CHƯƠNG 1: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME

1 Các phương pháp phá vỡ tế bào

1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học

Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được

hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật,

thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay

mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác

bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong

thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải

được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay.

Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng

tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định.

- Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp

nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.

- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường

lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng.

Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra

khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế

bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần

đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ

học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.

* Phương pháp đồng hóa áp lực cao:

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công

nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng

va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực

cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có

khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví

dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp

lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào

thực vật ít khi phải dùng phương pháp này.

* Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi

thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường

hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy

tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.

1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học

Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp

không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học,

phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương

pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).

Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh,

hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp

này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình

thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn

hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là

acetone.

Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử

dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một

phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở

dạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp

này là, khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng

nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người

ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được

hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.

Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme). Có hai phương pháp hiện đang được sử

dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ

bên ngoài vào.

Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả

năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những

enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt

động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức

hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm

chết tế bào. Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào

các loại nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm

men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều

nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy

phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng

bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.

Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme

từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá

trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử

dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật.

Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong

mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp). Ngoài

ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.

2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme

Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các

thành phần khác gồm hai phương pháp:

- Phương pháp ly tâm

- Phương pháp lọc

2.2.1 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme,

phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme,

dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật,

muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.

Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy khi

tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô,

dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:

- Protein có hoạt tính sinh học

- Các chất hòa tan khác

- Nước

Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch.

Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì

còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.

Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều

thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV.

Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường

tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến

hành trong điều kiện nhiệt độ thấp.

Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch

enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời

gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme.

Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm

hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa.

Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một

số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu

tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.

2.2.2 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men,

người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme

ngoại bào hòa tan.

Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương

pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào

thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản

trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt

dịch lọc; sức đề kháng.

Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:

- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung

dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu

quả.

- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và

trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay

được sử dụng nhiều hơn cả.

- Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất

enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung

dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật

liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng

quá trình lọc của vật liệu chất rắn.

- Lọc thông thường. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một

số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng

những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.

2.3 Phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối

lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt

khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính

vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:

- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme

- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này

- Tăng khả năng bảo quản enzyme

- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản

- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất

Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những

phương pháp sau:

2.3.1 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng

nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm

với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzyme

nhân tạo). Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế

bào sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ

chết. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó

các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào

bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.

Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ

sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo nguồn thu

nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá

trình cô đặc.

Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch

giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao.

Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho

phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu

hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô

đặc là điều rất cần thiết.

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:

- Bốc hơi lớp mỏng

- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng

- Bốc hơi ống dài

2.3.2 Phương pháp kết tủa

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong

phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp

kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với

một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và

kết tủa dương.

- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ

không nằm trong phần tủa.

- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết

tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.

* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao

quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của

enzyme.

Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết

bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng

thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế

tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay

ammonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song

chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng

để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch

muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu

của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%.

* Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng

rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung

quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên.

Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết

tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý

đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol

hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi

hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các

dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có

mặt của muối vô cơ. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ

3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định

bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch

enzyme.

* Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được

ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của

chúng gần giống dung môi hữu cơ. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện

quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng

polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %). Nếu sử dụng

nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho

kỹ thuật làm sạch sau này. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong

nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều

là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau.

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết

tủa enzyme.

* Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng

có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ

này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở

khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện

thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời

gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi

hoạt tính enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và

thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.

2.3.3 Phương pháp siêu lọc

Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ.

Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp

tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc,

thẩm thấu ngược.

Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh

khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược

dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi

đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu

nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử

dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và

poly propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu

màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta

còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.

2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme

2.4.1 Phương pháp kết tinh

Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để

kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch

phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

2.4.2 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng

đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay

vẫn chưa được phát triển rộng rãi.

2.4.3 Phương pháp sắc ký

* Phương pháp sắc ký lọc gel. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong

cột dùng để tách enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký

cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được

tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.

* Sắc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử

protein. Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy

mô công nghiệp. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH.

Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.

* Sắc ký kỵ nước. Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử

protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá

trình phân đoạn với muối. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã

được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate.

* Sắc ký đồng hóa trị. Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái

tĩnh.

* Sắc ký ái lực. Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền

không hòa

tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.

2.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật

2.5.1 Thu nhận enzyme amylase

Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-

amylase (hay glucose) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và

các polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase (hay

dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside. Sáu loại amylase này được xếp thành

hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào), và exoamylase (enzyme ngoại bào). Enzyme

amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và

ngô. Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và phương

pháp điện di trên gel polyacrylamide

* Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký

Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa

trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5)

(dung dịch đệm A). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô

được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem như

dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4 (25 – 60%). Phần kết

tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng

trong 20 phút.

Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì

sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A;

enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được

lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn

amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose.

Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

* Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)

Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn

với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp

sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Phần

nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme.

Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau

khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác

định sự hiện diện của amylase.

2.5.2 Thu nhận enzyme bromelin từ dứa

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng

phân giải protein, được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).

Phương pháp thu nhận

Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin

Thu dịch enzyme thô

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với

tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa

bromelin.

Các phương pháp tách bromelin

Phương pháp kết tủa enzyme

Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong điều kiện sinh

lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết

hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch,

protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với

nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của

chúng. Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa được

enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng

cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái

lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho

protein tủa xuống.

Cách thực hiện:

- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị một lít dung dịch nước dứa sau ly tâm,

cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt được độ bão hòa

ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau đó ly tâm

với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.

- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96% (cũng

đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 00C

trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa

bằng acetone và thu nhận tủa.

- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể

tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-40C. Ly tâm

hốn hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích

acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-40C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.

Phương pháp hấp phụ

Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay

betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau. Cách làm: cho kaolin

khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg

kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa.

Tủa được gọi là bromelin-kaolin.

Phương pháp siêu lọc

- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để

tách các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào

kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy

theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được

nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng.

- Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng

336cm2. Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm

nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử

dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.

- Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung

dịch đệm phosphate 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng

khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein

bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6. Sau đó, tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ

nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl

0,5M khuấy trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc

chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, góp

các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme.

Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin

Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH

7,2. Sau khi tất cả enzyme hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc

có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được

chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như

trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau hai giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1

lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.

Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 1000C trong một giờ rồi nhồi vào cột (kích

thước cột 23,5x0,9cm). Đặt 1 cái phễu thủy tinh phía trên cột, cho sephadex từ từ vào

phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục cho đến

khi nhồi xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không

có bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng

1ml/7 phút.

Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate

0,02M, pH 7,2. Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột.

Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút.

Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme được thu đến khi

dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình

thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua

sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả

năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra

trong khoảng thời gian 1 giờ.

Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký

Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn

khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons.

Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành

phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có

hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 –

20.000 Dalton.

2.5.3 Thu nhận enzyme papain

Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S. Papain là một protease thiol,

là một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. Quá

trình thu nhận papain tinh khiêt gồm các bước sau:

- Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain còn chứa

một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các chất tạp

khác. Để có được quy trình tách và tinh sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì

phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn tạp

lớn… Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150 cát sạch, nghiền kỹ trong

cối ở nhiệt độ phòng 200-300ml dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein

hydrochloride trong 1.000 ml dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa

pH dịch chiết tới pH 5,7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở

trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa

cối với dung dịch cystein để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1 lít. Dịch huyền phù

sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào

nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước lọc có màu trắng sữa

hoặc màu xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch được tiến

hành trong điều kiện lạnh.

- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh

lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch

NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 2.600rpm

trong 1 giờ. Dịch chiết phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.

- Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate: Cho ammonium sulfate vào dịch

enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500rpm thu nhận tủa, bỏ dịch

lỏng hoặc có thể giử lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml

dung dịch ammonium sulfate 40% độ bão hòa.

- Quá trình phân đoạn bằng NaCl: hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cystein 0,02M

(pH7-7,5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ ly tâm ở

2.500rpm trong một giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng.

- Kết tinh: tủa được thành dịch huyền huyền phù với 400ml dung dịch cytein 0,002M,

pH 6,5 ở nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại pH 6,5

sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành,

sau đó duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2.500rpm trong 4-5 giờ để thu

nhận tinh thể.

- Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dịch

protein có nồng độ khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời

khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể

tích dung dịch NaCl đã cho vào papain đã bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch

huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa như ở bước 5. Hoạt độ

riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như

trên.

- Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ khoảng 400C, thu nhận papain tinh chế.

Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trong

dung dịch đệm phosphate chứa cystein, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc

4000A0. Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.

2.5.4 Thu nhận enzyme ficin

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl (-

SH). Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và

bromelin. Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch nhựa tươi từ cây sung. Quá trình sơ chế

dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các bước sau:

- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất.

- Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn

toàn trong nước.

- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông

đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên.

- Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn

và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn.

- Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất

trong các phân đoạn enzyme.

- Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với

tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ

được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C.

2.6. Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật

Tùy theo yêu cầu của ứng dụng enzym mà ta cần enzym sạch và enzym không

sạch(chế phẩm thô, chế phẩm tinh).

Chế phẩm enzym thô thường chứa nhiều loại enzym khác nhau, chứa thành phần

môi trường chưa được đồng hóa và vi sinh khối tế bào vi sinh vật.

Chế phẩm enzym tinh là sản phẩm được tách khỏi dung dịch môi trường và tách

khỏi tế bào vi sinh vật, sau đó được tinh sạch bằng cách kết tinh, làm khô. Các chế phẩm

enzym tinh khiết được ứng dụng sản xuất các sản phẩm tinh khiết, vô trùng. Thông

thường chế phẩm enzym tinh chứa một loại enzym, cũng có một số trường hợp enzym

tinh chứa một số enzym cùng loại. Các enzym tinh thưòng sử ụng trong công nghiệp nhẹ,

mỹ phẩm, y học và trong một số công nghệ thực phẩm.

Quá trình thu nhận enzym sạch được trình bày như sau:

2.6.1 .Thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt:

Việc thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt bao gồm 2 giai đoạn:

2.6.1.1.Chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt:

Công đoạn chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt rất phức tạp.

Giai đoạn tinh chế dễ hay khó phụ thuộc rất nhiều vào công đoạn này. Khi tiến

hành chiết rút enzym từ canh trường ta thu được không chỉ có enzym hòa tan trong nước

mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ ché của môi trường và cà chất màu

của chính nấm mốc tạo ra. Hiện nay có hai phương pháp chiết rút enzym từ canh trường

nuôi cấy bề mặt:

a. Phương pháp thủ công:

Trong phương pháp thủ công chế phẩm enzym thô được nghiền nhỏ( nghiền bằng

cối với các thạch anh hoặc với bột thủy tinh sau khi được xử lí sạch hoặc máy nghiền.

Mục đích của quá trình này là làm tăng khả năng thu nhận enzym trong dịch chiết từ tế

bào vi sinh vật. Dịch chiết thu nhận được từ phương pháp này rất đục do trong đó chứa

rất nhiều chầt khác nhau.

b. Phương pháp chiết rút enzym bằng các thiết bị khuếch tán.

Trong phương pháp chiết rút bằng các thiết bị khuếch tán, các enzym được chuyển

từ tế bào vào nước do sự chêch lệch nồng độ enzym từ tế bào vào nước. Thiết bị dùng

cho quá trình này bao gồm nhiều thiết bị khuếch tán được lắp đặt nối tiếp nhau. Quá trình

khuếch tán được thực hiện như sau:

Nước (dung môi) được đưa từ bể khuếch tán chứa chế phẩm nấm mốc có hàm

lượng enzym và các chất tan khác thấp nhất. Dung dịch sau khi khuếch tán chứa nồng độ

enzym cao hơn sẽ đi từ bể khuếch tán có chế phẩm nấm mốc mới nạp vào. Như vậy, vấn

đề trở nên phức tạp trong điều hành. Để dễ hiểu ta xem cách vận hành cụ thể như sau:

Chế phẩm nấm mốc được đưa vào bể khuếch tán thứ nhất, đồng thời ta đưa nước

vào, giữ chế phẩm nấm mốc trong nước một thời gian. Tuần tự như vậy ta tiến hành với

tất cả các bể còn lại. Dòng chảy của dịch khuếch tán từ bể này sang bể khác sẽ làm giàu

hơn lượng khuếch tán vào. Dịch khuếch tán cuối cùng sẽ được bơm vào bể thu nhận và từ

bể khuếch tán thứ nhất, sau khi tháo bã nấm mốc được nối vào vị trí cuối cùng của dãy

khuếch tán. Khi đó bể khuếch tán thứ hai trong lúc này của bể thứ nhất. Trong quá trình

khuếch tán, nhiệt độ được duy trì là 25-280 C và cho thêm focmalin để tránh nhiễm trùng.

Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp trong chân không để

hàm lượng chất khô ít hơn 50-55%.

2.6.2 Thu nhận enzym từ phương pháp bề sâu:

Dung dịch lên men từ phương pháp nuôi cấy bề sâu, sau khi tách khối vi sinh vật

chứa hàm lượng chất khô rất thấp (khoảng 1 – 3 %). Do đó, để giảm chi phí dung môi

hoặc muối trung tính trong quá trình kết tủa ta phải cô đặc dung dịch này.

Phương pháp cô đặc phải sao cho hoạt tính dung môi không thay đổi. Muốn vậy

dung dịch phải được cô chân không ở nhiệt độ thấp, khoảng 25 – 300C. Lượng dịch sau

cô đặc sẽ giảm 4 – 10 lần. Phương pháp tốt nhất là cho dịch qua cột nhựa trao đổi ion

hoặc các chất hoạt động bề mặt. Hiện nay, người ta áp dụng một số phương pháp thu

nhận enzym từ dịch lọc của phương pháp bề mặt sâu như sau:

a.Phưong pháp thu nhận enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ

hoặc bằng muối trung tính từ dịch chiết của canh trường nuôi bề mặt. Dịch nuôi cấy từ

phưong pháp bề sâu phải làm cô đặc lại. Thao tác và các yêu cầu kỳ thuật tương tự như

phương pháp thu nhận kết tủa enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt.

b.Phương pháp hấp thụ hoàn toàn bởi silicagen. Được thực hiện ở pH 4,7 – 4,9.

Cách tiến hành được thực hiên như sau: cho dịch enzym chảy qua cột nạp đầy silicagen.

