698.

Vasiljevic, T. and Jelen, P. (2001). production of -galactosidase for lactose hydrolysis in milk and dairy products using thermophilic lactic bacteria. Innovative Food Science and Emerging Technology, 2, 75-85.

Vetere, A. and Paoletti, S. (1998). Separation and characterization of three -galactosidases from Bacillus circulans. Biochimica et Biophysica Acta, 1380, 223–231.

Wallenfels K. and Malhotra O.P. (1961) Galactosidase. Advance in Carbohydrate Chemistry, 16, 239-298.

Wells. A. F. (1984) Structural Inorganic Chemistry. 5th ed., Oxford University Press, Oxford, UK.

Zadow, J. T., McFeter, G. A., and Temple, K. L. (1972). Introduction and characterization of a - galactosidase in an extreme thermophile. Journal of Bacteriology, 110, 691-698.

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก

72

ภาคผนวก ก

อาหารเลยงเชอจลนทรยและการเตรยมสารเคม 1.อาหารเลยงเชอ

1.1 Lactose broth Lactose (Difco, U.S.A.) 5 กรม Peptone (Scharlau, Spain) 5 กรม Beef extract (Pronadisa, Spain) 3 กรม ละลายสวนประกอบทงหมดในน ากลน 1 ลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนง

ความดนไอ (Tomy 35-325; Tomy Kogyo, Japan) ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตางนว นาน 15 นาท

1.2 Lactose agar Lactose (Difco, U.S.A.) 5 กรม Peptone (Scharlau, Spain ) 5 กรม Beef extract (Pronadisa, Spain) 3 กรม Agar (Scharlau, Spain) 15 กรม ละลายสวนประกอบทงหมดในน ากลน 1 ลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนง

ความดนไอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตางนว นาน 15 นาท

1.3 Lactose – mineral salt medium Lactose (Difco, U.S.A.) 10 กรม Peptone (Scharlau, Spain) 10 กรม

Yeast extract (Scharlau, Spain) 10 กรม (NH4)2SO4 (Fluka, Buchs Switzerland) 5 กรม

73

K2HPO4 (Riedel-de Haën, Germany) 3 กรม KH2PO4 (Riedel-de Haën, Germany) 1 กรม MgSO4 . 7H2O (Fluka, Buchs Switzerland) 0.5 กรม ละลายสวนประกอบทงหมดในน ากลน 1 ลตร วด pH ดวยเครองวด pH (Schott GG 840)

ปรบpH ใหได 7.0 ดวย NaOH (LAB-SCAN) จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตางนว นาน 15 นาท 2. สารละลาย

2.1 สารละลายสาหรบการหากจกรรมของเอนไซม

2.1.1 สารละลายโซเดยมคารบอเนต 0.4 โมลาร ชง Na2CO3 (Riedel-de Haën, Germany) (MW 105.99) 42.396 กรม ละลายในน ากลน 1

ลตร เกบในทเยน

2.1.2 สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 50 มลลโมลาร pH 6.5 (Buffer A) ชง NaH2PO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 156.03) 7.8015 กรม และชง Na2HPO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 178.05) 8.9025 กรม ละลายทง 2 สารในน ากลน 1 ลตร ปรบ pH ใหได pH ตามทตองการดวย NaOH เกบในทเยน

2.1.3 สารละลาย 2-Nitrophenyl- -D-Galactopyranoside (oNPG) 22 มลลโมลาร ชง oNPG (SIGMA, U.S.A.) (MW 301.25) 0.0998 กรม ละลายใน 50 mM Sodium

phosphate buffer pH 6.5 ปรมาตร 10 มลลลตร เกบในทเยน

74

2.2 สารละลายสาหรบหาปรมาณโปรตน

เตรยมสารละลาย Bradford dye reagent โดยละลาย Coomassie-Brilliant blue G-250 (Fluka, Buchs Switzerland) จานวน 100 มลลกรม ใน 50 มลลลตร ของ 95% เอทานอล (Lab Scan, Ireland) เตม 100 มลลลตร ของ 85% phosphoric acid (Lab Scan, Ireland) ปรบปรมาตรใหเปน 1 ลตร ดวยนากลนเกบไวในขวดสชาสารละลายทไดมความเสถยรทอณหภมหองเปนเวลา 2 สปดาห

2.3 สารละลายสาหรบการทาบรสทธ

2.3.1 สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 50 มลลโมลาร pH 6.5 (Buffer A) ชง NaH2PO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 156.03) 7.8015 กรม และชง Na2HPO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 178.05) 8.9025 กรม ละลายทง 2 สารในน ากลน 1 ลตร ปรบ pH ใหได pH ตามทตองการดวย NaOH เกบไวในทเยน

2.3.2 สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 50 มลลโมลาร pH 6 + สารละลายโซเดยม

คลอไรด 1 โมลาร (Buffer B) ชง NaH2PO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 156.03) 7.8015 กรม ชง Na2HPO4.

2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 178.05) 8.9025 กรม และชง NaCl (Fluka, Buchs Switzerland) (MW 58.44) 58.44 กรม ละลายทง 3 สารในน ากลน 1 ลตร ปรบ pH ใหได pH ตามทตองการดวย NaOH เกบในทเยน

2.4 สารละลายสาหรบการศกษาคณลกษณะสมบต

2.4.1 สารละลายสาหรบ pH ทเหมาะสมและความเสถยรทมตอเอนไซม 2.4.1.1 สารละลาย 50 mM Citrate buffer (pH 3-5)

75

ชง Citric acid (Fluka, Buchs Switzerland) (MW 192.13) 9.6065 กรม ละลายในนากลน 1 ลตร และชง Tri-sodium citrate (Fluka, Buchs Switzerland) (MW 294.10) 14.705 กรม ละลายในน ากลน 1 ลตร วด pH ของสารละลาย Sodium citrate ใชสารละลาย Citric acid ปรบกรดใหได pH ทตองการ เกบในทเยน

2.4.1.2 สารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 50 มลลโมลาร (pH 6-7)

ชง NaH2PO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 156.03) 7.8015 กรม และชง Na2HPO4

. 2H2O (Riedel-de Haën, Germany) (MW 178.05) 8.9025 กรม ละลายทง 2 สารในน ากลน 1 ลตร ปรบ pH ใหได pH ตามทตองการดวย NaOH เกบในทเยน

2.4.1.3 สารละลาย 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8)

ชง Tris (Riedel-de Haën, Germany) (MW 121.14) 6.057 กรม ละลายในน ากลน 1 ลตร

ปรบ pH ใหได pH 8 ดวย HCl (Lab Scan, Thailand) 2.4.1.4 สารละลาย 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9-10)

