0. Molekularna i Celijska Imunologija

7/25/2019 0. Molekularna i Celijska Imunologija

http://slidepdf.com/reader/full/0-molekularna-i-celijska-imunologija 1/237

Tatjana Kosti i Silvana Andri

Molekularna i elijska

imunologija

Skripta za sve zainteresovane studente

WUS Austria – Daniel Print

http://www.guthcad.com/ssl/buy_pdf-xchange.htm




Tatjana Kosti, PhDvanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinjaDepartman za biologiju i ekologiju

Prirodno-matematiki fakultetUniverzitet u Novom SaduE-mail: [email protected]

Silvana Andri, PhDvanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinjaDepartman za biologiju i ekologijuPrirodno-matematiki fakultetUniverzitet u Novom SaduE-mail: [email protected]

Naslovnu stranu osmislili:NINI i TEJ

Grafiko oblikovanje korica:Predrag Nikoli

The publishing of this script is part of the project CDP+ 118/2006 financed by Austrian

Cooperation through WUS Austria

This copy is not for sale

Ova skripta je objavljena u okviru projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog odstrane Austrian Cooperation

Besplatan primerak

mailto:[email protected]








Predgovor

Ova skripta je rezultat realizacije projekta finansiranog od strane WUS-Austrija u okviru programa CDP+

(Course Development Program), u smislu unapredjenja predmeta Molekularna i elijska imunologija

namenjenog studentima osnovnih, Master i PhD studija na Prirodno-matematikom fakultetu, Univerziteta u

Novom Sadu.

Namera autora je bila da studentima uine dostupnim informacije koje e im pomoi da savladaju osnovne

principe molekularne i elijske imunologije, naglašavajui uticaj modernih tehnika i multidisciplinarni

nauni pristup u razumevanju funkcije imunog sistema. Skripta je pisana sa željom da se informacije

poredjaju u osnovni i jednostavan koncept koji bi pomogao studentima da razumeju kako radi imuni sistem.

Tekst skripte je organizovan tako da prati porogram predavanja iz kursa Molekularna i elijska imunologija,

ali ne sadrži opise specifine funkcije imunog sistema, u razliitim obolenjima. Studentima zainteresovanim

za ovu problematiku preporuujemo knjigu „Osnovna imunologija“ (Data Status; prevod knjige Basic

Immunology, Abbas AK & Lichtman AH) u kojoj su opisani osnovni poremeaji funkcije imunog sistema, kaoi kako imuni sistem funkcioniše u specifinim situacijama. Sve slike u skripti su preuzete iz knjige Cellular

and Molecular Immunology (Abbas AK & Lichtman AH, 2005).

S’ obzirom da je tekst skripte prvi pisani trag o sadržaju kursa, koji nema dugu tradiciju, sve kritike,

sugestije i komentari su više nego dobrodošli.

Veliko hvala Mariji Janji i Nataši Stojkov, saradnicama na grupi predmeta Fiziologija životinja, na pomoi

oko korekture teksta, kao i Predragu Nikoliu za tehniko i grafiko oblikovanje korica.

Na kraju, jedno jednostavno i ogromno hvala organizaciji WUS Austrija, Pokrajinskom sekretarijatu za

obrazovanje i kulturu, kao i i gospodinu Gezi Danijelu (štamparija Danijel Print) na ogromnom razumevanju

i finansijskoj podrsci u nameri da našim studentima obezbedimo skriptu koja e im, nadamo se, bar donekle

olakšati savladavanje predvienog programa kursa.

Autori







S A D R Ž A J

01. UVOD U IMUNOLOGIJU 102. FUNKCIONALNA ORGANIZACIJA IMUNOG SISTEMA 72.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE ORGANIZACIJE I FUNKCIJE IMUNOG SISTEMA 72.1.1. Uroeni i adaptivni imunitet 72.1.2. Tipovi adaptivnog imunog odgovora 112.1.3. Osnovne karakteristike / obeležja adaptivnog imunog odgovora 132.1.4. elijske komponente adaptivnog imunog sistema 172.1.5. Faze adaptivnog imunog odgovora 19

2.1.5.1. Prepoznavanje antigena 202.1.5.2. Aktivacija limfocita 212.1.5.3. Efektorna faza adaptivnog imunog odgovora: eliminacija antigena 212.1.5.4. Homeostaza: Slabljenje / opadanje / nestajanje imunog odgovora 222.2. ELIJE I TKIVA IMUNOG SISTEMA 232.2.1. elije imunog sistema 242.2.1.1. Limfociti 252.2.1.2. Antigen-prezentuju e elije (APCs) 29

2.2.2. Anatomija i funkcija limfoidnih tkiva 312.2.2.1. Kosna srž 312.2.2.2. Timus 332.2.2.3. Limfni vorovi i limfati ni sistem 332.2.2.4. Slezina 352.2.2.5. Kožni imuni sistem 362.2.2.6. Mukozni imuni sistem 372.2.2.7. Putevi i mehanizmi recirkulacije limfocita 39

03. PREPOZNAVANJE ANTIGENA 433.1. KARAKTERISTIKE ANTIGENA 433.2. ANTITELA 453.2.1. Molekularna struktura antitela 453.2.2. Sinteza i ekspresija Ig molekula 493.2.3. Karakteristike antitela vezane za prepoznavanje antigena 503.2.4. Antigen-antitelo interakcija 513.2.5. Karakteristike antitela vezane za efektorne funkcije 52

3.3. MOLEKULE GLAVNOG HISTOKOMPATIBILNOG KOMPLEKSA (MHC) 533.3.1.Osobine MHC gena 533.3.2. Osobine MHC molekula 543.3.3. MHC molekuli klase I 55







3.3.4. MHC molekuli klase II 563.3.5. Osobine peptid-MHC interakcija 563.3.6. Ekspresija MHC molekula

573.4. PROCESOVANJE I PREZENTACIJA ANTIGENA T LIMFOCITIMA 603.4.1. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti 603.4.2. Prezentacija proteinskih antigena CD4+ T limfocitima 623.4.2.1. Tipovi elija koje prezentuju antigene CD4+ T elijama 623.4.2.2. „Hvatanje“ i prezentacija proteinskih antigena 643.4.3. Prezentacija proteinskih antigena CD8+ T limfocitima 643.4.4. Procesovanje antigena 65

3.4.4.1. Procesovanje internalizovanog antgena 653.4.4.2. Procesovanje citosolnog antigena 683.5. RECEPTOR ZA ANTIGENE NA T LIMFOCITIMA (TCR) I POMONE MOLEKULE 713.5.1. Struktura TCR 723.5.2. Uloga TCR-a u prepoznavanju peptida+MHC kompleksa 733.5.3. CD3 i proteini 743.5.3.1. Struktura CD3 i proteina 743.5.3.2. Funkcija CD3 i proteina 75

3.5.4. TCR 753.5.5. Pomone molekule 763.5.6. CD4 i CD8 koreceptori ukljueni u aktivaciju T limfocita 773.5.6.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora 783.5.6.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora 783.5.7. CD28 i CTLA-4: receptori koji regulišu aktivaciju T elija 793.5.8. CD45 i CD2: molekuli koji uestvuju u signalnoj transdukciji 803.5.9. Adhezione molekule T limfocita: integrini, selektini, CD44 80

3.5.10. Efektorne molekule T limfocita 8204. AKTIVACIJA I REGULACIJA T I B LIMFOCITA 834.1. AKTIVACIJA T LIMFOCITA 834.1.1. Funkcionalni odgovor T limfocita 844.1.2. Uloga kostimulatora u aktivaciji T limfocita 864.1.3. Signalna transdukcija preko TCR receptora 884.1.3.1. Rani doga aji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacija protein kinaza i adapternihproteina

89

4.1.3.2. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima

924.1.3.3. Kalcijum- i protein kinaza C-posredovan signalni put u T limfocitima 934.1.3.4. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitima 944.2. AKTIVACIJA B LIMFOCITA 97







4.2.1. Generalne karakteristike humoralnog imunog odgovora 974.2.2. Prepoznavanje antigena i antigenom-indukovana aktivacija B elija 984.2.2.1. Signalna transdukcija od BCR kompleksa

984.2.2.2. Receptori za komplement obezbe uju sekundarni signal 1014.2.2.3. Funkcionalni odgovor B elija na prepoznavanje antigena 1024.2.3. Humoralni odgovor na proteinske antigene zavisi od T elija pomonica 1024.2.3.1. Rane faze humoralnog odgovora koji je zavisan od T elija su: interakcija T-B elija, proliferacija B elija,sekrecija antitela i „isotype switching“

103

4.2.3.2.Kasnije faze humoralnog odgovora zavisnog od T elija pomo nica: reakcije germinalnog centra 1084.2.4. Humoralni odgovor na T-nezavisne antigene 1104.2.5. Regulacija humoralnog imunog odgovora preko Fc receptora 11105. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA 1135.1. CITOKINI 1145.1.1. Osnovne karakteristike citokina 1155.1.1.1. Funkcionalne kategorije citokina 1175.1.1.2. Citokinski receptori i signaling 1185.1.2. Citokini koji posreduju i regulišu uroeni imunitet 1215.1.2.1. Faktor nekroze tumora (TNF) 1225.1.2.2. Interleukin-1 (IL-1) 1235.1.2.3. Hemokini 1245.1.2.4. Interleukin-12 (IL-12) 1255.1.2.5. Tip I interferoni (IFNs) 1275.1.2.6. Interleukin-10 (IL-10) 1295.1.2.7. Drugi citokini uro enog imuniteta 1295.1.2.8. Uloga citokina u uro enom imunitetu i inflamaciji 1305.1.3. Citokini koji posreduju i regulišu adaptivni imunitet 1315.1.3.1. Interleukin-2 (IL-2) 1325.1.3.2. Interleukin-4 (IL-4) 1335.1.3.3. Interleukin-5 (IL-5) 1345.1.3.4. Interferon- (INF- ) 1345.1.3.5. Faktor transformacije rasta (TGF- ) 1365.1.3.6. Drugi citokini adaptivnog imuniteta 1375.1.3.7. Uloga citokina T elija u specijalizovanom adaptivnom imunom odgovoru 1385.1.4. Citokini koji regulišu hematopoezu („hematopoezni“ citokini) 1385.1.4.1. Faktor stem elija (c-kit ligand)

1405.1.4.2. Interleukin-3 (IL-3) 1405.1.4.3. Interleukin-7 (IL-7) 1415.1.4.4. Drugi hematopoezni citokini 141







5.2. EFEKTORNI MEHANIZMI URO ENOG / NESPECIFINOG IMUNOG ODGOVORA 1435.2.1. Karakteristike uroenog imunog prepoznavanja 1445.2.2. Komponente uroenog imunog sistema

1475.2.2.1. Epitelijalne barijere 1495.2.2.2. Fagociti: neutrofili i makrofagi 1515.2.2.3. Uro eno-ubila ke elije – elije prirodne ubice – NK elije 1665.2.2.4. Sistem komplementa 1695.2.2.5. Drugi cirkulišu i proteini uro enog imuniteta 1715.2.2.6. Citokini 1725.2.3. Uloga uroenog imuniteta u stimulaciji adaptivnog imunog odgovora 174

5.3. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA POSREDOVANOG

ELIJAMA 1775.3.1. Tipovi elijama-posredovanih imunih reakcija 1775.3.2. Razvoj efektornih elija 1785.3.2.1. Prepoznavanje antigena od strane T elija i kostimulacija 1785.3.2.2. Klonalna ekspanzija T elija 1815.3.2.3. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u efektorne elije 1815.3.2.4. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u citoliti ne T elije (CTLs) 1865.3.3. Migracija efektornih T elija i drugih leukocita na mesto gde je antigen 187

5.3.4. Efektorni mehanizmielijama-posredovanog imuniteta 1885.3.4.1. T- elijama posredovana aktivacija makrofaga i drugih leukocita 188

5.3.4.2. Mehanizmi CTL-posredovanog uništavanja inficiranih elija 1915.4. EFEKTORNI MEHANIZMI HUMORALNOG IMUNOG ODGOVORA 1955.4.1. Pregled humoralnog imunog sistema 1955.4.2. Neutralizacija mikroba i njihovih toksina 1965.4.3. Antitelima-posredovana opsonizacija i fagocitoza 1985.4.3.1. Fc receptor fagocita 199

5.4.3.2.

elijama-posredovana citotoksi nost koja zavisi od antitele 2005.4.4. Sistem komplementa 201

5.4.4.1. Putevi aktivacije komplementa 2025.4.4.2. Receptori za proteine komplementa 2095.4.4.3. Regulacija aktivacije komplementa 2105.4.4.4. Funkcije komplementa 2115.4.5. Funkcija antitela na specijalnim anatomskim mestima u organizmu 2125.4.5.1. Mukozni imunitet 212

5.4.5.2. Neonatalni imunitet 213D. DODATAK 215D.1. LABORATORIJSKE TEHNIKE KOJE SE KORISTE U IMUNOLOGIJI 215D.1.1. Laboratorijske metode koje koriste antitela 215







D.1.1.1. Kvantifikacija antigena imunoesejima 215D.1.1.2. Puifikacija i identifikacija proteina 216D.1.1.3. Markiranje i detekcija antigena u elijama i tkivima

219D.1.1.4. Odre ivanje/merenje interakcije antigen-antitelo 221D.1.2. Analiza genske strukture i ekspresije 221D.1.2.1. „Southern Blot“ hibridizacija 221D.1.2.2. „Northern Blot“ hibridizacija 223D.1.2.3. Lan ana reakcija polimeraze 223D.1.3. Transgeni miševi i „knock-out“ ciljnih gena 224L. LITERATURNI IZVORI 227







1

UVOD U IMUNOLOGIJU 01U ovom delu skripte je dat kratak uvod u imunologiju, kao i najosnovniji pojmovi o evoluciji

imunog sistema.

Imunologija je nauka koja prouava mehanizme koji su se razvili u toku evolucije, a u cilju

odbrane organizma od štetnog uticaja stranih agenasa tj. svega onoga što organizam ne

prepoznaje kao svoje i što remeti ili preti da poremeti homeostazu. Re imunitet (imunost,

otpornost) je izvedena od latinske rei immunitas koja se koristila da opiše zaštitu Rimskih

senatora od javnih tužilaca tokom njihovog rada u senatu. Istorijski, imunost oznaava zaštitu odbolesti, ili preciznije zaštitu od svega što može dovesti do poremeaja homeostaze, a potom

eventualno i bolesti. elije i molekuli koji su odgovorni za zaštitu organizma ine imuni sistem,

a njihova zajednika i dobro koordinisana aktivnost, kao odgovor na strane agense, ini

imuni odgovor. Fiziološka funkcija imunog sistema je odbrana. Dugo vremena se imunologija

razvijala kao povezana sa mikrobiologijom u nameri da proui neutralisanje i uklanjanje

delovanja patogenih mirkoorganizama, pa su se i teorije o postanku i funkcionisanju imunog

sistema svodile samo na prirodnu selekciju koja je,ini se, dopustila razvoj samo viših

organizama iji se imunološki sistem mogao delotvornije odupreti napadu mikroorganizama.

Pokazalo se da imunološka reakcija postoji i na nepatogene mikroorganizme, pa je uloga imunog

sistema šira i mnogostrukija, te je vrlo teško jednostavno i precizno definisati fiziološku ulogu

imunog sistema.

Imunologija je eksperimentalna nauka bazirana na eksperimentalnim zapažanjima i zakljucima

koji se iz njih izvode. Evolucija imunologije kao eksperimentalne discipline zavisi od sposobnosti

da se manipuliše funkcijom imunog sistema u kontrolisanim uslovima. Istorijski, prvi jasan

primer ovakve manipulacije i jedan koji je ostao zabeležen kao najdramatiniji je svakako uspešna

vakcinacija Edvarda Dženera (engl. Edward Jenner) protiv malih boginja. Ovaj lekar je ustanovio







2

da pacijenti koji su se oporavili od kravljih boginja nisu bii zaraženi malim boginjama. Na osnovu

ovih zapažanja on je ubrizgao sadržaj fistule kravljih boginja u rame osmogodišnjeg deaka.

Kasnije je isti deak namerno inficiran malim boginjama, ali se bolest nije razvila. Dženerovootkrie vakcine (lat. vaccinus kravlji, od krava) je prouzrokovalo znaajan napredak u imunologiji i

ekspanziju primene vakcina, što se pokazalo kao najefikasniji metod za prevenciju infektivnih

bolesti.

U prošlom veku, posebno zadnjih 40 godina prošlog veka, novi eksperimentalni pristupi i

sofisticirane naune metode doprineli su boljem razumevanju funkcije imunog sistema.

Ekspanzivnim razvojem i napredkom metoda biotehnologije (produkcija monoklonalnih antitela;knock-out i transgene elijske linije; tehnologije rekombinantne DNK; proizvodnja rekombinantih

proteina, posebno antigena i antitela i njihovih fragmenata, kao i himernih i humaniziranih

antitela; proizvodnje citokina i drugih biološki aktivnih materija i dr.), poinje brži razvoj

imunologije, te nova saznanja brzo nalaze i praktinu primenu u transplantacijskoj i tumorskoj

medicini. Iskustvo da pri transplantaciji davalac (donor) i primalac (akceptor) moraju biti što

sliniji, nametnulo je potrebu istraživanja njihovih slinosti i razlika i razvilo novu disciplinu –

imunogenetiku, a tumorska imunologija je dobila mogunost klinike primene kroz

imunodijagnostiku i imunoterapiju

Stoga se danas, fiziološka uloga/funkcija imunog sistema ogleda u odbrani od infekcije,

zaštiti i odbrani od tumora, kao i u održanju antigenske i genske homeostaze organizma .

Odbrana protiv štetnih agenasa je posredovana ranom reakcijom urodjenog imuniteta

(prirodna otpornost organizma) i kasnom reakcijom steenog (adaptivna otpornost

organizma) imuniteta.

Prirodna i adaptivna otpornost su komponenete integrisanog odbrambenog odgovora organizma u

kome brojne elije i molekuli funkcionišu kooperativno. Imuni sistem prepoznaje stranog agensa,

a takodje, dovodi i do njegove destrukcije. Imuni sistem mora da prepozna štetni agens, a

takodje, mora da razlikuje stranog napadaa od sastavnih konstituenata sopstvenog organizma.

Ako se to ne desi, dolazi do pojave tzv. autoimunih bolesti kada imuni mehanizmi deluju protiv

sopstvenih molekula (prvenstveno proteinskih). Pored toga, imuni sistem može da uništi

kancerozneelije i/ili spre

i razvoj odredjenih tumora. Takodje, imuni sistem je uklju

en u

odbacivanje transplantata, sa izuzetkom transplantata od jednojajanog blizanca.







3

Osnovni pojmovi o evoluciji imunog sistemaIako i biljke i najprostiji životinjski oblici imaju odbrambene mehanizme, složenija evolucija

višeelijskih organizama je nametnula i vitalnu potrebu razvoja internog odbrambenog sistema

koji e ih štititi od razliitih stranih agenasa. Mehanizmi za odbranu organizma su prisutni u

„nekoj formi“ kod svih višeelijskih organizama i oni ine/predstavljaju tzv. urodjeni (prirodni,

nespecifini) imunitet. Mnogo specijalizovaniji odbrambeni mehanizmi se javljaju kod

vertebrata i oni ine još jedan odmbrambeni sistem tzv. steeni (adaptivni, specifini) imunitet

koji fukcioniše zajedno sa urodjenimine

i mo

an odbrambeni sistem.

Tabela 1.1. Prisustvo odredjenih odbrambenih mehanizama kod razliitih organizama

Taksonomska

grupa

Prirodni

imunitet

Steeni

imunitet

Fagocitoza T i B

limfociti

Antitela Antimikrobni

peptidi

Više biljke + - - - - +

Sundjeri + - + - - ?

Gliste + - + - - ?

Insekti, rakovi + - + - - +

Ribe + + + + + +

Žabe + + + + + +

Reptili + + + + + +

Ptice + + + + + +

Sisari + + + + + +

Razliite vrste elija kod beskimenjaka reaguju na mikroorganizme i/ili druge štetne agense takošto ih okružuju i uništavaju, ali nemaju antigen specifine limfocite i ne produkuju

imunoglobuline (Ig), niti proteine sistema komplementa. Ovi organizmi sadrže brojne solubilne

molekule kojima vezuju i liziraju mikroorganizme. Neki beskimenjaci poseduju specijalizovane

elije (acelomata- fagocitni amebociti; Mollusca & Arthropoda – hemocite; Annelides – celomociti;

tunicata – leukociti) koje su pretea elijama imunog sistema viših kimenjaka. Takodje,

dokazano je da su beskimenjaci sposobni da ispolje reakciju odbacivanja stranog tkivnog

transplantata. Smatra se da su se razliite komponenete imunog sistema sisara pojavile zajedno u

filogeniji i da se tokom evolucije poveavala njihova specifinost i kompleksnost delovanja (Tabele

1.1. i 1.2.).







4

Tabela 1.2. Evolucija imunog sistema - prisustvo odgovarajuih odbrambenih mehanizama kod razliitih organizama

Prirodna otpornost ( imunost) Adaptivna otpornost (imunost)

Fagocite NK elije Antitela T i B limfociti Limfni

vorovi

I n v e r t e b r a t a

Protozoa + - - - -

Spongia + + - - -

Annelides + - - - -

Arthropodes + - - - -

V e r t e b r a t a

Elasmobranchia + + + (samo IgM) -

Teleostea + + + (IgM, drugi?) -

Amphibia + + + (2-3 klase) -

Reptilia + + + (3 klase) -Aves + + + (3 klase) + (neke)

Mamalia + + + (8 klasa) +

NK elije (engl. natural killer cells) - urodjeno-ubilake elije ili elije prirodne ubice; + prisutan, - nije prisutan.

(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

S porastom veliine i složenosti telesne gradje, kao i sa stepenom encefalizacije organizama, i

odbrambeni sistem postajao je sve složeniji da bi odgovorio svim nametnutim zadacima. To je

posebno izraženo kod kimenjaka jer je kod njih odbrana od mirkoorganizama bila preduslovnjihovog opstanka, te se razvio sistem, tzv. adaptivni imuni sistem koji funkcioniše po principu

prepoznavanja i uenja. Osnovne osobine adaptivnog imunog odgovora (prepoznavanje;

enje/memorisanje; razlikovanje sopstveno/strano) su prisutne i kod nižih kimenjaka, ali se

tokom evolucije progresivno uveavala sposobnost razlikovanja razliitih antigena.

Prvi susret sa bakterijskim, gljivinim, virusnim agensom obino rezultira infekcijom praenom

razvojem bolesti. Imuni sistem pomaže da se organizam oporavi od infekcije, a nakon toga

organizam razvija odgovarajue mehanizme koji ga ine otpornim na sledeu infekciju istim

agensom. Pored toga, prilino velika sklonost kimenjakih elija ka zloudnim tumorskim

promenama morala je usloviti razvoj vrlo osetljivog sistema koji bi mogao prepoznati veoma fine i







5

tanane razlike izmedju zdrave i maligno-transformisane sopstvene elije. Kontinuirana borba

kimenjaka sa mikroorganizmima rezultirala je razvojem odbrambenog sistema koji radi na

principu prepoznavanja i neutralisanja (prirodni, urodjeni ili nespecifini mehanizmiodbrane) i/ili prepoznavanja, neutralisanja i uenja/pamenja (adaptivni, steeni ili

specifini mehanizmi odbrane).







6







7

FUNKCIONALNA ORGANIZACIJA

IMUNOG SISTEMA 02U ovom delu skripte se definišu i opisuju osnovni pojmovi ( tzv. “imunološku nomenklaturu” ) i

komponente imunog sistema u pogledu njihove funkcionalne organizacije. U prvom poglavlju e

biti definisani i opisani tipovi imunog odgovora i osnovne karakteristike i osnovni principi

funkcionisanja komponenti imunog sistema. Drugo poglavlje je posveeno opisu elija i tkiva

imunog sistema, sa posebnim osvrtom na odnos strukture i funkcije. Na ovaj nain se stvara

osnova za razumevanje naina na koji imuni sistem prepoznaje štetene agense i razvija

ogovarajuu odbrambenu reakciju.

2.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE ORGANIZACIJE I FUNKCIJE IMUNOG SISTEMA

2.1.1. Urodjeni i adaptivni imunitet

Odbrana organizma od

mikroorganizama i/ili drugih

štetnih agenasa je posredovana

mehanizmima i ranim reakci-

jama urodjenog imuniteta i

kasnijom reakcijom adaptivnog

imuniteta (Slika 2.1. i Tabele

2.1. i 2.2.).

Slika 2.1. Osnovni mehanizmi urodjenog i

steenog imuniteta







8

Urodjeni i adaptivni imunitet su funkcionalno neodvojive komponente imunog sistema i rade na

principu prepoznavanja i neutralisanja (prirodni, urodjeni ili nespecifini mehanizmi

odbrane) i/ili prepozavanja, neutralisanja i uenja/pamenja (adaptivni, steeni ilispecifini mehanizmi odbrane).

Tabela 2.1. Opšte karakteristike imunog odgovora

I M U N I O D G O V O R

URODJENI - PRIRODNI - NE SPECIFINI STEENI - ADAPTIVNI - SPECIFINI

Evolutivno STARIJI MLADJI

Antigen(specifina funkc. grupa) antigen ne zavistani antigen ne specfian odgovor

antigen zavistani antigen specifian odgovor

Maksimalni odgovor skoro trenutnopostoji latentni period izmedju izlaganja antigenu i

maksimalnog odgovora

Memorijski zapisizlaganje antigenu ne ostavlja nikakavzapamen trag o prethodnom susretu

izlaganje antigenu rezultira zapamivanjem tj.imunološkom memorijom u vidu memorijskih elija –

elija pamenja

Osnovne komponente Fizike barijere

Hemijski medijatori (sekretovane molekule)

elije: fagocite (neutrofili, makrofagi), NKelije, K elije, LAAK elije

Antigen Prezentujue elije (APC)

B limfociti i antitela (humoralni imuni odg.)citotoksini T limfociti (elijski imuni odg.)

memorijski B i T limfociti

Zajednike komponente bilo u pogleduaktivacije, efektornihmehanizama/reakcija ili pomoi

Brojni hemijski medijatori (interleukini, komplement)Fagocitne i Antigen Prezentujue elije (APC)

Mastociti, Eozinofili, Bazofili…


Urodjeni imunitet (prirodna ili nespecifina otpornost organizma) je predstavljen skupom

elijskih i biohemijskih odbrambenih mehanizama koji se nalaze u stanju pripravnosti ak i pre

infekcije i veoma brzo odgovaraju na infekciju. Ovi mehanizmi odgovaraju iskljuivo na infekcije

mikroorganizmima i u osnovi razvijaju isti odgovor prilikom ponovljene infekcije. Osnovne

komponenete urodjenog imuniteta su:

(1) fizike i hemijske barijere, kao što su epitel i antimikrobijalne supstance produkovane na

površini epitela;

(2) fagocitne elije (neutrofili i makrofagi) i urodjeno-ubilake elije (engl. Natural Killer - NK

cells) ili elije prirodne ubice;(3) proteini iz krvi, ukljuujui proteine lanove sistema komplementa, kao i druge medijatore

inflamacije;







9

(4) proteini koji se nazivaju citokini, a regulišu i koordinišu brojne aktivnosti elija nespecifinog

imunog sistema.

Mehanizmi urodjenog imunog sistema prepoznaju i specifini su za strukture koje su sline zapojedine grupe mikroorganizama, ali ne mogu da definišu fine i male razlike izmedju stranih

supstanci. Urodjeni imunitet obezbedjuje prvu, ranu, odbranu protiv invazije mikroorganizama.

Suprotno urodjenom imunitetu, razvio se specifian sistem imunih mehanizama koje stimulišu

izlaganje infektivnom agensu i poveava im se veliina odbrambene sposobnosti pri svakom

narednom izlaganju specifinom agensu. S obzirom da se ova forma imunog odgovora razvija kao

odgovor na infekciju i adaptira se prema infekciji naziva se adaptivna imunost ili adaptivni

imunitet. Osnovna obeležja adaptivnog imuniteta su veoma izražena specifinost za odredjene

molekule, kao i sposobnost »pamenja« (memorisanja) i na osnovu toga izraženije i brže reakcije

pri ponovljenom izlaganju istom stranom agensu. Adaptivni imuni odgovor je sposoban da

prepozna i reaguje na veoma veliki broj tzv. »mikrobijalnih« , ali i »nemikrobijalnih« supstanci.

Pored toga, poseduje neverovatno veliku sposobnost i kapacitet da razlikuje ak i veoma bliske

mikroorganizme i/ili molekule i zbog toga se naziva i specifini imunitet. Komponente

adaptivnog imuniteta su limfociti i njihovi produkti. Strane supstance koje indukuju specifian

imuni odgovor i/ili interaguju sa produktima imunološke reakcije nazivaju se antigeni.

Urodjeni (prirodni) mehanizmi odbrane su filogenetski stariji i u pripravnosti su za efikasno

delovanje pre bilo kakve naznake o tome da e homeostaza biti poremeena stranim agensom. U

sluaju susreta sa stranim agensom deluju brzo i svaki put sa jednakom efikasnošu aktiviraju

raspoložive resurse elija i molekula iako se komponente ovog sistema nisu prethodno srele sa

»napadaem«. Usmereni su relativno nespecifino protiv stranih agenasa (prepoznaju generalno

motive makromolekula koji grade zid bakterijskih elija i sl., ali ne specifine funkcionalne grupe).

Razlikuju strano od sopstvenog (prisutnog u homeostazi), ali nikako ne razlikuju vrstu stranog

agensa i ne ostavljaju nikakav memorijski zapis o susretu sa stranim agensom. Na suprot tome,adaptivni (steeni) mehanizmi odbrane, iako filogenetski mladji, usmereni su protiv tano

odredjene i specifine funkcionalne grupe koja igra ulogu specifinog »aktivatora« elija

adaptivnog imunog sistema. Kao rezultat aktiviranja adaptivnih mehanizama odbrane razvijaju se

specifine efektorne reakcije elijske (citotoksini T limfociti) ili humoralne (antitela)

komponente adaptivnog imunog sistema. Pored toga, adaptivni mehanizmi imunog odgovora

ostavljaju memorijski zapis o susretu sa specifinim stranim agensom i nakon ponovljenog

susreta reakcija usmerena ka uništavanju štetnog agensa je snažnija i brža, tj. efikasnija.







10

Tabela 2.2. Poreenje urodjenog i adaptivnog (humoralnog i elijskog) imunog odgovora

Karakteristike Urodjeni imuni odgovor Humoralni imuni odgovor elijski imuni odgovor Primarne elije Neutrofilni, eozinofilni i bazofilni

granulociti, mastociti, monociti i

makrofagi

B elije T elije

Poreklo elija Crvena koštana srž Crvena koštana srž Crvena koštana srž

Mesto maturaci je Crvena koštana srž (neut rof ilni,

eozinofilni i bazofilni granulociti i

monociti) i tkiva (mastociti i makrofagi)

Crvena koštana srž Timus

Mesto gde se nalaze zrele

elije

Krv, vezivno tkivo, limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo

Produkti primarne

sekrecije

Histamin, kinini, komplement,

prostaglandini, leukotrijeni, interferon

Antitela Citokini

Primarno dejstvo Inflamatorni odgovor i fagocitoza Zaštita od ekstracelularnih

antigena (bakterije, toksini,

paraziti, virusi)

Zaštita od intracelularnih antigena (virusi,

intracelularne bakterije i gljive) i tumora:

regulacija antitelo-posredovanog i elijskog

imunog odgovora (T elije pomonice i

supresorske T elije)

Reakcije

hipersenzitizacije(preosetljivosti)

Nema Trenutna hipersenzitivnost

(atopija, anafilaksija,citotoksine reakcije,

kompleksni imuni poremeaji)

Odložena hipersenzitivnost (alergija ili infekcija i

kontaktna hipersenzitivnost)


Urodjena i adaptivna otpornost su komponenete integrisanog odbrambenog odgovora organizma u

kome brojne elije i molekuli funkcionišu kooperativno. Iako je urodjena otpornost usmerena na

eliminaciju mikroorganizama, veliki broj patogenih vrsta je tokom evolucije stekao sposobnost

rezistencije na mehanizme urodjenog imuniteta, te njihova eliminacija zaheva mone mehanizmeadaptivnog imunog odgovora. Dve najznaajnije veze ova dva sistema su u tome što: (1) urodjeni

mehanizmi imunog odgovora stimulišu adaptivni imuni odgovor i utiu na prirodu adaptivnog

imunog odgovora, dok (2) adaptivni imuni mehanizmi koriste veliki broj efektornih mehanizama

urodjenog imuniteta u eliminaciji mikroorganizama, esto uveavajui odbrambene aktivnosti

urodjenih odbrambenih mehanizama.

Prema konvenciji/dogovoru termin imuni odgovor i imuni sistem se odnosi na adaptivniimunitet, dok se za urodjeni imunitet više koristi termin urodjena (prirodna) otpornost organizma,

ukoliko nije drugaije naznaeno.