Sau đó tách silicagen ra. Để tăng quá trình hấp phụ, người ta cho thêm 6 – 20% NaCl.

Sau đó silicagen được rửa bằng photphat natri ở pH= 8 – 8,4 hoặc bằng cacbonat natri

2%. Bằng cách này ta có thể thu được nước lọc từ canh trường nuôi cấy bề sâu xuống 8 –

10 lần. Sau đó rút enzym ra, silicagel được tái sinh lại bằng cách nung ở nhiệt độ 160 –

1700C hoặc cũng có thể xử lí bằng HCl 1N và rửa cẩn thận bằng nước cất.

Dung lượng hấp thụ của 1 gam silicagel là 60 – 120 - amilaza.

2.6.3 Tinh chế enzym

Để tinh chế enzym người ta dùng các dung môi hữu cơ để kết tủa, hoặc dùng một

số trung tính kết tủa.

a. Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzym bao gồm: etanol, izopropanol,

axeton. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Khi đó lực hút

và lực đẩy tỷ lệ thuận với hằng số điện môi. Do đó, trong dung dịch toàn bộ các protein

enzym và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử khác đều bị kết tủa. Do

sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và

đợt và sẽ lắng xuống.

Các yếu tố có ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm nồng độ dung môi, nhiệt độ,

phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzym. Kết tủa enzym bằng

etanol người ta thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật sau:

- Kết tủa trong điều kiện nhiệt độ từ 3 – 50 C. Thông thường, người ta phải làm lạnh

dung dịch chiết enzym và dung môi để tránh biến tính enzym.

- Khối lượng etanol cho vào gấp 3 – 4 lần thể tích dịch chiết enzym.

- Khuấy đều để phân phối etanol trong dung dịch.

- Sau khi có kết tủa đem lọc hoặc đem ly tâm để thu nhận kết tủa.

- Rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 – 3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa và

đem sấy chân không.

- Kết tủa enzym bằng izopropanol ta thực hiện các điều kiện kỹ thuật như sau:

+ Khối lượng izopropanol gấp 1,5 – 2 lần khối lượng dịch chiết enzym.

+ Các điều kiên khác thực hiện như thực hiện đối với etanol. Kểt tủa thu được từ

việc sử dụng etanol là một kết tủa dạng bột nhão và dính, do đo khi tiến hành sấy sễ

gặp rất nhiều khó khăn.

Kết tủa enzym bằng axetol ta cần lượng axetol nhiều hơn 1,5 – 2 lần dịch chiết

enzym. Điều lưu ý là axetol là một chất rất dễ gây cháy nổ, do đó việc thực hiện phải

rất cẩn thận.

Trong tất cả các phương pháp trên người ta cho thêm 0,2% CaCl2 để làm tăng

khả năng kết tủa của enzym và làm bền cấu trúc của chúng.

Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym kết tủa trên,

ta sẽ dựa trên độ hòa tan khác nhau trong hỗn hợp etanol và các enzym đó để tách.

b. Phương pháp kết tủa enzym bằng một số muối trung tính.

Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là: sulfat amon, sulfat natri, sulfat

magie.Trong đó người ta cho biết loại tốt nhất là sulfat amon vì độ hòa tan của chúng

cao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính các

enzym. Kết tủa bằng sulfat amon thường thu được các kết tủa enzym có hoạt tính cao hơn

các kết tủa enzym từ phương pháp dùng dung môi hữu cơ.

Nhược điểm lớn nhất của phương pháp kết tủa enzym bằng phương pháp trung

tính là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường tới 50 – 60% so với dung dịch chiết

enzym. Mặt khác, nếu trong phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa, thì ngoài

việc thu được kết tủa ta còn có thể tái thu hồi dung môi hữu cơ. Nhưng trong phương

pháp kết tủa bằng muối trung tính ta lại không thể tái thu hồi muối trung tính. Do đó, để

giảm giá thành ta có thể thực hiện bằng cách là làm cô đặc dịch chiết enzym trước khi

cho kết tủa enzym.

2.6.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV):

2.6.4.1. Thu nhận enzym protease từ VSV:

Nguồn thu nhận enzym protease:

Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có trong tế bào

hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theo

quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp, trong nông

nghiệp và trong y học.

Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease:

Vi khuẩn: Bac.subtilispha, Bac.cireulans, Bac.sphaericus, Bac.brevis, Bac.cerus…

Xạ khuẩn: Str.griseus, Str.rimous, Str.fradiae,…

Nấm mốc: Asp.oryzae, Asp.satoi, Asp.niegr, Pen.chrysogenum, Pen.cyaneo

fulvum, Mucor.pusillus

Các phương pháp thu nhận enzym protease

a. Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt

Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi.

Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2( đối với nấm sợi) hoặc từ 6,2-

7,2 ( đối với vi khuẩn). Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi

cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp

nhất ( thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất). Nói chung, đối với đa số

nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ. Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiết

rút enzym khỏi môi trường, loại bỏ nhũng phần không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối

vô cơ hay dung môi hữu cơ.

b. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu

Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng. Sau khi

làm lạnh, cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%. Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra

hoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy. Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cần

nhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc.

Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượng

oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV. Thể tích thùng lên men càng lớn

càng khó khống chế yếu tố này. Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3.Theo

các tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men(chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung

gian) sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm.

c. Thu nhận enzym protease:

Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSV

theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối loãng

hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nói

trên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc

hoặc li tâm, thu lấy dung dịch trong. Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzym

trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.

Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào

VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym. Quá trình này là một giai

đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật

bản đã tìm đựoc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường

nuôi cấy. Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường

làm giảm đáng kể hoạt động enzym.

2.6.4.2. Thu nhận enzym amylase từ VSV

Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym đựoc sử dụng rộng rãi trong nhất

trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác.

Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nói

riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814.

Các enzym amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong

hạt nảy mầm, nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và vi khuẩn.

Nguồn enzym amylase từ VSV

Trong thiên nhiên enzym có nhiều ở hầu hết ở thực vật, động vật và vi sinh vật.

Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùng

làm nguồn thu các chế phẩm enzym do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các

enzym này trong những điều kiện xác định.

Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thu enzym chỉ đạo.

Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzym amylase. Những chủng

VSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác và

thậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzym khác nhau.

VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn,

còn xạ khuẩn thì ít hơn.

. Thu nhận enzym amylase từ VSV

Muốn thu được các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập,

và chọn giống VSV để tuyên truyền lấy nhưng chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải

tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu

chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉ

phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các

điều kiện nuôi đặc hiệu.

Ngoài các yếu tố hóa học ( thành phần môi trường) ra, cá điều kiện lý hóa của quá

trình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzym amylase. Người

ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp. Ví

dụ, có thể dùng Bac.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hạơc chủ yếu là phức hệ

protease.

Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzym amylase

trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường, độ

tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu

tố cơ bản tối quan trọng. Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt và

phương pháp bề sâu.

a.Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt

Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ

( tinh bột, dextrin), hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành

phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.

Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám

mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất

của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Chất lượng của

cám mì, cám gạo có ảnh hưởng lứon tới hoạt lực của các emzym amylase.

Yêu câu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp

chất độc không quá 0.05%, nên dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng,

không hôi mùi mốc.

Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Các cấu tử được đưa vào có

thể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm

mạch (15-20%) , trấu( 2-25%) mùn cưa(5-10%), có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn( sau

khi tách lyenzym) làm cấu tử chính của môi trường.

Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để

đảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.

Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.5 atm trong vòng 4-6h, có thể thanh trùng loãng hơn

nóng ở nhiệt độ 120 độ C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin(40%) và

0,8% HCl kỹ thuật theo khối lương.

Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%, và giữ độ ẩm này trong

suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 55-

50% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzym amylase.

Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của

môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này

bằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ

thông khí có thể liên tiếp, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày

của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai

đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không

khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không

khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không

khí.

Nhiệt độ nuôi: tòan bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3

thời kỳ:

+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu

tiên), đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ

cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-30 độ C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ

32-38 độ C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí 96-100%

+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi ( kéo dài trong vòng 4-18 giờ). Thời kỳ

này cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy ngưòi ta thổi không

khí vô trùng có nhiệt độ 28-29 độ C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.

Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể thêm

nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu nước chiết bột đậu nành.

Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzym

amylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nông độ ionhydro trong môi trường và sự biến

đổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi.

Độ acid của canh trưởng đựoc xác định bởi thành phần và tính chất của các muối

vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV. Trước hết, pH

của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Nếu như thêm vào môi

trường các muối ammonium, thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải

phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi

trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzym amylase.

Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình VSV tiêu

thụ anion (NO3) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng

lên. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là 5.5-

5.7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm mạch và NaNO3 ). Trong

quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có

pH 7.8-8.2. Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng

NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase (là 7-8) khác

hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzym (pH 4,7-4,9). Khi điều chỉnh pH tới

giá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì họat lực -amylase cũng giảm

đi nhiều (gần bằng 23%). Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để

nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu

glucoamylase ngưòi ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột.

Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8.pH tối thích ban

đầu cho chủng này sinh trường là 7,0-7,2. Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0

(Fenikxova. Silova,1960). pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac. Subtilis nhằm thu hút -

amylase thích hợp nhất là 6,3-7,9. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đều

giảm vận tốc sinh tổng hợp enzym, còn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn hầu như không

phát triển.

Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng

của VSV và sự tạo thành các enzym amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ

dẫn đến làm giảm hoạt lục các enzym amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi

thuộc giống Aspergillus là 30-320C ( trong đó có Asp.oryzae 3-9-15 và Asp.awarmoni

22). Đối với -amylase, môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 370C.

Một số vi khuẩn khác laị có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn. .diataticus sinh

trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người

ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 500C nuôi

chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ

nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym tạo thành amylase của

Bac.coagulans và Bac.slerothermophilus đuợc nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác

xa nhau. Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị

mất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C

chỉ bị vô hoạt có 10-12% (Campell,1955). Các VSV ưa nhiệt(vi khuẩn) sinh tổng hợp nên

các amylase bền nhiệt. Enzym với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực

sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp. Vì

nuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về

độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm.

Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy

sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy.

Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên

lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó,

việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối

cũng như sinh tổng hợp các enzym của VSV.

Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiện

bằng nhiều cách khác nhau:

- Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi

- Bằng máy các kiểu chuyên dùng

- Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy

- Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men.

Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzym (cả

nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằng

sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi. Việc chọn

chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh

trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự

sinh tổng hợp enzym amylase nữa.

Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng (có

nhiệt độ cao không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi

trong khoảng 68-72 giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống

(48 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) phải

là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho

thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) tương ứng với 180

micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực

kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh

trưởng. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt

đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Điều này cũng dễ hiểu thôi, bởi lẽ ở

nhiệt độ tương đối cao (50-650C), độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống,

mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên.

Nguời ta nuôi Bac.subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 370C) có cánh

khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là

40m3/m3 môi trường/giờ. Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất (trong

48 giờ ở 370C) có cánh khuấy liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60m3/m3

môi trường/giờ. Thời gian nuôi VSV để có lượng amylase cực lớn trong phưong pháp

nuôi chìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng, vào phương pháp nuôi và một số

yếu tố liên quan. Việc xác minh thời gian nuôi tối thích cũng đựoc tiến hành bằng

thực nghiệm. Chẳng hạn ngưòi ta nuôi Asp.oryzae (3-9-15) trong thùng lên men nhân

giống 48 giờ, còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ. Lượng

giống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với tổng thể tích môi trưòng dinh

dưỡng.

Trong công nghiệp rượu, khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp gián

đoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ. Tuổi của nấm tốt nhất là 24-30 giờ và

lượng vật liệu gieo cấy là 10% so với tổng thể tích môi trường dinh dưỡng. Khi nuôi

bằng phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dòng chảy liên tục, thời gian

nuôi sez ngắn hơn rất nhiều (30-40 giờ) Asp.oryzae 22 sản sinh glucoamylase cũng

đựơc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52

giờ hay hơn nữa. Thời gian nuôi Bac.diastalicus ( để thu chế sản phẩm superbiolase

dùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống kéo dài 15

giờ, còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể

tích môi trường dinh dưỡng. Đối với Endomycopsis sp. Thời gian nuôi để có lượng

amylase cực lớn phải tới 80 giờ.

2.6.4.3. Thu nhận enzym pectinase từ VSV

Enzym pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự

phân hủy pectin trong tự nhiên thườn xảy ra khi trái cây chín. Những enzym này vì

vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.

. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt

Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám

gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là

các muối ammonim, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%.

Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h, sau đó giảm

xuống 240C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế

phẩm enzym thô và đem tinh chế.

Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được

trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate.

Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enym pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-

75%) hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa

0.79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu đựoc có độ tinh khiết

khoảng 90%, con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa

tối ưu đối với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly

tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy

thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.

2.6.4.4 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sâu

a. Phương pháp yếm khí:

Sự tích tụ enzum trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần

đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ

được sử dụng hoàn toàn.pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp.

Đối với nấm mốc,pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzym

pectinase.pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym pectinase. Khi pH dịch về phía

acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0 tuy sự tạo thành sinh khối khôngbị

ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các

trường nuôi cấy A.niger và A.awamori có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự.

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24.32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h.

Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi

truờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là

38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm

lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%.

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân

không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị

sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi

ra đạt 60-70%. Thời gian lưu của chế phẩm enztm trong thiết bị sấy phun phải không

quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu

được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chế sản phẩm pectinase

tinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ

4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối

ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ

pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trường

ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzym

bằng phươn pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ

bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp

(đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ

bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase

cao.

b. Phương pháp yếm khí:

Môi trường: Bã củ cải: 2%; (NH4)2HPO4: 0,75%, KH2P04:0,1%; CaCO3: 0,3%;

nước chiết ngô: 0,5%.

Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách

mạnh mẽ ở pha tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym sẽ tối đa

tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu cuả môi trường

dinh dưỡnglà 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường

bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích,Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở

nhiệt độ 350C.

Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần

môi trường gồm có:Lactose:20%; pectin củ cải: 1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4 :

0.3%; NaCl: 0,1%; MgSO4: 0.025 %; FeSO4: dạng viết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men

tự phân: 0.05%; ascorbic acid: 0,5%.

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa

enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung

môi hữu cơ,pH của dung dịch đã xử lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích

aceton thì họat độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.

Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế

phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ

thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase.

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thưòng theo

các bước cơ bản sau đây:

- Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)

- Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Bilogel A), hay trao đổi

cation (CM Bilogel A)

- Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang

- Tinh sạch bằng FPLC

Aliginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện

và thay thế pectate liên kết ngang.

2.6.4.5 Thu nhận enzym cellulase từ VSV

VSV sinh tổng hợp cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulase bị phân hủy vởi VSV cả trong điều kiện hiếu

khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulase đến sản phẩm cuối

cùng là glucose.

Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp các enzym cellulase có trong điều

kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số

trường hợp còn thấy cả nấm men.Một số loài VSV được nghiên cứu: Altenaria tennuis,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium Spp, Trichoderma reesei,

Actinomycees spp…

. Phương pháp thu nhận enzym cellulase

VSV có khả năng sin tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi

khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất sản xuất enzym cellulase hiện nay, người ta chủ yếu

nuôi cấy sợi nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất.

Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy

theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ

khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất

là cellulase. Thành phần môi trường nuôi cấy cạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó

vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định

để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Cả hai

nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường

xuyên phải được cung cấp oxy.

Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển

mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu, còn nấm sợi phát triển ở môi

trường acid. Do đó, khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ

khuẩn từ 6,2-7,6, còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5.

Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase củ xạ khuẩn và nấm sợi

cũng khác nhau.Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài

hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đã cho hoạt tính

enzym cellulase rất cao. Trong khi đó, xạ khuẩn phải mất ít nhất là 72 giờ mới tổng hợp

cellulase nhiều.

Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của cả hai nhóm VSV này, các loài xạ

khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzym cellulase của xạ khuẩn cũng

hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzym cellulase của nấm sợi.

Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế

phẩm cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối VSV, thành phần môi

trường và enzum.

Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối VSV

sẽ thu được enzym dạng bán tinh khiết. Enzym bán tinh khiết còn chứa nước, protein

không hoạt động và enzym. Bằng phương pháp hóa ký, ta sẽ loại được nước, protein

không hoạt động. Khi đó ta thu được chế phẩm enzym tinh khiết.

Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công

nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được

ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.

Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.

trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm enzym

cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế

bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn

các nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp

cơ học và hóa học.

2.6.4.6. Thu nhận enzym lipase từ VSV

VSV tổng hợp lipase

Trong thiên nhiên có nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp lipase. Chúng bao

gồm cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn.

Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Asperrgillus spp, Muscor spp,

Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichumspp.

Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Trorulopsis spp, Candia spp.

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp,

Achromobacter spp, Staphylococcus spp.

Thu nhận enzym lipase

Trong công nghiệp, người ta thường sản xuất lipase chủ yếu bằng phương pháp

nuôi cấy bề mặt. Trong môi trường có bổ sung chất béo như một cơ chất cảm ứng. Tuy

nhiên, hàm lượng chất béo cho vào môi trường với số lượng rất nhỏ (khoảng<1%) vì chất

béo thường không hòa tan với nước, nếu sử dụng số lượng lớn sẽ ảnh hưởng rất lớn đến

tính chất môi trường.

Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzym khỏi môi trường nuôi

cấy và tiến hành loại các tạp chất, cuối cùng là làm kết tủa, tinh chế và thu nhận enzym

tinh khiết. Enzym lipase được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa, trong sản

xuất phomai.

2.6.4.7 Thu nhận enzym glucose iso merase

Enzym glucose iso merase còn gọi là D-glucoseket toisomerase Enzym này được

ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất dịch đường glucose.

VSV tham gia tổng hợp glucose iso merase

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng

hợp enzym glucose iso merase. Các loài VSV đó được liệt kê trong bảng 6.17.

Trong đó các chủng thuộc Bacillus và Streptomyces được ứng dụng nhiều trong

sản xuất glucose isomerase theo quy mô công nghiệp. Hãng Novo của Đan Mạch sản

xuất enzym glucose iso merase cũng bằng Bacillus coagulans ở các nước châu Âu, Mỹ,

Nhật và Nam Triều Tiên.

Thu nhận enzym glucose iso merase

Lượng siro glucose/fructose được sản xuất trên thế giới rất lớn. trong đó,

glucose/fructose được sản xuất nhiều nhất ở Mỹ, Đức, Nhật, và một số nước châu Âu,

Đức và Mỹ là những nước sản xuất glucose-fructose lớn nhất (hàng năm Đức sản xuất

khoảng 10.000-20.000 tấn glucose/fructose). Nhu cầu về glucose/fructose trên thế giới rất

lớn, vì thế người ta sản xuất enzym glucose isomerase với số lượng nhiều để áp dụng cho

nhu cầu trên.

Ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên, người ta sản xuất enzym

glucose isomerase chủ yếu bằng vi khuẩn Bacillus coagulans. Vi khuẩn này được nuôi

bằng phương pháp chìm trong môi trường nuôi cấy thích hợp,chúng có khả năng sinh

tổng hợp enzym trong 24 giờ nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy ngưòi ta thường cho

muối cobalt và magie. Hai loại muối này kích thích quá trình sinh tổng hợp glucose-

isomerase.

Ngoài bacillus coagulans, nhiều nước còn sản xuất glucose-isomerase từ

Actinoplans missouriensis. VSV này có ưu điểm là chúng có khả năng phát triển ở rất

nhiều loại môi trường khác nhau và khả năng sinh tổng hợp glucose-isomerase cũng rất

mạnh.

Để thu nhận glucose-isomerase từ loài Streptomyces, người ta thương nuôi chúng

trong những bình lên men có pH 8,5. Trong số các chủng thuộc loài Streptomyces, người

ta thường nuôi ở nhiệt độ rất cao ( nhiệt độ nuôi trong khoảng 60-700C). Các thiết bị lên

men thường được thiết kế và chế tạo có dung tích 22m3.

Sau 24h nuôi cấy, người ta tiến hành ly tâm, thu dịch chứa enzym ngoại bào và

sau đó là áp dụng những phương pháp tinh chế để thu nhận enzym tinh khiết.

2.1 THU NHẬN ENZIM TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim,… những phế liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa amilase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzym khác.

Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, rennin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Rennin là chế phẩm enzim có giá trị lớn trong công nghiệp.

Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzim không lớn lắm. Các nguyên liệu này có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.

2.6.1 Enzim protease

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bò, bê..). Ngoài ra có 3 protease kiềm quan trọng là: Pacreatin, Trypsin [ E.C.3.4.21.4], Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1].

Pepsin [E.C.3.4.4.1]

Thành phần cấu tạo

Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin thô (heo) chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin (E.C.3.4.4.22).

Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu, là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Số lượng các amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực là lớn, làm cho enzim dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0.1N (theo Herriot, 1940).

Đặc tính

Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam).

Điểm đẳng điện của pepsin gần pH = 1. Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng pH 1-4, pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH 1.8 – 2.2. Pepsin bền nhất ở pH 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzim có phần thay đổi giảm đi. Từ pH = 5.5 trở lên pepsin không hoạt động.

Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsinPepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức pesinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành pepsin. Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:

Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin

Pepsin là enzim quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn, chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo. Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein, tạo thành chủ yếu những pepton, có ít hay không có amino acid tự do.

Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loai pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thuỷ phân lên cả hai cơ chất Hb và APD (acetyl –L- phenylalanin –L- diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên APD. Pepsin C hoạt động cơ chất Hb.

Hoạt động xúc tác của pepsin

Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo pepton có trọng lượng phân tử nhỏ.

Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin

Phức hợp pepsin- chất ức chế Pepsin + chất ức chếpH < 5.4

Chất ức chế Pepsin + chất ức chế

Pepsinogen phức hợp pepsin- chất ức chế +5peptidepepsin

pH = 5.4

- Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease, hoạt động ở vùng pH 1- 4, pH thích hợp khoảng 1.5–2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Ở 70oC mất khả năng tiêu đạm.

- Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. Trong đó, HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất, kế đến là HNO3, HBr, , H3PO4, các acid lactic, formic, gây tác động kém.

- Các muối lim loại nặng như Hb, Hg, Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến tính enzim.

- Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.

Các phương pháp thu nhận pepsin

Thu nhận dung dịch pepsin

Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme. Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày cổ động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng (theo Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966) hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid (theo Covalenco, 1966).

Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu suất thu enzym cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần (theo Teply và cộng sự,1980). Nguyên nhân là do phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào. Mặt khác, phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin, ta còn thu đựơc pepton, tận dung triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày trong sản xuất.

Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn.

Phương pháp 1 (Phương pháp chiết): Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol hay glyceryl, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng etanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường.

Phương pháp 2 (Phương pháp tự phân): Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Theo nhiều thực nghiệm, việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Nguyên nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị. Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C.

Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym trên một chất kết tủa. Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có mặt H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang di thẩm tích (dialyz). Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruché).

Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết

Phương pháp tủa.

Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích): Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng độ muối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau. Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như (NH4)2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin. Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzym, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy, thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân

không.

Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa

với cồn 950C hay aceton (tỷ lệ 1:3) (Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0 – 30C). Sau đó ly tâm, sấy tủa ở nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 – 50C để đảm bảo

hoạt tính của enzym.

Ví dụ: Quy trình tách chiết, thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày động vật của Payeda và cộng sự

Lọc

Ly tâm

Kết tủa

Sấy khô

Bảo quản

Sản phẩm Pepsin thô

NaCl nồng độ bão hòa 25%, khuấy, để yên 30 phút

Nguyên liệu

Tách màng nhầy

Tự phân

Xay nhuyễn, cân

HCl 0.5% (tỷ lệ 1:2), 40-500C, khuấy, để tự phân

24 -48 giờ

- Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản lạnh đông trước khi thực hiện (0 – 30C).

- Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trứơc khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ màng nhày bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức ăn thừa (rửa bằng tay) không làm tổn thất lớp màng nhấy chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy.

- Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất.- Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0.5% với tỷ lệ (theo khối

lượng) 1: 2 và nhiệt độ 40- 500C, khuấy đều; thời gian 24 – 48 giờ.- Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch.- Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến

khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat, cồn 85%, aceton, izopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000.

- Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm mất hoạt tính enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤ 50C.

- Tác nhân PEG 6000: (tương tự như muối vô cơ). Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzym và khuấy liên tục cho tan hết.

- Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 - 15 phút với tốc độ 5000 – 6000 vòng/phút.

- Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 400C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các chất độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin… trong quá trình sấy.

- Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân vật lý, hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.

Phương pháp hấp phụ

Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. Cơ sở khoa học của phương pháp này là cho enzym hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin, oxit sắt, than… Sau đó, dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzym mong muốn.

Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. Bổ sung NH4OH 0.1N vào dung dịch pepsin thô cho đến phản ứng kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp photphat gồm: dung dịch CaCl2 10%, dung dịch dinatriphotphat 5.5% với tỷ lệ 1:1. Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH và được hấp phụ trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng xuống. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với nước cất. Tiếp theo, lấy tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%, tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin tan trong dung dịch, lọc lấy dung dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2.4 – 2.6. Sau đó, thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete (tỷ lệ 1:1) để tủa pepsin. Kết tủa thu đựơc rửa với cồn, rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤ 450C.

Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc

Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C, áp suất thấp để enzym không

bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm đặc, sau đó được trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng bột khô.

Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng nhaøy và trữ ở trạng thái đông, rồi đưa đến pH = 2.7 – 2.9 bằng HCl và đựơc ủ ở 500C trong vài giờ. Dịch thủy phân được trộn đều và để yên phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt, để lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất thấp, enzym bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra. Sau khi pepsin bị tủa bằng alcohol, đem lọc và làm khô.

Các phương pháp chiết tách trên đều cho pháp thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin này hoàn toaøn có thể sử dụng trong điều trị trong y học hay công nghiệp.

Phương pháp tinh sạch pepsin

Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop

Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis, lấy dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào, chất kết tủa được rửa sạch với dung dịch MgSO4, sau đó hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách gia thêm H2SO4 N/2 pha loãng trong nước 450C, sau một lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính cao.

Phương pháp lọc qua gel sephadex.

Nguyên tắc

Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương nước, những phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di động ở ngoài gel, do đó di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Còn những phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Do đó những kỹ thuật này dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh, phân tử lượng càng nhỏ ra càng chậm.

Hóa chất và dụng cụ:

Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng gel sephadex thích hợp. Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm, cao 35cm và gel sepphadex G-100, cân 1.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0.028 trong 72 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaNO3 đựơc rửa sạch bằng nước cất sau đó nhồi vào cột, hay dùng gel sepphadex G-75.

Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2.2. Cách pha đệm p.H 2.2: X: dung dịch acid citric 0.1M (hòa tan 21,008g acid citric trong 1 lít nứơc cất), Y: dung dịch dianatri hydrophotphat

0.2M (hòa tan 35.6 g Na2HPO4.2H2O hay 71.7g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nứơc cất). Pha 98 ml dung dịch X và 2 ml dung dịch Y, ta có dung dịch đệm pH = 2.2. Chọn cột có = 1.8 cm, chiều cao h = 80cm.

Kỹ thuật nhồi cột

Cột sau khi rửa sạch (rửa cột để đổ gel): cột đựơc rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, đem sấy khô.

Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dịch sulfo cromic trong một ngày, rửa sạch lại, traùng nước cất rồi sấy khô.

Tiến hành nhồi cột với G- 75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và phân lớp.

Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho dung dịch đệm chảy ra từ từ. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt độ cao cần thiết. Bề mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm cao khoảng 2 cm để gel không bị khô.

Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó rửa cột bằng dung dịch đệm p H = 2.2 khoảng 24 giờ ( thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng 3 lần thể tích cột).

Đưa mẫu vào cột

Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua lọc bằng 283 ml cồn 85%. Sau đó ly tâm, kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50 ml dung dịch đệm pH 2.2 ta thu được dung dịch A.

Hút 3 ml dung dịch A, thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH 2.2, đem ly tâm bỏ cặn.

Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt gel thì cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột là 5 ml (từ 1 – 5% thể tích cột.). Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm chảy qua cột.

Thu mẫu qua cột

Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Số phân đoạn là n ống (ví dụ khoảng 30 ống), mỗi phân ñoạn ta thu khoảng 4 ml, các phân đoạn thu được, đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm. Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng, ghi nhận các peak chính được tạo thành. Sau đó xác định hoạt tính pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Theo kết quả tính hiệu suất về hoạt tính enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gel.