ชง Glycine (Difco, USA.) (MW 75.07) 3.7535 กรม ละลายในน ากลน 1 ลตร ปรบ pH ให

ได pH ทตองการดวย NaOH (Lab Scan, Thailand)

2.4.2 สารละลายสาหรบไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม 2.4.2.1 สารละลายไอออน Na+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง NaCl (Fluka, Buchs Switzerland; MW 58.44) มา 1.40 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน NaCl ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

76

2.4.2.2 สารละลายไอออน K+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง KCl (Fluka, Buchs Switzerland; MW 74.6) มา 1.79 กรม ละลายน ากลน 15 มลลลตร

นามาเจอจางแบบอนกรมดวยนากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน KCl ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.3 สารละลายไอออน Mg2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง MgCl2.6H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 203.3) มา 4.88 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน MgCl2.6H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.4 สารละลายไอออน Fe2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง FeSO4.7H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 277.9) มา 6.67 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน FeSO4.7H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.5 สารละลายไอออน Mn2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง MnCl2.4H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 197.9) มา 4.75 ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลารหลงจากนนนาสารละลายไอออน MnCl2.4H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

77

2.4.2.6 สารละลายไอออน Ca2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง CaCl2.2H2O (AnalaR@,England; MW 147.1) มา 3.53 กรม ละลายน ากลน 15 มลลลตร

นามาเจอจางแบบอนกรมดวยนากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน CaCl2.2H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.7 สารละลายไอออน Co2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง CoCl2.6H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 237.9) มา 5.71 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน CoCl2.6H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.8 สารละลายไอออน Zn2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง ZnSO47H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 287.54) มา 6.90 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน ZnSO47H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.2.9 สารละลายไอออน Cu2+ ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง CuCl2.2H2O (Fluka, Buchs Switzerland; MW 170.5) มา 4.10 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายไอออน CuCl2.2H2O ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

78

2.4.3 สารละลายนาตาลทมผลตอกจกรรมของเอนไซม 2.4.3.1 สารละลายนาตาล Galactose ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง Galactose (Fluka, Buchs Switzerland; MW 180.16) มา 4.33 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Galactose ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.3.2 สารละลายนาตาล Glucose ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง Glucose (Fluka,Buchs Switzerland; MW 180.16) มา 4.33 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Glucose ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.3.3 สารละลายนาตาล Lactose ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง Lactose (Fluka, Buchs Switzerland; MW 360.32) มา 8.65 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Lactose ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.3.4 สารละลายนาตาล Xylitol ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง Xylitol (Fluka, Buchs Switzerland; MW 152.15) มา 3.65 กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Xylitol ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

79

2.4.3.5 สารละลายนาตาล Xylose ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง Xylose (Fluka, Buchs Switzerland; MW 150.13) มา 3.61กรม ละลายน ากลน 15

มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 16 และ 160 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Xylose ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.4 สารละรเอเจนตทมผลตอกจกรรมของเอนไซม

2.4.4.1 สารละลาย DTT ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง DTT (MW 180.16) มา 4.33 กรม ละลายนากลน 15 มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรม

ดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 160 16 และ 1.6 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลาย DTT ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.4.2 สารละลาย EDTA ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง EDTA ( C10H16N2O8; MW 292.25) มา 7.01 กรม ละลายน ากลน 15 มลลลตร นามา

เจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 160 16 และ 1.6 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลาย EDTA ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.4.4.3 สารละลาย Urea ความเขมขน 1600 มลลโมลาร

ชง Urea (MW 60) มา 1.44 กรม ละลายน ากลน 15 มลลลตร นามาเจอจางแบบอนกรมดวย

น ากลนตอไปใหไดความเขมขน 160 16 และ 1.6 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลายน าตาล Lactose ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

80

2.4.4.4 สารละลาย 2-mercaptoethanol ความเขมขน 1600 มลลโมลาร ชง 2-mercaptoethanol (C2H6O3; MW 78) มา 1.87 กรม ละลายน ากลน 15 มลลลตร นามา

เจอจางแบบอนกรมดวยน ากลนตอไปใหไดความเขมขน 160 16 และ 1.6 มลลโมลาร หลงจากนนนาสารละลาย 2-mercaptoethanol ปรมาตร 30 ไมโครลตร มาผสมกบสารละลาย oNPG ปรมาตร 450 ไมโครลตร

2.5 สารเคมสาหรบหานาหนกโมเลกลของเอนไซม

2.5.1 สารละลายสาหรบ SDS-PAGE 2.5.1.1 สารละลาย 10 % SDS (Sodium dodecyl sulfate)

ชง SDS (Bio Basic Inc; MW 288.38) 10 กรม ละลายในน ากลนปรมาตร 25 มลลลตร และ

ปรบปรมาตรดวยนากลนใหได 100 มลลลตร 2.5.1.2 สารละลาย 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

ชง Tris-base (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) 6.06 กรม ละลายในน ากลนและ

ปรบ pH ดวย HCl หลงจากนนปรบปรมาตรใหเปน 100 มลลลตร ดวยนากลน 2.5.1.3 สารละลาย 1.5 M Tris-HCl pH 8.8

ชง Tris-base 18.17 กรม ละลายในน ากลน และปรบ pH ดวย HCl หลงจากนนปรบ

ปรมาตรใหเปน 100 มลลลตร ดวยนากลน 2.5.1.4 สารละลาย 30% (w/v) Bis-Acrylamide

เตรยม Acrylamide (Fluka, Buchs Switzerland; MW 71.08) 29.7% และ N,N’-methyene-

bisacrylamide (Fluka, Buchs Switzerland; MW 71.08) 0.3% ผสมใหเขากน

81

2.5.1.5 สารละลาย 10% (w/v) Amonium Persulphate ชง Amonium Persulphate (Bio Basic Inc; MW 288.20) 0.1 กรม ละลายในน ากลน

ปรมาตร 1 มลลลตร 2.5.1.6 สารละลายสาหรบลางสยอม Destain I (Destaining solution)

Methanol (Fluka, Buchs Switzerland; MW 32.04) 160 มลลลตร Acetic acid (AMRESCO, USA; MW 192.13) 40 มลลลตร นากลน 200 มลลลตร

2.5.1.7 สารละลายสาหรบลางสยอม Destain II (Destaining solution)

Methanol (Fluka, Buchs Switzerland; MW 32.04) 20 มลลลตร Acetic acid (AMRESCO, USA; MW 192.13) 28 มลลลตร นากลน 352 มลลลตร

2.5.1.8 สารละลายสาหรบสยอมโปรตน สาหรบ SDS-PAGE (Stain Solution)