11

2.1.2. Tipovi adaptivnog imunog odgovora

U pogledu korišenja razliitih komponenti i posrednika imunog sistema, kao i u pogledu razliitefunkcije u eliminisanju razliitih antigena, razlikuju se dva tipa adaptivnog imunog odgovora:

humoralni imunitet i elijama-posredovani imunitet (Slika 2.2.). Humoralni imunitet je

posredovan molekulama u krvi i mukoznim sekretima, koje se nazivaju antitela, a produkuju ih

elije koje se nazivaju B limfociti (ili B elije). Antitela prepoznaju antigene mikroorganizama,

neutrališu infektivnost mikroorganizama i

»oznaavaju« mikroorganizme za eliminaciju

preko razliitih drugih efektornih mehani-

zama imunog sistema. Humoralni imunitet je

osnovni odbrambeni mehanizam uperen

protiv vanelijskih (ekstracelularnih) anti-

gena i mikroorganizama i njihovih toksina

zbog toga što sekretovana antitela imaju

sposobnost vezivanja za ove mikroorganizme

i/ili njihove toksine i na taj nain asistiraju u

njihovoj eliminaciji. Antitela su veoma

specijalizovana, te razliita antitela mogu

aktivirati razliite efektorne mehanizme (npr.

neka stimulišu fagocitozu, druga aktiviraju

oslobadjanje inflamatornih medijatora iz

mastocita, i dr.).

Slika 2.2. Tipovi adaptivnog imuniteta

elijama-posredovani imunitet koji se još naziva elijski imunitet je posredovan specifinim

elijama koje se nazivaju T limfociti (ili T elije). elijski imunitet je odgovoran za imune

mehanizme kojima se uništavaju unutarelijski (intracelularni) antigeni i mikroorganizmi.

Ovaj tip imunog odgovora se razvio kao odgovor na unutarelijske mikroorganizme, kao što su

virusi i neke bakterije koji preživljavaju i proliferišu i unutar fagocita ili drugih elija organizma

domaina, a njihovi antigeni su nedostupni cirkulišuim antitelima. Odbrana organizma od

ovakvih tipova infekcije je funkcija elijama-posredovanog imuniteta, a time se poboljšavadestrukcija mikoorganizama »nastanjenih« u fagocitima ili se uništava inficirana elija, kako bi se

eliminisao izvor/rezervoar infekcije.







12

Zaštitna uloga imunosti uperena protiv razliitih vrsta mikroorganizama i njihovih antigena

može biti indukovana odgovorom organizma domaina na strani antigen ili prenošenjem

antitela ili limofocita koji su specifini za antigen/mikroorganizam. Forma imuniteta koja seindukuje prilikom prvog izlaganja stranom antigenu naziva se aktivni imunitet, zato što

organizam ima aktivnu ulogu u odgovoru na antigen (Slika 2.3.). Individue i limfociti koji nisu bili

izloženi specifinom antigenu nazivaju se naivni (intaktni, virgini). Suprotno, individue koje su

odgovorile specifinom reakcijom na antigen zaštiene su prilikom narednog izlaganja istom

antigenu i kaže se da su imune (otporne) na taj specifini antigen. U zavisnosti od naina

kontakta sa stranim agensom, i u odnosu na to da li organizam aktivno uestvuje u formiranju

odgovora, razlikuju se aktivan prirodni imunitet (sluajan kontakt sa antigenom izaziva

primarni odgovor; pri prvom kontaktu mogu da se razviju simptomi bolesti, ali ne moraju, a

razvija se otpornost na dati antigen) i aktivan veštaki imunitet - vakcinacija (vakcina sadrži na

neki nain promenjen

antigen tj. on nema

sposobnost virulentnosti ne-

go samo imunogeninosti,

tako da ne izaziva simptome

bolesti; prva vakcinacijaizaziva primarni odgovor, a

sledea odgovor memorijskih

elija, visok titar antitela i

dugotrajnu protekciju).

Slika 2.3. Aktivni i pasivni imunitet

Pasivni imunitet se može ostvariti prenošenjem seruma koji sadrži antitela i/ili limfocita od

specifino imunizovane individue (u procesu koji se naziva adaptivni transfer u eksperimentalnim

situacijama), pri emu primalac seruma/limfocita postaje imun na specifian antigen iako nikada

nije došao u kontakt sa njim, niti je razvio imuni odgovor (Slika 2.3.). Pasivna imunizacija je

koristan metod za poboljšanje rezistentnosti u veoma kratkom vremenu, bez potrebe za ekanjem

da se razvije adaptivni imuni odgovor. Pasivan prirodni imunitet stie fetus preko placente

majke, kao i odoje preko majinog mleka. Pasivan veštaki imunitet formira se aplikacijomgotovih antitela, što prouzrokuje momentalnu, ali kratkotrajnu zaštitu i koristi se kao tretman

koji spašava život kod potencijalno letalnih infekcija kakav je npr. tetanus (ubrizgavanje antitela







13

koja su izolovana iz životinje koja je imunizovana bakterijskim toksinima). U klinikim uslovima

se stepen imuniteta na prethodno izlaganje antigenu/mikoorganizmu meri indiretno, ili analizom

prisustva produkata imunog odgovora (serumska antitela specifina za antigene) iliadministracijom supstanci izolovanih i purifikovanih od mikroorganizama i praenjem/merenjem

reakcije na ove supstance. Reakcija na antigene je vidljiva/merljiva jedino kod individua koje su

ranije bile izlagane istom antigenu i za ovakve osobe se kaže da su “senzibilisane” na dati

specifian antigen, a reakcija njihovog organizma je indikator “senzibilisanosti”. Iako reakcija na

izolovani i preišeni antigen nema znaajnu zaštitnu funkciju, pokazano je da su senzibilisane

individue sposobne da ispolje zaštitni imuni odgovor protiv mikroba.

2.1.3. Osnovne karakteristike/obeležja adaptivnog imunog odgovora

Svi humoralni i elijama-posredovani imuni odgovori prema stranim antigenima ispoljavaju

nekoliko fundamentalnih karakteristika koje su posledica osobina limfocita koji zapravo i

posreduju u ovim odgovorima.

Specifinost (engl. specificity) – sigurnost da e veliki broj razliitih antigena izazvati specifian

odgovor.Diverzitet (engl. diversity)– raznolikost omoguava imunom sistemu da odgovori na veliki broj

razliitih antigena.

Memorija (engl. memory) – dovodi do poveanja odgovora prilikom ponovljenog izlaganja istom

antigenu.

Specijalizacija (engl. specialization) – generiše odgovore koji su optimalni za odbranu protiv

razliitih tipova mikroorganizama i njihovih antigena.

Ograniavanje sopstvenog (limitacija) tzv. »samoograniavajui« odgovor (engl. self-limitation) – dozvoljava/omoguava imunom sistemu da se »vrati« u stanje homeostaze.

Ne reaktivnost (tolerantnost) prema sopstvenom (engl. nonreactivity/tolerance to self)–

spreava ošteenje organizma domaina prilikom odgovora na strane antigene.

Specifinost i diverzitet se ispoljavaju kao sposobnost adaptivnog imunog sistema da razvija

specifian mehanizam imunog odgovora na veoma razliite antigene, ak i na razliite delove

jednog kompleksa proteina, polisaharida ili drugih makromolekula (Slika 2.4.). Delovi ovakvih

antigena koji se specifino prepoznaju od strane pojedina

nih limfocita nazivaju se determinante

(antigene determinante) ili epitope. Ova visoka specifinost postoji zbog toga što pojedini

limfociti ekpresuju membranske receptore koji su sposobni da razlikuju suptilne razlike u







14

strukturi izmedju odredjenih antigena. Klonovi limfocita sa razliitim specifinim receptorima su

prisutni kod neimunizovane (naivne) individue i sposobni su da prepoznaju i reaguju na

specifian antigen, na emu se zasniva osnovna postavka hipoteze klonske selekcije koja ekasnije u tekstu (deo 2.1.5.1. Prepoznavanje antigena ) biti malo detaljnije objašnjena. Ukupan

broj antigenih specifinosti limfocita jedne individue se naziva limfocitni repertoar i on je veoma

veliki. Procenjeno je da jedan organizam može razlikovati/odvojiti izmedju 107 i 109 razliitih

antigenih determinanti. Ovo svojstvo limocita se naziva diverzitet i rezultat je varijabilnosti u

strukturi antigen-vezjueg mesta na limfocitnom receptoru koji vezuje antigene. Drugim reima,

postoji veoma veliki broj klonova limfocita koji se razlikuju po strukturama njihovih antigenih

receptora, te se na taj nain kreira ukupan »repertoar« koji je ekstremno raznolik. Limfociti svakog

klona, nakon aktiviranja specifinim antigenom imaju sposobnost brze proliferacije, stvarajui

potomstvo iste specifinosti koje broji više hiljada elija. To je tzv. klonska ekspanzija koja

osigurava da se adaptivni imunitet suprotstavi brzoj proliferaciju mikoorganizama. Molekularni

mehanizmi koji omoguavaju i generišu veliki diverzitet u populaciji antigenih receptora bie

pomenuti u Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija limfocita .

Tabela 2.3. Osnovne osobine adaptivnog imunog odgovora

OSOBINA FUNKCIONALNI ZNACAJSpecifinost Razliiti Ag izazivaju specifine odgovore. Osnova za specifine odgovore leži u tome što limfociti ekspresuju membranske

receptore koji razlikuju fine razlike u strukturi koje postoje izmedju razli itih antigena.

DiverzitetImuni sistem specifino odgovara na širok spektar razliitih Ag (repertoar limfocita - izuzetno veliki; izraunato je da imuni sistem

može da razlikuje, i odgovori specifino, na 107-109 razliitih imunih determinanti). Drugim reima, postoje mnogi, razliiti klonovilimfocita koji se razlikuju u strukturi svojih receptora za antigene i u specifinosti za antigene

MemorijaPonovljeno izlaganje istom Ag izaziva vei i brzi imuni odgovor. Stimulacija naivnih limfocita sa Ag stimuliše ekspanziju klonova I

njihovu diferencijaciju na efektorne i dugo živee memorijske elije. Memorijski limfociti imaju specijalne karakteristike koje ih ineefikasnijim od naivnih limfocita (koji nisu bili u kontaktu sa Ag) u eliminaciji Ag.

Specijalizacija Odgovori su specifini i optimalni za razliite tipove Ag

Limitacija Imuni odgovor je vremenski ogranien - imuni sistem se vraa na nivo bazalne aktivnosti kada se eliminiše Ag

Tolerancija zasopstveno tkivo

Mehanizmi odbrane na strani patogen ne oštecuju sopstvene elije







15

Memorija se ispoljava kao sposobnost elija adaptivnog imunog sistema da na odredjeni nain

»memorišu« (zapamte) prethodni kontakt sa

antigenom i da se na taj nain poveasposobnost reakcije/odgovora prilikom

ponovljenog susreta sa istim antigenom.

Reakcija/odgovor na drugo i svako naredno

izlaganje istom antigenu naziva se

sekundarni imuni odgovor i on je obino

mnogo brži, vei, a esto i kvalitativno razliit

od prvog tzv. primarnog imunog odgovora

na isti antigen (Slika 2.4.).

Slika 2.4. Specifinost, memorija i tolerantnost na sopstveno

adaptivnog imunog odgovora

Primarni imuni odgovor se aktivira nakon prvog prodora antigena u organizam tj. kada

predhodno nestimulisani «naivni» limfociti prepoznaju antigen. Svaki naredni kontakt sa istim

antigenom, uglavnom, dovodi do razvijanja sekundarnog imunog odgovora. Sekundarni imuniodgovor zapoinje kada memorizujue elije (odredjenog primarnim kontaktom aktiviranog i

proliferisanog klona) prepoznaju iste antigene. Nakon prepoznavanja, one proliferišu i

diferenciraju se u efektorne elije, koje neutrališu antigen. Dakle, sekundarni imuni odgovor se

razvija brže od primarnog i ima veu amplitudu odgovora (npr. vei je titar antitela u serumu).

Smatra se da se zajedno sa sekundarnim, ponovo razvija i primarni imuni ogovor, koji e nakon

proliferacije i diferencijacije limfocita, ostaviti odredjeni broj memorizujuih elija u limfatinom

tkivu, cirkulaciji ili kosnoj srži. Imunološka memorija se javlja delimino zbog toga što svako

izlaganje specifinom antigenu dovodi do ekspanzije klona koji poseduje receptore za dati antigen.

Pored toga, stimulacija naivnih limfocita antigenima generiše tzv. dugo-živee memorijske elije

(ovaj fenomen e biti opisan u Poglavlju 2.2. elije i tkiva imunog sistema ). Ove memorijske elije

imaju specijalne karakteristike koje im omoguavaju da budu mnogo efikasnije u eliminaciji

antigena nego naivni limfociti koji nisu bili u kontaktu sa antigenom (npr. memorijski B limfociti

produkuju antitela, koja vezuju antigene sa veim afinitetom, nego antitela produkovana prilikom

primarnog imunog odgovora; memorijske T elije imaju veu sposobnost »dolaska« na mesto

infekcije nego naivne T elije). Imunološka memorija na neki nain vrši optimizaciju mehanizamaimunog odgovora u borbi sa infekcijama, jer svaki novi susret sa mikroorganizmom i/ili

antigenom generiše sve više memorijskih elija, a aktiviraju se i one koje su prethodno nastale.







16

Sposobnost memorisanja je jedan od razloga zbog kojeg vakcine obezbedjuju dugotrajnu zaštitu

protiv infekcija.

Specijalizacija se ogleda u sposobnosti imunog sistema da, na razliite mikroorganizme, odgovori

na veoma razliite, tano definisane i specijalne naine, maksimalno pojaavajui odbrambene

mehanizme usmerene protiv mikroorganizama. Prema tome, humoralni imunitet i elijama-

posredovani imunitet mogu biti aktivirani razliitim klasama mikroorganizama ili istim

mikroorganizmom u razliitim stadijumima infekcije (vanelijske i unutarelijske) i svaki tip

imunog odgovora štiti organizam domaina od date klase mikroorganizama. ak i u okviru

humoralnog i elijama-posredovanog imunog odgovora, priroda antitela ili T limfocita koji se

generišu može da varira od jedne do druge klase antigena (o specijalizaciji e biti diskutovano u

Odeljku 3. Prepoznavanje antigena i Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija limfocita ).

Ograniavanje sopstvenog (limitacija) ili tzv. »samoograniavajui« odgovor se ogleda u

sposobnosti imunog sistema da se vrati u stanje »homeostaze« odnosno mirovanja, u kome je bio

»zateen« prilikom invazije štetnog agensa, spreman da odgovori na naredni napad antigena.

Naime, svaki normalan imuni odgovor slabi tokom vremena nakon stimulacije sa antigenom, a

imuni sistem se »vraa« u svoje bazalno stanje mirovanja do uspostavljanja homeostaze.Homeostaza se održava u najveoj meri zbog toga što su imuni odgovori uzrokovani antigenima i

funkcionišu u cilju eliminacije antigena, te je stoga neophodna eliminacija osnovnih stimulusa za

preživljavanje i aktivaciju limfocita. Pored toga, antigeni i imuni odgovori na date antigene

inhibišu sam imuni odgovor.

Nereaktivnost (tolerantnost) prema sopstvenom se ogleda u sposobnosti adaptivnog imunog

sistema da se bori protiv velikog broja razliitih mikroorganizama, kao i drugih stranih antigena,ali da u normalnim, fiziološkim uslovima, ne reaguje protiv sopstvenih antigena i/ili potencijalno

antigenih molekula. Jedna od najmarkantnijih karakterijstika svakog normalnog imunog sistema

je njegova sposobnost da prepoznaje, reaguje/odgovara i eliminiše veliki broj stranih (onih koji

organizmu ne pripadaju) antigena, a da istovremeno ne reaguje i stvara ošteenja protiv

sopstvenih (onih koji organizmu pripadaju) antigenih molekula. Tolerancija prema sopstvenim

antigenima ili tolerancija prema sopstvenom se održava na raun nekoliko medjusobno-

koordinisanih mehanizama. Jedan od njih je eliminacija limfocita koji ekspresuju receptore

specifine za neke od sopstvenih antigena. Drugi mehanizam je dozvoljavanje limfocitima da se

»sretnu« sa drugim sopstvenim antigenima u situaciji kada je onemoguena stimulacija limfocita







17

koji reaguju na sopstveno (engl. self-reactive lymphocytes) ili postoji funkcionalna inaktivacija

ove grupe limfocita. Ovi mehanizmi tolerancije prema sopstvenom i diskriminacije izmedju

sopstvenih i stranih antigena bie detaljnije opisani u Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija limfocita . Abnormalnosti u indukciji ili održavanju tolerancije prema sopstvenom dovode do

imunog odgovora upravljenog prema sopstvenim tzv. autolognim antigenima i esto rezultira

poremeajima koji se nazivaju autoimune bolesti.

Sve nabrojane karakteristike imunog sistema su neophodne, ukoliko se želi ostvariti odbrambena

funkcija imunog sistema. Specifinost i memorija omoguavaju imunom sistemu da veoma

efikasno eliminiše perzistentne i ponovljenje stimulacije sa istim antigenom, te da sanira infekcije

koje su prolongirane ili uestale. Diverzitet/raznolikost je neophodna da bi imuni sistem odbranio

organizam od mnogih i raznovrsnih potencijalnih patogena iz okruženja. Specijalizacija

omoguava imunom sistemu da formira »sopstveni dizajn« odgovora kako bi najbolje i

najefikasnije eliminisao razliite vrste antigena. Ograniavanje sopstvenog imunog odgovora

omoguava imunom sistemu da se »vrati« u prvobitno stanje mirovanja nakon eliminacije svakog

stranog antigena i da bude u pripravnosti i sposoban da odgovori pri narednom susretu sa

antigenom. Tolerancija prema sopstvenom je vitalna za prevenciju ošteenja sopstvenih elija i

tkiva tokom održavanja funkcije raznolikog repertoara limfocita specifinog za strane antigene.

2.1.4. elijske komponente adaptivnog imunog sistema

Osnovne elije imunog sistema su limfociti, antigen prezentujue elije i efektorne elije.

Limofociti su elije koje specifino prepoznaju i odgovaraju na antigen i zbog toga su one

medijatori humoralnog i elijskog imuniteta. Postoje razliite populacije limfocita specifine ponainu prepoznavanja antigena i funkcijama (Slika 2.5). B limfociti su jedine elije sposobne da

produkuju antitela. Oni prepoznaju ekstracelularne antigene ukljuujui i one na površini elije, a

potom se diferenciraju u elije koje sekretuju antitela, te na taj nain predstavljaju medijatore

humoralnog imuniteta. T limfociti ne produkuju antitela. Ovi limfociti prepoznaju antigene

intracelularnih mikroorganizama i funkcionišu u smislu uništavanja ovih mikroorganizama ili

inficiranih elija, te predstavljaju medijatore elijama-posredovanog imuniteta. Antigeni receptori

T limfocita su membranski molekuli razliiti od antitela, ali strukturno povezani sa njima. T

limfociti imaju ogranienu specifinost za antigene, te oni prepoznaju iskljuivo peptidne antigene

koji su zakaeni za proteine ekspresovane na površini elija domaina, kodirane genima velikog







18

histokompatibilnog kompleksa (engl .

Major Histocompatibility Complex –

MHC). Stoga T elije prepoznaju iodgovaraju iskljuivo na antigene

vezane za površinu elije (engl. cell

surface antigens), dok na solubilne

antigene ne reaguju. T limfociti

podrazumevaju razliite subpopulaci-

je, a najbolje definisne su pomone T

elije (pomonice) i citolitini ili

citotoksini T limfociti (engl.

C ytolytic T L ymphocites - CTLs). Kao

markeri za fenotipsko razlikovanje

subpopulacija limfocita mogu se

koristiti membranski proteini.

Slika 2.5. Klase limfocita

Na primer, elije pomonice ekspresuju membranski protein CD4, dok citotoksini T limfociti

ekspesuju CD8 protein. T i B limfociti imaju klonalno distribuirane receptore za antigen tj. postoji

veliki broj klonova za razliite antigene, a pripadnici istog klona imaju iste receptore za antigene

na svojim membranama. Geni koji kodiraju receptore za antigene, se formiraju rekombinacijom

DNA segmenata, tokom razvoja ovih elija. Somatske rekombinacije generišu milione razliitih

gena za receptore, formirajui vrlo širok repertoar razliitih limfocita. Kao odgovor na stimulaciju

antigenom, pomone T elije sekretuju proteine koji se nazivaju citokini, a njihova funkcija je da

stimulšu proliferaciju i diferencijaciju kako samih T elija, tako i drugih elija ukljuujui B elije,

makrofage i druge leukocite. Citotoksine T elije uništavaju elije koje produkuju strane

antigene, kao što su elije inficirane virusim ili drugim intracelularnim mikroorganizmima.

Specifini T limfociti ija je funkcija da uestvuju uglavnom u inhibiciji imunog odgovora nazivaju

se regulatorni T limfociti. Njihovo stvaranje i precizna fiziološka uloga još uvek nije precizno

definisana. Pored B i T limfocita, trea klasa limfocita su tzv. urodjeno-ubilake elije (engl.

Natural Killer - NK cells) ili elije prirodne ubice ukljuene u urodjenoj otpornosti na viruse i

druge intracelularne mikroorganizme. Inicijacija i razvoj adaptivnog imunog odgovora zahtevada antigeni budu »uhvaeni« i »izloženi« specifinim limfocitima. elije koje ispunjavaju ova dva

zadatka i koje su u službi »serviranja« antigena limfocitima nazivaju se antigen prezentujue







19

elije (engl. Antigen Presenting Cells - APC). Najspecijalizovanije APC su dendritske elije kože

osposobljene da hvataju antigene koji dospevaju iz spoljašnjeg okruženja, da ih transportuju do

limfoidnih organa i na kraju da prezentuju ove antigene naivnim T limfocitima kako bi se aktiviraoimuni odgovor. Drugi elijski tipovi funkcionišu kao APC u razliitim stadijumima humoralnog i

elijama-posredovanog imuniteta. Aktivacija limfocita antigenima vodi ka generisanju velikog

broja razliitih medjusobno koordinisanih mehanizama koji imaju za cilj eliminaciju antigena i

veoma esto zahtevaju prisustvo specifinih elija koje se nazivaju efektorne elije. U razliitim

tipovima imunog odgovora efektorne elije mogu biti npr. aktivirani T limfociti, mononuklearni

fagociti i druge elije imunog sistema. Limfociti i »dodatne« elije koje su u funkciji imunog

sistema su koncentrisani u anatomski diskretnim limfoidnim organima gde one medjusobno

interaguju i iniciraju imuni odgovor. Limfociti su takodje prisutni i u krvi i odatle mogu da

recirkulišu u limfoidna tkiva, a potom na periferiju koja je izložena antigenu i da ga tamo

eliminišu. Detaljnije informacije o elijskoj komponeneti imunog sistema bie predoene u

Poglavlju 2.2. elije i tkiva imunog sistema.

2.1.5. Faze adaptivnog imunog odgovora

Adaptivni imuni odgovor se odvija kroz nekoliko faza – prepoznavanje antigena, aktivacija

limfocita i efektorna faza eliminacije antigena – praena »povratkom« u stanje homeostaze i

održavanja memorije (Slika 2.6.).

Svi imuni odgovori zapoinju

prepoznavanjem specifinog atigena.

Ovo prepoznavanje prouzrokuje i

vodi ka aktivaciji limfocita koji suprepoznali antigen, a kulminira u

razvoju efektornih mehanizama koji

posreduju fiziološku funkciju

imunog odgovora, odnosno,

eliminaciju antigena. Nakon

eliminacije anitigena, imuni odgovor

slabi i obnavlja se homeostaza.

Slika 2.6. Faze adaptivnog imunog odgovora







20

U narednim delovima teksta je dat sažet prikaz pojedinih faza adaptivnog imunog odgovora, a

detaljnije informacije bie predoene u posebnom poglavlju.

2.1.5.1. Prepoznavanje antigena

Svaka individua poseduje veliki broj limfocita klonskog porekla, pri emu je svaki klon nastao od

jednog jedinog prekursora i sposoban je da prepozna i reaguje na odredjenu antigenu

determinantu, te se nakon ulaska antigena »selektuje« specifian postojei klon i aktivira

antigenom (Slika 2.7.). Ovaj fundamentalni princip imunog sistema se naziva hipoteza klonske

selekcije, a predložena je kao hipoteza koja objašnjava kako imuni sistem može da ogovori na

veliki broj razliitih antigena. Prema ovoj hipotezi, antigen-specifini klonovi limfocita se razvjaju

ranije i nezavisno od izlaganja

antigenu. elije unutar jednog

klona poseduju identine antigene

receptore koji se razlikuju od

antigenih receptora na elijama

lanicama drugih klonova. Iako je

veoma teško postaviti gornju gra-

nicu broja antigenih determinantikoje prepoznaje imuni sistem

sisara, naješe se koriste

vrednosti izmedju 107 i 109. Ovo je

razumljiva aproksimacija broja

razliitih antigenskih receptornih

proteina koji se produkuju te

reflektuje broj pojedinih klonovalimfocita prisutnih u svakom

organizmu.

Slika 2.7. Hipoteza klonske selekcije

Ovo je razumljiva aproksimacija broja razliitih antigenskih receptornih proteina koji se

produkuju, te reflektuje broj pojedinih klonova limfocita prisutnih u svakom organizmu. Straniantigeni interaguju i aktiviraju postojee klonove antigen-specifinih limfocita tj. onih koji imaju







21

receptore za datu antigenu determinantu, u specijalizovanom limfoidnom tkivu gde imuni odgovor

zapoinje.

2.1.5.2. Aktivacija limfocita Aktivacija limfocita zahteva prepoznavanje dva razliita signala: prvi je antigen a drugi je

komponenta urodjenog imunog odgovora na mikroorganizme koji su oštetili eliju (Slika 2.8.).

Ovaj fenomen je definisan kao hipoteza dva signala za aktivaciju

limfocita. Potreba za antigenom (tzv. signalom 1 ili prvim

signalom) garantuje specifinost imunog odgovora (registrovae ga

samo klon koji ima specifini receptor za taj antigen). Potreba za

dodatnim stimulusom iniciranim od strane mirkoorganizama ili

reakcije urodjenog imuniteta na mikroorganizme (tzv. signal 2

ili drugi signal) garantuje da e imuni odgovor biti indukovan

onda kada bude potreban (protiv mikroorganizama ili drugih

štetnih agenasa) a ne protiv bezopasnih molekula ukljuujui i

sopstvene antigene.

Slika 2.8. Dva signala su neophodna za aktivaciju limfocita

Odgovor limfocita na antigene i drugi signal ukljuuje sintezu novih proteina, proliferaciju

elija i diferencijaciju u efektorne i memorijske elije. To podrazumeva aktivaciju transkripcije

gena koji ranije nisu bili aktivni tj. sintezu novih proteina, i proliferaciju elija odredjenog klona.

U sluaju nekih akutnih virusnih infekcija, veliina klona aktivranog antigenom može biti 50 000

puta vea od bazalne. Antigenom-aktivirani limfociti se diferenciraju u efektorne elije ,

(citotoksini T limfociti, elije pomonice i plazma elije), ija je funkcija da eliminišu antigene, imemorijske elije , koje su dugoživee i pokazuju uvean odgovor prilikom ponovnog susreta sa

istim antigenom. Periferni limfatini vorovi su mesto gde B i T limfociti odgovaraju na antigene

(koji pristižu iz perifernog tkiva putem limfe). U slezini limfociti odgovaraju na antigene poreklom

iz krvi.

2.1.5.3. Efektorna faza adaptivnog imunog odgovora: eliminacija antigena

Tokom efektorne faze imunog odgovora limfocti koji su bili specifino aktivirani antigenima

ostvaruju efektorne funkcije koje vode do eliminacije antigena. Efektorne i neke memorijske elije,

napuštaju limfne vorove, odlaze u periferno tkivo na mesto infekcije gde su neophodne za







22

eliminaciju mikroba. Eliminacija ekstracelularnih i intracelularnih antigena posredstvom antitela

i T limfocita veoma esto zahteva ueše kako drugih, tzv. nelimfatinih elija, tako i ueše

odbrambenih mehanizama koji su operativni u urodjenom imunom odgovoru. Prema tome, istimehanizmi urodjenog imunog odgovora, koji obezbedjuju prvu liniju odbrane protiv infektivnih

agenasa, mogu biti korišeni prilikom odredjenih adaptivnih odgovora u eliminaciji

mikroorganizama. Pored toga, kao što je napomenuto ranije, veoma važna generalna funkcija

adaptivnog imunog odgovora je da pojaava efektorne mehanizme urodjenog imuniteta i da ih

fokusira na ona tkiva i elije koji su napadnuti stranim antigenom.

2.1.5.4. Homeostaza: Slabljenje/opadanje/nestajanje imunog odgovora

Na kraju imunog odgovora, imuni sistem se vraa u svoje bazalno stanje mirovanja, najveim

delom zbog toga što veina antigen-stimulisanih limfocita umire apoptozom. Apoptoza je forma

regulisane, fiziološke elijske smrti u kojoj nukleus prolazi kondenzaciju i fragmentaciju, plazma

membrana postaje »mehurasta« i ispunjena vezikulama, interna struktura i poredak

membranskih lipida se gubi, te mrtva elija biva veoma brzo fagocitirana i pre izlivanja njenog

sadržaja. Apoptoza je proces suprotan nekrozi, obliku elijske smrti, u toku koga nuklearana i

elijska membrana pucaju i sadržaj se izliva što aktivira mehanizme lokalne inflamatorne reakcije.

Velika frakcija antigenima-aktiviranih limfocita ulazi u proces apoptoze verovatno zbog toga štopreživljavanje limfocita zavisi od antigena i antignenom-indukovanih faktora rasta, te kada imuni

odgovor eliminiše antigen kojim je bio iniciran, limfociti ostaju bez stimulusa esencijalnih za

preživljavanje i umiru. Za preživljavanje memorizujuih elija nije potrebna stimulacija sa

antigenom. Izvestan broj memorizujuih elija migriraja u limfne noduse (gde obezbedjuje pul

antigen specifinih limfocita, koji mogu biti brzo aktivirani i diferencirani u efektorne elije,

prilikom ponovnog izlaganja istom antigenu), dok druge ostaju u mukoznom tkivu ili cirkulišu u

krvi (odakle mogu biti regrutovane za brzi odgovor u bilo kom delu tela).

Osnovni pojmovi i principi uvedeni u ovom poglavlju detaljnije e biti objašnjeni u tekstu poglavlja

koja slede.







23

2.2. ELIJE I TKIVA IMUNOG SISTEMA

elije koje

ine imuni sistem (IS) i koje su odgovorne za funkciju IS, se nalaze rasute po svim

tkivima u organizmu, prisutne su u cirkulaciji (cirkulišu krvotokom i limfotokom), ili su

organizovane u anatomski definisane grupacije elija tzv. limfne organe. Anatomska organizacija

ovih elija i njihova sposobnost da cirkulišu po organizmu tj. da se stalno kreu i rasporedjuju

izmedju krvi, limfe i tkiva, je od suštinskog znaaja za nastajanje imunog odgovora (IO).

Da bi IS bio efikasan u borbi protiv razliitih patogena mora da zadvolji sledee zahteve:

1. treba da odgovori na mali broj razliitih mikroba koji mogu da prodru na bilo kom

mestu u organizam;

2. mali broj elija IS (tzv. naivnih limfocita), treba da specifino prepozna i odgovori na

strane antigene;

3. efektorni mehanizmi imunog sistema (Ab i efektorni T limfociti) treba da unište strane

mikrobe na mestima njihovog prodora u organizam, kao i na mestima koja su udaljena od

mesta prodora mikroba.

Sposobnost IS da se suoi sa ovim zahtevima i da efikasno zastiti organizam od stranih Ag, zavisiod organizacije i karakteristika elija i tkiva IS.

• Specijalizovana tkiva (periferni limfatini organi) vezuju (koncentrišu) antigene koji prodiru

kroz glavne ulaze u organizam (koža, GIT, RS). Vezivanje antigena i njihov transport do

limfatinih organa je prvi korak u adaptivnom IO.

• Naivni limfociti (limfociti koji nisu bili u kontaktu sa antigenom) migriraju kroz periferne

limfatine organe i tu se susreu sa antigenom, prepoznaju ga i iniciraju IO. (Memorijski iefektorni limfociti nastaju od antigen-stimulisanih naivnih limfocita).

• Efektorni i memorijski limfociti cirkulišu krvotokom i dospevaju i do mesta prodora

antigena i tu se zadržavaju. Time je omogueno sistemsko delovanje imuniteta tj. da imuni

mehanizmi funkcionišu bilo gde u organizmu.







24

2.2.1. elije imunog sistema

elije koje su uklju

ene u adaptivni IO su:

antigen-specifini limfociti,

specijalizovane elije koje iskazuju antigene i time aktiviraju limfocite (engl. antigen-

presenting cells, APCs),

efektorne elije koje eliminišu antigene.