Ví dụ: Một số phương pháp và kết quả thu nhận tinh sạch pepsin dê.

Tinh sạch pepsinogen: pepsinogen là dạng zymogen của pepsin, là enzym chính trong dạ dày. Có hai loại chính pepsinogen A và C được biết đến ở hoạt động ở động vật trưởng thành.

Dạ dày dê đựơc cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Tất cả những tiến trình trên đựơc thực hiện ở 0-40C, ngoại trừ FPLC thực hiện ở nhiệtt độ phòng. Sắc ký trên DEAE- Sephacel là lọc gel được thực hiện trong đệm Na2SO4 0.01M, pH 7.0 (Thực hiện FPLC trong đệm Tris-HCl 0.01M, p H 7.0). Bản chất những tiến trình dùng tinh sạch pepsinogen Suncus (chuột xạ nhà) và được mô tả sau đây:

- Phần múi khế của dạ dày (tổng khối lượng trung bình 6.1g) được đồng hóa với 20 ml đệm Na2SO4 0.01M, dung dịch đồng nhất đựoc ly tâm ở 15.000 vòng/phút. Phần bên trên đem tiến hành qua cột DEAE- Sephacel (1.5 x 30cm). Protein đã hấp phụ được giải phóng theo thiều gradient nồng độ của NaCl từ 0- 0.5M. Hoạt động thủy phân Hb được phát hiện tạo thành ba peak. Peak I chứa loại pepsinogen C và peak II, III chứa pepsinogen A. Protein của mỗi peak sau khi qua lọc gel tren cột sephadex G-100 (1.5 x 100cm). Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột mono Q, HR 5/5 để tinh sạch lần cuối. Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 0- 0.5M hơn 30 phút ở mức chảy thấp 1.0 mol/phút. Hỗn hợp pepsinogen A và C được phân tách hoàn toàn chia ra từng loại isozymogen.

Bảng 2.1 Phương pháp tinh sạch các pepsinogen

BướcProtein (mg)

Hoạt tính

(đơn vị)

Hoạt tính riêng (đơn vị/ mg Protein)

Hiệu suất

1- Phần thô phía trên đồng nhất

2- DEAE-Sephacel

Pepsinogen A-1

Pepsinogen A-2 +A-3

PepsinogenC-1 + C-2

3- Sephadex G-100

Pepsinogen A-1

PepsinogenA-2 + A-3

Pepsinogen C-1 +C-2

4- Mono Q FPLC

Pepsinogen A-1

321

9.2

8.2

20.0

0.82

1.3

1.4

0.43

64

11

15

14

8.1

11

4.8

5.6

1.1

0.2

1.8

0.7

9.9

8.5

3.4

13

100

17

23

22

13

17

7.5

8.8

Pepsinogen A-2

Pepsinogen A-3

Pepsinogen C-1

Pepsinogen C-2

0.32

0.21

0.23

0.13

4.4

3.1

2.4

1.5

14

15

10

12

6.9

4.8

3.8

2.3

- Điện di các protein: pepsinogen đã tinh sạch được thực hiện để không biến tính dựa theo phương pháp PAGE (polyacrtlamyl gel electrophoresis) của Ornstein và Davis, và SDS-PAGE theo Weber và osborn. Protein được nhuộm bằng Coomassie briliiant blue.

- Deglycozyl hóa: mỗi pepsinogen (khoảng 0.2 µg) được ủ với 1 đơn vị tối thiểu của glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, việc làm giảm khối lượng của pepsinogen được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen C-2 suncus được sử dụng như một kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen.

- Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch các enzym ở mỗi bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry và cộng sự và đo ở bước sóng 280nm với serum albumin heo như một tiêu chuẩn. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch được xác định bằng cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối lượng phân tử.

- Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid (10µg protein) bị thủy phân bằng HCl bay hơi ở 1500C/1giờ ở hệ thống Water PICCO- TAGTM Worj Station (Millipore Corp, Milford, MA). Mẫu được phân tích bằng máy phân tích amino acid.

Rennin [E.C.3.4.4.3]

Rennin là enzim đông tụ sữa, đựơc tìm thấy ở dịch tiêu háo của ngăn thứ tư dạ dày bê.

Thành phần cấu tạo.

Renin chứa nhiều amino acid acid tính hơn amino acid kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn pepsin.

Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin

Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4.5. Rennin là enzim thuỷ phân liên kết peptide trong protein, và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt tác động mạnh lên các liên kết tạo bởi tyrosine và phenylalamine.

Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH.

Sự hoạt hoá prorennin

Trong môi trường acid ở pH = 5 sự hoạt hoá prorennin thành rennin xảy ra không đáng kể, nhưng ở pH < 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh.

Các yếu tố ảnh hưởng

pH tối ưu của rennin pH = 3.7. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH 3.7 các ion làm tăng hoạt độ rennin, những cation hoá trị +1 làm giảm hoạt tính của nó. Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H2S 0.0001M và MgCl2.

Quá trình thu nhận dịch rennin

Nguyên liệu

Tách màng nhầy

Lọc

Ly tâm

Tự phân

Kết tủa

Xay nhuyễn, cân

NaCl nồng độ bão hòa

hoặc HCl

HCl 0.2% hoặc nước muối 10% , 0.7% acid boric trên

tổng V, chỉnh pH 4

Sấy khô

Bảo quản

Sản phẩm rennin thô

- Nguyên liệu: ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi. Lấy phần múi khế của bao tử và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, rửa nhẹ bằng nước lạnh, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.

- Hoá chất: Muối NaCl, HCl sử dụng để thu tủa enzim phải tinh khiết, khô không lẫn tạp chất, đặc biệt là kim loại nặng vì gây tủa và bất hoạt enzym. Natribenzoat: chất bảo quản.

- Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hoá, máy đo pH.

- Phương pháp thu nhận: có 2 cách+ Cách 1: Dạ dày xay nhuyễn, HCl 0.2%, bổ sung 0.7% acid boric trên

tổng V tỷ lệ 1:3 theo V. + Cách 2: Dạ dày xay nhuyễn, nước muối 10%, chỉnh HCl pH = 4

tỷ lệ 1:3 theo V. Cho 0.7% acid boric trên tổng V (tác dụng bảo quản). Giữ ở 35 – 400C cả 2 mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đó dùng HCl N chỉnh pH = 4. Lấy ra đem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thô (a) có chứa rennin. Dịch rennin được kết tủa bằng cách acid hoá dung dịch hoặc bão với NaCl. Gelatin thường xuyên được thêm vào để giúp kết tủa vá tách renin ra khỏi dung dịch bằng sự ly tâm 45 phút ở 5.000 vòng/ phút.

- Thu rennin dạng bột + Tiến hành tủa enzim theo phương pháp diêm tích với muối trung

tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch (A) một lượng NaCl kkhoảng 22 – 23% cho đến khi bão hoà NaCl.

+ Để tủ lạnh 20 phút.+ Lấy ra ly tâm lọc. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri, sấy khô rồi để vào

bình hút ẩm. + Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion.+ Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có phân tử

lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn.+ Cân chính xác một lượng enzim bột vào túi colodion (cellophane).