เตรยมทความเขมขน คอ 0.1 % Coomassie brilliant blue R250 in methanol,10% acetic

acid Coomassie brilliant blue R-250 (GibcoBRL, USA, MW 825.98) 0.5 กรม Methanol (Fluka, Buchs Switzerland, MW 32.04) 200 มลลลตร Acetic acid (Amresco, USA, MW 192.13) 50 กรม นากลน 500 มลลลตร

2.5.1.9 สสงเคราะหสาหรบผสมโปรตน (4xgel loading dye) สาหรบ SDS-PAGE

นา 4 mM EDTA (Fluka, Buchs Switzerland; MW 292.25), 40% glycerol (Riedel-de

Haën, Germany; MW 92.09), 100 mM DTT (Fluka, Buchs Switzerland; MW 154.25), 4% SDS,

82

1.45 mM bromophenol blue (Fluka, Buchs Switzerland; MW 699.99) และ 200 mM Tris-HCl (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) pH 7.5 นามาผสมใหเขากน

2.5.1.10 สารละลายบฟเฟอร Tris-glycine

เตรยม 25 mM Tris-HCl (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) pH 8.3, 0.1% SDS และ

192 mM Glycine (GibcoBRL,USA; MW 75.05) ผสมใหเขากน 2.5.1.11 4-methylumbelliferyl -D-galactosidase

นา 0.5 M Acetate buffer pH 10 ผสมกบ 3.5 mg/ml 4-Methylumbeliferyl -D-

galactosidase (Fluka, Buchs Switzerland; MW 338.32) ใหเขากน 2.5.1.12 Polyacrylamide Gel 12% (Separating gel)

นากลน 6.4 มลลลตร 30% (w/v) Bis-Acrylamide 8 มลลลตร 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 5.2 มลลลตร 10% SDS 0.2 มลลลตร 10% APS 0.2 มลลลตร TEMED (Fluka, Buchs Switzerland; MW 166.21) 0.012 มลลลตร

2.5.1.13 Polyacrylamide Gel 5% (Stacking gel)

นากลน 4.4 มลลลตร 30% (w/v) Bis-Acrylamide 1 มลลลตร 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 0.760 มลลลตร 10% SDS 0.06 มลลลตร 10% APS 0.06 มลลลตร TEMED 0.012 มลลลตร

83

2.5.2 สารละลายสาหรบ Native-PAGE 2.5.2.2 สารละลาย 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

ชง Tris-base (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) 6.06 กรม ละลายในน ากลนและ

ปรบ pH ดวย HCl หลงจากนนปรบปรมาตรใหเปน 100 มลลลตร ดวยนากลน 2.5.2.3 สารละลาย 1.5 M Tris-HCl pH 8.8

ชง Tris-base 18.17 กรม ละลายในน ากลน และปรบ pH ดวย HCl หลงจากนนปรบ

ปรมาตรใหเปน 100 มลลลตร ดวยนากลน 2.5.2.4 สารละลาย 30% (w/v) Bis-Acrylamide

เตรยม Acrylamide (Fluka, Buchs Switzerland; MW 71.08) 29.7% และ N,N’-methyene-

bisacrylamide (Fluka, Buchs Switzerland; MW 71.08) 0.3% ผสมใหเขากน 2.5.2.5 สารละลาย 10% (w/v) Amonium Persulphate

ชง Amonium Persulphate (Bio Basic Inc; MW 288.20) 0.1 กรม ละลายในน ากลน

ปรมาตร 1 มลลลตร 2.5.2.6 สารละลายสาหรบลางสยอม

Methanol (Fluka, Buchs Switzerland; MW 32.04) 160 มลลลตร Acetic acid (AMRESCO, USA; MW 192.13) 40 มลลลตร นากลน 200 มลลลตร

2.5.2.7 สารละลายสาหรบลางสยอม Destain II (Destaining solution)

84

Methanol (Fluka, Buchs Switzerland; MW 32.04) 20 มลลลตร Acetic acid (AMRESCO, USA; MW 192.13) 28 มลลลตร นากลน 352 มลลลตร

2.5.2.8 สสงเคราะหสาหรบผสมโปรตน (4xgel loading dye) สาหรบ Native-

PAGE นา 4 mM EDTA (Fluka, Buchs Switzerland; MW 292.25) , 40% glycerol (Riedel-de

Haën, Germany; MW 92.09) , 1.45 mM bromophenol blue (Fluka, Buchs Switzerland; MW 699.99) และ 200 mM Tris-HCl (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) pH 7.5 นามาผสมใหเขากน

2.5.2.9 สารละลายบฟเฟอร Tris-glycine

เตรยม 25 mM Tris-HCl (Riedel-de Haën, Germany; MW 121.14) pH 8.3, และ 192 mM

Glycine (GibcoBRL,USA; MW 75.05) ผสมใหเขากน 2.5.2.10 4-methylumbelliferyl -D-galactosidase

นา 0.5 M Acetate buffer pH 10 ผสมกบ 3.5 mg/ml 4-Methylumbeliferyl -D-

galactosidase (Fluka, Buchs Switzerland; MW 338.32) ใหเขากน 2.5.2.11 Sepharose gel 12% (Separating gel)

นากลน 6.4 มลลลตร 30% (w/v) Bis-Acrylamide 8 มลลลตร 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 5.2 มลลลตร 10% APS 0.2 มลลลตร TEMED (Fluka, Buchs Switzerland; MW 166.21) 0.012 มลลลตร

85

2.5.2.12 Sepharose gel 5% (Stacking gel) นากลน 4.4 มลลลตร 30% (w/v) Bis-Acrylamide 1 มลลลตร 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 0.760 มลลลตร 10% APS 0.06 มลลลตร TEMED 0.012 มลลลตร

2.5.3 สารละลายสาหรบ Gel filtration

2.5.3.1 Lysozyme (Hen egg white, Fluka, Switzerland; MW 14600)

ผสมเอนไซมใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ

10 มลลกรม /มลลลตร 2.5.3.2 Trypsin (Albumin from hen egg white, Sigma, USA; MW 23800)

ผสมเอนไซมใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ

10 มลลกรม /มลลลตร

2.5.3.3 Protenase K (Albumin from bovince serum, USB, UK; 28900) ผสมเอนไซมใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ

10 มลลกรม /มลลลตร 2.5.3.4 Lipase (Aspergillus niger, Fluka, Switzerland; MW 45000)

ผสมเอนไซมใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ

10 มลลกรม /มลลลตร

86

2.5.3.5 Amyloglucosidase (Sigma, USA; MW 97000) ผสมเอนไซมใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ

10 มลลกรม /มลลลตร

2.6 สารเคมสาหรบการการศกษาและระบสายพนธของเชอ

2.6.1 สารเคมสาหรบการศกษาลกษณะของจลนทรยโดยทางจลชววทยา/ชวเคม 2.6.1.1 Gram crystal violet 0.25%