Tabela 2.4. elije imunog sistema i njihova primarna funkcija

TIP ELIJE PRIMARNA FUNKCIJA TIP ELIJE PRIMARNA FUNKCIJA

P R I R O D N I IM U N I T E T S T E E N I I M U N I T E T

Neutrofilnigranulociti

Fagocitoza i inflamatorni procesi; naješe prvinapuštaju cirkulaciju i dolaze do inficiranog tkiva

B elije Nakon aktivacije, diferenciraju se uplazma elije ili memorijske B elije

Monociti Napuštaju cirkulaciju i u tkivima se razvijaju umakrofage

Plazma elije Produkuju antitela koja su direktno iliindirektno odgovorna za destrukcijuantigena

Makrofagi Najmoniji fagociti; znaajni u kasnim

stadijumima infekcije i reparacije tkiva,rasporeeni su u celom organizmu u ciljupravovremenog »hvatanja« stranih agenasa;produkuju antigene; uestvuju u aktivaciji T i Blimfocita

Memorijske B elije

Brzo i efikasno odgovaraju na antigenna koji je imuni sistem prethodno vereagovao; odgovorne za imunitet

Bazofilni granulociti Pokretljive elije, napuštaju cirkulaciju, dospevajudo tkiva gde pospešuju oslobaanje jedinjenjakoja uestvuju u inflamatornim procesima

Citotoksine C elije Odgovorne za destrukciju elijaliziranjem ili produkcijom citokina

Mastociti Nepokretne elije u vezivnom tkivu; pospešujuinflamatorne procese

T elije odgovorne zaodgodjenu hipersenzitivnost

Produkuju citokine koji pospešujuinflamatorne procese

Eozinofilnigranulociti

Iz krvi prelaze u razliita tkiva i oslobaaju jedinjenja koja inhi bišu inflamatorne procese T elije pomonice Aktiviraju B elije i efektorne T elije

Prirodne elije ubice Liziraju tumorske elije i elije inficirane virusima Supresorske T elije Inhibiraju B elije i efektorne T elijeMemorijske T elije Brzo i efikasno odgovaraju na antigen

na koji je imuni sistem prethodno vereagovao; odgovorne za steeniimunitet

Dendritske elije Procesuju antigene i uestvuju uaktivaciji B i T elija







25

Slika 2.9. Kretanje elija imunog sistema tokomimunog odgovoraDendritske elije “love” antigene na mestu njihovog

prodora u organizam i transportuju/koncentrišu ih do

limfnih vorova, gde aktiviraju naivne limfocite koji

su putem krvi dospeli u limfne vorove. Efektorne i

memorijske elije, koje su nastale u limfnom voru,

ulaze u cirkulaciju i putem krvi dospevaju do bilo kog

tkiva. Antitela, takodje, dospevaju u krvotok i tako

mogu da lociraju antigene bilo gde u organizmu.

Memorijske elije, mogu da ostanu u perifernom

limfatinom tkivu ili mogu da udju u krvotok.

2.2.1.1. Limfociti

Limfociti su jedine elije u organi-

zmu sposobne da specifino pre-

poznaju antigene. Oni su odgo-

vorni za dve osnovne karakteristi-

ke adaptivnog IO, za specifinost i

postojanje imunološke memorije.

Morfologija limfocitaNaivni limfociti su elije koje nisu

bile u kontaktu sa antigenom.

Zbog njihove veliine i izgleda

morfolozi ih nazivaju mali limfociti.

To su elije dijametra 8-10 µm,

koje imaju veliko, centralno

položeno jedro i tanak sloj citoplazme u kojoj se nalaze

oskudno zastupljene organele (nekoliko mitohondrija,

ribozoma, lizozoma bez specijalizovanih organela). Pre

stimulacije sa antigenom, naivni limfociti se nalaze u stanju

mirovanja, u G0 fazi elijskog ciklusa. Nakon susreta sa

antigenom, naivni limfociti, ulaze u G1 fazu, postaju vei

(10-12 µm u dijametru), imaju više citoplazme i organela, ipovišen nivo citiplazmatine RNA, i dobijaju naziv veliki

limfociti ili limfoblasti.Slika 2.10. Faze elijskog ciklusa limfocita







26

Klase limfocita

Iako su morfološki posmatrano isti, limfociti se razlikuju po svojoj funkciji kao i po proteinskim

produktima. B limfociti (nosioci humoralnog imuniteta), su dobili naziv zato što kod ptica oveelije sazrevaju u Bursi Fabricii . Sisari ne poseduju anatomski ekvivalent Burse Fabricii, te oni

sazrevaju u kosnoj srži. T limfociti (medijatori elijske imunosti), nastaju u kosnoj srži, a zatim

migriraju i sazrevaju u timusu. T limfocite ine dve grupe limfocita, T elije pomonice i citolitiki

(citotoksini) T limfociti (CTLs). T i B limfociti poseduju klonalno distribuirane receptore za

antigene. Drugim reima, postoji mnogo klonova ovih elija koji se medjusobno razlikuju po

specifinosti njihovih receptora za odredjene antigene (pripadnici istog klona ekspresuju iste

receptore za antigen, koji se razlikuje od receptora pripadnika drugog klona). Geni koji kodiraju

receptore za antigene se formiraju rekombinacijom segmentata DNA u toku razvoja ovih elija.

Zahvaljujui ovim somatskim rekombinacijama nastaju geni za milione razliitih receptora i tako

nastaje vrlo velik i raznolik repertoar limfocita. Urodjeno-ubilake elije (engl. natural killer cells;

NK) su trea populacija limfocita koja poseduje razliite receptore od T i B limfocita i ija je

funkcija vezana za nespecifinu imunost (prirodnu otpornost).

Tabela 2.5. Klase limfocita

KLASA FUNKCIJA RECEPTOR ZA ANTIGEN FENOTIPSKI MARKER

T limfociti - pomonice Stimulišu rast i diferencijaciju B

limfocita.

Aktiviraju makrofage sekrecijom

citokina.

heterodimer CD3+, CD4+, CD8-

Citolitiki T limfociti

(citotoksini)

Uništavaju virusom inficirane elije,

tumorske elije; odbacivanje alografta.

heterodimer CD3+, CD4-, CD8+

B limfociti Produkcija antitela Antitelo vezano za membranu

limfocita (imunoglobulin)

Fc receptori; klasa II MHC;

CD19; CD21

Urodjeno-ubilake

elije

Uništavaju virusom inficirane elije,

tumorske elije;

Imunoglobulinu-slian receptor na

ubilakim elijama

Fc receptor za IgG

(CD16)

Membranski proteini se mogu koristiti kao fenotipski markeri za razlikovanje funkcionalno

razliitih populacija limfocita. Na primer, veina T elija pomonica ekspresuje površinske

proteine tzv CD4, dok veina CTLs ekspresuje površinske proteine CD8. Antitela specifi

na za te

markere, obeležena odgovarajuim probama, mogu se koristiti za identifikaciju i izolaciju razliitih

populacija limfocita. *Prihvaena nomenklatura za markere limfocita je CD nomenklatura. CD







27

(cluster of differentiation) je istorijski termin koji oznaava kolekciju monoklonalnih antitela, koja

su specifina za razliite markere diferencijacije limfocita. CD sistem obezbedjuje uniforman

pristup u identifikaciji površinskih molekula na limfocitima, APCs i mnogim drugimelijskim

tipovima imunog sistema. Mnogi od ovih proteina/markera imaju znaajnu ulogu u funkciji

limfocita.

Slika 2.11. Morfologija limfocita. A- limfocit u perifernoj krvi (svetlosna mikroskopija); B- mali limfocit (elektronska mikroskopija); C- veliki limfocit (elektronska mikroskopija).

Diferencijacija limfocita

Kao i ostale elije krvi, i limfociti nastaju u kosnoj srži. U toku kompleksnog procesa sazrevanja

(maturacije) oni ekspresuju receptore za antigene i dobijaju funkcionalne i fenotipske

karakteristike zrele elije. B limfociti sazrevaju u kosnoj srži, dok T limfociti napuštaju kosnu srž,

nastanjuju timus, i tu maturiraju u zrelu formu. Zrele forme limfocita napuštaju kosnu srž i

timus, ulaze u cirkulaciju i

nasta-njuju periferne limfne

organe. Zrele forme limfocita,

koje se nalaze u limfnim voro-

vima, a nisu bile u kontaktu saantigenom, nazivaju se naivni

limfociti.

Slika 2.12. Sazrevanje limfocita

Funkcija naivnih limfocita je da prepoznaju antigene i iniciraju adaptivni IO. Ukoliko se ne sretnu

sa antigenom, naivni limfociti posle nekog vremena bivaju izloženi apoptozi i umiru, a populacija

se održava na odredjenom nivou zahvaljujui nastajanju novih naivnih limfocita od progenitornih

elija kosne srži. Procenjeno je da poluživot naivnih limfocita miša iznosi oko 3-6 meseci, dok

humani limfociti žive nekoliko godina. Veruje se da je za preživljavanje naivnih limfocita

neophodno “slabo” prepoznavanje sopstvenih antigena, tako da elije primaju signale koji ih

održavaju u životu, a nedovoljni su da aktiviraju diferencijaciju u efektorne elije. Priroda ovih

auto-antigena znaajnih za preživljavanje naivnih limfocita, za sada nije poznata. Drugim reima,

receptor za antigen na naivnim limfocitima je neophodan ne samo za prepoznavanje stranog

antigena i iniciranje diferencijacije u efektorne elije, nego i za preživljavanje naivnih elija. Takodje, smatra se da su i citokini znaajni za preživljavanje naivnih limfocita.







28

Aktivacija limfocita

Antigeni i drugi stimuluisi aktiviraju naivne limfocite da se diferencijraju u efektorne i memorijske

elije. Ova aktivacija se odvija u nekoliko faza.Sinteza novih (de novo ) proteina. Odmah nakon stimulacije zapoinje transkripcija gena,

koji su predhodno bili u mirovanju, i sinteza novih proteina. Sintetišu se citokini (u T elijama),

koji stimulišu rast i diferencijaciju limfocita i drugih efektornih elija; citokinski receptori, koji

ine limfocite senzitivnim na stimulaciju

citokinima; i mnogi drugi proteini

ukljueni u transkripciju gena i deobu

elija.

Proliferacija elija. Kao odgovor

na antigen i faktore rasta produkovane iz

elija, antigen-specifini limfociti bivaju

zahvaeni mitotikim deobama. Ovo vodi

ka proliferaciji i poveanju antigen-

specifinog klona tj. ekspanziji klona.

Kod nekih akutnih infekcija virusima,

broj virus-specifinih T limfocita može da

poraste pedeset hiljada puta u odnosu na

bazalni (nestimulisani) broj.

Slika 2.13. Faze aktivacije limfocita

Diferencijacija u efektorne elije. Neki od antigen-stimulisanih limfocita se diferenciraju

u efektorneelije,

ija je funkcija eliminacija antigena. Efektorni limfociti su: pomo

ne T

elije,CTLs i B limfociti koji produkuju antitela. Diferencirane T elije pomonice, na membrani

ekspresuju proteine, koji mogu da reaguju sa ligandima drugih elija (kao sto su makrofage i B

limfociti), a takodje sekretuju citokine koji aktiviraju druge elije. Diferencirani CTLs imaju

granule koje sadrže proteine ukljuene u uništavanje virusom-inficiranih elija kao i tumorskih

elija. B limfociti se diferenciraju u elije koje sintetišu i sekretuju antitela (plazma elije). One

imaju širi sloj citoplazme sa dobro razvijenim granuliranim endoplazmatskim retikulumom (gde se

sintetišu antitela i drugi proteini, koji se sekretuju ili ulaze u sastav membrane limfocita), kao i

perinuklearni Golgi kompleks (gde molekule antitela dobijaju konanu formu i gde se pakuju u

sekretorne vezikule). Smatra se da više od 1/2 ukupne mRNA plazma elija kodira proteine

antitela. Plazma elije se razvijaju u limfoidnim organima na mestu IO, i mogu da migriraju nazad







29

u kosnu srž, gde neke od njih žive duži period nakon završetka IO. Ipak veina plazma elija ne

živi dugo nakon eliminacije antigena.

Diferencijacija u memorijske elije. Neki od antigen-stimulisanih B i T limfocita sediferenciraju u memorijske elije, koje su odgovorne za brzi i masovan IO, nakon ponovnog

susreta sa istim antigenom (sekundarni IO). Memorijske elije preživljavaju u stanju

funkcionalnog mirovanja i nekoliko godina nakon eliminacije antigena. Od naivnih i efektornih

limfocita se razlikuju po proteinima koje ekspresuju na svojoj membrani. Memorijski B limfociti

na membrani ekspresuju Ig kao što su IgG, IgE i IgA dok naivni B limfociti imaju IgM i IgD.

Takodje, memorijski T limfociti u odnosu na naivne T elije na membrani imaju više adhezivnih

molekula, kao što su integrini i CD44. Ovi proteini promovišu migraciju memorijskih elija na

mesto infekcije. Neke memorijske elije migriraju u limfne vorove gde obezbedjuju pul antigen-

specifinih limfocita, koji mogu brzo da odgovore na ponovni prodor antigena (mogu brzo da

proliferišu u efektorne elije). Druge memorijske elije, nastanjuju mukozna tkiva ili cirkulišu

krvotokom, odakle brzo mogu da budu regrutovane u efektorni odgovor, i usmerene na mesto

prodora antigena.

2.2.1.2. Antigen-prezentuju e elije (APCs)

Antigen-prezentujue elije (APCs) su populacije elija koje su specijalizovane da “hvataju”antigene i iskazuju ih na svojim membranama, T limfocitima. One, obezbedjuju signal koji

stimuliše proliferaciju i diferencijaciju T limfocita. Najbrojnija populacija APCs, ukljuena u

aktivaciju T limfocita su dendritske elije. Makrofage, kao i B limfociti, takodje, mogu da

funkcionišu kao APCs (B limfociti mogu da iskažu antigene, na svojoj membrani, T elijama

pomonicama). Specijalizovane elije tzv. folikularne dendritske elije, iskazuju antigene B

limfocitima, tokom odredjenih faza humoralnog imunog odgovora.

Dendritske elije. Dendritske elije imaju znaajnu ulogu u “hvatanju” proteinskihantigena i indukciji elijskog imunog odgovora (stimulaciji T limfocita). Ove elije se nalaze ispod

epitela u veini organa, gde “hvataju” antigene, a zatim ih transportuju do perifernih limfoidnih

organa. Tu se dendritske elije sreu sa T limfocitima. Veina potie od monocitne loze i otuda

naziv mijeloidne dendritske elije.

Mononuklearni fagociti. Sistem mononuklearnih fagocita se sastoji od elija ija je

primarna funkcija fagocitoza. elije ovog sistema potiu od elija kosne srži, koje ulaze u

cirkulaciju a potom sazrevaju i bivaju aktivirane u razliitim tkivima.

Monociti su nepotpuno diferencirane elije koje napuštaju kosnu srž, i ulaze u

cirkulaciju. Monociti su dijametra 10-15 µm, imaju bubrežasto jedro i granuliranu citoplazmu







30

koja, izmedju ostalog, sadrži lizozome, fagocitne vakuole i citoskeletne filamente. Kada dospeju u

tkiva, ove elije sazrevaju i postaju makrofage. Nakon aktivacije, makrofage se mogu razviti u

razliite morfološke forme. One koje se nalaze u blizini epitelnih

elija u koži, razvijaju izrazitoveliku citoplazmu i nazivaju se epiteloidne elije. Aktivirane makrofage se mogu fuzionisti i tako

formirati multinukleatne džinovske elije. Makrofage se nalaze u svim organima, i vezivnim

tkivima, i u zavisnosti od lokalizacije imaju razliite nazive. Na primer, u CNS se zovu mikrogli-

jalne elije; kada oblažu vaskularne sinuse u jetri, nazivaju se Kupferove elije; u pluima su

alveolarne makrofage; dok se multinukleatni fagociti kosti zovu osteoklasti.

Makrofage, koje su fagocitirale antigene, prikazuju te antigene na svojoj membrani, efektornim T

limfocitima. Efektorni T limfociti, onda, aktiviraju makrofage da unište antigene. Ovakva

dešavanja predsta-

vljaju glavni mehani-

zam elijskog imunog

odgovora protiv intra-

celularnih mikroba

(antigena).

Slika 2.14. Sazrevanje mononuklearnog fagocita

Makrofage, takodje, aktiviraju naivne T limfocite i indukuju primarni IO. Ipak, smatra se da su

dendritske elije mnogo efikasnije u indukovanju primarnog IO. Mononuklearni fagociti su,

takodje, znaajne efektorne elije u nespecifinom i u specifinom IO (prirodnom i steenom IO).

Efektorne funkcije makrofaga vezane za nespecifinu imunost su fagocitoza mikroba i produkcija

citokina koji aktiviraju druge elije ukljuene u inflamatorni odgovor. U adaptivnom IO,

makrofage takodje, imaju znaajne efektorne funkcije: u elijskom IO, antigen-stimulisani T limfociti aktiviraju makrofage da unište fagocitirani antigen; u humoralnom IO, receptori za

antitela, koji se nalaze na membrani makrofaga, prepoznaju antigene okružene antitelima

(opsonine) i fagocitiraju ih.

Folikularne dendritske elije. Folikularne dendritske elije (FDCs) su prisutne u

germinalnim centrima limfnih folikula u limfnim vorovima, slezini i mukoznim limfoidnim

tkivima. Veina ovih elija nije poreklom od elija kosne srži i nije srodna dendritskim elijama.

FDCs “hvataju” antigene u kompleksu sa antitelom ili produkte komplementa, i iskazuju ove

antigene na svojim membranama, da bi bili prepoznati od B limfocita.







31

2.2.2. Anatomija i funkcija limfoidnih tkiva

Vrlo važna karakteristika IS, koja omoguava elijske interakcije neophodne za faze

prepoznavanja i aktivacije IO, je da su limfociti i ostale elije koje pomazu IO, lokalizovane i

koncetrisane u anatomski definisanim tkivima ili organima. Antigeni koji prodiru u organizam se

transportuju do ovih tkiva, to su mesta njihove koncentracije, i tu se antigeni sreu sa T

limfocitima. Limfoidna tkiva su klasifikovana

kao:

generativni organi (primarni

limfoidni organi), u kojima limfociti

ekspresuju receptore za antigene i

fenotipski i funkcionalno maturiraju;

periferni organi (sekundarni limfoidni

organi), gde se inicira proliferacija i

razvoj limfocita kao odgovor na prodor

stranih antigena.

Primarni limfoidni organi sisara su kosna srž,gde nastaju svi limfociti, i timus, gde T limfociti

maturiraju i dobijaju funkcionalne kompe-

tencije.

Sekundarnim limfoidnim organima i tkivima

pripadaju limfni vorovi, slezina, kožni i

mukozni imuni sistem, kao i agregati limfocita

koji se nalaze u vezivnom tkivu gotovo svihorgana sa izuzetkom CNS.

Slika 2.15. Limfoidni organi u organizmu oveka

2.2.2.1. Kosna srž

Kosna srž je mesto nastajanja svih elija krvi, ukljuujui i nezrele limfocite, kao i mesto gde B

limfociti maturiraju. U toku fetalnog perioda hematopoeza se odvija u žumananoj kesi i para-

aortinom mezenhimu, a kasnije i u fetalnoj jetri i slezini. Ovu funkciju postepeno, tokom

vremena, preuzima kosna srž i to pogotovo kosna srž pljosnatih kostiju, tako da u pubertetu

hematopoetsku sposobnost uglavnom imaju srži sternuma, kimenih pršljena, rebara i iliane







32

kosti. Crvena kosna srž ovih kostiju (koja ima hematopoetsku sposobnost) je retikularna formacija

smeštena izmedju trabekula. Prostori u ovoj sundjerastoj formaciji su ispunjeni masnim elijama,

stromalnim fibroblastima i prekursornimelijama krvi. Ove prekursorne

elije sazrevaju i ulaze ugustu mrežu vaskularnih sinusa, i tako ulaze u cirkulaciju. Kada je kosna srž ošteena ili postoje

veliki zahtevi za krvnim elijama, jetra i slezina mogu da budu mesta ekstramedularne

hematopoeze. Sve krvne elije potiu od zajednike stem celije, koja delovanjem odredjenih

faktora postaje opredeljena elija za odredjenu lozu (eritroidnu, megakariocitnu, granulocitno-

monocitnu i limfocitnu). Stem elije ne poseduju markere karakteristine za diferencirane krvne

elije ali ekspresuju proteine CD34 i Sca-1 (engl. stem cell antigen-1), preko kojih je mogua

njihova identifikacija. Proliferacija i matura-cija prekursorskih elija u kosnoj srži je stimulisana

citokini-ma (mnogi od

ovih citokina se

nazivaju stimulirajui

faktori kolonije koji se

sekre-tuju iz

stromalnih elija i

makrofaga i

obezbedjuju lokalnookruženje po-godno za

hematopoezu.1

Kosna srž, sadrži i

dugoživece plazma eli-

je koje sekretuju anti-

tela, a koje su nastale

u perifernim limfati-nim tkivima nakon

susreta sa antigenom.

1 Stem elije imaju potencijal da se razviju u razliite tipove elija. Klase stem elija (u koliko razlii tih tipova elija mogu da se diferencijraju):

Totipotentne elije (oplodjena jajna elija)Pluripotentne

Multipotentne (HSCs, expresuju markere /proteine/ CD34 i Sca-1 – koriste se za identifikaciju stem elija iz suspenzije elija kosne srži, prilikomtransplantacije kosne srži).

Slika 2.16. Hematopoeza







33

2.2.2.2. Timus

Timus je mesto maturacije T limfocita. Sastoji se iz dva režnja, a svaki režanj je fibroznim septama

podeljen na vei broj lobulusa.

Svaki lobulus je podeljen na korteks (spolja; gusto

nastanjen T limfocitima - timociti) i medulu (unutra;

redje naseljenu T limfocitima). Rasute po timusu su i

nelimfoidne epitelijalne elije, makrofage i dendritske

elije. Neke od timusnih dendritskih elija ekspresuju

specifine markere, kao sto je CD8 koji je tipian za T

limfocite, pa se zovu limfoidne dendritske elije (za

razliku od mijeloidnih dendritskih elija opisanih ranije). Timus je dobro vaskularizovan i sadrži eferentni limfatini

sud koji se drenira u medijastinalni limfni vor. Nezreli T

limfociti dospevaju do korteksa krvotokom, i tu zapoinje

njihova maturacija. U toku maturacije timociti migriraju u

medulu, tako da medula sadrži uglavnom zrele T limfocite.

Zreli T limfociti napuštaju timus i krvotokom dospevaju do

perifernih limfatinih organa.

Slika 2.18. Morfologija timusa

2.2.2.3. Limfni vorovi i limfati ni sistem

Limfni vorovi su agregati elija bogatih limfocitima, smešteni duž limfnih sudova. Sastoje se od

korteksa i medule. Okruženi su fibroznom kapsu-lom, a brojni aferentni limfatini sudovi izlivajulimfu u subkapsularni (marginalni) sinus. Limfa napušta vor preko eferentnih limfatinih

sudova, koji izlaze kroz hilum. Ispod subkapsularnog sinusa korteks sadrži agregate elija tzv.

folikule. Neki folikuli sadrže centralne delove, zvane germinalni centri, koji se svetlo boje

klasinim histološkim bojama. Folikuli bez germinalnog centra su primarni folikuli, a oni sa

germinalnim centrima, sekundarni folikuli. Oko limfatinih i vaskularnih sudova se nalaze

prostori koji sadrže limfocite kao i dendritske elije i mononuklearne fagocite. Ispod korteksa,

nalazi se medulla koja je nastanjena makrofagama i plazma elijama. Krv dospeva u limfni vorarterijama (kroz hilus) koje se u korteksu granaju u kapilare, a napušta vor venskim sudom koji

izlazi kroz hilus.







34

Razliite klase limfocita su rasporedjene u razliitim regionima limfnog vora. Folikuli su B

elijske zone limfnog vora. Primarni folikuli sadrže

uglavnom zrele, naivne B limfocite. Germinalni centri

se razvijaju u zavisnosti od stimulacije antigenom. To

su mesta intenzivne proliferacije B limfocita, selekcije

elija koje produkuju specifina antitela, i mesta

nastajanja memorijskih elija. Nastavci FDCs formiraju

retikularnu mrežu u germinalnim centrima. T limfociti

nastanjuju korteks ispod i izmedju folikula. Oko 70% T

limfocita korteksa su CD4+ pomone T elije, izmedjunjih se nalaze CD8+ T limfociti. Dendritske elije,

takodje, nastanjuju T elijsku zonu limfnog vora.

Razliita anatomska distribucija odredjenih klasa

limfocita, u limfnom voru, je determinisana

citokinima. Naivni T i B limfociti ulaze u limfni vor

kroz arterije. Ove elije napuštaju cirkulaciju i ulaze ustromu korteksa limfnog vora kroz specijalizovane

sudove tzv. “high endothelial venules” (HEVs).

Slika 2.18. Morfologija limfnog vora

Naivni T limfociti ekspresuju receptore za hemokine

(citokine) tzv. CCR7. CCR7 prepoznaje hemokine koji

se produkuju samo u T zoni nodusa tj. hemokiniprivlae naivne T limfocite u T zonu nodusa.

Dendritske elije takodje ekspresuju CCR7 i migriraju

u oblast koju nastanjuju naivni T limfociti. Naivne B

elije, ekspresuju drugi hemokinski receptor, CXCR5, koji prepoznaje hemokine produkovane u

folikulima tj. u B elijskoj zoni limfnog vora. Ovakva anatomska organizacija limfnog vora

omoguava da je svaka populacija limfocita u bliskom kontaktu sa odgovarajucim APCs (npr.

naivni T limfociti sa dendritskim elijama a B elije sa FDCs).







35

Nakon stimulacije sa antigenima B i T elije gube receptore koji ih zadržavaju u odredjenim

regionima limfnog vora. Aktivirani T limfociti izlaze

izvora i ulaze u cirkulaciju, dok aktivirane B

elijemigriraju u germinalne centre ili u medulu odakle

sekretuju antitela.

Antigeni, uglavnom, do limfnih vorova

dospevaju kroz limfne sudove. Koža, epitel i

parenhimatini organi poseduju brojne limfne

kapilare koji absorbuju i dreniraju intersticijalnu

tecnost, limfu. Iz limfnih kapilara limfa se drenira u

vee limfne sudove, pa u još vee i vee a zatim u

ductus toracicus koji se uliva u vena cava superior.

Ovim putem se svakodnevno u krvotok vraa par

litara limfe. Antigeni (mikrobi) esto u telo prodiru

preko kože, gastrointestinalnog i respiratornog

trakta. Ova tkiva ispod epitela imaju dendritske

elije. Dendritske elije »hvataju« strane antigene,

migriraju u limfni sud i dospevaju do limfnih vorovakoji funkcionišu kao filteri pre ulivanja limfe u

krvotok. Kada limfa kroz aferentne limfne sudove

udje u limfni vor, ona se izliva u stromu limfnog

vora. Dendritske elije koje nose antigene migriraju

u T elijsku zonu (stromu) i tu se zadržavaju.

Solubilni antigeni bivaju fagocitrani od strane

dendritskihelija i makrofaga koje se nalaze u

stromi limfnih vorova rezultat je akumulacija i koncentracija antigena u limfnim vorovima i

njihova prezentacija u formi koja može biti prepoznata od strane specifinih T limfocita.

2.2.2.4. Slezina

Slezina je smeštena u gornjem levom kvadrantu trbušne duplje i izgradjena je od crvene i bele

pulpe. Bela pulpa se sastoji od limfnog tkiva organizovanog u podru ja koja sadrže odvojeno T i B

limfocite. T limfociti su smešteni oko arteriola, tako da formiraju T elijsku zonu tzv.

periarterijalna limfoidna zona. B limfociti su organizovani, slino limfnim vorovima u limfoidne

folikule koji grade B elijsku zonu. B limfociti su organizovani vorovima u limfoidne folikule.

Slika 2.18. Raspored T i B limfocita u limfnom voru







36

Limfoidni folikuli gra-

de B elijsku zonu.

Arteriole se završavaju

u vaskularnim sinusi-

ma, oko kojih su rasu-

ti eritrociti, makrofage,

dendritske elije, nešto

limfocita i plazma

elija. Ovakva morfolo-

ška organizacija ini

crvenu pulpu slezine.

Mehanizam raspodele

razliitih klasa limfoci-

ta je slian onom u li-

mfnim vorovima, i za-

visi od prisustva he-

mokina. Antigeni i

limfociti ulaze u slezi-nu kroz vaskularne si-

nuse. U zavisnosti od

hemokina T limfociti

bivaju privueni u T elijske zone a B limfociti ulaze u folikule. Splenina vena nosi krv iz slezine

u portalni krvotok. Slezina je mesto gde se odvija filtracija krvi, a crvena pulpa slezine je glavno

mesto fagocitoze opsonizovanih mikroba (okruženih antitelima). Osobe bez slezine su izuzetno

podložne bakterijskim infekcijama izazvnim meningokokama i pneumokokama zato što se ovebakterije eliminišu opsonizacijom i fagocitozom.

2.2.2.5. Kožni imuni sistem

Koža sadrži specijalizovan imuni sistem koji se sastoji od limfocita i APCs. Koža je najvei organ u

telu i znaajna fizika barijera izmedju organizma i spoljašnje sredine. Koža je aktivni uesnik u

odbrani organizma od stranih patogena i ima sposobnost da generiše i podrži lokalnu imunu i

inflamatornu reakciju. Epidermis kože sadrži vei broj elijskih populacija: keratinociti,

melanociti, epidermalne Langerhansove elije i intraepitelijalne T elije. Melanociti i keratinociti

nemaju naroitog znaaja u adaptivnom imunom odgovoru, iako keratinociti produkuju nekoliko

Slika 2.20. Limfni sistem







37

citokina i tako doprinose nespecificnim imunim i inflamatornim reakcijama. Langerhansove elije

su nezrele dendritske elije, koje svojim nastavcima formiraju gotovo kontinu-alnu mrežu za

hvatanje antigena u suprabazalnom epidermisu. Nakon sti-mulacije citokinima, Langerhansove

elije retrahuju svoje nastavke, gube

adhezivne karakteristike koje ih vezuju za

epide-rmalne elije i migriraju u dermis.

Putem limfe dospevaju do limfnih

vorova. Ovaj proces je sitimulisan

hemokinima koji deluju specifino na

Langerhansove elije. Intraepitelijalni

limfociti ine oko 2% od ukupnog broja

limfocita u koži (ostali se nalaze u

dermisu), veina od njih su CD8+ T

limfociti. Intraepidermalni T limfociti

ekspresuju ogranien set receptora za

antigene. Kod miševa (i još nekih vrsta)

mnogi intraepidermalni T limfociti

ekspresuju receptor koji nije tipian za T limfocite i sastoji se iz i lanaca (za razliku od tipinogreceptora za antigene na CD4+ i CD8+ elijama, koji je izgradjen od i lanca). receptor za

antigene je takodje karakteristian i za intraepitelijalne T limfocite intestinuma, što je verovatno

povezano sa prepoznavanjem mikroba koji obino prodiru kroz epitel. Dermis, kao i druga vezivna

tkiva, sadrži rasute makrofage i T limfocite (CD4+ i CD8+) uglavnom oko krvnih sudova. Nije jasno,

da li su ove elije stalno nastanjene u dermisu ili su se tu zatekle u recirkulaciji (u tranzitu)

izmedju krvi i limfe.

2.2.2.6. Mukozni imuni sistem

Mukozna površina gastrointestinalnog i respiratornog trakta je nastanjena limfocitima i APCs koji

iniciraju IO na progutane i inhalirane antigene. Kao i koža, epitel mukoze je mesto mogueg

prodora stranih antigena, i predstavlja barijeru izmedju spoljašnje i unutrašnje sredine

organizma. U mukozi gastrointestinalnog trakta, limfociti su u veem broju nadjeni u 3 regiona: u

epitelijalnom sloju, rasuti po lamini proprii i u anatomski uoblienim tvorevinama u lamini proprii

tankog creva u tzv. Pajerovim ploama. elije na svakoj od ovih lokacija imaju karakteristine

fenotipske i funkcionalne karakteristike. Veina intraepitelijalnih limfocita su T elije. Kod ljudi,

Slika 2.21. Kožni imuni







38

to su uglavnom CD8+, od kojih 10% ima receptor za antigene na T celijama (TCR) u formi

lanaca. Lamina pro-

pria sadrži mešanu

populaciju elija koja

ukljuuje T limfocite,

uglavnom CD4+, koji

imaju fenotip aktivi-

ranih elija. Verova-

tno, T limfociti prepo-

znaju i odgovaraju na

antigene, u mezente-

rinom limfnom vo-

ru, a zatim migriraju

nazad u intestinum

gde naseljavaju lami-

nu propriu. Lamina

propria, takodje, sa-

drži i veliki broj akti-viranih B limfocita,

plazma elija, kao i

makrofage, dendri-

tske elije, eozinofile i

mastocite. Pored ra-

sutih limfocita, mu-

kozni imuni sistem,sadrzi organizovana limfna tkiva tzv. Pajerove ploe. Kao limfoidni folikuli slezine i limfnih vo-

rova centralni delovi folikula su B elijske zone koje esto sadrže i germinalne centre. U

interfolikularnim regionima Pajerovih ploa se nalaze malobrojni CD4+ limfociti. Neke od

epitelijalnih elija koje prekrivaju Pajerove ploe su specijalizovane M (membranske) elije. Ove

elije su izgubile mikrovile, i zadobile funkciju aktivne pinocitoze tj. transportuju makromolekule

iz crevnog lumena u subepitelijalno tkivo. Smatra se da M elije imaju važnu ulogu u transportu

antigena do Pajerovih ploa. Folikuli slini Pajerovim ploama su zastupljeni u apendiksu i u

manjem broju u ostalim regionima gastrointestinalnog i respiratornog trakta.