Cân trọng lượng túi có chứa enzym, cho túi vào becher đựng nước cất và cho thẩm tích trong môi trường nứơc lạnh 0 – 40C. Khuấy và thay đổi nước lạnh thường xuyên ( hai ngày đêm) làm khô nhanh túi bằng cách sấy quạt gió, nhiệt độ 30 - 400C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.

+ Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl: m1 – m2 = m

m1: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích (g)

m2: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm sau thẩm tích (g)

m: Trọng lượng muối NaCl đã thẩm tích qua màng (g)

- Tinh sạch rennin: Rennin được chiết và làm sạch bằng sắc ký DEAE- Sephadex.

- Tái chế: tách enzim từ nước sữa (dung dịch còn lại sau khi tách phần ñông tụ) và tái sử dụng bằng phương pháp sắc ký.

Pacreatin

Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường trích pancreatin tuỵ tạng của heo.

Thành phần

Pancreatin là hệ enzym thuỷ phân xúc tác các phaûn ứng chuyển hoá đạm, đường, chất béo và một số chất khác ở trong ruột.

Tính chất PancreatinPancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh và nó hoạt động mạnh nhất từ 2 -3 giờ sau khi ăn để thực hiện quá trình tiêu hoá ở ruột non. Pancreatin có thể pepton hoá nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo… và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hoá.

Thu nhận pancreatin

Sơ đồ thu nhận pacreatin bằng phương pháp tách chiết với aceton

Nghiền nhỏ

Sản phẩm Pancreatin thô

Ly tâm lấy tủa (lần 1)

Ly tâm lấy tủa (lần 2)

Rửa tủa bằng aceton

Sấy tủa nhẹ ở 30- 350C

Tụy heo bảo quản tươi ở nhiệt độ

đông đá

Tách bỏ mỡ và mô liên kết, xay nhỏ đem cân

Tủa thu lấy enzym

Lọc lấy dung dịch bằng rây

Na2CO3 1.2%

(tỷ lệ 1:2), 200C, khuấy 3 giờ

Aceton lạnh (1:4) khuấy 10 phút, để lắng 15 phút ở

nhiệt độ lạnh

Sơ đồ thu nhận pacreatin kết tủa bằng muối (NH4)2SO4

(NH4)2SO4 60 – 70% (1;2)

Tụy heo bảo quản

tươi

Tách màng nhầy

Ly tâm lấy tủa

Nghiền nhỏ

Lọc lấy dung dịch

Sấy tủa nhẹ ở 400C

Sản phẩm Pancreatin

thô

Lọc lấy dung dịch

Pha với nứơc cất (1:1) tự phân ở 200C,

để tự phân

6-8hH2SO4 0.25N (2:1),

pH = 3.5-4, 1h

Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi đã được bảo quản, cân trong lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với troïng lượng tuỵ tươi, sau đó đem sấy ở những nhiệt độ 500C, 600C, 700C. Sau một thời gian sấy thì đem xay nhuyễn và được chế phẩm pacreatin thô.

Trypsin [ E.C.3.4.21.4]

Trypsin có trong dịch tuỵ người và động vật. Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nên gọi là protease kiềm tính. Vai trò của trypsin là tiếp tục thuỷ phân các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thuỷ phân một phần ở dạ dày. Ở trong máu cũng có một ít trypsin hoạt động.

Sự hoạt hoá trypsinogen: Trong tuyến tuỵ, đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không hoạt động là trypsinogen. Sau đó được hoạt hoá dưới tác động của enzim đường ruột enterokinase.

pH tối ưu của trypsin là pH = 8. Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ cơ thể.

Hoạt động và tính đặc hiệu: Trypsin tác dụng lên hầu hết các cơ chất là protein, tác dụng trên hemoglobin, albumin biến tính của huyết tương, đối với collagen hay albumin của trứng thì cần xử lý nhiệt sơ bộ thì trypsin mới có tác dụng. Trypsin không làm đông tụ sữa như pepsin, rennin, chymotrypsin.

Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]

Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tuỵ. Là protease quan trọng sau trypsin.

Chymotrypsin được thu nhận ở dạng tinh thể. Chymotrypsin tiết ra dưói dạng không hoạt động là chymotrypsinogen, sau đó chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động là Chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin.

Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường pH kiềm, hoạt động ở p H 7 - 8 và tối ưu là pH = 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5.4. Trong ruột, chymotrypsin thuỷ phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hoá một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngắn và các amino acid tự do. Hoạt tính của chymotrypsin tương đối hơi yếu hơn trypsin nhưng nó lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn.

Phương pháp thu nhận tách chymotrypsin ra khỏi trypsin

Chuẩn bị

Đệm phosphate 0.067M, pH 7.0. Hòa tan 4.54g K2HPO4 trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa tan 4.73g NaH2PO4 khan vào trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa chung 38.9ml dung dịch K2HPO4 với 61.1ml dung dịch NaH2PO4. Điều chỉnh pH bằng cách nhỏ từng giọt (nếu cần thiết) dung dịch NaH2PO4 đến khi đạt pH 7.0.

Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23.7mg N-acetyl-D-tyrosin ethyl ester (cơ chất thích hợp dùng để xác định chymotrypsin) vào khoảng 50ml dung dịch đệm phosphate 0.067M, pH 7.0. Giữ lạnh khi pha loãng với đệm pH 7.0 đến 100ml.

Dung dịch trypsin tinh khiết: hòa tan một lượng chính xác trypsin tinh thể vào hydrochloric acid 0.001N để thu được một dung dịch chứa 650 đơn vị USP trypsin trong mỗi ml.

Cách thực hiện

Độ hấp thu được đo bằng quang phổ kế trong điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh không được thay đổi quá 0.50C và nhiệt độ trong ngăn để mẫu là 25± 0.10C.

Hút 200µl dung dịch acid HCl 0.001N và 3ml dung dịch cơ chất vào trong một cuvette 1cm. Đặt cuvette này vào quang phổ kế và điều chỉnh thiết bị để có được độ hấp thu 0.2 ở bước sóng 273nm.

Hút 200µl dung dịch trypsin tinh khiết vào một cuvette khác, thêm 3ml dung dịch cơ chất và đặt cuvette vào quang phổ kế. Bắt đầu tính thời gian từ khi bắt đầu thêm dung dịch cơ chất vào dung dịch enzym. Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không kém hơn 5mm kể từ khi cho cơ chất vào dung dịch enzym. Lập lại các bước trên ít nhất một lần. Các giá trị của độ hấp thu tuyệt đối ít quan trọng hơn sự ổn định trong ít nhất 3 phút thì phải lập lại tiến trình trên và nếu cần thiết thì thực hiện với một nồng độ thấp hơn.

Lập lại quá trìn trên lần thứ hai với cùng nồng độ pha loãng, theo dõi sự thay đổi độ hấp thu trong lần thực hiện đầu tiên. Xác định sự thay đổi độ hấp thu trung bình trong mỗi phút, chỉ sử dụng các giá trị trong vòng 3 phút.

Cách tính số đơn vị USP chymotrypsin mỗi mg trysin tinh khiết theo công thức:

(A2 – A1) x (0.0075 TW)

Với A2: Độ hấp thu lần đầu

A1: Độ hấp thu lần cuối

T : Thời gian giữa lần đầu đọc và cuối (phút)

W : Trọng lượng (mg) của trypsin tinh thể trong thể tích dung dịch được dùng xác định độ hấp thu.