ชง Crystal violet (Fluka, Buchs Switzerland) 0.5 กรม ละลายในน ากลนปรมาตร 200

มลลลตร

2.6.1.2 Gram iodine ชงโซเดยมไฮดรอกไซด (Lab-Scan, Thailand) 0.4 กรม ละลายในน ากลนปรมาตร 100

มลลลตร และเตมไอโอดน (Fluka, Buchs Switzerland) 20.0 กรม หลงจากนนเตมโพแทสเซยมไอโอไดด (Riedel-de Haen) 1 กรม แลวคนใหเขากน

2.6.1.3 Gram safranin (Counterstain) 0.2 %

ชง Safranin T (Fluka, Buchs Switzerland) 0.2 กรม ละลายในนากลนปรมาตร 100 มลลลตร

2.6.1.4 Malachite green 0.5%

ชง Malachite green oxalate (Fluka, Buchs Switzerland) 0.5 กรม ละลายในน ากลน

ปรมาตร 100 มลลลตร

87

2.6.1.5 สารละลายไฮโดรเจนเปอรออกไซด 3% (Catalase reagent) นา 30% ไฮโดรเจนเปอรออกไซดปรมาตร 1 มลลลตร และปรบปรมาตรใหเปน 10

มลลลตรดวยนากลน

ภาคผนวก ข

1. กราฟมาต

1.1 ส0.0098 กรมมลลลตร ไดค 1.2 มลลลตร แลมลลลตร จะไ

1.3 เเหมาะสม โดและ บฟเฟอร

1.4 ด(Blank ใชสปฏกรยาโดย

1.5 ว8.SG8 07393เขมขนของ o

1.6 กจากกราฟมาต

โดย

กาหµmole ของ oสามารถคาน

รฐานสารละล

สารละลาย o-ม ละลายดวยความเขมขนเสารละลาย oลวเตมสารละไดความเขมขเจอจาง o-nitrดยเตม Stock ร (ml) ทปรมดดสารละลายสารละลายฟอสารละลายโซวดคาการดด30; USA) oNP กบคากาการหา Activiตรฐานของ o y คอ ค

x คอ คหนดให 1 หนoNP จาก oNPวณหา Activi

กราฟ

ลาย oNP

-nitrophenol ยสารละลายฟเทากบ 2.82 มo-nitrophenolะลายฟอสเฟตขนสดทายเทาrophenol ดวยsolution II (mาตร 1000, 97ย o-nitrophenสเฟตบฟเฟอซเดยมคารบอกลนแสงดวยทความยาวครดดกลนแสงity ของตวอยNP สามารถหาการดดกลนวามเขมขนขอวย (Unit, U)

PG ในเวลา 1 ity ไดจาก

ภาคผนว

ฟมาตรฐาน แ

(oNP) Stock ฟอสเฟตบฟเฟมลลโมลาร l (oNP) Stocตบฟเฟอร 50ากบ 0.651 มลยสารละลายฟml) ทปรมาต75, 950, 925, nol ทมการเจออร 50 มลลโอเนต 0.4 โมลยเครองUV ลน 420 นาโง ดงภาพท 33ยาง หาคา y แสงทความยอง oNP (มล ของ -galaนาท ภายใตส

วก ข

ละการคานวณ

solution I: ชฟอร 50 มลล

ck solution II0 มลลโมลารลลโมลาร ฟอสเฟตบฟเฟตร 0 , 25, 50,

900, 875, 85อจางปรมาตรโมลาร พเอชลาร ปรมาตร 7

spectrophotนเมตร นาคา

3 และ ตารางท

าวคลน 420 นลโมลาร)

actosidase คอสภาวะททากา

ณ

ชง oNP (Flukลโมลาร pH

I: ดดจาก Stoร pH 6.5 ป

ฟอร 50 มลลโ 75, 100, 125

50, 800 ตามลร 500 ไมโครช 6.5 แทนต750 ไมโครลตtometer (Spาทไดไปเขยนท 12

นาโนเมตร

อ ปรมาณของารทดลอง

ka, Buchs Swi6.5 ปรมาต

ock solution ปรบปรมาตรเ

โมลาร พเอช 5, 150, 200 ตาดบ ลตร ใสใน Eวอยางเอนไซตร pectronic®Gนกราฟมาตรฐ

งเอนไซมททา

89

itzerland) ตร 25.00

I มา 3.0 ปน 10.0

6.5 อยางตามลาดบ

Eppendrof ซม) หยด

Genesys™ ฐานความ

าใหเกด 1

90

ตารางท 12 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ oNP กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 420 นาโนเมตร

ปรมาตรสารละลาย oNP 0.864 ไมโครโมลตอมลลลตร

ปรมาตร50 mM NaH2PO4.2H2O

pH 6.5 ไมโครลตร

ความเขมขนสารละลาย oNP ไมโครโมลตอมลลลตร

OD 420

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3 เฉลย

0 1000 0 0 0 0 0

25 975 0.0613 0.11 0.109 0.109 0.109

50 950 0.0326 0.195 0.194 0.195 0.195

75 925 0.0488 0.276 0.275 0.276 0.276

100 900 0.0651 0.374 0.378 0.376 0.376

125 875 0.0814 0.493 0.496 0.498 0.496

150 850 0.0997 0.625 0.626 0.622 0.624

200 800 0.1302 0.815 0.81 0.814 0.813

91

ภาพท 33 กราฟมาตรฐานสารละลาย oNP 2. กราฟมาตรฐานโปรตน

การเตรยมกราฟมาตรฐานของโปรตน โดยวเคราะหตามวธของ Bradford (Bradford, 1976) วธนอาศยการจบกนระหวางส Coomassie-Brilliant blue G-250 กบโปรตนซงทาใหคาการดดกลนแสงสงสดของสเลอน (shift) จาก 465 นาโนเมตร (สแดง) ไปท 595 นาโนเมตร (สน าเงน) เปนวธทรวดเรวและมความไวสง เหมาะสาหรบหาปรมาณโปรตนในชวง 1 ถง 140 ไมโครกรม

2.1 เตรยมสารละลาย Bradford dye reagent โดยละลาย Coomassie-Brilliant blue G-250 (Fluka, Buchs Switzerland) จานวน 100 มลลกรม ใน 50 มลลลตร ของ 95% เอทานอล (Lab Scan, Ireland) เตม 100 มลลลตร ของ 85% phosphoric acid (Lab Scan, Ireland) ปรบปรมาตรใหเปน 1 ลตร ดวยนากลนเกบไวในขวดสชาสารละลายทไดมความเสถยรทอณหภมหองเปนเวลา 2 สปดาห