Slika 2.22. Mukozni imuni sistem







39

2.2.2.7. Putevi i mehanizmi recirkulacije limfocita

Limfociti se stalno kreu kroz krvotok i limfni sistem, krei se od jednog do drugog perifernog

limfatinog tkiva, kao i ka mestima prodora antigena tj. ka mestima inflamacije.

Ovo stalno kretanje limfocita izmedju razliitih lokacija naziva se recirkulacija limfocita, a

mehanizmi koji regulišu koji limfociti e nastaniti koja tkiva = ‘homing” limfocita (npr. odredjene

populacije limfocita ulaze u jedna tkiva a ne u druga). Putevi recirkulacije naivnih limfocita se

razlikuju od puteva efektornih i memorijskih elija. Tako naivni limfociti recirkulišu kroz periferne

limfoidne organe, dok efektorni limfociti migriraju u periferna tkiva ka mestima infekcije i

inflamacije.

Slika 2.23. Putevi recirkulacije T limfocita







40

Recirkulacija limfocita i njihova migracija u odredjeno tkivo je omoguena:

adhezionim molekulima na limfocitima, endotelijalnim elijama i u ekstracelularnom

matriksu;

hemokinima koji se produkuju u endotelu i u drugim tkivima.

Adhezija limfocita za endotelne elije koje oblažu postkapilarne venule, determiniše koja tkiva e

biti nastanjena limfocitima.

Adhezija limfocita za komponente ekstracelularnog matriksa u tkivu i njihovo odvajanje od

matriksa, odredjuje koliko dugo e limfociti biti zadržani u odredjenom ekstravaskularnom

prostoru, pre nego što limfom i limfotokom budu ponovo vraeni u krvotok.

Adhezione molekule koje se ekspresuju na limfocitima se nazivaju “homing” receptori a ligandi

koji se ekspresuju na vaskularno-endotelnim elijama su adresini.

“Homing” receptori na limfocitima su molekule koje pripadaju familijama:

selektina

integrina i

Ig superfamiliji.

Naravno, ovi receptori su razliiti od receptora za antigen, a model recirkulacije limfocita je

nezavisan od antigena.

Recirkulacija naivnih T limfocita kroz limfoidne organeNaivni T limfociti uglavnom nastanjuju i recirkulišu kroz periferne limfatine organe, gde

prepoznaju i odgovaraju na strane antigene. Kao što je poznato, antigeni su koncentrisani u

limfnim vorovima i slezini, gde su iskazani na membranama dendritskih elija, a kretanje

naivnih limfocita kroz limfne vorove i slezininu poveava verovatnou susreta sa tim antigenima

(a samim tim i iniciranje adaptivnog imunog odgovora)2. Naivni limfociti koji udju u limfni vor,

napuštaju cirkulaciju kroz modifikovane postkapilarne venule tzv. “high endotelial venules”

(HEVs), i migriraju u stromu limfnogvora. HEVs su prisutne i u mukoznim limfoidnim organimakao što su Pajerove ploe u crevu. Migracija naivnih limfocita iz cirkulacije u stromu limfnog vora

ukljuuje seriju interakcija, izmedju limfocita i endotelnih elija HEVa. Naivni limfociti na svojoj

membrani ekspresuju homing recepror, L-selektin (CD62L, pripada familiji selektina), a HEVs

ekspresuju adresin (peripheral node addressin, PNAd) koji je ligand za L-selektin. Vezivanje L-

selektina za ligand je interakcija niskog afiniteta, tako da strujanje krvi kroz venulu kida tu vezu,

nakon ega se veza ponovo uspostavlja ali na drugom mestu. Drugim reima, T limfociti ostaju

vezani za HEV samo nekoliko sekundi, zatim se odvajaju i vežu ponovo na drugom mestu. Ovo

izgleda kao valjanje limfocita po površini endotela. U limfnom voru se produkuju hemokini, koji

2Neto protok limfocita kroz limfne ovorove je vrlo visok ~25 x 109 elija prodje kroz limfni vor u toku jednog dana







41

se takodje iskazuju na površini endotelnih elija, tako da limfociti koji se valjaju po površni

endotela reaguju i sa hemokinima. Ovo poveava silu vezivanja limfocita za endotel i oni mogu da

se provuku izmedju endotelnih elija u stromu limfnog vora. U stromi limfociti migriraju prema

gradijentu hemokina koji ih privlae. T elije, koje ekspresuju CCR7, migriraju u zonu koja

produkuje hemokine koji e se vezati za ove receptore (T elijsku zonu), a B elije, koje ekspresuju

CXCR5, migriraju u limfoidne folikule pod uticajem hemokina koji se vezuju za CXCR5. Naivni T

limfociti koji ulaze u limfni vor mogu biti aktivirani antigenom. Nekoliko sati posle prodora

antigena, protok krvi kroz limfni vor može biti povean i do 20 puta. Ovo poveava broj naivnih

limfocita koji dospevaju

na mesto koncentracije

antigena. Naivne T elije

koje ulaze u limfni vor

“skeniraju” dendritske

elije na prisustvo

antigena i ako prepo-

znaju antigen, one se

aktiviraju, umnožavaju

(klonalna ekspanzija) idiferenciraju na efekto-

rne i memorijske T

elije. T elije koje se ne

susretnu sa antigenom,

izlaze iz limfnog vora

kroz eferentne limfatine

sudove, vraaju se u ci-rkulaciju, a potom na-

stanjuju drugi limfni

vor. Malo se zna o ho-

mingu limfocita u slezini

-nema morfoloski difere-

nciranih HEVs-a.

Slika 2.24. Migracija naivnih iefektornih T limfocita







42

Migracija efektornih i memorijskih T limfocita na mesto inflamacije

Efektorne i memorijske elije koje napuštaju limfne vorove odlaze u periferno tkivo, na mesto

infekcije gde su neophodne za eliminaciju mikroba u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora.

Diferencijacija naivnih u efektorne elije je praena i promenama ekspresije nekoliko adhezionih

molekula. Ekspresija L-selektina opada, a nivo E- i P-selektina i CD44 raste. Diferencirane

efektorne elije, takodje, gube ekspresiju CCR7 receptora za hemokine. Kao rezultat gubitka

receptora, efektorne elije ne ostaju u limfnom voru, ve eferentnim limfatikim sudovima ulaze

u cirkulaciju. Kao rezultat nespecifi-nog odgovora, na mestu infekcije, se produkuju citokini.

Neki deluju na endotel i stimulišu ekspresiju liganda za integrine, kao i E- i P-selektine. Integrini

T elija se vežu za svoje ligande na endotelnim elijama i migriraju iz krvnog suda u podru je

infekcije. Integrini i CD44 se takodje vezuju za proteine ekstracelularnog matriksa što zadržava

efektorne T elije u podru ju infekcije.

Memorijske elije poseduju heterogen model ekspresije adhezionih molekula, i u zavisnosti od njih

migriraju i zadržavaju se u odredjenim limfoidnim tkivima.

Recirkulacija B limfocita

Migracija B limfocita u razliita tkiva je slina migraciji T limfocita, i regulisana je istimmolekularnim mehanizmima.

Naivne B elije migriraju u folikule limfnih vorova, (L-selektin CXCR5 receptor za hemokine na

membrani naivnih B limfocita). Nakon aktivacije B elije gube ekspresiju CXCR5, napuštaju

folikul i ulaze u T zonu limfoidnog organa. Aktivirane B elije ekspresuju integrine, koje koriste da

migriraju u periferna tkiva. Neke plazma elije koje produkuju antitela, migriraju u kosnu srž.

Mehanizam ove migracije nije poznat. Ostale elije koje produkuju antitela ostaju u limfoidnim

organima, a antitela ulaze u cirkulaciju i putem krvi dospevaju do antigena.







43

PREPOZNAVANJE ANTIGENA 03Adaptivni imuni odgovor zapoinje specifinim prepoznavanjem antigena od strane limfocita. Uovom delu e biti opisana molekularna i elijska osnova prepoznavanja antigena, kao i

specifinosti T i B limfocita vezane za prepoznavanje antigena.

Osnovni nosioci funkcije prepoznavanja antigena u adaptivnom IO su 3 klase molekula:

antitela

molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (major histocompatibility complex; MHC)

receptor za antigen na T limfocitima (T cell antigen receptor; TCR).

Medju njima, antitela su najbolje prouena, imaju najširi dijapazon vezivanja razliitih antigenih

struktura, imaju veliku sposobnost razlikovanja razliitih antigena, i imaju najvei afinitet za

antigene.

3.1. KARAKTERISTIKE ANTIGENA

Antigen je bilo koja supstanca koja može specifino da se veže za antitelo ili TCR. Antitela mogu

da prepoznaju razliite biološke molekule, ukljuujui, jednostavne intermedijarne metabolite,

šeere, lipide, hormone, kao i makromolekule kao što su kompleksi karbohidrata, fosfolipida,

nukleinskih kiselina i proteina. Medjutim, samo su makromolekule sposobne da stimulišu B

limfocite i iniciraju humoralni imuni odgovor. Molekuli koji su sposobni da iniciraju imuni

odgovor se nazivaju imunogeni. Mali molekuli, mogu da se vežu za antitela ali nisu sposobni da

iniciraju imuni odgovor (nisu imunogenini). U praksi, ovakve molekule (hapteni) se vezuju zamakromolekule pre imunizacije. Kompleks hapten-nosa može da funkcioniše kao imunogen.

Molekuli su obino mnogo vei nego deo preko koga se vežu za antitelo/receptor.







44

Antitelo se vezuje za odredjen mali deo molekule antigena koji se zove antigena determinanta ili

epitop. Antigene determinante mogu biti formirane kovalentnom strukturom ili kao u sluaju

proteina i nukleinskih kiselina, nekovalentnim organizovanjem molekule u prostoru. Ukoliko

epitope formira nekoliko susednih ostataka aminokiselina tj. determinisane su linearnom

sekvencom zovu se linearne determinante. Ako ih ine ostaci aminokiselina koji nisu u linearnoj

sekvenci nego predstavljaju ostatke aminokiselina u 3D prostoru onda su to konformacione

determinante. Antitela koja prepoznaju konformacione determinante obino prepoznaju nativne

proteine dok antitela koja prepoznaju linearne determinante obino prepoznaju denaturisane

proteine.

Makromolekule obino sadrže multiple determinante. Neke od njih se ponavljaju a za svaku može

da se veže antitelo/receptor. Prisustvo multiplih identinih determinanti se oznaava kao

multivalentnost ili polivalentnost antigena. Mnogi globularni proteini ne sadrže multiple

identine epitope i nisu polivalentni ukoliko nisu u agregatima. Polisaharidi i nukleinske kiseline,

obino imaju identine epitope koji se ponavljaju, koji su obino odvojeni nekim drugim epitopom

(polivalnentni su). Površina elija, ukljuujui i mikrobe, obino sadrži polivalentne regione

proteinskih i ugljenohidratnih antigenih determinanti.

Determinante koje prepoznaju B elije:

linearne sekvence determinanti (primarna sekvenca rezidua) ili konformacione determinante (sekundarna, tercijarna, kvaternarne);

male, obino 4-8 rezidua (AK ili šeera)

Determinante koje prepoznaju T elije:

primarna sekvenca rezidua (ne prepoznaju polisaharide ili nukleinske kiseline; proteini su

T-zavisni Ag, šeeri T-nezavisni Ag).

Ag je proteolitiki degradiran u male peptide. T-elije ne prepoznaju slobodan peptid nego

kompleks peptid + MHC; Ag determinante - obino 8-15 AK.







45

3.2. ANTITELA

Antitela su glikoproteini, koji specifino vežu antigene u fazi prepoznavanja, i u efektornoj fazi

humoralnog imunog odgovora.

Razlikuju se dve forme antitela, a to su:

membranska forma, antitelo je vezano za membranu B limfocita i funkcioniše kao receptor

za antigene na B elijama (BCR), i

sekretovana forma, antitelo se sintetiše u antigen-stimulisanim B elijama i egzocitozom

izbacuje u krv ili telesne tenosti.

Interakcija antigena sa BCR inicira odgovor B elija i time zapoinje faza prepoznavanja

humoralnog imuniteta. U efektornoj fazi humoralnog imunog odgovora, sekretovana antitela vežu

antigene i aktiviraju nekoliko efektornih mehanizama koji ih eliminišu.

Sekretovana antitela su prisutna u krvi, mukoznim sekretima i intersticijalnom fluidu gde

neutrališu i eliminišu mikrobe i toksine tj. funkcionišu kao efektorne molekule humoralnog

imuniteta. Sekretovana antitela i BCR prepoznaju antigene svojim varijabilnim domenima, dok

konstantni regioni sekretovanih antitela imaju sposobnost da vežu druge molekule (npr. receptore

na fagocitima, mastocitima, elijama prirodnim ubicama ili proteine komplementa) u smislu

eliminacije štetnog antigena. Može se rei da antitela imaju dve funkcije u humoralnomimunitetu: BCR prepoznaje antigene i inicira humoralni imuni odgovor, dok sekretovana antitela

eliminišu antigene u efektornoj fazi imunog odgovora.

3.2.1. Molekularna struktura antitela

Zbog razliite rastvorljivosti, serumski glikoproteini se mogu razdvojiti na albumine i globuline izkojih se dalje zahvaljujui razliitoj elektroforetskoj pokretljivosti mogu izdvojiti razliite frakcije.

Veina antitela je izolovana iz tree grupe migrirajuih globulina tzv. gama globulina ili

imunoglobulina (Ig). Svi molekuli antitela imaju zajednike osnovne strukturne karakteristike ali

ispoljavaju i znaajnu raznolikost u regionima koji vežu antigene.

Molekul antitela je izgradjen od dva identina teška lanca (H) i dva identina laka lanca (L) koja

grade varjabilni region i jedan ili više konstantnih regiona. etiri lanca su povezana tako da

formiraju molekul koji ima oblik slova Y. Disulfidnim vezama su medjusobno povezana dva teška

lanca, kao i laki za teške lance. Teški i laki lanci su izgradjeni iz serije ponavljanih homologih







46

jedinica koji imaju globularnu konformaciju – Ig domen. Teški i laki lanci su izgradjeni od amino-

terminalnog varijabilnog regiona (V) koji je odgovoran za prepoznavanje antigena i karboksi-

terminalnog konstantnog kraja (C). U teškom lancu V region je izgradjen od jednog Ig-domena, a

C region se sastoji od 3-4 Ig-domena. Svaki laki lanac se sastoji od jednog V i jednog C regiona.

Varijabilni regioni sadrže razliite sekvence aminokiselinskih ostataka, koje su specifine za

antitela produkovana u B limfocitima odredjenog klona i razlikuju se od antitela drugih klonova B

limfocita. Deo antitela koji sadrži ceo laki lanac (VL i CL ) povezan sa VH i prvim CH regionom teskog

lanca je deo antitela zadužen za prepoznavanje antigena tzv. Fab (engl . fragment antigen binding).

V region teškog lanca (VH) i V

region lakog lanca (VL ) formiraju

antigen vezujue mesto. Zbogtoga što je svaki molekul antitela

izgradjen iz dva teška i dva laka

lanca, svako antitelo sadrži dva

mesta za koja se vezuje antigen

tj. dvovalentno je. C regioni ne

doprinose prepoznavanju

antigena. C regioni teških lanacaformiraju tzv Fc region (engl .

fragment crystalline) koji

interaguju sa efektornim

molekulama i elijama imunog

sistema, i tako su odgovorni za

veinu bioloških funkcija

antitela. Karboksi-terminalni

kraj teškog lanca je povezan sa

membranom B limfocita, tako da

formira antitela vezana za

membranu tj. BCR.

Postoje dve klase ili dva izotipa

lakih lanaca i laki lanci koji

se razlikuju po sastavu karboksi

terminalnog konstantnog (C) regiona. Molekul antitela ima ili dva laka lanca ili dva laka lanca.

Za sada nije poznata funkcionalna razlika izmedju antitela koja sadrže lance i lake lance.

Slika 3.1. Molekularna struktura antitela.







47

Postoji 5 tipova teških lanaca koji se razlikuju u C regionu (, , , , ). U zavisnosti od teškog

lanca koji sadrže, antitela se mogu klasifikovati u 5 klasa (izotipova): IgM, IgD, IgG, IgE, i IgA.

Fizike i biološke karakteristike ovih klasa kao i njihove efektorne funkcije sumirane su u tabeli

3.1.

Tabela 3.1. Osnovne karakteristike pojedinih klasa antitela

Klasaantitela

Izoforme H lanac Koncentracija userumu (mg/mL)

Poluživot userumu (dani)

Forma u kojoj se sekretuje Funkcija

IgA IgA1, 2 (1 ili 2) 3.5 6 Monomer, dimer, trimer Mukozni imunitet, neonatalnipasivni imunitet

IgD - u tragu 3 - Receptor za antigene na naivnim Blimfocitima

IgE - 0.05 2 monomer Aktivacija mastocitaIgG IgG1-4 (1.2.3,4) 13.5 23 monomer Opsonizacija, aktivacija

komplementa, citotoksinostzavisna od antitela, neonatalnaimunost, inhibicijaB limfocitapovratnom spregom

IgM - µ 1.5 5 pentamer Receptor za antigene na Belijama, aktivacija komplementa

B limfociti, pripadnici istog klona mogu da se razlikuju po tome što u toku imunog odgovora mogu

da produkuju antitela razliite strukture. B

elije inicijalno produkuju samo Ig koji su povezani sa

elijskom membranom tj. BCR. Ovi receptori na naivnim B limfocitima, su u stvari molekuli IgM i

IgD vezani za membranu elija. Nakon stimulacije naivnih B limfocita sa antigenima i T elijama

pomonicama, antigen-specifini klon proliferiše i diferencira se u plazma elije koje sekretuju

antitela. Drugim reima, promene na karboksi-terminalnom kraju antitela vodi ka produkciji

antitela koja se sekretuju ali imaju istu specifinost za odredjeni antigen. Neke plazma elije

poreklom od iste naivne B elije sekretuju IgM a druge IgD antitela. Ova mogunost sinteze

antitela razliite klase tj razliitog izotipa teškog lanca Ig nosi naziv «haevy chain class (isotype)

switching». Iako tokom humoralnog imunog odgovora, može doi do zamene C regiona teškog

lanca antitela, svaki klon B limfocita zadržava svoju specifinost, zato što se V region ne menja.

Drugim reima razliiti izotipovi antitela su nosioci razliitih efektornih funkcija. Pri tom svi

izotipovi imaju istu antigensku specifinost. Zašto je to potrebno? Sinteza Ig razliitih klasa

omoguava humoralnom imunom odgovoru da se adaptira na karakteristike konkretnog antigena

tj. pronalaženja optimalnog naina za eliminaciju antigena. Mnogi od molekula koji posreduju u

prepoznavanju adheziji i vezivanju u kimenjakom imunom sistemu imaju delimino istu

sekvencu AK i tercijarnu strukturu – koja je identifikovana u Ig teškog i lakog lanca = Igsuperfamilija







48

Slika 3.2. Forme teškog lanca imunoglobulina (membranskih i sekretovanih). Membranska forma teškog lanca sadrži transmembranskiregion izgradjen od hidrofobnih ostataka aminokiselina i citoplazmatini region koji se razlikuje kod razliitih izotipova. Citoplazmatini region

membranske forme teškog lanca sadrži 3 rezidue, dok 3 sadrži 28 ostataka aminokiselina. C- termilani region teških lanaca sekretovanih

imunoglobulina se takodje razlikuje: lanac ima rep (21 ostatak) koji je ukljuen u formiranje pentamera, dok 3 ima kratak rep (samo 3aminokiseline).







49

Slika 3.3. Super familija imunoglobulina

3.2.2. Sinteza i ekspresija Ig

molekula

Teški i laki lanci Ig, kao i veina

proteina u eliji se sintetiše na

granuliranom endoplazmatskom

retikulumu. Odgovarajua prosto-

rna organizacija teškog lanca Ig i

njihovo povezivanje sa lakimlancima je regulisano proteinima

endoplazmatskog retikuluma tzv.

aperonima (engl. chaperones). Ovi

proteini (ukljuujui i klaneksin i

BiP (binding protein)) se vežu za

novosintetisani polipeptid Ig, i time

ga obeležavaju za degradaciju

ukoliko od njega ne nastane

molekul Ig. U endoplazmatskom

retikulumu se teški i laki lanci

kovalentno vezuju (preko disulfidne

veze i N- glikozilacije). Nakon

spajanja, molekuli Ig se odvajaju od

aperona i dospevaju u cisterne

Goldži kompleksa gde se pakuju u

vezikule (modifikacija karbohidra-

ta), transportuju do plazma

membrane i egzocitozom sekretuju

iz elije. Biosinteza proteina koji su

vezani za Ig lance je koordinisana

sa sintezom Ig. Na primer, IgA i IgM

se sekretuju kao multimeri koji su povezani sa J lancem. U elijama koje produkuju takvaantitela, transkripcija gena teškog i lakog lanca Ig je koordinisana sa transkripcijom gena i

biosintezom za J lanac. Maturacija B elija (od progenitorne elije kosne srži) je praena







50

promenama u ekspresiji Ig gena i produkcijom razliitih formi Ig molekula. Pre-B elija (najranija

forma koja produkuje polipeptide Ig) sintetiše menbransku formu teškog lanca. Za

novosintetisane polipeptide se veže aperon, što ograniava njegovo kretanje iz elije, tako da ovi

polipeptidi ostaju u citoplazmi pre-B elija i degradiraju se intracelularno. Mala koliina lanaca

se ekspresuje na površini limfocita i zajedno sa proteinima koji se nazivaju »surogati lakog lanca«

formira pre-B elijski receptor. Nezreli i zreli B limfociti produkuju ili lake lance koji se vežu za

lanace i formiraju molekule IgM. Ovakvo povezivanje spreava degradaciju teškog lanca i

dozvoljava IgM da se ekspresuje na elijskoj membrani. Zreli B limfociti ekspresuju membranske

forme IgM i IgD ( i teški lanci povezani sa ili lakim lancima). Ovi membranski Ig receptori

funkcionišu kao receptori za antigen i iniciraju proces aktivacije B elija. BCR je nekovalentno

povezan sa dva druga membranska proteina Ig i Ig koja funkcionišu u prenosu signala. Kadaantigen aktivira zrelu B eliju, zapoinje njena diferencijacija u eliju koja sekretuje antitela

(plazma elija). Ovaj proces je praen promenama u modelu produkcije Ig. Jedna od ovih promena

je konverzija membra-nskih Ig u Ig koji se sekretuju iz elije. Druga promena je ekspresija

razliitih izotipova

teškog lanca tj. »havy

chain isotype

switching«.

Slika 3.4. Ekspresija imuno-globulina tokom maturacije Blimfocita

3.2.3. Karakterisike antitela vezane za prepoznavanje antigena

Antitela specifino prepoznaju razliite antigene i vezuju se za njih sa razliitim afinitetom. V

region antitela je odgovoran za sve karakteristike vezane za prepoznavanje antigena.

Specifinost antitela su vrlo specifina za antigen, prepoznaju i vrlo male razlike u hemijskoj

strukturi3. Ipak, nekad antitela proizvedena za jedan antigen mogu da reaguju i sa drugim,

strukturno slinim antigenom »cross-reaction«.

3Smatra se da individue produkuju ogroman broj strukturno razliitih antitela, verovatno oko 109, a pri tome svako antitelo ima razliitu specifinost.







51

Diverzitet (raznolikost) postojanje velikog broja antitela koja reaguju sa razliitim antigenima.

Ukupna kolekcija antitela razliite

specifinosti repertoar antitela.

Afinitet suma privlanih i odbojnih

sila izmedju jedne Ag determinante i

jednog veznog mesta na Ab4.

Aviditet je mera ukupne jaine

vezivanja antigena sa mnogim

antigenim determinantama i multi-valentnim antitelom. Aviditet zavisi od

valentnosti antigena i od valentnosti

antitela (on je više nego suma

individualnih afiniteta).

Slika 3.5. Valentnost i aviditet interakcije

antitelo-antigen

3.2.4. Antigen-antitelo interakcija

Reakcija izmedju antigena i antitela je reverzibilna reakcija, koja se ostvaruje nekovalentnim

vezama npr. vodonikovim vezama, elektrostatikim vezama, Van der Waals-ovim silama i

hidrofobnim vezama.

Ag + Ab AgAb

4 Antitela produkovana tokom primarnog imunog odgovora na jedan proteinski antigen obino imaju Kd izmedju 10-7 – 10-9 M, dok u sekundarnom imunom odgovoru

afinitet raste, Kd je 10-11 M ili više.







52

3.2.5. Karakteristike antitela vezane za efektorne funkcije

Mnoge od efektornih funkcija imunoglobulina su posredovane Fc regionom molekula, tako

da antitela koja se razlikuju u Fc regionu, ispoljavaju razliite funkcije.

Antitela mogu ispoljiti efektorne funkcije samo ako su vezana sa antigenom (slobodni Ig ne

ispoljavaju efektorne funkcije).

Promene u izotipovima antitela tokom humoralnog imunog odgovora utiu na to kako i gde

e se ispoljiti efektorne funkcije antitela.

C region teškog lanca, takodje determiniše i tkivnu distribuciju antitela.

Iako se antitela produkuju u limfnim vorovima, ona se sekretuju i putem krvi, te dospevaju do

mesta infekcije gde ispoljavaju razliite efektorne funkcije. Efektorne reakcije humoralnog imunogodgovora prikazane su u tabeli 3.2.

Tabela 3.2. Efektorne reakcije humoralnog imunog odgovora

Funkcija antitela Objašnjenje

Neutralizacija Neutrališu infektivnost mikroba/patogenost toksina vezujui se za njih te smanjuju sposobnost mikroba da se vežu za eliju dmaina

Opsonizacija Opsonini stimulišu fagocitozu tako što se Fc regioni antitela vezuju za Fc receptore na fagocitima. Vezivanje Fc regiona za Fc

receptor stimuliše baktericidnu funkciju fagocita

Aktivacija komplementa Aktivacija komplementa je objašnjena ranije. Aktivacija komplementa vodi ka formiranju citolitikog kompleksa membrane. Razliitiprodukti aktivacije komplementa promovišu fagocitozu, izazivaju lizu elija i stimulišu inflamaciju.

Mukozni imunitet IgA se produkuje u lamini proprii mukoznih organa i aktivno transportuje kroz epitel (vezivanjem za Fc receptor) u lumen, gde blokirasposobnost mikroba da prodru u epitel

Neonatalni imunitet Novorodjene je zaštieno IgG majke koja prolaze kroz placentu (fetus) ili je zaštieno antitelima iz majinog mleka, tako što se IgGtransportuje kroz epitel creva (neonatalni Fc receptor).







53

3.3. MOLEKULE GLAVNOG HISTOKOMPATIBILNOG KOMPLEKSA (MHC)

Osnovne funkcije T limfocita su odbrana protiv intracelularnih mikroba i aktivacija drugih elija

kao što su makrofage i B limfociti. Receptori za antigene na T limfocitima (TCR, engl . T cell

receptor), mogu da prepoznaju samo proteinske antigene koji su iskazani na površini drugih

elija, tako da je za ispoljavanje njihove funkcije nužno da reaguju sa drugim elijama npr. sa

inficiranim elijama domaina, antigen-prezentujuim elijama, makrofagama i B limfocitima.

Specijalizovani proteini, koji imaju ulogu u

iskazivanju antigena T limfocitima, su produkti

gena glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC,

engl . major histocompatibility complex). TCRprepoznaje strukturu antigeninog peptida kao i

odredjene ostatke MHC molekula, na površini

antigen-prezentujuih ili drugih elija domaina.

Slika 3.6. TCR prepoznaje MHC+antigenini peptid

Produkati MHC gena su podeljeni u dve grupe u zavisnosti od tipa proteinskog antigena koje

iskazuju: klasa I MHC i klasa II MHC molekula. Klasa I uestvuje u iskazivanju citosolnih

(intracelularnih) antigena za koje svojim receptorima mogu da se vežu CD8+ citolitini T limfociti.

Klasa II je ukljuena u ekspresiju ekstracelularnih antigena koji su prvo fagocitirani i iskazani

CD4+ T elijama pomonicama. Poznavanje strukture i biosinteze MHC molekula i njihovog

povezivanja sa peptidima antigena je osnova za razumevanje kako T elije prepoznaju strane

antigene.

3.3.1. Osobine MHC gena

Dva tipa polimorfnih MHC gena (geni MHC klase I i geni MHC klase II), kodiraju dve grupe

strukturno razliitih ali homologih proteina. Klasa I MHC molekula prezentuje peptide da

bi bili prepoznati od CD8+ T limfocita a klasa II MHC molekula prezentuje peptide CD4+ T

elijama.

MHC geni su najpolimorfniji geni prisutni u genomu. Serološkim analizama je za neke HLA

lokuse identifikovano vise od 250 alela. Molekularnim sekvenciranjem je pokazano da







54

svaki serološki definisan HLA alel ima multiple varijante koje se medjusobno razlikuju.

Drugim reima, polimorfizam je mnogo vei od onog pokazanog serološkim studijama.

MHC geni se kodominantno ekspresuju u svakoj individui.

Set MHC alela prisutnih na svakom hromozomu se zove MHC halotip.

3.3.2. Osobine MHC molekula

Svi MHC molekuli imaju iste osnovne strukturne karakteristike koje su od suštinskog zna aja zanjihovu funkciju tj. za iskazivanje peptida antigena i njegovog prepoznavanja od T limfocita.

Svaki MHC molekul se sastoji od ekstracelularne peptid-vezujue pukotine, 2

imunoglobulinu (Ig)-slina domena, transmembranskog domena preko kog je privršen za

elijsku membranu, i citoplazmatinog domena.

Polimorfne aminokiselinske rezidue MHC molekula se nalaze pored vezujue pukotine.

Zbog varijabilnosti u aminokiselinskom sastavu, u ovom regionu, razliite MHC molekule

vezuju i iskazuju razliite peptide koji bivaju specifino prepoznati od Ag-receptora na T elijama.

Ne polimorfan Ig-slian domen MHC molekule sadrži vezno mesto za CD4 i CD8 molekule

T limfocita.

Tabela 3.3. Karakteristike molekula MHC klase I i II

OSOBINA MHC KLASE I MHC KLASE II

Polipeptidni lanac (44-47 kD)2-mikroglobulin (12 kD)

(32-34 kD) (29-32 kD)

Lokacija polimorfne rezidue 1 i 2 domeni 1 i 2 domeni

Vezno mesto za T celijski koreceptor 3 region veze CD8 2 region veze CD4

Velicina pukotine koja vezuje peptid Peptide od 8-11 rezidua Peptide od 10-30 rezidua ili vise

Nomenklatura covek mis

HLA-A, HLA-B, HLA-CH-2K, H-2D, H-2L

HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DPI-A, I-E







55

3.3.3. MHC molekuli klase I

Klasa I MHC molekula se sastoji od dva nekovalentno povezana polipeptidna lanca: MHC-kodiran

lanac (teški lanac; od 44-47 kD), i MHC-nekodiran lanac 2-mikroglobulin (12 kD). lanci su orjentisani tako da se oko 3/4

polipeptida nalazi ekstracelularno. Imaju

kratak hidrofoban transmembranski

segment, i karboksi terminalni kraj koji se

nalazi u citoplazmi. Amino terminalni region

sadrzi 1 i 2 domene (svaki sadrži oko 90

aminokiselinskih rezidua) koji formirajuveznu pukotinu. Veliina pukotine je dovoljno

velika da može da veže peptide koji sadrže

oko 8-11 aminokiselinskih ostataka. Dakle,

nativni globularni proteini treba da budu

procesovani i da se fragmenti koji su dovoljno

mali vežu za MHC molekulu.

Slika 3.7. Struktura MHC molekula klase I

1 i 2 domeni sadrže polimorfne rezidue

koje doprinose varijabilnosti razliitih alela klase I u vezivanju peptida koji se prezentuju T

limfocitima. Konzervisani region, u pogledu sastava polipeptidnog lanaca ima 3 segment,

lanca, koji gradi Ig-slian domen. Ovaj segment sadrži vezno mesto za CD8 receptore.

Laki lanac MHC klase I ne kodiraju geni MHC kompleksa. Ovaj lanac je identian sa proteinom

koji je identifikovan u urinu i nosi naziv 2 mikroglobulin. Strukturno, 2 mikroglobulin ima Ig-

slian domen i nekovalnentno se veže za 3 segment lakog lanca.Potpuno formiran MHC molekul klase I je heterotrimer koji sadrži:

lanac +

2

mikroglobulin + antigenini peptid.

Za stabilnu ekspresiju molekula na elijskoj membrani potrebno je prisustvo sve tri komponente

heterotrimera.

Svaka heterozigotna individua, na svakoj eliji, ekspresuje 6 razliitih molekula klase I. lanci

ovih molekula su derivati dva alela HLA-A, HLA-B i HLA-C gena koji su nasledjeni od roditelja.