2.2 เตรยมสารละลาย Bovine serum albumin (BSA) (Fluka, Buchs Switzerland) ทความเขมขน 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 และ 1.0 มลลกรมตอมลลลตรในนากลน

2.3 ปเปต BSA ในแตละความเขมขนใสหลอดทดลองละ 0.1 มลลลตร และเตม Dye reagent ปรมาตร 5 มลลลตร ทงทอณหภมหอง 5 นาท

2.4 วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง UV spectrophotometer (Spectronic®Genesys™ 8.SG8 073930; USA) ทความยาวคลน 595 นาโนเมตรนาคาทไดไปเขยนกราฟมาตรฐานความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสง ดงภาพท 34 และ ตารางท 13

y = 6.138xR2 = 0.997

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

oNP concentration (mM)

OD

420

92

2.5 การหาปรมาณโปรตน จากกราฟมาตรฐานของโปรตน จะไดสมการ y

โดย y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร x คอ ความเขมขนของโปรตน (มลลกรม/มลลลตร)

สามารถคานวณหาปรมาณโปรตนไดดงน

ตารางท 13 ความสมพนธระหวางความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลนท 595 นาโนเมตร

BSA (mg/ml)

OD 595 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0 0 0 0

0.2 0.114 0.116 0.118 0.116

0.4 0.258 0.268 0.252 0.259

0.6 0.354 0.34 0.334 0.343

0.8 0.437 0.431 0.461 0.444

1 0.581 0.582 0.578 0.58

93

ภาพท 34 กราฟมาตรฐานโปรตน 3. กราฟมาตรฐาน เจลฟลเตรชน

3.1 โปรตนทใชคอ Lysozyme (Hen egg white, Fluka, Switzerland; MW 14600) Trypsin

(Albumin from hen egg white, Sigma, USA; MW 23800), Protenase K (Albumin from bovince serum, USB, UK; 28900), Lipase (Aspergillus niger, Fluka, Switzerland; MW 45000), Amyloglucosidase (Sigma, USA; MW 97000)

3.2 ผสมโปรตนททราบน าหนกโมเลกลใน Buffer (50 mM NaPP + 100 mM NaCl, pH 6.5) ใหมความเขมขนเทากบ 10 mg/ml 3.3 หาน าหนกโมเลกลของเอนไซมดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (AKTA TM FPLC with Frac-950; Amersham Pharmacia, Sweden) โดยผาน Gel filtration ทภายในคอลมนบรรจ Biogel P-100 อตราการไหล 0.1 ml/min เขยนกราฟมาตรฐานน าหนกโมเลกลของโปรตนกบเวลาทถกชะออกจากคอลมน ดงภาพท 35 และ ตารางท 14

y = 0.5763xR2 = 0.995

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Protein concentration (mg/ml)

OD

595

94

ตารางท 14 ความสมพนธระหวางนาหนกโมเลกลของโปรตนกบเวลาทถกชะออกจากคอลมน

Protein MW Elute(ml) Time(Min) Lysozyme 14600 75.00 570.00

Trypsin 23800 72.00 720.00

Protenase K 28900 70.00 700.00

Lipase 45000 65.00 650.00

Amyloglucosidase 97000 40.00 400.00

ภาพท 35 กราฟมาตรฐานเจลฟลเตรชน

95

4. การคานวณหาพารามเตอรของการทาบรสทธของเอนไซม Specific activity Specific activity (U / mg) = activity (U / mg) protein (mg / ml) Total activity Total activity (U) = activity (U / mg) x volume (ml) Total protein Total protein (mg) = protein (mg / ml) x volume (ml) Purification fold Purification fold = Specific activity (U / mg) Specific activity of crude (U/mg) % Recovery

% Recovery = Total activity (U) Total activity of crude (U)

ภาคผนวก ค

97

ภาคผนวก ค

ขอมลผลการทดลอง ตอนท 1. การเตรยมเอนไซม -galactosidase ตารางท 15 การหากจกรรมของเอนไซม -galactosidase จากการทาใหเซลลแตก

เชอ กจกรรมของเอนไซม -galatocsidase (U/ml)

B 1.2 1.72 ตอนท 2 การทาบรสทธเอนไซม -galactosidase ตารางท 16 ผลการทาบรสทธเอนไซม -galactosidase

Purification Step Total

activity (U)

Total Protein

(mg)

Specific activity (U/mg

protein)

Purification (Fold)

Recovery (%)

Crude enzyme 25.8 89.6 0.29 1 100

DEAE+Ultrafiltration 24.3 37.1 0.65 2.24 94.1

Affinity+Ultrafiltration 22.3 20.3 1.1 3.79 86.4

98

ตอนท 3. การศกษาคณลกษณะสมบตของเอนไซม (Characterization) ตารางท 17 การศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidase (Dilute 10 เทา)

อณหภม (°C)

OD 420 Enzyme activity (U/ml)

% Relative activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

40 0.152 0.15 0.152 0.151 1.027 47.34

45 0.165 0.164 0.16 0.163 1.106 50.99

50 0.241 0.242 0.245 0.243 1.647 75.91

55 0.291 0.293 0.294 0.293 1.987 91.55

60 0.32 0.318 0.321 0.32 2.17 100

65 0.195 0.193 0.192 0.193 1.312 60.48

70 0.142 0.145 0.144 0.144 0.975 44.94

75 0.136 0.135 0.131 0.134 0.91 41.92

80 0.13 0.131 0.128 0.13 0.88 40.57

99

ตารางท 18 การศกษา pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม -galactosidase (Dilute 10 เทา)

pH OD 420 Enzyme

activity (U/ml) % Relative

activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

3 0.002 0.001 0.001 0.001 0.009 0.54

4 0.015 0.014 0.018 0.016 0.106 6.31

5 0.112 0.116 0.11 0.113 0.765 45.37

6 0.224 0.224 0.226 0.225 1.525 90.47

6.5 0.248 0.251 0.246 0.248 1.686 100.00

7 0.215 0.212 0.214 0.214 1.450 86.04

8 0.132 0.133 0.13 0.132 0.894 53.02

9 0.098 0.097 0.097 0.097 0.661 39.19

10 0.059 0.057 0.058 0.058 0.394 23.36

100

ตารางท 19 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 3, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD 420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.036 0.035 0.035 0.035 0.240 100

1 0.01 0.012 0.01 0.011 0.072 30.169

2 0.005 0.003 0.003 0.004 0.025 10.371

6 0.005 0.001 0.003 0.003 0.020 8.485

0 0.036 0.035 0.035 0.035 0.240 100 ตารางท 20 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 4, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.172 0.171 0.172 0.172 1.165 100

1 0.054 0.051 0.053 0.051 0.346 29.716

2 0.043 0.042 0.044 0.043 0.292 25.054

3 0.029 0.031 0.03 0.030 0.204 17.480

4 0.027 0.03 0.031 0.029 0.199 17.091

5 0.03 0.028 0.03 0.029 0.199 17.091

6 0.017 0.017 0.017 0.017 0.115 9.905

12 0.005 0.005 0.005 0.005 0.034 2.913

101

ตารางท 21 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 5, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.267 0.27 0.274 0.270 1.835 100

1 0.199 0.193 0.197 0.196 1.333 72.627

2 0.176 0.181 0.18 0.179 1.215 66.215

3 0.158 0.156 0.154 0.156 1.059 57.707

4 0.155 0.156 0.155 0.155 1.054 57.461

5 0.153 0.152 0.151 0.152 1.032 56.228

6 0.152 0.154 0.151 0.152 1.034 56.351

7 0.151 0.153 0.15 0.151 1.027 55.981

8 0.149 0.15 0.149 0.149 1.014 55.241

9 0.143 0.15 0.144 0.146 0.989 53.885

10 0.143 0.146 0.148 0.146 0.989 53.885

11 0.136 0.138 0.141 0.138 0.939 51.172

12 0.123 0.126 0.128 0.126 0.853 46.486

102

ตารางท 22 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 6, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.286 0.285 0.286 0.286 1.939 100

1 0.237 0.24 0.236 0.238 1.613 83.202

2 0.224 0.236 0.224 0.228 1.548 79.818

3 0.209 0.198 0.2 0.202 1.373 70.832

4 0.206 0.206 0.208 0.207 1.403 72.349

5 0.2 0.201 0.199 0.200 1.358 70.015

6 0.198 0.199 0.2 0.199 1.351 69.665

7 0.201 0.202 0.197 0.200 1.358 70.015

8 0.193 0.192 0.19 0.192 1.301 67.098

9 0.192 0.191 0.196 0.193 1.310 67.565

10 0.19 0.189 0.188 0.189 1.283 66.165

11 0.191 0.188 0.201 0.193 1.312 67.682

12 0.189 0.186 0.186 0.187 1.269 65.464

103

ตารางท 23 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 6.5, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.291 0.292 0.292 0.292 1.980 100

1 0.278 0.281 0.28 0.280 1.898 95.878

2 0.264 0.256 0.259 0.260 1.763 89.021

3 0.241 0.24 0.244 0.242 1.640 82.850

4 0.222 0.226 0.225 0.224 1.523 76.908

5 0.226 0.224 0.225 0.225 1.527 77.136

6 0.218 0.218 0.225 0.220 1.496 75.536

7 0.215 0.211 0.214 0.213 1.448 73.137

8 0.215 0.219 0.216 0.217 1.471 74.279

9 0.21 0.218 0.216 0.215 1.457 73.594

10 0.216 0.21 0.217 0.214 1.455 73.480

11 0.21 0.208 0.214 0.211 1.430 72.222

12 0.201 0.202 0.201 0.201 1.367 69.023

104

ตารางท 24 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 7, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.273 0.277 0.272 0.274 1.860 100

1 0.237 0.24 0.236 0.238 1.613 86.736

2 0.221 0.224 0.223 0.223 1.511 81.261

3 0.211 0.214 0.218 0.214 1.455 78.220

4 0.206 0.199 0.205 0.203 1.380 74.206

5 0.202 0.201 0.202 0.202 1.369 73.597

6 0.195 0.191 0.19 0.192 1.303 70.070

7 0.189 0.187 0.188 0.188 1.276 68.610

8 0.182 0.184 0.182 0.183 1.240 66.664

9 0.181 0.183 0.18 0.181 1.231 66.177

10 0.179 0.182 0.184 0.182 1.233 66.299

11 0.182 0.184 0.182 0.183 1.240 66.664

12 0.177 0.169 0.173 0.173 1.174 63.136

105

ตารางท 25 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 8, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.262 0.264 0.263 0.263 1.785 100

1 0.224 0.239 0.23 0.231 1.568 87.845

2 0.212 0.219 0.211 0.214 1.453 81.380

3 0.199 0.214 0.211 0.208 1.412 79.098

4 0.199 0.192 0.191 0.194 1.317 73.774

5 0.192 0.19 0.191 0.191 1.297 72.634

6 0.193 0.19 0.191 0.191 1.299 72.760

7 0.191 0.194 0.19 0.192 1.301 72.887

8 0.182 0.187 0.19 0.186 1.265 70.859

9 0.186 0.181 0.187 0.185 1.254 70.225

10 0.181 0.184 0.187 0.184 1.249 69.972

11 0.178 0.182 0.181 0.180 1.224 68.577

12 0.165 0.172 0.169 0.169 1.145 64.141

106

ตารางท 26 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 9, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.279 0.278 0.279 0.279 1.892 100

1 0.237 0.228 0.23 0.232 1.573 83.116

2 0.22 0.223 0.22 0.221 1.500 79.289

3 0.203 0.207 0.204 0.205 1.389 73.429

4 0.199 0.204 0.198 0.200 1.360 71.874

5 0.201 0.202 0.204 0.202 1.373 72.592

6 0.201 0.202 0.201 0.201 1.367 72.233

7 0.195 0.193 0.197 0.195 1.324 69.961

8 0.195 0.196 0.198 0.196 1.333 70.439

9 0.196 0.192 0.194 0.194 1.317 69.602

10 0.197 0.191 0.193 0.194 1.315 69.483

11 0.186 0.183 0.181 0.183 1.244 65.775

12 0.172 0.174 0.178 0.175 1.186 62.666

107

ตารางท 27 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (pH 10, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.254 0.255 0.256 0.255 1.731 100

1 0.218 0.212 0.216 0.215 1.462 84.442

2 0.212 0.211 0.212 0.212 1.437 83.004

3 0.201 0.205 0.204 0.203 1.380 79.736

4 0.191 0.188 0.19 0.190 1.287 74.377

5 0.191 0.194 0.186 0.190 1.292 74.638

6 0.189 0.192 0.191 0.191 1.294 74.769

7 0.183 0.184 0.183 0.183 1.244 71.893

8 0.188 0.18 0.183 0.184 1.247 72.024

9 0.181 0.183 0.181 0.182 1.233 71.239

10 0.184 0.182 0.181 0.182 1.238 71.501

11 0.178 0.176 0.182 0.179 1.213 70.063

12 0.166 0.167 0.168 0.167 1.134 65.488

108

ตารางท 28 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (40 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.228 0.226 0.227 0.227 1.541 100