56

3.3.4. MHC molekuli klase II

Klasa II molekula se sastoji od dva nekovalentno povezana polipeptidna lanca: lanac od 32-34

kD i lanac od 29-32 kD. Oba lanca, molekula MHC klase II, su kodirana polimorfnim MHC

genima. N terminalni, 1 i 1 segmenti

formiraju veznu pukotinu. Polimorfne

rezidue su locirane u/oko 1 i 1

segmenta (kod ljudi segment ima vei

polimorfizam od segmenta). 2 i 2

segmenti molekula klase II su savijeni

tako da formiraju Ig-sline domene, kojisu, slino molekulama klase I,

konzervisani tj. nisu polimorfni. Petlja

2 segmenta sadrži vezno mesto za CD4

receptore T limfocita. Oba lanca ( i )

sadrže transmembranske i

citoplazmatine regione. Novosintetisani

molekuli klase II su povezani sa tzv.invarijantnim lancima (Ii) . To su

nepolimorfni polipeptidi, ija je uloga u

determinaciji kretanja molekule u eliji.

Formiran MHC molekul klase II je heterotrimer koji sadrzi: lanac + lanac + vezan antigenini

peptid. Kao i u sluaju molekula klase I, ekspresovan molekul na elijskoj membrani sadrži sve tri

komponente heterotrimera.

3.3.5. Osobine peptid-MHC interakcija

Svaki peptid koji može da bude antigenian mora da sadrži neke ostatke aminokiselina kojima se

vezuje za MHC pukotinu, kao i ostatke koji se projektuju iz pukotine i koje e biti prepoznate od T

limfocita. Nabrojane su osobine MHC-peptid interakcija:

Slika 3.8. Struktura MHC molekula klase II







57

Molekuli klase I i klase II imaju pukotinu koja može da «primi» razliite antigenine

peptide.

Peptidi koji se vezuju za MHC pukotinu imaju strukturne karakteristike koje

promovišu/stimulišu interakciju sa molekulama MHC. To podrazumeva, na primer, da ve-

liina peptida odgovara veliini pukotine u koju treba da se

smesti, i da peptid ima ostatke aminokiselina koje su

komplementarne sastavu MHC pukotine5.

Povezivanje antigeninih peptida i MHC molekula je

saturaciona reakcija, malog afiniteta (Kd oko 10-6 M)6.

MHC molekule ne razlikuju strane od sopstvenih

peptida, tako da MHC molekule iskazuju strane, kaoi sopstvene peptide. T elije nadgledaju iskazivanje

antigeninih peptida, a smatra se da je blaga

stimulacija sopstvenim antigenima neophodna za

održavanje ovih elija u životu.

Slika 3.9. Kompeticija antigena za T limfocit

3.3.6. Ekspresija MHC molekula

S obzirom da je ekspresija MHC molekula neophodna za iskazivanje antigena T limfocitima, u

daljem tekstu e biti navedene neke osnovne/znaajne karakteristike njihove ekspresije.

Molekuli MHC klase I se konstitutivno ekspresuju na svim nukleiranim elijama, dok se klasa II

ekspresuje samo na dendritskim elijama, B limfocitima, makrofagama i na još nekoliko elijskih

tipova. Ovakav model ekspresije je vezan za funkciju T limfocita koji prepoznaju molekule klase I i

II. Na primer, efektorna funkcija CD8+ T limfocita, koji prepoznaju MHC klasu I, je da unište elije

inficirane intracelularnim mikrobima, kao što su npr. virusi. S obzirom da virusi mogu da

5Ostaci aminokiselina antigeninog peptida sadrže bone lance koji se vežu za komplementarne aminokiseline MHC molecule (esto hidrofobnim

interakcijama). Ovakvi ostaci se nazivaju “anchor residue” a nalaze se ili u centru ili na krajevima antigeninog peptida. Svaki molekul MHC-peptidsadrži jedan ili dva regiona preko kojih se ostvaruje ova medjusobna interakcija.6

Afinitet peptid-MHC interakcije je mnogo manji nego afinitet vezivana antigen-antitelo (Kd oko 10-7 do 10-11). Saturacija molekula klase II sa

peptidom traje oko 15-30 minuta. Jednom vezan peptid može da bude vezan duži period, od nekoliko sati do nekoliko dana!!!







58

inficiraju bilo koji eliju koja ima nucleus, ligandi koje prepoznaju CD8+ T limfociti, treba da se

ekspresuju na svim nukleiranim elijama. Suprotno, set efektornih funkcija CD4+ T limfocita, koji

prepoznaju MHC molecule klase II, je ogranien na mali broj elijskih tipova. Na primer, naivne

CD4+ T elije treba da prepoznaju antigene prezentovane od strane dendritskih elija u perifernim

limfatinim organima. Diferencirane CD4+ T pomone elije, aktiviraju makrofage koji onda

eliminišu predhodno fagocitiran ekstracelularni antigen, i aktiviraju B limfocite da sintetišu

antitela koja se takodje ukljuuju u eliminaciju ekstracelularnih antigena.

Ekspresija MHC molekula je stimulisana citokinima koji se produkuju tokom nespecifinog i

specifinog IO. Interferoni, IFN-, IFN- i IFN-, kao i TNF i limfotoksin (LT), poveavaju ekspresiju

molekula MHC klase I u veini elijskih tipova. Interferoni se produkuju tokom ranognespecifinog imunog odgovora na mnoge

viruse, a TNF i LT na mnoge mikrobne

infekcije. Tako, nespecifian imuni odgovor

na mikrobe poveava ekspresiju MHC

molekula koji prikazuju mikrobne antigene

specifinim T limfocitima. Ekspresija mole-

kula klase II je takodje regulisana razliitimcitokinima u razliitim elijama. IFN- je

osnovni stimulator ekspresije molekula klase

II u APCs. IFN- se produkuje u NK elijama

tokom nespecifinog imunog odgovora (me-

hanizam kojim nespecifini stimuliše

specifini/adaptivni imuni odgovor). Takodje,

IFN- se produkuje i u antigenom-

aktiviranim T limfocitima u reakcijama

adaptivnog imunog odgovora, a njegova

sposobnost da stimuliše ekspresiju molekula

klase II na APCs predstavlja mehanizam

amplifikacije adaptivnog imunog odgovora.

Slika 3.10. IFN- stimuliše ekspresiju molekula MHC klase II







59

Citokini, u mnogim elijskim tipovima, stimulišu ekspresiju MHC molekula, preko

stimulacije transkripcije gena za klasu I/II. Stimulacija transkripcije zapoinje vezivanjem

transkripcionih faktora, koji su aktivirani citokinima, za regulatorne DNA sekvence u

promotornom regionu MHC gena. Nekoliko transkripcionih faktora se vezuje za protein “class II

transcription activator” (CIITA), a itav kompleks (CIITA+transkripcioni faktori) se veže za

promoter klase II i pokree transkripciju. Zbog toga što formira kompleks sa transkripcionim

faktorima, CIITA funkcioniše kao glavni regulator ekspresije gena klase II.

Ekspresija mnogih proteina ukljuenih u procesovanje i prezentaciju antigena je specifino

regulisana i koordinisana. Na primer, IFN- poveava transkripciju gena, ne samo MHC klase I/II,

nego i 2-mikroglobulina, gena koji kodiraju dve subjedinice proteozoma, kao i gene za subjedinice TAP heterodimera.







60

3.4. PROCESOVANJE I PREZENTACIJA ANTIGENA T LIMFOCITIMA

T limfociti imaju centralnu ulogu u reakcijama adaptivnog imunog odgovora na proteinske

antigene. U okviru elijskog imunog odgovora, CD4+ T limfociti aktiviraju makrofage da unište

fagocitirane antigene, a CD8+ T limfociti ubijaju elije inficirane intracelularnim mikrobima. U

humoralnom imunom odgovoru, CD4+ T elije pomonice interaguju sa B limfocitima i stimulišu

ih na proliferaciju i diferencijaciju. APCs prikazuju MHC-antigenine peptide naivnim T elijama u

fazi prepoznavanja (iniciraju imuni odgovor), kao i diferenciranim T elijama u efektornoj fazi

(stimulišu mehanizme koji eliminišu antigene). U ovom odeljku e biti opisane karakteristike APCs

i procesi kojima se formiraju i iskazuju antigeni na APCs.

3.4.1. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti

Antigeni koje prepoznaju T limfociti su razliiti po svojim fiziko-hemijskim karakteristikama od

onih koji mogu biti prepoznati antitelima ili B limfocitima. Neke karakteristike prepoznavanja

antigena su jedinstvene i vezane samo za T limfocite.

Tabela 3.4. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti

KARAKTERISTIKE ANTIGENA KOJE PREPOZNAJU T LIMFOCITI OBJAŠNJENJE

T elije prepoznaju samo peptide MHC može da veže samo peptide

T elije prepoznaju linearnu a ne konformacionu determinantu peptidnihantigena

Peptidi se vezuju u pukotinu MHC molekula u linearnoj konformaciji i ne mogu daformiraju konformacionu determinantu

T elije prepoznaju samo antigene vezane za elijsku membranu MHC molekule su membranski proteini koji iskazuju stabilno vezan peptid na

elijskoj membrani

CD4+ i CD8+ T elije prepoznaju antigene iz ekstracelularnog ilicitoslonog pula

CD4+ elije pomonice prepoznaju peptide vezane za klasu II MHC molekula,Dok CD8+ citotoksini T limfociti prepoznaju peptide vezane za klasu I MHC

molekula.

Veina T limfocita prepoznaje samo peptide, dok B elije prepoznaju peptide, proteine,

nukleinske kiseline, polisaharide, lipide i hemikalije malih molekula. Drugim reima, T elijski

imuni odgovor se indukuje samo proteinskim antigenima (izvor peptida), dok humoralni imuni

odgovor nastaje kao reakcija na proteinske i neproteinske antigene. Neke T elije su specifine zamale molekule = haptene (npr. dinitrofenol ili laktam). U ovim sluajevima hapten se veže sa

„sopstvenim proteinom“ i takav konjugat hapten-nosa biva prepoznat od T limfocita.







61

T elije su specifine za sekvencu aminokiselina u peptidu. Nasuprot, B elije mogu da

prepoznaju konformacione determinante, koje postoje kada su antigeni u svojoj nativnoj

tercijarnoj konfiguraciji. TCR prepoznaje samo nekoliko rezidua i peptida. Razliite T elije

odgovaraju na antigene koji se razlikuju samo u jednoj aminokiselini.

T elije prepoznaju i odgovaraju na strane peptide samo kada su povezani sa membranom

APCs. B elije i sekretovana antitela prepoznaju solubilne antigene kao i one koji se nalaze na

elijskoj membrani.

T elije jedne individue prepoznaju peptidne antigene samo ako su ti peptidi povezani i

prikazani u kompleksu sa MHC molekulima te individue. Ovakvo prepoznavanje antigena kojenosi naziv MHC restrikcija (engl. self MHC restriction), može biti demonstrirano u

eksperimentalnim situacijama kada se T limfociti jedne individue pomešaju sa APCs druge. MHC

restrikcija je posledica procesa selekcije tokom sazrevanja T limfocita u timusu, koji osiguravaju

da T elije jedne individue prepoznaju samo antigene iskazane na membrani APCs te iste

individue (prepoznaju strani peptid samo kada je vezan za odredjen alelski oblik MHC molekula).

Iako T elije pokazuju osobinu MHC restrikcije, one mogu da prepoznaju strane MHC molekule

prisutne u graftovima tkiva prilikom transplantacije i dovedu do odbacivanja grafta.

CD4+ elije pomonice prepoznaju peptide u kompleksu sa MHC molekulama klase II, dok

CD8+ CTLs prepoznaju komplekse antigeninih peptida i MHC molekula klase I. Vezano za

predhodno, CD4+ T limfociti prepoznaju peptide poreklom od ekstracelularnih proteina koji su

internalizovani u vezikule APCs, dok CD8+ CTLs prepoznaju peptide poreklom od citosolnih,

obino, endogeno sintetisanih proteina.

Pored prezentacije antigena vezanih za MHC molekule, postoji još jedan sistem prezentacije,

specijalizovan za prezentaciju lipidnih antigena. CD1 molekule se ekspresuju na razliitim APCs i

elijama epitela i smatra se da su ukljuene u iskazivanje lipidnih antigena, neuobiajenim

populacijama T limfocita. Istraživanja na elijskim linijama T limfocita su pokazala da razliite

elije mogu da prepoznaju lipidne antigene iskazane sa CD1. To su CD4 + , CD8+, kao i CD4- CD8-

T limfociti koji ekspresuju TCR kao i T elije. Takodje, CD1-povezane lipide može da

prepozna i mala populacija T limfocita koje ekspresuju marker za NK elije tzv. NK-T elije.







62

3.4.2. Prezentacija proteinskih antigena CD4+ T limfocitima

CD4+ elije pomonice kontrolišu imune odgovore na proteinske antigene. One su efektorne elije

u elijskom imunitetu i obezbedjuju stimuluse koji su znaajni za proliferaciju i diferencijaciju B

limfocita i citolitinih T limfocita. Kao što je ve reeno, CD4+ limfociti prepoznaju antigene na

membrani samo onih elija koje ekspresuju MHC molekule klase II, a to su APCs (dendritske

elije, makrofage, B limfociti). Antigen-

prezentujue elije «hvataju» ekstracelularne

proteinske antigene, transportuju ih,

koncentrišu u limfnom voru, i iskazuju u formi

koja može biti prepoznata od antigen-specifinihCD4+ T limfocita.

Slika 3.11. APCs su neophodne za aktivaciju T elija

APCs imaju dve važne funkcije u aktivaciji CD4+ T limfocita. One „konvertuju“ proteinske antigene

u peptide i prikazuju ih u kompleksu sa MHC molekulama T limfocitima. Proces konverzije

nativnih proteina u peptidne fragmente povezane sa MHC molekulama je procesovanje antigena.

Druga važna funkcija APCs je da obezbedjuju dodatne stimuluse za aktivaciju T limfocita. Dodatni

stimulusi, koji se ostvaruju preko hemijskih medijatora tzv. kostimulatora, su neophodni za

punu aktivaciju T elija.

3.4.2.1. Tipovi elija koje prezentuju antigene CD4 + T elijama

Mnoge sisarske elije imaju sposobnost endocitoze i proteolitikog razlaganja proteinskih

antigena, ali samo

specijalizovane populacijeelija ekspresuju MHC

molekule klase II.

elije koje funkcionišu kao

APCs za T elije pomonice su

dendritske elije, mononukle-

arni fagociti i B limfociti

(profesionalne APCs).

Slika 3.12. Funkcije razliitih APCs







63

Dendritske elije su najefikasnije APCs u iniciranju T elijskog odgovora. Makrofage iskazuju

antigene diferenciranim CD4+ T elijama u efektornoj fazi elijskog imunog odgovora, a B limfociti

iskazuju antigene T elijama pomonicama u humoralnom imunom odgovoru.

Dendritske elije su prisutne na glavnim mestima prodora mikroorganizama (nalaze se u

perifernim limfatinim organima, u epitelu kože, gastrointestinalnom, i respiratornom traktu, kao

i u skoro svim parenhimatinim organima). Prototip nezrelih dendritskih elija su Langerhansove

elije epidermisa, koje zbog svojih dugakih nastavaka okupiraju ak 25% površine epidermisa

iako ine manje od 1% elijskih populacija prisutnih u koži. Funkcija epitelijalnih dendritskih

elija je da „hvataju/love“ proteinske antigene, da ih internalizuju i transportuju do limfnih

vorova. Tokom migracije do limfnih vorova, dendritske elije maturiraju i postaju sposobne da

efikasno iskažu antigene na svojoj me-mbrani. Zrele dendritske elije prikazuju

antigene T limfocitima u T elijskoj zoni

limfnog vora.

Makrofage su APCs koje aktivno

fagocitiraju velike partikule. One imaju

velikog znaaja u prikazivanju antigena

poreklom od fagocitiranih bakterija iliparazita. U efektornoj fazi elijskog imu-

nog odgovora, diferencirani T limfociti,

prepoznaju antigene na membrani

fagocita, i stimulišu ih, da aktiviraju

procese uništavanja fagocitiranih anti-

gena.

B limfociti preko BCR-a (receptora za

antigene) vezuju i internalizuju solubilne

proteinske antigene koje potom

procesuju i iskazuju na membrani, T

elijama pomonicama. Antigen-

prezentujua funkcija B limfocita je vrlo

važna za T-zavisnu produkciju antitela.

Slika 3.13. Putevi prodora ekstracelularnih antigena







64

Endotelne elije vaskularnog sistema, takodje mogu da ekspresuju MHC molekule klase II i da

prikažu antigene T elijama krvi.

3.4.2.2. „Hvatanje“ i prezentacija proteinskih antigena

Kao što je ve spomenuto, nezrele dendritske elije „hvataju“ antigene na mestima njihovog

prodora i transportuju ih do limfatinog vora. Nezrele dendritske elije ekspresuju membranske

receptore kojim vežu mikrobe (manozni receptor, „toll-like receptor“, videti kasnije), internalizuju

ih, i zapoinju procesovanje proteina koji e se vezati sa produktima gena MHC klase II.

Mikroorganizmi stimulišu nespecifie imune reakcije, tokom kojih se produkuju inflamatorni

citokini. Kombinacija delovanja mikroorganizama i citokina aktivira dendritske elije, one gube

kontakt sa epitelom i poinju da ekspresuju hemokinske receptore, CCR7, koji su specifini zahemokine produkovane u T elijskoj zoni limfnog vora. Nezrele dendritske elije koje su

internalizovale mikroorganizme sazrevaju tokom migracije do limfnog vora i postaju elije koje

iskazuju peptidne antigene naivnim T limfocitima. Zrele dendritske elije ekspresuju visok nivo

MHC molekula klase II za koje su vezani antigenini peptidi, kao i kostimulatore neophodne za

aktivaciju T elija (aktivacija primarnog T elijskog odgovora).

U efektornoj fazi elijskog odgovora, predhodno aktivirani efektorni ili memorijski CD4+ T limfociti,

mogu da prepoznaju strane antigene i odgovore na njih na bilo kom mestu u organizmu (a nesamo u limfatinom tkivu). Drugim reima, aktivirani T limfociti migriraju na mesta inflamacije,

gde makrofage ili druge APCs iskazuju antigene.

3.4.3. Prezentacija proteinskih antigena CD8+ T limfocitima

Sve elije (koje imaju nukleus) mogu na svojoj membrani da iskažu citosolne peptidne antigene u

kompleksu sa MHC molekulama klase I. Ovakve antigene prepoznaju CD8+ T limfociti.

Antigeni koji se iskazuju uz pomo molekula MHC I su endogeni tj. citosolni antigeni. Na primer,

to su viralni proteini u sluaju virusnih infekcija ili mutirani proteini kod tumorskih elija.

Efektorni CD8+ limfociti (citotoksini) prepoznaju ovakve antigene, i uništavaju elije koje ih

iskazuju. Ostaje pitanje kako te elije dospeju do limfatinog tkiva gde mogu biti prepoznate od

strane naivnih CD8+ T limfocita i kako se aktiviraju naivni CD8+ limfociti? Objašnjenje aktivacije

naivnih CD8+ T limfocita možda predstavlja problem, zbog toga što antigen može biti produkovan

u bilo kojoj eliji koja nije profesionalna antigen-prezentujua elija. Da bi se aktivirali i da biproliferisali naivni CD8+ T limfociti treba da prepoznaju kompleks peptid-MHC klase I, i da budu







65

kostimulisani od strane antigen-prezentujuih elija, ili da prime signal od T elija pomonica.

Verovatno je da antigen-prezentujue elije (dendritske elije) fagocitiraju virusom inficirane ili

tumorske elije i da ekspresuju viralne ili tumorske antigene na svojoj površini. Njih prepoznaju

naivni CD8+ T limfociti koji zapoinju primarni imuni odgovor. Ovaj proces se naziva «unakrsna-

prezentacija» (engl . cross-

presentation) i oznaava

da antigen-prezentujue

elije mogu da iskažu

antigene drugih elija

(inficiranih virusom ili

tumorske) i na taj nainaktiviraju T limfocite spe-

cifine za taj antigen.

3.4.4. Procesovanje antigena

Proteinski antigeni prisutni u acidnim vezikulama APCs se povezuju sa MHC molekulama klase II, dok

antigeni prisutni u citosolu reaguju sa MHC molekulama klase I.

Ova osnovna razlika izmedju vezikularnih (endocitozom unetih) i citosolnih antigena je pokazana

eksperimentalno. Prezentacija/sudbina istog antigena u APCs se razlikuje ukoliko on na razliite

naine unese u eliju.

3.4.4.1. Procesovanje internalizovanog antigena

Procesovanje internalizovanog antigena podrazumeva proces proteolitike razgradnje antigena u

endocitoznim vezikulama, i vezivanje antigeninih peptida za MHC molekule klase II.

Internalizacija ekstracelularnog proteina

Razliite APCs, vezuju proteinske antigene, na razliite naine, sa razliitom efikasnošu i

specifinošu. Dendritske elije i makrofage, ekspresuju raznolike površinske receptore koji

prepoznaju strukture koje su zajednike mnogim mikroorganizmima (videti kasnije). Makrofage,

takodje, ekspresuju receptore za Fc fragmente antitela, kao i receptor za C3b protein

komplementa. Vezivanje antigena u kompleksu sa antitelom/komplementom stimuliše njihovu

Slika 3.14. Unakrsna prezentacija. Antigen prezentujue elija fagocitira inficiranu eliju iiskazuje antigen-MHC I na svojoj membrani. Antigen-MHC I prepoznaju naivni CD8+ T limfocitikoji se aktiviraju i iniciraju primarni imuni odgovor.







66

internalizaciju. B limfociti na membrani imaju imunoglobuline, koji funkcionišu kao BCR, i koji

efikasno posreduju internalizaciju antigena. Ovi receptori funkcionišu kao receptori visokog

afiniteta i vežu antigene pri vrlo malim koncentracijama u ekstracelularnoj tenosti.

Nakon internalizacije proteinski antigen je lokalizovan u intracelularnoj vezikuli tzv. endozomu,

koja sadrži proteolitike enzime i ima nisku pH vrednost. Endozom se, na svom intracelularnom

putu sree sa lizozomom (vezikula koja sadrži enzime vezane za membranu). Partikularni antigeni

se internalizuju u vezikule,

zvane fagozomi, koje mogu

da se fuzionišu sa lizozomom

i na taj nain nagrade tvore-

vine zvane fagolizo-zomi ilisekundarni lizozomi.

Slika 3.15. Eksperimentalni prikaz iskazi-vanja ekstracelu-larnog i intracelularnogprote-inskog antigena na istim APCs.Kada se protein (ovalbumin) doda APCskao ekstracelularni antigen, APCs (koje

ekspresuju MHC klase I i klase II) eprezentovati antigenine peptide ukompleksu sa molekulama klase II (A).Kada se ovalbumin sintetiše intracelularnokao rezultat transfekcije gena za ovalbumin(B) ili kada se protein ubaci u elijukorišenjem npr. osmotskog šoka (C),antigeni peptidi e se ekspresovati ukompleksu sa molekulama MHC klase I.

Procesovanje internalizovanih proteina u endozomalnoj i lizozomalnoj vezikuli

Internalizovani proteini se, u endozomima i lizozomima, enzimatski razlažu na peptide, od kojih

mnogi imaju strukturne karakteristike koje omoguavaju njihovo vezivanje za „pukotinu“ MHC

molekula klase II. Degradacija proteinskih antigena u vezikulama je aktivan proces koji se odvija

delovanjem proteaza koje imaju optimum aktivnosti pri niskim pH vrednostima (npr. katepsini).

Biosinteza i transport MHC molekula klase II

Biosinteza MHC molekula klase II se odigrava u endoplazmatskom retikulumu, a novosintetisani

MHC molekuli su povezani sa invarijantnim lancem (Ii), koji okupira pukotinu u koju e se

vezati antigenini peptid. i lanci molekula klase II se sintetišu i medjusobno povezuju u







67

endoplazmatskom retikulumu. Novonastali dimeri klase II, su strukturno nestabilni, a njihovo

formiranje je pomognuto aperonima, prisutnim u endoplazmatskom retikulumu (npr. kalneksin).

Takodje, u endoplazmatskom retikulumu se heterodimer povezuje sa Ii lancem. Tokom

kretanja ka površini elije, egzocitozna vezikula koja transportuje MHC molekule klase II od/iz

endoplazmatskog retikuluma, se fuzioniše sa endocitoznom vezikulom koja sadrži internalizovane

i procesovane antigene. Formacija u kojoj se MHC molekule spajaju sa antigeninim peptidom

nose naziv MHC klase II kompartmani (MHC) ili vezikule klase II (CIIV; nalaze se u makrofagama

i B elijama miša). MIIC ima karaktristinu lamelarnu strukturu i sadrži sve komponente

potrebne za nastajanje kompleksa peptid-MHC II, ukljuujui i enzime koji degradiraju proteinske

antigene, molekule klase II, Ii lanac, i humani leukocitni antigen DM (HLA-DM).

Slika 3.16. Procesovanje i iskazivanje ekstracelularnih proteinskih antigena u kompleksu sa MHC molekulama klase II

Nastajanje kompleksa peptid+MHC II

U okviru MIIC, delovanjem proteolitikih enzima i HLA-DM, Ii lanac se odvaja od molekula klase

II, a antigenini peptidi vežu za pukotinu na molekulu klase II. Proteolitiki enzimi koji suestvovali u nastajanju antigeninog peptida (katepsin S), takodje, razlažu Ii lanac do CLIP







68

peptida (engl. class II-associated invariant chain peptide), koji se i dalje nalazi u veznoj pukotini.

Da bi pukotina bila slobodna da se u nju veže antigenini peptid, potrebno je ukloniti CLIP iz nje.

Ovo se dešava delovanjem HLA-DM (molekule koja je takodje kodirana MHC genima i koja ima

strukturu slinu MHC molekulama klase II). HLA-DM funkcioniše kao «izmenjiva peptida»,

olakšavajui odvajanje CLIP-a iz pukotine i njegovu zamenu za antigenini peptid.

Ekspresija kompleksa peptid+MHC II na membrani APCs

Vezivanjem antigeninog peptida za molekul MHC klase II, formira se stabilan kompleks koji se

transportuje do elijske membrane gde se prezentuje CD4+ T limfocitima. Interesantno je da samo

kompleksi peptid+MHC II putuju, od MIIC vezikularnog kompartmana do elijske membrane, a ne

i ostali proteini ukljueni u prezentaciju antigena (molekuli kao što su DM ostaju u vezikuli).Mehanizam ovog selektivnog iskazivanja samo odredjenih proteina, nije poznat.

3.4.4.2. Procesovanje citosolnog antigena

Antigenini peptidi, nastaju proteolitikom razgradnjom citosolnih proteina, transportom nastalih

peptida do endoplazmatskog retikuluma, i njihovim vezivanjem za novosintetisane molekule klase

I.

Slika 3.17. Procesovanje i iskazivanje citosolnin proteinskih antigena u kompleksu sa MHC molekulama klase I







69

Produkcija proteina u citosolu

Veina proteina, od kojih nastaju peptidi koji e biti iskazani na membrani u komleksu sa

molekulama klase I, se produkuje endogeno u citosolu nukleiranih elija. Strani antigeni u

citosolu, mogu biti produkti virusa ili drugih intracelularnih mikroorganizama, koji inficiraju

eliju i produkuju svoje proteine tokom svog životnog ciklusa. U tumorskim elijama, mutirani

geni ili onkogeni, diktiraju sintezu proteinskih antigena. Nekada i partikularni antigeni, koji su

fagocitirani u fagozome, mogu biti iskazani na membrani kao kompleks sa molekulama klase I.

Neki mikroorganizmi su sposobni da oštete membranu fagozoma i na taj nain formiraju pore

kroz koje mogu da dospeju u citoplazmu. Kada fagocitirani antigeni prodru u citoplazmu oni se

dalje procesuju kao i drugi citosolni antigeni.

Proteolitika degradacija citosolnih proteina

Glavni mehanizam nastajanja peptida od proteinskih antigena je njihova proteoliza u

proteazomima. Proteazomi su multiproteinski enzimski kompleksi sa širokim proteolitikim

delovanjem, nadjeni u gotovo svakoj eliji. Oni su odgovorni za degradaciju razliitih

citoplazmatinih proteina i time ukljueni u održavanje osnovnih funkcija svake elije. Mali

polipeptidi tzv. ubikvitinini (engl .

ubiquitin), obeležavaju proteinekoji eliji nisu potrebni, a ovako

markirane proteine prepoznaje i

razlaže proteazom.

Slika 3.18. Uloga TAP-a u prezentacijipeptid+MHC I kompleksa. U elijama kojenemaju funkcionalan TAP, molekuli klase I nemogu da se vežu sa antigeninim peptidom,

nestabilni su i degradiraju se u endo-plazmatskomretikulumu. Kada se elije transfekuju sa TAPgenom i on se sintetiše u funkcionalan protein,mogua je ekspresija kompleksa antigeninipeptid+MHC I na elijskoj membrani.

Transport peptida iz citosola do endoplazmatskog retikuluma

Nastali peptidi se iz citosola translociraju u endoplazmatski retikulum, gde je mogua njihova

interakcija sa novosintetisanim molekulama klase I. S obzirom da su antigenini peptidi nastali u

citosolu, a da molekuli klase I nastaju u endoplazmatskom retikulumu, mora postojati

mehanizam kojim e se citosolni peptidi dostaviti u endoplazmatski retikulum. Antigenini peptidi







70

se iz citosola u endoplazmatski retikulum transportuju ATP-zavisnim transporterom, tzv.

transporterom povezanim sa procesovanjem antigena (TAP; engl . transporter associated with

antigen processing). Tap je heterodimer (izgradjen od dva lanca kodirana MHC genima), koji se

uglavnom nalazi u endoplazmatskom retikulumu, a transportuje peptide koji su optimalne

veliine za kasnije povezivanje sa molekulama klase I (od 6-30 aminokiselinskih ostataka). U

lumenu endoplazmatskog retikuluma, TAP je proteinskim linkerom (tapasinom) povezan sa

novosintetisanim molekulama klase I. Na taj nain su MHC I molekule strateški locirane na mesto

gde mogu da prime peptide.

Nastajanje i ekspresija peptid+MHC I kompleksa

Kao što je ve spomenuto, novosintetisani i 2-mikroglobulin dimeri u endoplazmatskomretikulumu, se vežu za TAP kompleks (preko tapasina), i stupaju u kontakt sa odgovarajuim

antigeninim peptidom. Kompleks peptid+MHC I se odvaja od tapasina, izlazi iz endoplazmatskog

retikuluma i transportuje do Goldži kompleksa, gde se pakuje u egzocitozne vezikule i

transportuje do površine elije. Na elijskoj membrani, ovakav kompleks, e prepoznati CD8+ T

limfociti. i 2-mikroglobulin dimeri, za koje se nisu vezali antigenini peptidi su nestabilni, tako

da se degradiraju u endoplazmatskom retikulumu.

Tabela 3.5. Karakteristike procesovanja i prezentovanja antigena i MHC molekula klase I i IIOsobina Put iskazivanja antigeninog peptida+ MHC klase II Put iskazivanja antigeninog peptida+ MHC klase

I

Sastav kompleksa peptid + MHC Polimorfni i lanci + peptid Polimorfni lanac i 2-mikroglobulin + peptid

Tipovi antigen-presentujuih elijaDendritske elije, mononuklearni fagociti, B limfociti,endotelne elije, epitel timusa Sve elije koje imaju nukleus

T elije koje prepoznaju CD4+ elije CD8+ elije

Izvor proteinskog antigena Endozom alni/lizozom alni proteini (uglavnom

internalizovani iz ekstracelularnog okruženja)

Citosolni proteini (uglavnom sintetisani u eliji; mogu

da dospeju u citosol iz fagosoma)

Enzimi odgovorni za formiranje peptida Endosomalne i lizozomalne protease Citosolni proteozom

Mesto formiranja kompleksa MHC+pept id Spec ijal izovani vezikularni kompartman Endoplazmatski ret ikulum

Molekuli ukljueni u transport i vezivanjeza MHC molekule

Kalneksin u endoplazmatskom retikulumu, invarijantnilanac u endoplazmatskom retikulumu

Kalneksin, kalretikulin, TAP u endoplazmatskomretikulumu

Fiziološki znaaj prezentacije antigena u sastavu MHC molekula

MHC molekuli obezbedjuju da T limfociti prepoznaju samo antigene koji se nalaze u elijama, kao

i da te antigene prepozna odgovarajui tip T limfocita (elije pomonice ili CTLs), koji je

najefikasnij u borbi protiv odredjenog antigena.







71

3.5. RECEPTOR ZA ANTIGENE NA T LIMFOCITIMA (TCR) I POMONE MOLEKULE

T limfociti reaguju na peptidne fragmente proteinskih antigena koji su iskazani na APCs.Zapoinjanje odgovora podrazumeva:

specifino prepoznavanje antigena,

adheziju T limfocita na APCs,

transdukciju signala do T elija.

Za svaki od ovih dogadjaja su odgovorni razliiti setovi molekula na T limfocitu. U narednom

tekstu e biti opisane osnovne karakteristike molekula ukljuenih u prepoznavanje, adheziju i

transdukciju signala na T limfocitima. T limfociti imajudvojnu specifinost: oni prepoznaju polimorfne rezidue MHC

molekula (MHC restrikcija tj. da prepoznaju sopstvene MHC

molekule) i prepoznaju antigene koji su iskazani tim

molekulama (specifinost). Receptor koji prepoznaje peptid-

MHC kompleks je receptor za antigene na T limfocitima (TCR).

On je klonalno distribuiran tj. klonovi T elija sa razliitim

specifinostima ekspresuju razliite receptore za antigene.