1 0.216 0.213 0.218 0.216 1.464 95.000

2 0.212 0.211 0.21 0.211 1.432 92.944

3 0.206 0.21 0.212 0.209 1.421 92.210

4 0.201 0.202 0.202 0.202 1.369 88.833

5 0.199 0.195 0.198 0.197 1.339 86.924

6 0.198 0.199 0.192 0.196 1.333 86.483

7 0.197 0.19 0.191 0.193 1.308 84.868

8 0.191 0.19 0.192 0.191 1.297 84.134

9 0.194 0.193 0.19 0.192 1.306 84.722

10 0.184 0.185 0.184 0.184 1.251 81.198

11 0.181 0.179 0.184 0.181 1.231 79.876

12 0.18 0.183 0.177 0.180 1.222 79.289

109

ตารางท 29 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (45 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.228 0.229 0.228 0.228 1.550 100

1 0.216 0.21 0.218 0.215 1.457 94.010

2 0.209 0.21 0.211 0.210 1.425 91.966

3 0.205 0.208 0.206 0.206 1.401 90.361

4 0.19 0.193 0.191 0.191 1.299 83.792

5 0.19 0.191 0.192 0.191 1.297 83.646

6 0.19 0.191 0.19 0.190 1.292 83.354

7 0.191 0.188 0.191 0.190 1.290 83.208

8 0.182 0.181 0.186 0.183 1.242 80.142

9 0.182 0.181 0.186 0.183 1.242 80.142

10 0.181 0.18 0.182 0.181 1.229 79.266

11 0.182 0.184 0.178 0.181 1.231 79.412

12 0.179 0.18 0.181 0.180 1.222 78.828

110

ตารางท 30 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (50 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.223 0.22 0.221 0.221 1.502 100

1 0.185 0.187 0.186 0.186 1.263 84.059

2 0.18 0.184 0.182 0.182 1.235 82.251

3 0.182 0.178 0.176 0.179 1.213 80.745

4 0.176 0.178 0.176 0.177 1.199 79.841

5 0.171 0.17 0.171 0.171 1.158 77.130

6 0.166 0.169 0.17 0.168 1.143 76.075

7 0.161 0.161 0.159 0.160 1.088 72.460

8 0.158 0.154 0.154 0.155 1.054 70.200

9 0.156 0.156 0.157 0.156 1.061 70.652

10 0.156 0.155 0.151 0.154 1.045 69.597

11 0.152 0.15 0.151 0.151 1.025 68.242

12 0.151 0.151 0.15 0.151 1.023 68.091

111

ตารางท 31 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (55 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.221 0.22 0.22 0.220 1.496 100

1 0.198 0.193 0.197 0.196 1.330 88.934

2 0.192 0.19 0.192 0.191 1.299 86.816

3 0.19 0.19 0.192 0.191 1.294 86.514

4 0.19 0.195 0.19 0.192 1.301 86.967

5 0.157 0.156 0.158 0.157 1.066 71.238

6 0.146 0.148 0.146 0.147 0.996 66.549

7 0.146 0.148 0.146 0.147 0.996 66.549

8 0.143 0.143 0.144 0.143 0.973 65.037

9 0.142 0.142 0.142 0.142 0.964 64.432

10 0.142 0.139 0.137 0.139 0.946 63.222

11 0.14 0.136 0.138 0.138 0.937 62.617

12 0.13 0.133 0.131 0.131 0.891 59.592

112

ตารางท 32 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (60 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.228 0.224 0.226 0.226 1.534 100

1 0.217 0.218 0.22 0.218 1.482 96.613

2 0.22 0.216 0.22 0.219 1.484 96.761

3 0.216 0.215 0.219 0.217 1.471 95.876

4 0.208 0.203 0.208 0.206 1.401 91.303

5 0.202 0.198 0.199 0.200 1.355 88.353

6 0.188 0.19 0.188 0.189 1.281 83.486

7 0.18 0.178 0.182 0.180 1.222 79.651

8 0.171 0.17 0.169 0.170 1.154 75.226

9 0.159 0.16 0.159 0.159 1.082 70.506

10 0.144 0.147 0.145 0.145 0.987 64.310

11 0.132 0.135 0.133 0.133 0.905 59.000

12 0.125 0.128 0.13 0.128 0.867 56.493

113

ตารางท 33 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (65 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.221 0.22 0.222 0.221 1.500 100

1 0.181 0.187 0.186 0.185 1.254 83.568

2 0.18 0.177 0.18 0.179 1.215 81.003

3 0.17 0.168 0.171 0.170 1.152 76.780

4 0.157 0.155 0.159 0.157 1.066 71.048

5 0.142 0.139 0.142 0.141 0.957 63.807

6 0.131 0.129 0.13 0.130 0.882 58.829

7 0.127 0.131 0.127 0.128 0.871 58.075

8 0.113 0.113 0.116 0.114 0.774 51.589

9 0.1 0.103 0.1 0.101 0.686 45.706

10 0.092 0.095 0.093 0.093 0.634 42.236

11 0.085 0.083 0.086 0.085 0.575 38.314

12 0.076 0.078 0.08 0.078 0.529 35.298

114

ตารางท 34 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (70 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.231 0.228 0.227 0.229 1.552 100

1 0.004 0.001 0.003 0.003 0.018 1.166

2 0.004 0.001 0.001 0.002 0.014 0.875

3 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.729

12 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.729 ตารางท 35 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (75 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.23 0.229 0.231 0.230 1.561 100

1 0.004 0.001 0.003 0.003 0.018 1.160

2 0.004 0.001 0.001 0.002 0.014 0.870

3 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.725

12 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.725

115

ตารางท 36 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม -galactosidase (80 องศาเซลเซยส, Dilute 10 เทา)

Time (hr)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.228 0.227 0.224 0.226 1.536 100

1 0.004 0.001 0.003 0.003 0.018 1.178

2 0.004 0.001 0.001 0.002 0.014 0.884

3 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.737

12 0.003 0.001 0.001 0.002 0.011 0.737 ตารางท 37 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.207 0.213 0.212 0.211 1.430 100.000

116

ตารางท 38 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Na+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.204 0.206 0.207 0.206 1.396 97.627

10 0.196 0.195 0.195 0.195 1.326 92.722

100 0.18 0.206 0.201 0.196 1.328 92.880

ตารางท 39 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (K+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.215 0.211 0.21 0.212 1.439 100.633

10 0.217 0.213 0.214 0.215 1.457 101.899

100 0.207 0.195 0.202 0.201 1.367 95.570

117

ตารางท 40 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mg2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.203 0.203 0.205 0.204 1.382 96.678

10 0.24 0.23 0.236 0.235 1.597 111.709

100 1.4 1.357 1.378 1.378 9.356 654.275 ตารางท 41 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Fe2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.514 0.527 0.517 0.519 3.525 246.520

10 1.172 1.178 1.182 1.177 7.992 558.863

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000

118

ตารางท 42 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mn2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.23 0.235 0.238 0.234 1.591 111.235

10 0.667 0.678 0.657 0.667 4.530 316.773

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000 ตารางท 43 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Ca2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.196 0.186 0.192 0.191 1.299 90.823

10 0.222 0.232 0.221 0.225 1.527 106.804

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000

119

ตารางท 44 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Co2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.212 0.219 0.22 0.217 1.473 103.007

10 0.417 0.407 0.417 0.414 2.808 196.361

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000 ตารางท 45 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Zn2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.19 0.187 0.194 0.190 1.292 90.348

10 0.116 0.128 0.122 0.122 0.828 57.912

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000

120

ตารางท 46 การศกษาชนดของไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Cu2+, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.123 0.135 0.126 0.128 0.869 60.760

10 0.143 0.144 0.137 0.141 0.959 67.089

100 0 0 0 0.000 0.000 0.000 ตารางท 47 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.326 0.324 0.336 0.329 2.231 100.000 ตารางท 48 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Galactose ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.253 0.254 0.244 0.250 1.699 76.166

10 0.189 0.191 0.193 0.191 1.297 58.113

100 0.068 0.061 0.065 0.065 0.439 19.675

121

ตารางท 49 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Glucose ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.271 0.262 0.267 0.267 1.810 81.136

10 0.254 0.252 0.254 0.253 1.720 77.079

100 0.201 0.19 0.189 0.193 1.312 58.823 ตารางท 50 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Lactose ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.287 0.281 0.278 0.282 1.914 85.801

10 0.226 0.224 0.223 0.224 1.523 68.255

100 0.087 0.093 0.09 0.090 0.611 27.383

122

ตารางท 51 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Xylital ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.292 0.298 0.293 0.294 1.998 89.553

10 0.272 0.273 0.278 0.274 1.862 83.468

100 0.244 0.247 0.242 0.244 1.659 74.340 ตารางท 52 การศกษาชนดของน าตาล ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Xylose ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.305 0.294 0.301 0.300 2.036 91.277

10 0.279 0.275 0.277 0.277 1.880 84.280

100 0.253 0.251 0.249 0.251 1.704 76.369 ตารางท 53 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (None ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0 0.24 0.239 0.241 0.240 1.629 100.000

123

ตารางท 54 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (DTT ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.229 0.23 0.228 0.229 1.554 95.424

10 0.228 0.232 0.23 0.230 1.561 95.840

100 0.238 0.236 0.238 0.237 1.611 98.896

ตารางท 55 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (EDTA ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.228 0.231 0.227 0.229 1.552 95.285

10 0.228 0.227 0.228 0.228 1.545 94.868

100 0.038 0.04 0.038 0.039 0.262 16.112

124

ตารางท 56 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Urea ,Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.24 0.238 0.239 0.239 1.622 99.591

10 0.24 0.238 0.24 0.239 1.625 99.730

100 0.231 0.234 0.228 0.231 1.568 96.257 ตารางท 57 การศกษาชนดของ Reagents ทมผลตอกจกรรมของเอนไซม -galactosidase (Mercaptoethanol, Dilute 10 เทา)

Concentration (mM)

OD420 Enzyme activity (U/ml)

% Residue activity ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

1 0.227 0.232 0.234 0.231 1.568 96.257

10 0.212 0.215 0.213 0.213 1.448 88.895

100 0.197 0.198 0.2 0.198 1.346 82.645

125

ตารางท 58 ผลการหาคาจลศาสตรของเอนไซม -galactosidase

Concentration

ปรมาณ oNP ทเกดขนตอนาท (mM oNP/min) 1/S 1/V

(mM oNPG) ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 1/mM oNPG

1/mM oNP/mi

m

1.5071 0.000413 0.000391 0.000391 0.000398 0.664 2511

3.0141 0.000869 0.000934 0.000945 0.000916 0.332 1091.739

4.5212 0.001216 0.00126 0.001282 0.001253 0.221 798.295

6.0282 0.001423 0.001466 0.001466 0.001452 0.116 688.803

7.5353 0.001792 0.001814 0.001846 0.001817 0.133 550.219

9.0423 0.002042 0.002064 0.002009 0.002038 0.111 490.604

10.5494 0.002227 0.002205 0.002151 0.002194 0.095 455.792

12.0564 0.002335 0.002389 0.002368 0.002364 0.083 422.986

18.0846 0.002791 0.00277 0.002824 0.002795 0.055 357.785

24.1129 0.00315 0.003074 0.003106 0.00311 0.041 321.548

30.1411 0.003486 0.003563 0.003541 0.00353 0.033 283.292

126

คาอธบายสญลกษณและคายอ

เบตา % เปอรเซนต ml มลลลตร L ลตร mg มลลกรม M โมลาร mmol มลลโมลาร nM นาโนเมตร KDa กโลดลตน mmolL-1min-1 มลลโมลตอลตรตอนาท oC องศาเซลเซยส h ชวโมง U หนวยของเอนไซม OD คาการดดกลนแสง rpm รอบตอนาท BOD Bilogical Oxygen Demand COD Chemical Oxygen Demand psi Pound per square inch

127

ประวตผวจย

ชอ-สกล นายสมยศ โอศรพนธ Mr. Somyos Osiriphun วน เดอน ปเกด 31 มกราคม 2523 ทอย 71/10 ถนนเศรษฐศร ตาบลสามเสนใน เขตพญาไท จงหวด

กรงเทพมหานคร 10400 ประวตการศกษา

พ.ศ. 2545 สาเรจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

พ.ศ. 2550 ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

ประวตการทางาน พ.ศ. 2551-ปจจบน ผชวยนกวจย สถาบนเทคโนโลยชวภาพและวศวกรรมพนธศาสตร

จฬาลงกรณมหาวทยาลย การเสนอผลงานวจย Poster presentation and Proceeding

พ.ศ. 2551 Somyos Osiriphun and Phimchanok Jaturapiree. Purification and some properties of -galactosidase from stain B1.2. The 4th Naresuan Research Conference, 28-29 July 2008, Phitsanulok, Thailand

Paper พ.ศ. 2552 Somyos Osiriphun and Phimchanok Jaturapiree. “Isolation and

characterization of -galactosidase from the thermophile B1.2.” As. J. Food Ag-Ind. 135-143.

Poster presentation พ.ศ. 2552 Somyos Osiriphun and Phimchanok Jaturapiree. “Isolation and

characterization of -galactosidase from the thermophile B1.2.” The Food Innovative Asia Conference 2009. 18-19 June, 2009. BITEC, Bangkok. Thailand