Biohemijski signal koji se ostvaruje nakon prepoznavanja

antigena (vezivanja TCR + peptid-MHC) se ne prenosi samim

TCR nego su u taj proces ukljueni proteini koji su

nekovalentno vezani za antigenski receptor (CD i ) TCR

kompleks.

Slika 3.19. TCR i pomone molekule.

Za prepoznavanje antigena i prenos signala (signaling) su odgovorna dva seta molekula:

visoko varjabilni TCR na T limfocitima i membranski Ig na B limfocitima i

signalni proteini (CD i lanci na T elijama kao i Ig i Ig u B elijama).

T elije ekspresuju i druge membranske receptore koji ne prepoznaju antigene ali doprinose

odgovoru T elija na antigene (adhezione molekule koje stabilizuju vezivanje T elija za APCs,

adhezione molekule koje regulišu migraciju i druge). To su pomone molekule.







72

3.5.1. Struktura TCR

TCR koji se ekspresuje na CD4+ elijama pomonicama i CD8+ citolitinim T limfocitima je

heterodimer sastavljen od dva transmembranska, polipeptidna lanca ( i ), kovalentno povezanadisulfidnim vezama. i lanci se sastoje od N-terminalnog varijabilnog domena (V),

konstantnog domena (C), hidrofobnog transmembranskog domena i kratkog citoplazmatinog

domena. V domeni i lanaca sadrže regione visoke varijabilnosti (hipervarijabilne domene ili

CDRs; engl . complementarity-determining regions). Tri

CDRs na lancu su rasporedjena pored tri slina

regiona na lancu tako da formiraju region TCR-a koji

specifino prepoznaje peptid-MHC kompleks. U i

lanacu, CDR3 ima najveu varjabilnost i najviše dopri-

nosi ukupnoj varjavilnosti TCR-a. V domen lanaca

sadrži i CDR4 koji ne doprinosi vezivanju za antigen ali

se veže za mikrobijalne produkte tzv. superantigene.

Oba TCR lanca, kao i teški i laki lanci Ig, su kodirani

multiplim genskim segmentima koji podležu somatskim

rekombinacijama tokom maturacije T limfocita.

Slika 3.20. Struktura TCR

C domeni i lanaca sadrže regione koji imaju rezidue cisteina koje doprinose medjusobnom

disulfidnom povezivanju dva lanca. Transmembranski (hidrofobni) domen sadrži rezidue pozitivno

naelektrisanih aminokiselina, kao što je lizin u lancu, i lizin i arginin u lancu. Ove rezidue

interaguju sa negativnim reziduama u transmembranskim regionima drugih polipeptida koji

formiraju TCR kompleks (CD i ). Oba lanca, imaju kratke citoplazmatine repove (5-12 ostataka

aminokiselina). Kao i membranski Ig na B limfocitima, ovi citoplazmatini regioni su previšekratki da bi imali funkciju u transdukciji signala. Ovu funkciju vrše molekule koje su fiziki

povezane sa TCR-om i grade TCR kompleks.

Iako molekuli TCR-a i imunoglobulina pokazuju strukturnu slinost, mogu se zapaziti i znaajne

razlike izmedju ova dva tipa molekula. TCR se nikada ne sekretuje iz elije i on sam ne ispoljava

efektorne reakcije. Umesto efektornih reakcija, TCR inicira signale koji aktiviraju efektorne

funkcije T limfocita. Takodje, za razliku od Ig, lanci koji grade TCR imaju uvek isti C region (nepostoje razliite klase molekula u zavisnosti od razliite ekspresije C regiona, kao kod Ig tj. ne

postoji “isotype switching”).







73

Tabela 3.6. Osobine receptora za antigene: TCR i imunoglobulina

T elijski receptor (TCR) Imunoglobulin (Ig)

Komponente i lanci Teški i laki lanci

Broj Ig domena Jedan V i jedan C domen u svakom lancu Teški lanac: jedan V domen, tri od etri C domenaLaki lanac: jedan V domen I jedan C domen

Broj CDRs Tri u svakom lancu za vezivanje antigena; etvriti

hipervarijabilni region u lancu (nepoznata

funkcija)

Tri u svakom lancu

Udružene signalne molekule CD3 i Ig i Ig

Afinitet za antigen (Kd) 10-5-10-7 M 10-7-10-11 M (sekretovani Ig)

Promene nakon elijske aktivacijeProdukcija sekretovane forme………………………………………….Zamena izotipova

………………………………………….Somatske mutacije

Ne………………………………………….Ne

………………………………………….Ne

Da………………………………………….Da

………………………………………….Da

3.5.2. Uloga

TCR-a u prepoznavanju peptid+MHC kompleksa

i lanci TCR-a specifino prepoznaju peptid-MHC kompleks preko CDR-a.

Mesto preko koga se ostvaruje interakcija sa antigenom je ravna površina koju formiraju CDRs,

i lanca. Zapanjujua je injenica da boni lanci samo jedne ili dve aminokiseline antigeninogpeptida, vezanog za MHC, ostvaruje kontakt sa TCR-om. Ovo ilustruje neverovatnu sposobnost T

limfocita da razlikuju razliite antigene na osnovu samo par/nekoliko razlika u aminokiselinskim

ostacima. Afinitet TCR-a za MHC-peptid kompleks je mala. Konstanta disocijacije (Kd) za intera-

kciju TCR-a i MHC-peptid kompleksa

varira izmedju 10-5 – 10-7 M. Ovaj mali

afinitet je verovatno razlog postojanja

pomonih molekula tj. postojanja potrebeza stabilizacijom adhezije izmedju T elija

i APCs. TCR i pomone molekule na T

elijama formiraju sa svojim ligantima na

membrani APCs supramolekularne stru-

kture tzv. imunološke sinapse.

Formiranje sinapsi inicira signal koji se

prenosi u eliju.

Slika 3.21. Komponente TCR kompleksa







74

Sve elije koje ekspresuju TCR su MHC ograniene, u smislu da ekspresuju ili CD4 ili CD8

koreceptor. Malobrojna populacija T limfocita, ekspresuje marker karakteristian za NK elije. To

su NK-T elije. TCR lanac na NK-T elijama ima ogranien diverzitet TCR prepoznaje lipide

koji su vezani za CD1 molekule. Ostale elije koje prepoznaju lipide+CD1 komplekse i na njih

reaguju produkcijom citokina kao što su interleukin-4 i interferon su: CD4+, CD8+, ili CD4-,

CD8- T elije.

3.5.3. CD3 i proteini

CD3 i proteini su nekovalentno povezani sa TCR heterodimerom. Kada TCR prepozna

antigen, ovi proteini prenose signal (ogovorni su za signalnu transdukciju) koji vodi ka aktivaciji T

elija. CD3 molekula se sastoji iz 3 proteina: , i . TCR kompleks, takodje sadrži i disulfidno

povezan homodimer lanaca. CD3 i proteini su identini na svim T elijama, nezavisno od

njihove specifinosti, što je vezano za njihovu funkciju prenosa signala, a ne prepoznavanja

antigena.

3.5.3.1. Struktura CD3 i

proteina

Kao što je ve spomenuto CD3 proteini se sastoje od tri CD3 proteina to su , i lanci. N-terminalni ekstracelularni regioni ovih lanaca sadrže Ig-slian domen – pripadaju Ig superfamiliji.

Transmembranski domeni, sva tri CD3 lanca, sadrže negativno naelektrisani aspartat koji se veže

za pozitivno naelektrisane rezidue transmembranskog domena i lanaca TCR-a. – održava

kompleks intaktan. Citoplazmaticni domeni , i lanaca (od 44-81 ostataka aminokiselina)

sadrže po jednu kopiju konzervisane sekvence važne za transmisiju signala “immunoreceptor

tyrosine-based activation motif ” (ITAM). ITAM ima centralnu ulogu u signalingu preko TCR

kompleksa. On je takodje, nadjen, na citoplazmatinim regionima drugih membranskih proteina

limfocita koji su ukljueni u proces transdukcije signala ( lanci TCR kompleksa, lanci Ig i

Ig membranskih Ig na B limfocitima, kao i kod nekoliko Fc receptora). lanci su izgradjeni od:

kratkog ekstracelularnog regiona (9 aminokiselinskih ostataka), transmembranskog regiona koji

sadrži negativan aspartat i dugakog citoplazmatinog repa (113 ostataka aminokiselina koje

imaju 3 ITAMa). lanac je takodje povezan sa signalingom drugih receptora na limfocitima (Fc

receptor na NK elijama).

Za ekspresiju TCR kompleksa potrebna je sinteza sve tri komponente.







75

Slika 3.22. Ekspresija TCR kompleksa.U nedostaku CD3 (u stvari bilo koje

komponente) nee doi do formiranja TCRkompleksa, a svi proteini koji ga grade e bitidegradirani u eliji. Transfekovanjem elija sagenom koji nedostaje (u ovom sluaju gen za

CD3) e dovesti do formiranja i ekspresije TCRkompleksa na elijskoj membrani.

3.5.3.2. Funkcije CD3 i

proteina

CD3 i proteini povezuju prepoznavanje antigena i biohemijske dogadjaje koji dovode do

funkcionalne aktivacije T limfocita.

Posle prepoznavanja antigena dolazi do fosforilacije tirozinske rezidue ITAMs u citoplazmatinom

repu CD3 i proteina. Fosfotirozin postaje vezno mesto za adapterne proteine i za tirozin kinazu

sa Src homologim 2 domenom (SH2), ukljuujui i ZAP-70 kinazu, koja se veže za lanac, kao i

Fyn kinazu koja se veže za CD3. Aktivacija ovih kinaza aktivira put signalne transdukcije koji

vodi ka promenama ekspresije gena u T elijama.

3.5.4. TCR

TCR je drugi tip TCR-a koji se ekspresuje na malom broju T elija. To je disulfidno vezan

heterodimer koji je, takodje, povezan sa CD3 i proteinima. i TCR lanci se sastoje od

ekstracelularnog Ig-slinog V regiona i C regiona, hidrofobnog transmembranskog domena, ikratkog citoplazmatinog repa.

TCR se povezuje sa istim CD3 i lancima kao i heterodimer. Veina elija koje ekspresuju

TCR ne ekspresuju CD4 i CD8.

Više od 50% intraepitelijalnih limfocita su limfociti koji ekspresuju TCR .

TCR ne prepoznaju peptid-MHC komplekse, nego prepoznaju drugaije forme antigena. Neke

elije koje imaju TCR prepoznaju male fosforilisane molekule, alkil-amine ili lipide, koje su

iskazane “neklasinim” MHC I-slinim molekulima.







76

3.5.5. Pomone molekule

T elije ekspresuju nekoliko integralnih proteina membrane, koji imaju važnu ulogu u odgovoru T

limfocita na antigene. Svi ovi proteini se esto nazivaju pomone molekule.

Slika 3.23. Pomone molekule na T limfocitu.

Pomone molekule imaju nekoliko zajednikih osobina koje determinišu njihovu ulogu u imunom

odgovoru:

pomone molekule T limfocita reaguju sa ligandima koji se nalaze na membrani drugih

elija kao što su: APCs, endotelne elije krvnih sudova i u ekstracelularnom matriksu;

pomone molekule su nepolimorfne i nepromenljive (identine na svim T elijama i kod

svih individua jedne vrste);

mnoge pomone molekule prenose signale u unutrašnjist T elija tako da su znaajne za

regulaciju funkcije T limfocita (najbolje prueni CD8 i CD4 koreceptori);

vezivanje pomonih molekula za ligande na površini APCs poveava adheziju izmedju T

limfocita i APCs;

vezivanje pomonih molekula za endotelijalne elije i proteine ekstracelularnog matriksa je

odgovorno za “homing” i zadržavanje T elija u tkivima;

pomone molekule su korisni elijski “markeri” za identifikaciju T elija u normalnom I

patološkom tkivu.







77

Tabela 3.7. Osnovne pomone molekule T limfocita

Ime molekule S i n o n i m i Biohemi-jske

odlike

Familija gena e l i j s k a

ekspresija

L i g an d Afinitet

Kdx10-6

M

Uloga u aktivaciji T

elija Adhezija Signaling

CD4 T4 (ovek)L3T4(miš)

55-kD monomer Ig T limfocitiogranieni naklasu MHC II

Klasa II MHC +-

+

CD8 T8 (ovek)Lyt2(miš)

ili dimer;

78-kD lanac;32- do 34-kD b

lanac

Ig T limfocitiogranieni naklasu MHC I

Klasa I MHC 200 +-

+

CD28 Tp44 Homodimer od

44-kD veliine

lanaca

Ig 90 CD4+ T

elija, 50

CD8+

T elija

B7-1 (CD80), B7-2(CD86)

4 - +

CTLA-4(CD152)

Homodimer odlanaca veliine33- do 34-kD;

može bitimonomer;

90 je

intracelula-ran

Ig Aktivirane Telije

B7-1B7-2

0,4 - +

CD45R T200; zajedniki

antigenleukocita

180-220-kD

monomer;citoplasma-tskefosfataze

Leukociti Nepoznat - +

CD2 T11, antigenpovezan safunkcijomleukocita (LFA) -2

50-kD monomer Ig 90 T elijeovek), NKelije

LFA-3 10-20 + +

LFA-1 CD11aCD18 Dimer od 180-

kD lanca, 95-

kD lanca

Integrin Leukociti,trombociti

Intracelularnaadhezionamolekula (ICAM)-1ICAM-2

ICAM-3

0,1 + +-

L-selektin CD62L, Mel-14 150-kDmonomer

Selektin Leukociti Ugljeni hidrati kaoligandi na HEV

105 + -

CD44 Pgp-1 80-200 kDmonomer

Limfociti,granulociti

Proteini matriksa + +

-

3.5.6. CD4 i CD8 koreceptori ukljueni u aktivaciju T limfocita

CD4 i CD8 su proteini koji se vezuju za nepolimorfni region MHC molekule i ukljueni su u

prenos signala tj. zajedno sa signalom TCR kompleksa iniciraju aktivaciju T elija. Zreli T

limfociti ekspresuju ili CD4 ili CD8 molekule. CD4 i CD8 reaguju sa MHC molekulama kada TCR

specifino prepozna peptid-MHC kompleks na površini elije koja iskazuje antigene.







78

3.5.6.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora

CD4/CD8 su transmembranski glikoproteini, lanovi Ig superfamilije.

CD4 se ekspresuje kao monomer, na površini perifernih T limfocita, timocita, a prisutan je

i na mononuklearnim fagocitima i nekim dendritskim elijama. Ima 4 ekstracelularna Ig-slinadomena, hidrofobni transmembranski domen, i citoplazmatini rep (38 ostataka aminokiselina).

Preko svoja dva N-terminalna Ig-slina domena, veže se za 2 domen MHC molekula klase II.

CD8 su disulfidno povezani heterodimeri, sastavljeni od CD8 i CD8 lanca. Oba lanca

imaju jedan ekstracelularan Ig-slian domen, hidrofobni transmembranski region, i

citoplazmatini rep (25 aminokiselinskih ostataka). Ig domen CD8 se vezuje za nepolimorfni 3

domen MHC molekula klase I. Neke elije ekspresuju CD8 homodimere (izgleda da imaju

drugaciju funkciju), dok je populacija T limfocita koja ekspresuje CD8 heterodimer mnogo vea.

3.5.6.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora

CD8 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase I. Kao što je poznato, ova klasa

molekula se ekspresuje na svim nukleiranim elijama i uglavnom je vezana za prezentaciju

intracelularnih antigena. CD4 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase II, koji se

ekspresuju na APCs i vezani su za prezentaciju ekstracelularnih antigena. T elije koje ekspresuju

CD4 koreceptor (i ograniene su na interakciju sa MHC II molekulama) produkuju citokine,

nazivaju se T elije pomonice. T limfociti koji ekspresuju CD8 koreceptor (i ogranieni su na

interakciju sa MHC I molekulama) su citotoksini (citolitini; CTL) T limfociti ukljueni u

eliminaciju intracelularnih antigena. CD4/CD8 doprinose transdukciji signala nakon prepoznava

nja antigena. Signalni put koji se aktivira vezivanjem

za CD4/CD8 koreceptore se ukljuuje u aktivaciju

specifine familije Src kinaza tzv. Lck koja je

nekovalentno vezana za citoplazmatini rep CD4 i

CD8 koreceptora. Prenos signala je posredovan Lckkinazom. Veza CD4/CD8 i Lck je neophodna za

maturaciju i aktivaciju T limfocita. Kada TCR

prepozna antigen, CD4/CD8 koreceptori se vežu za

odgovarajue MHC molekule. Ovo vezivanje

približava koreceptor i njegovu Lck, do TCR komple-

ksa, a Lck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u

CD3 i lancima i tako inicira aktivaciju T elija.Slika 3.24. Lck signalni put u T limfocitima.Lck je tirozin kinaza (Src familija) povezana sa citoplazmatinim repom CD4 i CD8.

CD4/CD8 asocirana Lck je neophodna za maturaciju i aktivaciju T elija.







79

Sem uloge u signalnoj transdukciji, CD4/CD8 koreceptori, poveavaju adheziju T limfocita za

ciljnu eliju (eliju koja prezentuje antigen+MHC I/II).

3.5.7. CD28 i CTLA-4: receptori koji regulišu aktivaciju T elija

Kao što je poznato, za proliferaciju i diferencijaciju B i T limfocita u efektorne elije su potrebna

dva ekstracelularna signala. Prvi signal je obezbedjen vezivanjem za antigen-specifian receptor (u

sluaju T elija to je vezivanje peptid-MHC molekula za TCR i koreceptore CD4/8). Drugi signal je

obezbedjen vezivanjem za molekule koje imaju zajednini naziv kostimulatori. Najbolje definisani

kostimulatori za T limfocite su proteini B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86) koji se ekspresuju na

profesionalnim APCs. Receptor za ove proteine na T limfocitima je molekula CD28. Ovaj receptorse ekspresuje na CD4 T elijama (~90%) i na CD8 T elijama (~ 50% kod ljudi i na svim naivnim

elijama pacova). CD28, je membranski protein koji

obezbedjuje sekundarni signal potreban za aktivaciju T

limfocita tj. zajedno sa signalima poreklom od TCR

kompleksa uestvuje u aktivaciji T elija. CD28 je

homodimer izgradjen od 2 lanca koji imaju Ig-sline

domenime.

Slika 3.25. Interakcija B7 liganda i CD28/CTLA-4 receptora

Vezivanje B7 molekula (APCs) za CD28 signal

koji indukuje ekspresiju anti-apoptotikih

proteina, stimuliše produkciju faktora rasta i

drugih citokina i stimulise proliferaciju i

diferencijaciju T elija. Vezivanjem B7 molekula

sa membrane APCs, za CD28 receptore T

limfocita, indukuje se ekspresija anti-

apoptotikog proteina, stimuliše produkcija

faktora rasta i drugih citokina, i promoviše

proliferacija i diferencijacija T elija.

Slika 3.26. Stimulacija proliferacije i diferencijacije T limfocita







80

Na T limfocitima je otkriven još jedan receptor za B7 molekule, a to je CTLA-4 (CD152). Ovaj

receptor je strukturno homolog CD28 receptorima, ali se ekspresuje na aktiviranim CD4+ i CD8+ T

elijama. Funkcija ovog receptora je da inhibiše aktivaciju T elija tj. uestvuje u terminaciji

odgovora T limfocita.

3.5.8. CD45 i CD2: molekuli koji uestvuju u signalnoj transdukciji

CD45 je protein, tirozin fosfataza, koja ima

ulogu u regulaciji tirozin kinaza tokom rane

aktivacije T elija.

CD2 je membranski molekul T limfocitakoji doprinosi adheziji i ima ulogu u

prenosu signala.

Slika 3.27. Pomone molekule

3.5.9. Adhezione molekule T limfocita: integrini, selektini, CD44

Neke pomone molekule T limfocita, funkcionišu kao intercelularne adhezione molekule koje

imaju znaajnu ulogu u interakciji T

elija sa APCs, kao i u procesu migracije T limfocita namesto infekcije.

Integrini su heterodimerni proteini, koji se ekspresuju na leukocitima, a nijhovi citoplazmatini

domeni su u kontaktu sa citoskeletom. Postoje dve podfamilije integrina. Pripadnici obe familije

ekspresuju konzervisane lance (1 ili CD18 i 2 ili CD29), povezane sa razliitim lancima.

Naješe adhezivne molekule koje se ekspresuju na T limfocitima su 1 integrini, takodje poznati i

kao VLA (engl . very late activation) i 2 integrin, esto zvan i LFA-1 (engl . leukocyte function-

associated antigen-1). Integrini T elija LFA-1 i VLA-4 se vezuju za ICAMs i VCAM-1 na površini

drugih elija. Ove adhezivne interakcije su znaajne za stabilnu interakciju T elija i APCs, kao i







81

za migraciju T elija iz krvi u tkiva. Integrini su odgovorni i za zadržavanje antigen stimulisanih T

elija u limfoidnim organima, kao i na perifernim mestima infekcije.

Tabela 3.8. Integrini

Subjedinice I me Ligandi Funkcije

1 1 VLA-1 (CD49aCD29) Kolagen, laminin Adhezija elija za matriks

2 VLA-2 (CD49bCD29) Kolagen, laminin Adhezija elija za matriks

3 VLA-3 (CD49cCD29) Fibronektin, kolagen, laminin Adhezija elija za matriks

4 VLA-4 (CD49dCD29) Fibronektin, VCAM-1, MadCAM-1 Adhezija elija za matriks;“homing”; kostimulacija T elija?

5 VLA-5 (CD49eCD29) Fibronektin Adhezija elija za matriks

6 VLA-6 (CD49fCD29) Laminin Adhezija elija za matriks

7 CD49gCD29 Laminin Adhezija elija za matriks8 CD49hCD29 ? ?

v CD51fCD29 Vitronektin, fibronektin Adhezija elija za matriks

2 L CD11aCD18(LFA-1) ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 Adhezija leukocita naendotelijum; T elija-APCadhezija; kostimulacija T el

M CD11bCD18(MAC-1, CR3) iC3b, fibrinogen, factor X, ICAM-1

Adhezija leukocita i fagocitoza;adhezija elija za matriks

X CD11cCD18(p150,95;CR4) iC3b; fibrinogen Adhezija leukocita i fagocitoza;adhezija elija za matriks

3 IIb GPIIb/ IIIa (CD41CD61) Fibrinogen, f ibronektin, vonWillebrand factor, vitronektin,trombospondin

Adhezija i agregacija trombocita

V Vitronektin receptor (CD51CD61)

Fibrinogen, fibronektin, vonWillebrand factor,trombospondin,fibronektin,osteopontin, kolagen

Adhezija elija za matriks

4 6 CD49fCD104 Laminin Adhezija elija za matriks

5 Vitronektin Adhezija elija za matriks

6 Fibronektin Adhezija elija za matriks

7 LPAM-1 Fibronektin, VCAM-1, MadCAM-1 Vraanje limfocita u mukozna

limfoidna tkivaE HML-1 E-kadherin Zadržavanje intraepitelijalnih T

elijaSkraenice: APC, antigen prezentujue elije; iC3b, C3b inaktivisan; ICAM, intracelularna adheziona molekula; VCAM-1, “vascular cell adhesion molecule-1”; LFA,“leukocyte function-assosiated antigen”; MadCAM-1, “mucosal addressin cell adhesion molecule-1”

Aviditet integrina za svoje ligande se poveava nakon delovanja hemokina na T elije, kao i posle

stimulacije T elija kroz TCR kompleks. Ekspresija integrina se poveava posle TCR stimulacije, a

ekspresija liganada za integrine na APCs, je poveana posle stimulacije sa inflamatornim

citokinima.







82

Selektini su karbohidratni vezujui proteini, prisutni na membranei leukocita, endotelijalnih

elija i trombocita. Osnovna funkcija im je da regulišu migraciju leukocita u razliita tkiva.

Selektin koji se ekspresuje na leukocitima (L-selektin) je prisutan i na naivnim T limfocitima, i

njegova ekspresija se smanjuje kod aktiviranih oblika. L-selektin je ukljuen u navodjenje naivnihlimfocita u limfne vorove, tokom njihove migracije. Dva druga selektina tzv. E-selektin (koji se

ekspresuje na endotelnim elijama) i P-selektin (na trombocitima i endotelnim elijama) se brzo

produkuju na endotelnim elijama nakon aktivacije sa citokinima tokom inflamatorne reakcije.

CD44 su odgovorni za retenciju T elija u ekstravaskularnom prostoru na mestima infekcije, kao i

za vezivanje aktiviranih i memorijskih elija za endotel u tkivima koja su zahvaena inflamacijom.

3.5.10. Efektorne molekule T limfocita

T limfociti ekspresuju mnoge druge molekule koje su ukljuene u njihove efektorne funkcije.

Aktivirani CD4+ T limfociti ekspresuju površinski protein, CD40 ligand (CD40L ili CD154) koji se

vezuje za CD40 receptor na B limfocitima, makrofagama, dendritskim elijama i endotelnim

elijama i aktivitra ih. Drugim reima CD40L je znaajan medijator mnogih efektornih reakcija T

elija pomonica, kao što je stimulacija B elija da produkuju antitela i aktivacija makrofaga daunište fagocitirane mikroorganizme.

Aktivirane T elije, takodje ekspresuju ligand za Fas receptor. Vezivanje Fas-a, za a Fas ligand T

elija, dovodi do apoptoze T limfocita. Ovaj proces ima naroit znaaj u eliminaciji T limfocita,

nakon ponavljane stimulacije antigenima. Angažovanje Fas liganda, takodje, obezbedjuje jedan od

puteva kojim CTLs eliminišu ciljne elije.







83

AKTIVACIJA I REGULACIJA T I B

LIMFOCITA 044.1. AKTIVACIJA T LIMFOCITA

Vezivanje antigena za svoje receptore zajedno sa drugim stimulusima, aktivira ekspanziju i

diferencijaciju naivnih T limfocita kao i efektorne funkcije diferenciranih limfocita. Razliite

populacije T elija se razlikuju u nainu stimulacije kao i razliitim modelom odgovora na tu

stimulaciju. U daljem tekstu e ukratko biti sumirane generalne karakteristike aktivacije T

limfocita.

Naivni T limfociti prepoznaju antigene u perifernom limfatinom voru, i tu se aktiviraju.

Aktivacija limfocita vodi ka ekspanziji antigen-specifine limfocitne populacije i

diferencijacije elija na efektorne i memorijske.

Efektorne T elije prepoznaju antigene u limfoidnim organima ili u nelimfoidnom tkivu i tu

se aktiviraju i postaju sposobne za ispoljavanje efektornih funkcija.

Da bi se T limfociti aktivirali oni moraju da prepoznaju antigen iskazan na APCs,

kostimulatore (drugi signal), i citokine produkovane iz APCs kao i iz drugih T limfocita.

Da bi se aktivirali naivni T limfociti, oni moraju da prepoznaju antigene na dendritskim

elijama, dok efektorne T elije mogu da odgovore na antigene prezentovane na membrani

razliitih APCs.







84

Slika 4.1. Aktivacija naivnih i efektornih T limfocita. Antiigeni koje dendritske elije transportuju u limfne voroveprepoznaju naivni T limfociti koji recirkulišu kroz ove limfnevorove. T elije se aktiviraju da bi se diferencirale u efektornei memorijske elije koje mogu ostati u limfoidim organima, ili,mogu migrirati u nelimfoidna tkiva. Na mestu infekcije, efekto-

rne elije se opet aktiviraju antigenima i obavljaju razliitefunkcije.

4.1.1. Funkcionalni odgovor T limfocita

Odgovor T limfocita na prepoznavanje antigena, delovanje kostimulatora i drugih signala se sastoji

od sekrecije citokina, proliferacije i diferencijacije.

Jedan od prvih odgovora T elija na prepoznavanje antigena, je sekrecija proteina tzv. citokina. U

T elijama signal, koji potie od prepoznavanja antigena i kostimulatora, aktivira transkripciju

nekoliko citokinskih gena koja vodi ka sintezi ovih proteina. Interleukin, IL-2 je tipian citokinski

protein koji se produkuje iz naivnih T elija i funkcioniše kao faktor rasta za T elije. U zavisnosti

od razliitih uslova aktivacije, naivne T elije se mogu diferencirati u razliite grupe elija koje

produkuju razliite citokine i izvode razli

ite efektorne funkcije. Na primer, T H1 i T H2 populacijeefektornih CD4+ elija pomonica produkuju citokine koji aktiviraju makrofage i B limfocite u

efektornoj fazi elijskog i humoralnog imuniteta. Aktivirane T elije se mogu identifikovati preko

ekspresije novosintetisanih površinskih proteina tzv. aktivacionih markera (npr. lanac IL-2

receptora).







85

Slika 4.2. Faze odgo-vora T elija.Prepoznavanje antigenaod strane T elija indu-kuje produkciju citokina(IL-2), a potom klonalnuekspanziju kao rezultatIL-2 indukovane autokri-ne proliferacije elija, i

na kraju diferencijaciju Telija u efektorne ilimemorijske elije. Uefektornoj fazi odgovo-ra, efektorne CD4+ Telije odgovaraju naantigen produkujui cito-kine koji indukuju akti-vaciju makrofaga i Blimfocita, dok efektorneCD8+ tj. CTLs odgova-

raju tako što ubijajudruge elije.

Proliferacija T limfocita, koja se aktivira kao odgovor na prepoznavanje antigena, nastaje kao

rezultat autokrinog delovanja citokina koji stimulišu rast. Citokini se produkuju u eliji koja je

aktivirana, a ta ista elija ekspresuje i površinske receptore za te citokine. Osnovni autokrini

faktor rasta za veinu T elija je IL-2. Produkcija IL-2, kao i ekspresija receptora za IL-2 je

stimulisana prepoznavanjem antigena. elija koja je prepoznala antigen, vezuje IL-2 koji je

sekretovala, i tako, kao odgovor na sopstvene citokine, proliferiše. IL-2 nije jedini faktor rasta za T

elije. APCs i druge nelimfoidne elije, produkuju citokin IL-15, koji stimuliše proliferaciju CD8+ T

elija, posebno memorijskih elija iz CD8+ subpopulacije. Rezultat proliferacije naivnih T elija je

ekspanzija klona - iz malog pula naivnih antigen-specifinih limfocita, generiše se veliki broj elija

potrebnih za eliminaciju antigena.

Nakon stimulacije sa antigenom i proliferacije, neke od proliferisanih elija se diferenciraju u

efektorne elije koje eliminišu antigene i mogu da aktiviraju druge imune elije. Neke od antigen-stimulisanih T elija se razvija u dugo-živee, funkcionalno mirne memorijske elije.





86

Nakon eliminacije antigena, T elijski odgovor opada tj. vraa se na bazalni nivo. S obzirom da je

antigen eliminisan, limfociti su lišeni stimulusa neophodnih za njihovo preživljavanje

(obezbedjenih antigenom, kostimulatorima i citokinima produkovanim tokom inflamatorne

reakcije), veina antigen-stimulisanih elija umire apoptozom.

4.1.2. Uloga kostimulatora u aktivaciji T limfocita

Kao što je ve više puta izneto, za proliferaciju i diferencijaciju T limfocita potreban je signal od

APCs tzv. kostimulatora kao i specifian signal poreklom od antigena. Najbolje opisan

kostimulatorni put aktivacije T elijaukljuuje interakciju površinske mo-

lekule T elija, CD28, i kostimula-

tornih molekula ekspresovanih na

APCs B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86).

Slika 4.3. Funkcije kostimulatora u aktivaciji T

elija.A - APCs koja nije aktivirana skoro da ne ekspresujekostimulatore ili ih ekspresuje u maloj koliini te nemože da aktivira naivne T elije.B – Mikrobi, kao i c itokini produkovani tokom urodjenogimunog odgovora aktiviraju APCs da ekspresuju kosti-mulatore, kao što je B7. Na ovaj nain APCs postajusposbne da aktiviraju naivne T elije. Takodje, aktivi-rane APCs produkuju citokine (IL-12) koji stimulišu dife-rencijaciju naivnih T elija u efektorne.

Preko CD28 elija dobija signale koji pojaavaju odgovore na antigen, stimulišu produkciju

citokina kao što je IL-2, i diferencijaciju naivnih elija u efektorne i memorijske.

Inicijacija T elijskog odgovora “u pravo vreme i na pravom mestu” je omoguena regulacijom

ekspresije kostimulatora. Ekspresija B7 kostimulatora je stimulisana mikrobijalnim produktima

npr. endotoksinom i citokinima kao što je INF- koji se produkuju tokom nespecifinog imunog

odgovora. Kada su T elije aktivirane, one ekspresuju molekul CD40L, koji se veže za CD40 na

membrani APCs i inicira ekspresiju B7 kostimulatora na APCs.





87

Slika 4.4. B7 koaktivacija.A – APC koja nema kostimulatora ne stimuliše odgovore

CD4+ i može indukovati anergijuT elija (anergija je stanje ukome nema odgovora na antigensku stimulaciju i esto senaziva klonska anergija jer predstavlja nesposobnostkolonova T i B elija da odgovore na antigen; engl. anergy)B, C, D, E – Ekspresija B7 molekula indukovana transfe-kcijom gena (B) ili improvizacija stimulatornog signala saanti-CD28 antitelom (C) prouzrokuje aktivaciju T elija.Slino, uzajamno povezivanje TCR kompleksa sa antitelomspecifinim za TCR/CD3 kompleks ne aktivira T elije (D),ali dodatak aktivacionog anti-CD28 antitela indukujeodgovor T elija.

Eksperiment prikazan na slici pokazuje da je B7:CD28kostimulacija medjusobno povezana.

Slika 4.5. Uloga CD40 u aktivaciji T elija.Prepoznavanje antigena od strane T elija indukuje ekspresiju CD40 liganda (CD40L). CD40L vezuje CD40 na antigen-prezentujuim elijama(APCs) i stimuliše ekspresiju B7 molekula kostimulatora i sekreciju citokina, što aktivira T elije. Zakljuak: CD40 pravi APCs “boljim” APCs. T elijemogu ekspresovati CD40L i bez stimulacije, ali to zahteva B7:CD28 kostimulaciju, kao i antigen. Prema tome B7 i CD40 se uzajamno stimulišu.

4 1 3 Si l t d k ij k TCR k l k





88

4.1.3. Signalna transdukcija preko TCR kompleksa

Cilj aktivacije kaskada signalnih reakcija u T elijama, je koordinisana aktivacija transkripcije

gena u naivnim elijama, a od ijih produkata zavisi odgovor i funcije aktiviranih T elija. Signalniput koji se aktivira stimulacijom TCR kompleksa je najveim delom definisan in vitro analizama na

razliitim populacijama T elija. Dobijeni rezultati su definisali osnovne karakteristike signalne

transdukcije u T elijama:

multiplim vezivanjem za TCR i koreceptore, aktivira se signalni put TCR-a;

kao odgovor na prepoznavanje antigena dolazi do grupisanja membranskih receptora (engl.

clustering), fosforilacije tirozinskih ostataka nekoliko proteina, i aktivacije adapternih

proteina; signali TCR kompleksa koordinativno aktiviraju nekoliko biohemijskih puteva: signalni

put.

Ras-MAP kinaza, put

protein kinaze C, i

kalcijum-kalcineurin

signalni put. Aktivacija

ovih enzima se dešava vrlo

brzo nakon stimulacije

TCR-a (nekoliko minuta), a

aktivacija svakog od ovih

puteva indukuje

transkripcione faktore koji

stimulišu ekspresiju

razliitih gena T elija

(proces koji traje nekolikosati).

Slika 4.6. Signalni putevi koji se aktivirajuaktivacijom TCR kompleksa.Vezivanje TCR i koreceptora za komplekspeptid-MHC na APCs inicira dogadjaje napoetku signalnog puta, što dovodi do fosfo-

rilacije -lanca, vezivanja i aktivacije ZAP-70,fosforilacije adapternih proteina i aktivacije ra-zliitih elijskih enzima, što onda aktiviratranskripcione faktore koji stimulišu ekspresijurazliitih gena ukljuenih u odgovor T elija.

U d t k t biti i i l t TCR i l j k k di





89

U narednom tekstu e biti opisani glavne etape u TCR signalnoj kaskadi.

4.1.3.1. Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacija protein

kinaza i adapternih proteina

Odmah nakon prepoznavanja antigena, na membrani T limfocita se pokreu procesi koji grupišu

molekule koji uestvuju u signalnoj transdukciji.

Formiranje imunološke sinapse

Kada TCR kompleks prepozna MHC-peptid na APCs dolazi do brze mobilizacije membranskih

proteina, i intracelularnih signalnih molekula, na mesto kontakta APCs i T elija. Region fizikog

kontakta izmedju T elija i APCs se naziva imunološka sinapsa. Molekuli na membrani T elija sebrzo mobilišu oko centra sinapse koja ukljuuje: TCR kompleks (TCR, CD3, lance), CD4 ili CD8

koreceptore, receptore za kostimulatore (kao što su CD28), kao i enzime i adapterne proteine koji

su povezani sa citoplazmatinim repom transmembranskih receptora. Integrini se nalaze na

periferiji sinapse, gde doprinose stabilizaciji kontakta izmedju T elije i APC. Mnoge sinapse se

nalaze u regionima elijske membrane koji se razlikuju u lipidnom sastavu od ostalih regiona

membrane – mikrodomeni obogaeni glikolipidima. Prepoznavanje antigena stimuliše

organizaciju membranskih molekula u sinapsi i angažovanje signalnih puteva koji aktiviraju

proteine citoskeleta.

Aktivacija tirozin kinaza

Odmah nakon organizacije membranskih molekula i formiranja sinapse dolazi do aktivacije tirozin

kinaza7 povezanih sa citoplazmatinim domenima molekula CD3 i koreceptornih proteina, kao i

fosforilacija tirozna u CD3 i lancima. Citoplazmatini regioni CD3 i lanaca sadrže peptidnu

sekvencu tzv. ITAM (engl . immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) koja e biti

fosforilisana Lck-om, kinazom koja pripada Src familiji tirozin kinaza, i koja je povezana sacitoplazmatinim repom CD4/CD8 koreceptora8. Lck može biti aktivirana autofosforilacijom, a

aktivna Lck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i lancima. Još jedna kinaza je fiziki

povezana sa TCR kompleksom. To je Fyn, kinaza koja je povezana sa CD3 proteinom i ima slinu

ulogu kao Lck.

7 Tirozin kinaze su enzimi koji katališu fosforilaciju ostatka tirozina u razliitim proteinskim supstratima.8 Kada se TCR veže za peptid-MHC kompleks, vezae se i CD4 ili CD8 koreceptori za nepolimorfne regione molekula klase II ili I vezivanje e

približiti citoplazmatine repove CD4/CD8 koreceptora, ITAM regionima, CD3 i lanaca.





90

Slika 4.7. Šematski prikaz formiranja imunološke sinapse.Pre prepoznavanja antigena razliiti receptori na T elijama i njihovi ligandi na APC su dispergovani/rasuti po površini plazma membrana ove dve elije. Kada T elijaprepozna antigen izložen i prezentovan od strane APC, selektovani receptori i njihovi odgovarajui ligandi se redistribuiraju u definisanu zonu kontakta elija-elijaformirajui sinapsu. Molekule u centralnom delu sinapse formiraju centralni supramolekularni aktivacioni klaster (engl. central SupraMolecular Activation Cluster -

cSMAC), dok molekuli na periferiji sinapse formiraju periferni supramolekularni aktvivacioni klaster (engl. peripheral SupraMolecular Activation Cluster - pSMAC).





91

Slika 4.8. Fosforilacija tirozina u tokuaktivacije T elija.Nakon prepoznavanja antigena, CD4-povez-ana Lck postaje aktivna i fosforiliše ITAM-e

CD3 i lanaca. ZAP-70 se veže za fosfotiro-

zine lanca i fosforiliše ih i aktivira. AktivniZAP-70 fosforiliše tirozine u razliitimadaptornim molekulama kao što je LAT (B). Adapterni protein postaje vezno mesto za

elijske enzi-me kao što je PLC1 i proteinekoji aktiviraju Ras i MAP kinaze (C), a ovienzimi aktiviraju razliite elijske odgovore.

Fosforilisani tirozin u okviru ITAM sekvence postaje vezno mesto (“docking site”) za tirozin kinazu

ZAP-70 (engl . -associated protein of 70-kD). ZAP-70 sadrži dva konzervisana regiona koja se vežu

za fosfotirozine ITAM sekvenci lanaca. Vezani ZAP-70 postaje substrat za susednu Lck, koja

fosforiliše tirozine ZAP-70. Jednom aktivirani ZAP-70, može da se autofosforiliše kao i da

fosforiliše brojne signalne molekule. Kritino mesto za aktivaciju “downstream” signalnih

molekula je aktivacija ZAP-70. Da bi se dostigao kritian nivo angažovanja ZAP-70 molekula

potrebna je njegova multipla aktivacija i multipla fosforilacija ITAMs-a lanaca9.

9 Potreba da se jedna T elija veže za antigen više puta svaki in vezivanja dovodi do ponovne fosforilacije ITAM-a lanaca, što vodi kamultiplom angažovanju ZAP-70 molekula.

Još jedna kinaza koja ima ulogu u aktivaciji T elija je PI-3 kinaza (engl phosphatidylinositol-3)





92

Još jedna kinaza koja ima ulogu u aktivaciji T elija je PI-3 kinaza (engl . phosphatidylinositol-3),

koja fosforiliše inozitol-lipide povezane sa membranom. Ovaj enzim se regrutuje aktivacijom TCR-

a i adapternih proteina, a on generiše nastajanje fosfatidilinozitol trifosfata (PIP3) od membranskih

bifosfata. PIP3 je vezno mesto za fosfolipazu C kao i za Itk kinazu (i Btk u B limfocitima). PI-3kinaza je ukljuena i u signaling koji potie od CD28 molekula. Aktivnost kinaza u T elijama je

kontrolisana delovanjem tirozin fosfataza. Tirozin fosfataze mogu da defosforilišu tirozinske

ostatke, i na taj nain inhibišu ili stimulišu enzimsku aktivnost kinaza. TCR kompleks angažuje

dva tipa fosfataza. To su SHP-1 i SHP-2, koje funkcionišu tako što inhibišu signalnu transdukciju

uklanjanjem fosfatne grupe iz kljunih signalnih molekula.

Regrutovanje i aktivacija adapternih proteinaAktivirani ZAP-70 fosforiliše nekoliko adapternih proteina koji aktiviraju/vežu signalne molekule.

Adapterni proteini10 vežu signalne molekule i organizuju ih u specifiane elijske kompartmane

(regione) i tako promovišu aktivaciju odredjenog signalnog puta. Za aktivaciju TCR signalne

kaskade, neophodna je aktivacija ZAP-70 i fosforilacija LAT adapternog proteina (engl . linker

activation of T cells). Fosforilisani tirozini LAT molekule su vezno mesto za SH2 domene drugih

adapternih molekula i enzima ukljuenih u nekoliko signalnih kaskada. Aktivirani LAT direktno

vezuje fosfolipazu C1 (kljuni enzim aktivacije T elija), i koordiniše regrutovanje nekoliko drugih

adapternih proteina (SLP-76 kao i Grb-2) u imunološku sinapsu.

4.1. 3.2. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima

Ras je pripadnik familije guanozin nukleotid-vezujuih proteina (mali G proteini) koji su ukljueni

u aktivaciju razliitih procesa u mnogim elijama. On je povezan sa elijskom membranom preko

kovalentno vezanih lipida. U neaktivnoj formi, vezno mesto Ras-a za nukleotide guanina je

okupirano guanozin-difosfatom (GDP). Kada se vezani GDP zameni guanozin-trifosfatom (GTP),

Ras se konformaciono izmeni i može da regrutuje/aktivira razliite enzime.Kada ZAP-70 fosforiliše LAT, za LAT se vezuje Grb-2 (preko svog SH2 domena). Grb-2

angažuje Ras GTP/GDP faktor razmene, nazvan Sos, koji katališe zamenu GDP sa GTP

molekulom i tako nastaje forma Ras-a vezana sa GTP-om (RasGTP). RasGTP funkcioniše kao

alosterni aktivator enzima zvanih MAP kinaze (mitogen activated protein). U T elijama postoje tri

glavne MAP kinaze: ERK, JNK i p38.

10 Adapterni proteini sadrže strukturne motive/domene kojim se vezuju za druge proteine. Ovi motivi ukljuuju motive koji vežu Src 2 i 3 domene

(SH2 i SH3), fosfotirozin-vezujue domene (PTB) i PH domene.

RasGTP stimuliše aktivaciju MAP kinazne kaskade koja ukljuuje najmanje tri razliite





93

RasGTP stimuliše aktivaciju, MAP kinazne kaskade, koja ukljuuje najmanje tri razliite

kinaze, a svaka od njih fosforiliše/aktivira sledeu u kaskadi. Aktivacija, MAP kinazne kaskade

dovodi do aktivacije ERK-a (engl . extracellular receptor-activated kinase) koji fosforiliše protein

Elk, koji stimuliše Fos, komponentu neophodnu za aktivaciju transkripcionog faktora AP-1(activation protein-1).

Paralelno sa aktivacijom Ras-a, TCR-povezane kinaze takodje mogu da aktiviraju i drugi

GTP/GDP izmenjivaki protein, tzv. Vav, koji deluje na drugi “mali G protein” – Rac. RacGTP

inicira aktivaciju enzimske kaskade, koja rezultuje aktivacijom MAP kinaze, zvane JNK (engl . c-

Jun N-terminal kinase). Aktivirana

JNK fosforiliše c-Jun, drugu ko-

mponentu neophodnu za aktiva-ciju AP-1 transkripcionog faktora.

Trei pripadnik familije MAP ki-

naza, je p38. Ova kinaza se

takodje aktivira RacGTP siste-

mom, a rezultat njenog angažova-

nja je aktivacija razliitih transkri-

pcionih faktora.

Slika 4.9. Ras-MAP signalni put u aktivaciji Tlimfocita.ZAP-70 se aktivira prepoznavanjem antigena (videti sliku4.8.), fosforiše adapterne proteine vezane za membranu,što onda dovodo do vezivanje drugog adaptera Grb-2.

ZAP-70 fosforiliše Grb-2 pravei mesto za privlaenje Sosfaktora za GTP/GDP razmenu. Sos konvertuje RasGDPu RasGTP (nije prikazan) koji aktivira kaskadu enzima,što kulminira aktivacijom MAP kinaze koja se zove ERK

kinaza. Paralelan Rac-zavistan put koji se naziva stresom-aktiviranog proteina (engl . Stress-Activated Protein - SAP),ili SAP-zavisni kinazni put generiše drugu aktivnu MAPkinazu koja se zove JNK kinaza (nije prikazano na slici).

4.1.3.3. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovan signalni put u T limfocitima

TCR signalni put ukljuuje i aktivaciju 1 izoforme fosfolipaze C (PLC1), a produkti nastali

hidrolitikim razlaganjem membranskih lipida aktiviraju transkripcione faktore u T elijama. PLC1

je citosolni enzim specifian za inozitol fosfolipide. Fosforilisani LAT, aktivira PLC1, koja katališe

hidrolizu membranskih fosfolipida tj. fosfatidilinozitol 4,5-bifosfata (PIP2). Nastali produkti

inozitol 1 4 5-trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) aktiviraju dva odvojena signalna puta u T





94

inozitol 1,4,5 trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) aktiviraju dva odvojena signalna puta u T

elijama.

IP3 difunduje kroz citoplazmu do endoplazmatskog retikuluma, gde se vezuje za receptor i

stimuliše oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog retikuluma, poveavajui nivo slobodnog Ca++ ucitoplazmi sa 100 nM do 600 ili ak 1000 nM. Ca++ se vezuje za kalmodulin, a kompleks Ca++ -

kalmodulin aktivira nekoliko enzima, ukljuujui i serin/treonin fosfatazu – kalcineurin.

DAG je hidrofobna molekula koja ostaje u elijskoj membrani, na mestu gde je formirana.

Kombinacija povišenog nivoa intracelularnog Ca++ i DAG-a, aktivira PKC koja je povezana sa

elijskom membranom. Akti-

virana PKC se konforma-

ciono menja, tako da njenokatalitiko mesto postaje

dostupno supstratu.

Slika 4.10. Signaling preko metabolizmamembranskih inozitol fosfolipida.LAT (adapterni protein na T elijama koji sefosforiliše tokom njihove aktivacije) se

vezuje za PLC1 aktiviranu fosforilacijomsa ZAP-70 i drugim kinazama (npr. Itk).

Aktivna PLC1 hidrolizuje membranski PIP2

i stvara IP3 (stimuliše poveanje kalcijuma ucitosolu) i DAG (aktivira enzim PKC).Poveanje citosolskog kalcijuma i aktivacija

PKC potom aktivira razliite transkripcionefaktore, što rezultira formiranjem raznolikihelijskih odgovora.

4.1.3.4. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitima

Enzimi angažovani TCR signalnom kaskadom, aktiviraju transkripcione faktore, koji se vezuju za

regulatorne domene brojnih gena u T elijama, i aktiviraju njihovu transkripciju. Citoplazmatini

putevi signalne transdukcije vode ka aktivaciji efektornih enzima, kao što su kinaze ERK, JNK iPKC, kao i fosfataza kalcineurin. Ovi enzimi doprinose aktivaciji transkripcionih faktora kao što

su NFAT, AP-1 i NF-B koji funkcionišu kao stimulatori ekspresije gena u antigen-stimulisanim T





95

su NFAT, AP 1 i NF B koji funkcionišu kao stimulatori ekspresije gena u antigen stimulisanim T

elijama.

Slika 4.11. Aktivacija transkripcionih faktora u Telijama.Veliki broj signalnih puteva konvergira u antigenima-stumulisanim T elijama,u cilju aktivacije i generisanja transkripcionih faktora koji stimulišu ekspresiju razliitihgena (u ovom sluaju IL-2 gena). Kalcijum–kalmodulinom aktivirani NFAT, kao i Ras i Rac signalni putevi generišu dva komponenete AP-1. Manje se zna o linku

izmdju TCR signala i aktivacije NF-kB (NF-kB je prikazan kao kompleks od dve subjedinice koje su tipi no p50 i p65 proteini nazvani prema njihovoj molekulskoj

veliini u kilodaltonima). PKC je važna u aktivaciji T elija, a PKC je posebno važna u aktivaciji NF-kB. Svi ovi transkripcioni faktori funkcionišu koordinativno uregulaciji genske ekspresije. Obratiti pažnju na injenicu da je prikazano da razliiti signalni putevi aktiviraju jedinstvene trankripcione faktore, ali postoji i razumljivopreklapanje pojedinih signalnih puteva, pa svaki signalni put može da igra ulogu u aktivaciji velikog broja transkripcionih faktora.

NFAT (engl . nuclear factor of activated T cells) je transkripcioni faktor neophodan za ekspresiju





96

( g ) j p p p j

IL-2, IL-4, TNF i drugih citokinskih gena. On je prisutan u inaktivnoj, serin-fosforilisanoj formi u

citoplazmi nestimulisanih T limfocita. NFAT se aktivira kalcijum-kalmodulin zavisnom fosfatazom,

kalcineurinom. Kalcineurin defosforiliše citoplazmatski NFAT, i na taj nain izaziva njegovutranslokaciju u nukleus.

AP-1 je transkripcioni factor nadjen u mnogim tipovima elija. AP-1 je ime za familiju DNA-

vezujuih faktora izgradjenih od dimera dva proteina koja se medjusobno vežu preko zajednikih

strukturnih motiva tzv. “leucine zipper”. AP-1 faktor, koji je najbolje opisan, se sastoji iz Fos i Jun

proteina.

NF-B su homodimerni ili heterodimerni proteini, koji su homologi sa proto-onkogenima

znaajnim za transkripciju mnogih gena, u razliitim tipovima elija. NF-B je prisutan u

citoplazmi u kompleksu sa proteinima – inhibitorima B (IB) koji spereavaju njegovu

translokaciju u nukleus. Signalne kaskade PKC, MAP kinaze, kao porast intracelularnog

kalcijuma stimulišu fosforilaciju IB kinaze koja fosforiliše IB. Za fosforilisanu formu IB se

vezuju peptidi ubikvitina, koji je obeležavaju za proteolitiku degradaciju u proteazomima. Nastali

NF-B se translocira u nukleus, gde doprinosi aktivaciji citokinskih gena i gena za receptore

citokina.

4.2. AKTIVACIJA B LIMFOCITA





97

4.2.1. Generalne karakteristike humoralnog imunog odgovora

Proces aktivacije B elija i nastajanje elija sposobnih da produkuju antitela je proces koji

se sastoji iz nekoliko faza. Kao što je ve napisano, antigen-specifini B limfociti sazrevaju

u kosnoj srži a zatim naseljevaju periferne limfne vorove, koji su i mesto njihovog susreta

sa stranim antigenom. Humoralni imuni odgovor se inicira prepoznavanjem antigena od

strane antigen-specifinog klona B limfocita. Antigen se vezuje za membranske IgM i IgD

receptore, na naivnim Belijama, i aktivira ih. Aktivacija B

elija se sastoji od serije

odgovora koji vode ka ekspanziji antigen-specifinog klona tj. proliferaciji i diferencijaciji

pri emu nastaju efektorne elije koje sekretuju antitela i memorijske elije. Neke

aktivirane B elije poinju da produkuju antitela koja su drugaija od IgM i IgD tj. da

produkuju druge izotipove antitela – “heavy chain class/isotype switching”.

CD4+ T elije pomonice prepoznaju proteinske antigene i imaju važnu ulogu u aktivaciji B

limfocita. Termin “pomonice” proizilazi iz potrebe da ove elije stimulišu ili pomognu B

limfocitima da produkuju antitela.

Humoralni odgovor na neproteinske antigene, kao što su polisaharidi i lipidi, ne ukljuuje

angažovanje antigen-specifinih T elija pomonica.

Aktivirane B elije se diferenciraju u elije koje sekretuju antitela (neke od njih produkuju

antitela duži period) i dugoživee memorijske elije.

Humoralni odgovor na proteinske antigene koji ukljuuje “heavy chain class/isotype

switching” je vezan za funkcije T elija pomonica.

Primarni i sekundarni humoralni odgovor se razlikuje u kvalitetu i kvantitetu. Primarni

odgovor nastaje nakon stimulacije naivnih B elija, dok sekundarni nastaje poslestimulacije memorijskih B elija. Sekundarni odgovor se brže razvija od primarnog i

produkuje se vea koliina antitela. U sekundarnom odgovoru se produkuje više izotipova

antitela (heavy chain class/isotype switching).

4.2.2. Prepoznavanje antigena i antigenom-indukovana aktivacija B elija





98

Aktivacija antigen-specifinih B limfocita je inicirana vezivanjem antigena za membranske

imunoglobuline, koji funkcionišu kao receptori za antigene. Antigeni receptor, na B limfocitima,ima dve kljune uloge u njihovoj aktivaciji:

prepoznavanje antigena indukuje grupisanje receptora i drugih signalnih molekula u

membrani (clustering), i prenos biohemijskih signala koji iniciraju proces aktivacije B

limfocita;

receptor koji je vezao antigen se internalizuje u endozomalnu vezikulu, i ako je antigen

protein, procesuje u peptide koji se prezentuju na membrane B elija da bi bili prepoznati

od Telija pomo

nica.

4.2.2.1. Signalna transdukcija od BCR kompleksa

Vezivanje antigena za BCR inicira grupisanje receptora na membrani B limfocita. Da bi BCR

ispoljio funkciju signalne molekule, potrebno je da se dva ili više receptora dovedu u vezu ili da

receptori budu povezani multivalentnim antigenima. IgM i IgD, koji funkcionišu kao BCR na

naivnim limfocitima, imaju kratak citoplazmatini

rep (3 aminokiseline) nedovoljan za transdukciju

signala. Signali se, u stvari, prenose preko dva druga

molekula, Ig i Ig, medjusobno povezana

disulfidnim vezama. Ig i Ig su nepohodni i za

površinsko ekspresovanje imunoglobulinskih

receptora i zajedno sa njima grade BCR kompleks.

Drugim reima, Ig i Ig imaju istu funkciju kao CD3

i lanci na T limfocitima. Citoplazmatini rep Ig i

Ig lanaca sadrži ITAM motiv, koji je neophodan zaprenos signala, a grupisanje membranskih Ig dovodi

u vezu nekoliko ITAM motiva.

Slika 4.12. BCR kompleks.Memnbranski IgM (kao i IgD) na površini maturiranih B elija je asociran sa

invarijatnim Ig i Ig molekulama, koje sadrže na svojim citoplazmatinimrepovima ITAM koji ima posreduje i ima funkciju u signalingu. Uoiti slinosti saTCR kompleksom (Slika 3.21. u poglavlju 3.5.).

Rani dogadjaji u signalnoj transdukciji koja potie od BCR su vrlo slini dogadjajima u TCR





99

signalnom putu.

Grupisanje membranskih Ig indukuje fosforilaciju tirozina u sastavu ITAM motiva Ig i Iglanaca. Tirozin kinaze Lyn, Blk i Fyn (pripadnici Src familije tirozin kinaza), koje su

vezane za BCR kompleks, uestvuju u fosforilaciji tirozina Ig i Ig. Za fosfotirozinske

ostatke Ig i Ig, se vezuje tirozin kinaza Syk, koja je ekvivalent kinazi ZAP-70 u T

limfocitima.

Syk i druge tirozin kinaze, aktiviraju “downstream” signalne puteve koji su regulisani

adapternim proteinima. U B elijama, adapterni protein SLP-65 (BLNK) ima kljuno mesto

u formiranju veze sa drugim adapternim proteinima, izmenjivaima guanozin nukleotida, i

drugim enzimima, kao što su fosfolipaza C, i Btk, Itk tirozin kinaze.

Signalni put Ras-MAP kinaza se aktivira u antigen-stimulisanim B limfocitima. SLP-65

regrutuje Sos (GDP/GTP factor razmene) koji, verovatno preko interakcije sa Grb-2,

aktivira Ras. Signalni put aktiviranog Ras-a je slian onom u aktiviranim T limfocitima.

U aktiviranim B limfocitima se aktivira i PLC signalni put. PLC2 se aktivira vezivanjem

SLP-65 ili je fosforilisana Syk i Btk tirozin kinazom. Aktivna PLC razlaže PIP2, dajui IP3 i

DAG. IP3 mobiliše kalcijum iz intraelijskih depoa, a porast intacelularnog kalcijuma

stimuliše kalcijum-zavisne enzime. DAG aktivira neke izoforme PKC koja fosforiliše

serin/treonin ostake drugih proteina.

Aktivacija BCR signalnih kaskada aktivira transkripcione faktore, koji indukuju ekspresiju

gena, iji produkti su neophodni za funkcionalnu aktivaciju B elija.

Signalne puteve, koji su angažovani stimulacijom membranskih IgM i IgD naivnih elija, koriste i

membranske forme IgG, IgA, i IgE. Ove izoforme su, takodje, povezane sa Ig i Ig.





100

Slika 4.13. Signalni put BCR kompleksa. Antigenom-indukovano uzajamno povezivanje membanskih imunoglobulina na B elijama vodi ka grupisanju Ig i Ig molekula i fosforilaciji

tirozina na citoplazmatinom repu ITAMs molekula. Ovo vodi ka privlaenju Syk i posledinoj fosforilaciji tirozina Ig i Ig molekula ovom kinazom.Nekoliko signalnih kaskada prati ovaj dogadjaj, kao što je prikazano, vodei ka aktivaciji nekoliko transkripcionih faktora. Ovi putevi signalne

transdukcije su slini putevima opisanim kod T elija (videti poglavlje 4.1., Slika 4.8.).

4.2.2.2. Receptori za komplement obezbedjuju sekundarni signal





101

Za aktivaciju B limfocita, neophodan je i sekundarni signal koji obezbedjuju proteini

komplementa. Sistem komplementa se sastoji od plazma proteina, koji se aktiviraju vezivanjem ili

za kompleks antigen-antitelo (klasian put aktivacije), ili se vezuju direktno za neke polisaharide ipovršinu mikroorganizama (alternativni ili lektinski put). Aktivacija komplementa dovodi do

proteolize proteina komplementa. Kljuna komponenta sistema komplementa je protein C3, a

njegovo razlaganje dovodi do formiranja C3b molekula koji se kovalentno veže za mikroorganizam

ili kompleks antigen-antitelo. C3b se dalje degradira u C3d koji ostaje vezan za antigen. B

limfociti ekspresuju receptore za C3d tzv. receptori za komplement tipa 2 (CR2 ili CD21).

Kompleks C3d i antigen, ili C3d i kompleks antigen-antitelo se vezuje za B elije preko

membranskog receptora za antigene (BCR) i CR2 koji prepoznaje vezani C3d. CR2 se ekspresujena zrelim B limfocitima, kao kompleks sa druga dva membranska proteina, CD19 i CD81.

Kompleks CR2-CD19-CD81 se esto naziva i kompleks koreceptora B elija, zato što CR2 vezuje

antigen preko C3d molekula, a u isto vreme antigen je vezan direktno preko membranskih Ig.

Aktivacija CR2, dovodi u vezu citoplazmatini domen CD19 sa kinazama povezanim sa BCR

kompleksom, tako da one fosforilišu

citoplazmatini domen molekula

CD19. Fosforilisani CD19 aktivira

nekoliko signalnih puteva (jedan od

njih je vezan za PI-3 kinazu, koja

pojaava signaling iniciran vezivanjem

antigena za membranske Ig).

Slika 4.14. Uloga komplementa u aktivaciji B limfocita.B elije ekspresuju kompleks od CR2 receptora komple-menta, CD19 i CD81. Antigeni mikoba koji su vezali C3dmogu simultano zauzeti i molekul CR2 kao i membranskivezani Ig na površini B elije. Ovo vodi ka inicijacijikaskade signalinga i od BCR kompleksa i od CR2

kompleksa. Zbog svega toga je dogovor na Cd3-antigenkompleks mnogo pojaan, u odnosu na odgovor u kojem je prisutan samo antigen.

4.2.2.3. Funkcionalni odgovori B elije na prepoznavanje antigena

R f k j i i i l d k ij k k i ij BCR k l k k i i j





102

Rane faze koje su inicrane signalnom transdukcijom preko aktivacije BCR kompleksa, aktiviraju

proliferaciju B elija i njihovu diferencijaciju, kao i pripremu za interakciju sa T elijama

pomonicama. Prepoznavanje antigena stimuliše ulazak elija koje su prethodno bile u miru u G1fazu elijskog ciklusa koja je praena poveanjem veliine elije, uveanjem citoplazmatine RNK i

biosintezom organela kao što su ribozomi. Preživljavanje B elija je poveano kao rezultat

indukcije razliitih anti-apoptotikih gena. Aktivirane B elije, takodje, pokazuju mali nivo

proliferacije i sekrecije antitela. Ekspresija nekoliko citokinskih receptora (citokini su produkti T

elija) je takodje poveana, što omoguava antigen-specifinim B limfocitima da odgovaraju na

pomo T elija. Istovremeno, B elije menjaju nivo ekspresije receptora za hemokine, što im

omoguava da migriraju u pravcu T elija pomonica i da interaguju sa njima.

4.2.3. Humoralni odgovor na proteinske antigene zavisi od T elija pomonica

Humoralni odgovor na proteinske antigene zahteva prepoznavanje antigena od strane T elija

pomonica i kooperativnost izmedju antigen-specifinih B i T limfocita. Funkcija T elija pomonica

je otkrivena još 1960 godine,

pre klasifikacije limfocita u dveklase na T i B limfocite. Kasnije

studije su pokazale da je veina

T elija pomonica CD4+CD8- i

da prepoznaju peptidne

antigene iskazane u kompleksu

sa MHC molekulima klase II.

Pomoni T limfociti stimulišuklonalnu ekpanziju B elija,

”isotype switching”, afinitetnu

maturaciju, kao i direfencijaciju

u memorijske B elije.

Slika 4.15. Poetni i kasni dogadjaji u humoralnom imunom odgovoru zavisnom od T-elija pomonica

Razliite faze T-zavisne aktivacije B elija odvijaju se u razliitim anatomskim regionima





103

perifernog limfatinog tkiva. Poetna faza se odvija na granici izmedju T elijske zone i primarnih

folikula, a rezultira proliferacijom B elija, inicijalnom sekrecijom antitela i malim brojem “isotype

switching” procesa. Kasna faza T-zavisnog humoralnog imunog odgovora se odvija umikrookruženju germinativnih centara u okviru limfoidnih folikula, a rezultira afinitetnom

maturacijom, generisanjem B elija i veim brojem “isotype switching” procesa.

4.2.3.1. Rane faze humoralnog odgovora koji je zavisan od T elja su: interakcija T-B

elija, proliferacija B elija, sekrecija antitela i “isotype switching” .

Interakcija izmedju T elija pomonica i B limfocita postupno ukljuuje: antigenom-indukovanu

aktivaciju obaelijska tipa; fizi

ki kontakt izmedju

elija; prezentaciju antigena od strane B

elija

diferenciranim T elijama pomonicama; aktivaciju T elija pomonica i ekspresiju membranskih i

sekretornih molekula od strane T elija pomonica, a koji e aktivirati B elije.

Antigenom-indukovana migracija B elija i T elija pomonica.

Specifini B i T limfociti prepoznaju proteinske antigene u perifernim limfatinim tkivima.

Aktivirani limfociti migriraju jedni prema drugima i iniciraju humoralni imuni odgovor. U

perifernom limfatinom tkivu se nalazi mali broj naivnih B i T limfocita specifinih za odredjeni

antigen (1 na 105 ili 106), tako da je malo verovatno da e se potrebna elija nai na pravom mestu

u pravo vreme. Ovaj problem je rešen regulisanim kretanjem limfocita u limfnom organima. Kao

što je ve spomenuto (vidi 2.2) naivni B i T limfociti nastanjuju razliite oblasti limfnih organa, a

nakom aktivacije sa antigenom migriraju jedni prema drugima. Na ovaj nain se obezbedjuje

njihov susret samo kada za to postoji potreba. Jedan do dva dana od prodora antigena, naivne

CD4+ T elije prepoznaju antigene iskazane na membrani profesionalnih APCs (dendritske elije) u

T elijskoj zoni limfnog organa. Aktivirane T elije smanjuju ekspresiju CCR7 (receptor kojireaguje na hemokine produkovane u T-elijskoj zoni), i napuštaju ovu oblast. U isto vreme B

limfociti prepoznaju antigen u folikulu, aktiviraju se, poinju da ekspresuju CCR7, i time

stimulišu migraciju ka T-elijskoj zoni folikula. Drugim reima aktivirane T i B elije se susreu

na granici izmedju folikula i T zone u limfnom organu. Aktivirane T elije pomonice ekspresuju

membranske molekule i sekretuju citokine koji stimulišu B elije na proliferaciju i diferencijaciju.

3-7 dana nakon prodora antigena, B elije koje sekretuju antitela su nadjene blizu aktiviranih T

limfocita.

B limfociti prezentuju proteinske antigene T elijama pomonicama





104

Antigen-specifini membranski Ig, na B limfocitima,

prepoznaju i vezuju nativne antigene, a zatim se kompleksinternalizuje, procesuje u endozomalnim vezikulama, i

peptidni fragmenti antigena iskazuju na membrani u

kompleksu sa molekulima MHC klase II. Na ovaj nain, u

humoralnom imunom odgovoru, B limfociti funkcionošu

kao APCs i iskazuju antigene CD4+ T limfocitima.

B limfocit u „T elija – B elija konjugatu”, je izložen

delovanju signala sa membrane T limfocita, kao idelovanju visokih koncentracija citokina produkovanih u T

limfocitima tj. stimulisan je za proliferaciju i

diferencijaciju. Sekretovana antitela su specifina za

konformacionu determinantu antigena, zato što su

membranski Ig B limfocita sposobni da vežu

konformacione epitope nativnih antigena. Ovakva

sposobnost prepoznavanja antigena odredjuje finu

specifinost antitela, koja nije zavisna od T elija

pomonica sposobnih da prepoznaju samo linearnu

sekvencu antigena.

Slika 4.16. B limfociti iskazuju antigene T elijama pomonicama

Vezivanje antigena za membranske Ig, poveava ekspresiju kostimulatora što poveava

sposobnost B limfocita da aktiviraju T elije pomonice. Kostimulatori koji se ekspresuju na

aktiviranim B limfocitima su B7-2 i B7-1. Obe ove molekule se vezuju za CD28 na T elijamapomonicama. Na ovaj nain, T elije pomonice se aktiviraju prepoznavanjem dva signala:

antigen-MHC kompleksa (signal 1) i kostimulatora (signal 2), i ispoljavaju efektorne funkcije tj.

“pomažu” proliferaciju i diferencijaciju B limfocita.

Aktivacija B limfocita posredovana T elijama pomonicama: uloga interakcije CD40:CD40

ligand i uloga citokina.

Aktivirane T elije pomonice (antigenom i B7 kostimulatorima), na svojoj membrani ekspresujumolekule tzv. CD40 ligande (CD40L) koji se vezuju za CD40 receptore na B limfocitima koji su

iskazali antigene (slika 4.20). Ova interakcija stimuliše proliferaciju i diferencijaciju B elija.

( 5 ) j b ki i T lij k ji j k h l T i li di





105

CD40L (CD154) je membranski protein T elija, koji je strukturno homolog TNF i Fas ligandima.

CD40 se konstitutivno ekspresujue na B elijama, a CD40L na površini aktiviranih T elija

pomonica. Vezivanje CD40L za CD40 dovodi do oligomerizacije CD40 molekula i njihovogpovezivanja sa citoplazmatinim proteinima tzv. TRAFs (engl . TNF receptor associated factors).

TRAF – CD40 interakcija aktivira enzimsku kaskadu, koja aktivira transkripcione faktore,

ukljuujui i NF-B i AP-1. T elije pomonice na ovakav nain tj. direktnim elijskim kontaktom,

stimulišu/aktiviraju i druge ciljne elije (npr. CD40L – CD40 interakcija koja aktivira makrofage).

Slika 4.17. Mehanizam aktivacije B limfocita posredovan T elijama pomonicama

Aktivirane T elije pomonice sekretuju citokine koji zajedno sa CD40L stimulišu proliferaciju i

diferencijaciju B limfocita. Citokini imaju dve osnovne funkcije:

stimulišu proliferaciju B elija (koja je inicirana CD40 signalima)

stimulišu produkciju razliitih izotipova antitela (haevy chain switching).

Za antigenom aktivirane B limfocite je karakteristino da imaju višestruko uvean odgovor na

citokine. Naime, prepoznavanje antigena od strane B limfocita stimuliše ekspresiju receptora za

citokine, a B limfociti koji su u direktnom kontaktu sa T elijama pomonicama, su izloženi

delovanju visoke koncentracije citokina, što sve vodi ka stimulaciji odgovora antigen-specifinih B

limfocita. Citokini (IL-2, IL-4 i IL-5) produkovani u T elijama pomonicama, stimulišu

proliferaciju B limfocita. IL-6, koji se sekretuje iz makrofaga T elija kao i mnogih drugih tipovaelija funkcioniše kao factor rasta za ve diferencirane B limfocite koji produkuju antitela.

Dif ij ij B li f it lij k j d k j tit l





106

Diferencijacija B limfocita u elije koje produkuju antitela

CD40 i citokini aktiviraju transkripcione faktore koji stimulišu transkripciju gena za Ig kao isintezu Ig. Citokini, kao što su IL-2, IL-4, i IL-6 stimulišu sintezu i sekreciju antitela iz aktiviranih

B limfocita. U limfnim organima elije koje sekretuju antitela se uglavnom nalaze izvan folikula,

na mestima kao što su crvena pulpa slezine i medulla limfnog vora.Mnogi B limfociti koji

sekretuju antitela se transformišu u tzv. plazma elije. To su elije koje se morfološki razlikuju od

limfocita i strukturno su opredeljene za produkciju velike koliine antitela. Dve do tri nedelje

nakon prodora antigena, plazma elije migriraju u kosnu srž, tako da ona postaje glavno mesto

produkcije antitela. Plazmaelije mogu da sekretuju antitela i nekoliko meseci pa

ak i godina,nakon eliminacije antigena iz organizma. Smatra se da je oko polovine antitela u krvi zdravih

osoba produkt dugo-živeih plazma elija kosne srži, koja predstavljaju neposrednu zaštitu u

sluaju ponovnog prodora istog antigena. elije koje produkuju antitela ne cirkulišu, ve

sekretuju antitela u krv i u mukozne sekrete i tako se cirkulacijom distribuiraju po organizmu.

Diferencijacija B elija, od elija koje specifino prepoznaju antigene u efektorne elije, ukljuuje

promenu u ekspresiji membranskih Ig u sekretovane Ig. Molekuli membranskih Ig se od

sekretovanih Ig razlikuju u karboksi-terminalnom regionu, a „izmena“ membranske u neku od

klasa Ig koji se sekretuju, podrazumeva promenu u procesovanju mRNA teškog lanca Ig.

Izmena teškog lanca imunoglobulina (heavy chain isotype switching)

U zavisnosti od stimulacije citokinima i angažovanja CD40 molekula, neki od aktiviranih B

limfocita koji ekspresuju IgM i IgD, ulaze u proces koji vodi ka izmeni teškog lanca (heavy chain

isotype switching), tj. produkciji antitela koja u svom sastavu imaju teške lance razliitih klasakao što su ,, i lanci11 (slika 4.18.).

“Isotype switching” se dešava u perifernom limfatinom tkivu, u B elijama koje su aktivirane i

nalaze se na granici folikula. Neophodnost stimulacije B limfocita preko angažovanja CD40

signala je dobro dokumentovana kod miševa ili osoba koje nemaju CD40 ili ligand za CD40. U

ovom sluaju, aktivirani B limfociti produkuju uglavnom IgM, bez/ili sa malom produkcijom

11 Osnovni molekularni mehanizam izmene u sintezi teškog lanca (isotype switching) je proces rekombinantne izmene (engl. switchrecombination) u okviru kog u B limfocitima dolazi do rekombinacije VDJ segmenta sa C regionom.

antitela drugih klasa. Mehanizam preko kog CD40 molekuli indukuju promenu transkripcije

t šk l j š k ij t





107

teškog lanca još uvek nije poznat.

Slika 4.18. Proces “izmene” teškog lanca imunoglobulina - Ig “heavy chain isotype switching”.B elije aktivirane signalima (CD40L, citokini) od strane T elija pomonica prolaze “switching” proces tako da produkuju nekoliko razliitih izotipovaimunoglobulina koji imaju razliite efektorne funkcije.

Citokini, takodje imaju važnu ulogu u regulisanju produkcije teških lanaca razliitih klasa. Na

primer, IL-4, koji se uglavnom sekretuje iz CD4+ T elija, je glavni faktor koji reguliše “izmenu”

teškog lanca u teški lanac IgE. Takodje, produkcija IgG2 kod miševa zavisi od interferona-, koji

se sintetiše u T elijama i NK elijama.

Produkcijom razliitih tipova antitela omoguena je velika plastinost humoralnog imunog

odgovora, zbog toga što generisanje antitela koja imaju razliite efektorne funkcije omoguava

eliminaciju razliitih tipova antigena (slika 4.21). Izmena tipa teškog lanca Ig, je regulisana

aktivacijom odredjenog tipa T elija pomonica u zavisnosti od tipa mikroorganizma koji je





108

aktivacijom odredjenog tipa T elija pomonica, u zavisnosti od tipa mikroorganizma koji je

aktivirao imuni odgovor. Na primer, glavni humoralni imuni odgovor na bakterije koje imaju

kapsulu bogatu polisaharidima, se sastoji od antitela klase IgM. IgM se vežu za bakteriju,aktiviraju komplement, i indukuju fagocitozu bakterije. Dakle, polisaharidni antigeni koji ne

stimulišu T elije pomonice, izazivaju produkciju IgM antitela (sa vrlo malom/bez, promene ka

IgG). Imuni odgovor na viruse i mnoge bakterije se sastoji od produkcije antitela IgG klase, koji

svoje efektorne funkcije ispoljavaju opsonizacijom i vezivanjem komplementa. Virusi i mnoge

bakterije aktiviraju T elije pomonice, T H1 podklase, koje produkuju IFN- za koji se smatra da je

glavni stimulator B elija za izmenu u produkciji antitela ka IgG. Imuni odgovor na mnoge

parazite (Helmintes ) je uglavnom produkcija IgE, koji eliminišu antigen ukljuivanjem eozinofila. Takodje, ova antitela posreduju alergijskim reakcijama. Helmintes aktiviraju T H2 populaciju T

elija pomonica, koje produkuju IL-4. IL-4 je odgovoran za izmenu u sintezi antitela ka IgE klasi.

Takodje, anatomska lokalizacija B elija determiniše “isotype switching”. Na primer, B limfociti u

mukoznom tkivu produkuju IgA, klasu antitela koja se najefikasnije transportuje kroz epitel u

mukozni sekret. Izmenu u sintezi antitela ka IgA stimuliše TGF-, koji se produkuje u mnogim

tipovima elija u mukozi, kao i IL-5 iz T elija pomonica. Navedeni primeri izmene u sintezi

teškog lanca ilustruju funkciju T elija pomonica kao kontrolora imunog odgovora tj. kako se u

zavisnosti od tipa antigena, aktiviraju razliite T elije pomonice koje preko sekrecije razliitih

citokina regulišu produkciju antitela odredjenih klasa.

4.2.3.2. Kasnije faze humoralnog odgovora zavisnog od T elija pomo nica: reakcije germinalnog centra

Kasne faze humoralnog odgovora, koje ukljuuju afinitetnu maturaciju i nastajanje memorijskih

elija, se odigravaju u germinalnim centrima folikula. Kao što je ve

spomenuto, odgovor B

elijana proteinske antigene zapoinje na granici izmedju folikula i T-zone u limfnom voru. etiri do

sedam dana nakon prodora antigena, neke aktivirane B elije migriraju u folikul i poinju da

proliferišu, formirajui svetlo obojen centralni deo folikula tzv. germinalni centar. Germinalni

centar je mesto brze proliferacije limfocita. Izraunato je od jedne aktivirane B elije u

germinalnom centru, za 5 dana nastane 5000 progenitornih elija. Svaki formirani germinativni

centar sadrži elije nastale od jedne ili nekoliko antigen specifinih klonova B elija.

Arhitektura limfoidnih folikula kao i reakcije germinalnog centra zavise od prisustva folikularnih

dendritskih elija (FDCs). FDCs ekspresuju receptore za complement (CR1, CR2 i CR3) kao i Fc

receptor (molekule ukljuene u selekciju B limfocita u germinalnim centrima). FDCs ne

ekspresuju molekule MHC klase II Poreklo ovih elija je nepoznato One ne nastaju u kosnoj srži





109

ekspresuju molekule MHC klase II. Poreklo ovih elija je nepoznato. One ne nastaju u kosnoj srži

i znaajno se razlikuju od dendritskih elija koje ekspresuju MHC II molekule koje prezentuju

proteinske antigene CD4+ T elijama. FDCs imaju dugake nastavke koji formiraju “mrežu” okogerminalnih centara.

Formiranje germinalnih centara zavisi i od prisustva T elija pomonica i interakcije izmedju CD40 i

CD40L . Kod ljudi i miševa sa genetikim defektom u razvoju i aktivaciji T elija, kao u sluaju

mutiranih CD40 i CD40L ne dolazi do

formiranja germinalnih centara.

“Afinitetna maturacija” je procesprodukcije antitela poveanog afiniteta

za odredjeni antigen (afinitet raste u

kasnim fazama humoralnog odgovora).

Ona nastaje kao rezultat somatske

mutacije gena za Ig teškog i lakog lanca

(„point mutation” tako da nastaju

mutanti CDR regiona varjabilnog regiona

molekule, praene selektivnim preži-

vljavanjem onih B elija koje produkuju

antitela najveeg afiniteta za antigen. T

elije pomonice i CD40:CD40L interakcije

su neophodne za proces “sazrevanja

afiniteta”. Drugim reima, ovaj proces se

dešava samo u humoralnom imunom

odgovoru na proteinske antigene, koji jezavisan od T elija pomonica. B limfociti

germinalnog centra koji sadrže mutirane

gene za Ig lance migriraju ka nastavcima

FDCs. Ovi B limfociti e biti zahvaeni

apoptozom ukoliko se ne vežu za antigen

koji je iskazan na FDCs.Slika 4.19. Selekcija B elija u germinalnim centrima

Drugim reima, samo one elije koje poseduju specifine receptore za iskazane antigene e

preživeti Kao rezultat ovog procesa selekcije u germinalnom centru e ostati samo one elije koje





110

preživeti. Kao rezultat ovog procesa selekcije, u germinalnom centru e ostati samo one elije koje

produkuju Ig visokog afiniteta za taj antigen.

Nastajanje memorijskih elija i sekundarni imuni odgovor

Neke od aktiviranih B elija se ne razvijaju u elije koje sekretuju antitela, ve postaju dugovene.

Ove elije koje se nazivaju memorijske elije, imaju sposobnost dugog života bez stimulacije sa

antigenom, i odgovorne su za nastajanje brzog imunog odgovora na ponovni prodor istog antigena.

Za sada nije poznato zašto se neki od prekursora klonova antigen-stimulisanih B elija diferencira

u elije koje sekretuju antitela a zašto neke elije ostaju “funkcionalno mirne” dugo-živee

memorijskeelije. Neke memorijske

elije ostaju u limfnom

voru, druge izlaze iz germinalnihcentara folikula, cirkulišu putem krvi i nastanjuju druga limfna tkiva. Memorijske elije obino

ekspresuju “mutirani” receptor, visokog afiniteta za antigen i molekule Ig koje poseduju

“izmenjene” teške lance (prošle su proces “isotype swithing”). Produkcija velike koliine

odgovarajuih izotipova Ig velikog afiniteta za antigen mnogostruko ubrzava

inaktivaciju/eliminaciju antigena nakon njegovog ponovnog prodora u organizam.

Za mnoge karakteristike sekundarnog humoralnog imunog odgovora, su odgovorne CD4+ T elije

pomonice. Tako, izmena teškog lanca Ig, koja je tipina karakteristika sekundarnog odgovora,

nastaje zahvaljujui interakciji B limfocita sa citokinima sekretovanim iz T elija pomonica.

Porast afiniteta produkovanih antitela, koji nastaje posle svakog narednog prodora antigena

(proces afinitetne maturacije), takodje, nastaje kao rezultat interakcije B limfocita sa specifinim T

elijama pomonicama12.

4.2.4. Humoralni odgovor na T-nezavisne antigene

Mnogi neproteinski antigeni, kao što su polisaharidi i lipidi, stimulišu produkciju antigena bez

pomoi T elija. Ovi antigeni se zovu timus-nezavisni ili T-nezavisni antigeni. Mnogi od ovih

antigena, ukljuujui polisaharide, glikolipide i nukleinske kiseline su polivalentni, mogu da se

multiplo vežu za membranske Ig na B elijama, i da aktiviraju komplement tj. mogu direktno da

aktiviraju B elije bez pomoi T elija. T-nezavisni antigeni stimulišu produkciju antitela za koju je

12 Antitela visokog afiniteta su neophodna za brzu i efikasnu eliminaciju mikroorganizama i njihovih toksina. Zato vakcine protiv mnogih

mikroorganizma moraju da indukuju afinitetnu maturaciju i formiranje memorijskih elija (obe reakcije se dešavaju aktivacijom T elija pomonica).Ovakav koncept se može primeniti i u dizajnu vakcina za neke polisaharidne antigene, koje ne stimulišu T elije. U ovakvim sluajevima

polisaharidni antigen se vezuje za strani protein tako da se formira konjugat koji e aktivirati T elije pomonice konjugovane vakcine.

karakteristino da nema/ima vrlo malo, izmene izotipova teškog lanca. Drugim reima, produkuju

se antitela malog afiniteta uglavnom klase IgM ili/i male koliine IgG Takodje za humoralni





111

se antitela, malog afiniteta, uglavnom klase IgM ili/i male koliine IgG. Takodje, za humoralni

odgovor na T-nezavisne antigene je karakteristino da ne dolazi do formiranja memorijskih elija,

jer je za nastajanje memorijskih elija neophodna aktivacija T elija pomonica, koja je u ovomsluaju izostala.

4.2.5. Regulacija humoralnog imunog odgovora preko Fc receptora

Sekretovana antitela mogu da inhibišu dalju aktivaciju B elija, formiranjem antigen-antitelo

kompleksa koji se vezuje za receptor

za antigene kao i zaFc

receptore

na antigen specifinim B limfocitima

(slika 4.23). Ovo je osnova za

funkionisanje negativne povratne

sprege antitela tj. smanjivanje

sekrecije antitela. IgG inhibišu

aktivaciju B elija formiranjem

kompleksa sa antigenima i ovi

kompleksi se preko Fc regiona IgG

vezuju za receptor Fc II (CD32).

Citoplazmatini domen ovog rece-

ptora sadrži motiv (6 aminokiselina:

izoleucin-X-tirozin-X-X-leucin) za koji

je karakteristiano da prenosi “nega-

tivne” signale. Po analogiji sa ITAM-

om, ovaj motiv nosi naziv ITIM (engl .immunoreceptor tyrosine-based

inhibition motif ).

Slika 4.20. Regulacija aktivacije B limfocita preko Fc receptora

Aktivacija Fc receptora dovodi do fosforilacije tirozina koji se nalazi u sastavu ITIM-a, što formira

vezno mesto za inozitol-5-fosfatazu, SHIP (engl . SH2 domain-containig inositol phosphatase).

Regrutovana SHIP hidrolitiki razlaže PIP3 (koji nastaje nakon gruisanja BCR-a, o emu je bilo

ranije rei) i vezuje PLC i Btk (koje su ukljuene u signaling preko BCR-a) Kompleks antigen-





112

ranije rei) i vezuje PLC i Btk (koje su ukljuene u signaling preko BCR a). Kompleks antigen

antitelo reaguje sa receptorom za antigen (antigen se veže za BCR), kao i sa Fc receptorom (Ig se

preko Fc regiona veže za receptor) i na taj nain se inhibitorne fosfataze dovode u kontakt sakomponentama BCR signalnog puta, koji inhibišu.

Drugim reima, aktivacija inhibitornog signalnog puta, koja se ostvaruje preko citoplazmatinog

regiona Fc receptora, zaustavlja aktivaciju B elija.

EFEKTORNI MEHANIZMI





113

EFEKTORNI MEHANIZMI

IMUNOG ODGOVORA 05Fiziološka funkcija svih imunih odgovora je eliminacija mikroba ili drugih štetnih agenasa. U

prethodnim delovima (treem i etvrtom) su opisani mehanizmi kojima specifini limfociti

prepoznaju i reaguju na strane antigene (prepoznavanje i faza aktivacije adaptivnog imunog

odgovora). Poglavlja koja pripadaju ovom delu skripte su posveena efektornim mehanizmima koji

se aktiviraju tokom imunog odgovora i njihovom medjusobnom kordinisanom delovanju u odbrani

organizma.

U poglavlju 5.1. se opisuju citokini, solubilni posrednici i urodjene i adaptivne imunosti. Poglavlje

5.2. se odnosi na efektorne mehanizme urodjenog imunog odgovora i ranu odbranu organizma

uperenu protiv štetnih agenasa. U poglavlju 5.3. se opisuju efektorni mehanizmi imunog odgovora

posredovanog elijama i to T-limfocitima i makrofagima koji funkcionišu kao odbrambeni

mehanizmi protiv intraelijskih (intracelularnih) mikroba. Poglavlje 5.4. prikazuje efektorne

mehanizme humoralnog imuniteta, odnosno imuniteta posredovanog antitelima ukljuujui i

sistem komplementa, koji omoguavaju odbranu protiv vanelijskih mikroba.

5.1. CITOKINI





114

Generalno posmatrano, citokini su peptidi ili polipeptidi koji su produkt sekretorne aktivnosti jedne elije a mogu da utiu na rast i aktivnost drugih elija. To je familija proteina koje sekretuju

elije urodjenog i adaptivnog imuniteta i koji posreduju veliki broj funkcija ovih elija, pa time i

efektornih funkcija urodjenog i steenog imunog odgovora. Jedna vrsta elija može sekretovati

razliite citokine, ali razliite elije mogu sekretovati isti tip citokina, a i jedan tip citokina može

delovati na spektar razliitih elija. Citokini se sintetišu kao odgovor na inflamatorne ili antigene

stimuluse i obino deluju lokalno, u autokrinom i/ili parakrinom maniru vezujui se za svoje

receptore na ciljnim elijama. Neki citokini mogu biti produkovani u dovoljnoj koliini da cirkulišu

i ispoljavaju endokrine efekte. Na veliki broj elija citokini deluju kao faktori rasta. Razliiti

citokini stimulišu raznolike odgovore elija ukljuene u imunitetu i inflamaciji. U aktivacionoj fazi

adaptivnog imunog odgovora citokini stimulišu rast i diferencijaciju limfocita a u efektornoj fazi

urodjenog i adaptivnog imuniteta oni aktiviraju razliite efektorne elije i stimulušu ih da

eliminišu antigene. U klinikoj medicini citokini su važni kao terapeutski agensi i kao ciljne

molekule za specifine antagoniste u velikom broju imunih i inflamatornih bolesti.

Nomenklatura citokina se esto bazira na njihovim elijskim izvorima. Citokini koje produkuju

mononuklearni fagociti nazivaju se monokini, dok se oni koje produkuju limfociti zovu limfokini.

Sa razvojem anti-citokinskih antitela i proba postalo je jasno da isti protein može biti sintetizovan

i od strane limfocita i monocita, a i raznih drugih tkivnih elija, ukljuujui endotelijalne elije i

neke epitelijalne elije. S obzirom na to da je najvei broj citokina produkovan od strane leukocita

(makrofaga i T elija) i da oni ispoljavaju efekat na druge leukocite oni se nazivaju i interleukini.

Ovaj termin nije sasvim precizan zbog toga što postoji veliki broj citokina sekretovan od strane

limfocita i koji deluju na limfocite a ne zovu se interleukini (jer je njihovo otkri e prethodiloimenu), i obrnuto, mnogi citokini se zovu interleukini a niti su produkti leukocita, niti pak na njih

deluju. Ovaj termin je ipak koristan zbog toga što se novi citokini, nakon molekularne

karakterizacije, oznaavaju kao interleukin (IL) broj (npr. IL-1, IL-2 i dr.). U ovoj skripti se koristi

termin citokini bez restrikcije u pogledu na elijski izvor ili biološku aktivnost date molekule.

5.1.1. Osnovne karakteristike citokina





115

Citokini su polipeptidi koji se produkuju kao odgovor na mikroorganizme i druge antigene i kojisu posrednici i regulišu imuni i inflamatorni odgovor (Slika 5.1.). Iako su strukturno razliiti, neke

osnovne karakteristike su im zajednike (Slika 5.2.):

Citokini se sekretuju

veoma brzo i taj proces je

samo-limitirajui. Citokini se

ne deponuju u eliji kao

molekule spremne da obave

svoju funkciju, nego je njihova

sinteza inicirana novog genskom

transkripcijom a kao posledica

aktivacije elije. Ova transkri-

pciona aktivacija je prolazna i

informacione RNK koje kodiraju

veinu citokina su nestabilne, te

je i sinteza citokina takodje

transientna.

Slika 5.1. Uloga citokina u odbrani organizma.

Produkcija nekih citokina može dodatno biti kontrolisana procesovanjem RNK, kao i post-

transkripcionim mehanizmima, kao što su proteolitiko oslobadjanje aktivnog produkta-peptida

od inaktivne prekusorske molekule. Jednom sintetisani, citokini se veoma brzo sekretuju i to uznaajnoj koliini, što rezultira veoma burnim otpuštanjem kada je potrebno.

Efekti citokina su esto plejotropni i redundantni (Slika 5.2.). Plejotropizam

predstavlja sposobnost jednog citokina da deluje na razliite elije, što omoguava datom citokinu

da bude medijator u razliitim biološkim efektima. Bez obzira na ovu osobinu, terapeutska

primena citokina je ograniena zbog toga što se esto pri administraciji citokina u željene svrhe,

javljaju brojni neželjeni sporedni efekti. Redundancija je sposobnost veeg broja citokina da

ispolje istu funkciju. Kod ove osobine efekat mutacije jednog gena ili citotokinskih antagonista nemora imati funkcionalne posledice jer funkcija „inhibisanog“ citokina može biti kompenzovana

nekim drugim.

Citokini esto utiu na sintezu i aktivaciju drugih citokina. Sposobnost jednog

citokina da stimuliše produkciju drugih vodi ka kaskadi u kojoj drugi ili trei u kaskadnom nizu





116

p j g j j g

mogu da posreduju biološku aktivnost prvog. Dva citokina mogu ispoljavati antagonistiki, ili

aditivni ili pak sinergistiki (vei od oekivanog) efekat jedan prema drugom (Slika 5.2.).Citokini mogu delovati

lokalno ili sistemski. Veina

citokina ispoljava svoju biološku

aktivnost u blizini mesta sopstvene

produkcije, ili na samu eliju koja

ih je sekretovala (autokrina

aktivnost) ili na elije u okolini

(parakrina aktivnost). Ukoliko se

produkuju u veoj koliini citokini

mogu da ulaze u cirkulaciju i da

deluju na mestima udaljenim od

mesta njihove produkcije.

Slika 5.2. Osnovne karakteristike citokina. plejotropizam- jedan citokin ima multiple efekte narazliite elijske tipove; redundancija- razliiti citokiniimaju isti ili slian efekat; sinergizam-dva ili visecitokina imaju aditivne effekte; antagonizam- jedancitokin inhibira dejstvo drugog

Citokini ispoljavaju svoj

efekat vezivanjem za specifine

membranske receptore na ciljnimelijama. Receptori za citokine

esto vezuju svoje ligande sa velikim

afinitetom (Kd u opsegu od 10-10 do 10-12 M). Ova osobina omoguava da veoma male koliine

citokina „okupiraju“ receptore u dovoljnoj meri da izazovu biološki efekat. Veliki broj elija

ekspresuje veoma nizak nivo citokinskih receptora (u nizu od 100 do 1000 receptora po eliji), ali

je ovaj broj adektvatan da indukuje odgovor upravo zbog velikog afiniteta receptora prema

ligandu.

Spoljašnji signali regulišu ekspresiju citokinskih recptora, a time i odgovor elija na

citokine. Poznato je da stimulacija T ili B limfocita antigenima dovodi do poveane ekspresije

citokinskih receptora. Zbog ove osobine tokom imunog odgovora antigen-specifini limfociti

dominiraju u pogledu odgovora na sekretovane citokine. Ovo je jedan od mehanizama kojima se





117

održava specifinost imunog sistema iako citokini sami po sebi nisu antigen specifini. Ekspresija

citokinskih receptora je regulisana i samim citokinima, ukljuujui i to da isti citokin koji sevezuje za receptor, istovremeno dozvoljava i stimulaciju pozitivne amplifikacije ili negativne

povratne sprege.

elijski odgovor na najvei broj citokina je sadržan u ekspresiji gena u ciljnoj eliji,

što rezultuje ekspresijom nove funkcije, a nekada i proliferacijom ciljne elije. Veina

promena u ekspresiji gena indukovana citokinima rezultira diferencijacijom T i B limfocita i

aktivacijom efektornih elija, kao što su makrofagi. Izuzetak od pravila da citokini funkionišu tako

što menjaju obrazac ekspresije gena su hemokini koji prouzrokuju rapidnu migraciju elija, kao i

citokin koji se zove faktor nekroze tumora (engl. Tumor Necrosis Factor – TNF) i koji indukuje

apoptozu aktiviranjem elijskihe enzima, bez nove genske transkripcije ili sinteze proteina.

5.1.1.1. Funkcionalne kategorije citokina

Prema svojoj osnovnoj biološkoj aktivnosti citokini su klasifikovani u tri funkcionalne kategorije.

(1) Medijatori i regulatori urodjenog imuniteta se produkuju uglavnom od strane

mononuklearnih fagocita, a kao odgovor na infektivne agense. Bakterijski produkti kao što su

lipopolisaharidi (LPS) i viralni produkti kao što je dvostruka RNK direktno stimulišu makrofage da

sekretuju citokine kao deo urodjene otpornosti. Isti citokini mogu takodje biti produkovani i

sekretovani i od strane makrofaga koji su aktivirani antigen-stimulišuim T elijama, te su tako

deo adaptivnog elijama-posredovanog imuniteta.

(2) Medijatori i regulatori adaptivnog imuniteta se produkuju uglavnom od strane T limfocita,

a kao odgovor na specifino prepoznavanje stranih antigena. Neki citokini T elija funkcionišu

primarno u regulaciji rasta i dfierencijacije razliitih limfocitnih populacije, te tako igraju važnu

ulogu u aktivacionoj fazi T elijama-posredovanog imunog odgovora. Drugi citokini poreklom od T elija regrutiraju, aktiviraju i regulišu specijalizovane efektorne elije kao što su: mononuklearni

fagociti, neutrofili i eozinofili, u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora.

(3) Stimulatori hematopoeze se produkuju od strane stromalnih elija kosne srži, leukocita i

drugih elija, a stimulišu rast i diferencijaciju nezrelih leukocita.

Generalno, citokini i urodjenog i adaptivnog imuniteta su produkti razliitih elijskih populacija, a

svoj ekfekat ispoljavaju na razliite ciljne

elije. I pored toga, ove raznovrsnosti nisu apsolutnezbog toga što neki od citokina može biti produkovan i tokom urodjenog i adaptivnog imunog

odgovora, a biološka aktivnost razliitih citokina koji se produkuju tokom ovih odgovora može se

medjusobno „preklapati“.





118

Tabela 5.1. Citokini i njihove funkcije

CITOKIN O P I S

Interferon alfa (IFN) Spreava replikaciju virusa i inhibiše elijski rast; sekretuju ga elije inficirane virusima

Interferon beta (IFN) Spreava replikaciju virusa, inhibiše elijski rast, smanjuje ekspresiju MHC I i MHC II; sekretuju ga fibroblastiinficirani virusima

Interferon gama (IFN) Obuhvata oko 20 razliitih proteina koji aktiviraju makrofage i prirodne elije ubice, stimulišu steeni imunitetpoveavajui ekspresiju MHC I i MHC II i spreavajui replikaciju virusa; sekretuju ih T elije pomonice,citotoksine T elije i elije ubice.

Interleukin–1 (IL-1) Kostimulacija B i T elija, pospešuje produkciju prostaglandina i razvijanje inflamatornih procesa, delujui na

hipotalamus dovodi do nastanka groznice (pirogeno dejstvo); sekretuju ga makrofagi, B elije i fibroblasti

Interleukin-2 (IL-2) Kostimulacija B i T elija, aktivacija makrofaga i elija ubica; sekretuju ga T elije pomonice

Interleukin-4 (IL-4) Aktivira B elije i uestvuje u alergijskim reakcijama, što rezultuje produkcijom imunoglobulina E (IgE); sekretuju gaT elije pomonice

Interleukin-5 (IL-5) Stimuliše eozinofilne granulocite i tako uestvuje u odgovoru na prisustvo parazita; sekretuju ga T elije pomonice

Interleukin-8 (IL-8) Kao hemotaksini faktor privlai neutrofilne i bazofilne granulocite i pospešuje inflamatorne procese; sekretuju gamakrofagi

Interleukin-10 (IL-10) Inhibiše sekreciju interferona gama i interleukina; sekretuju ga supresorske T elije

Limfotoksin Ubija ciljne elije; sekretuju ga citotoksine T elije

Perforin Dovodi do formiranja pukotine u membrani ciljne elije, što rezultira liziranjem elije; sekretuju ga citotoksine Telije

Faktor nekroze tumora(Tumor necrosis factor -TNF) Aktivira makrofage i pospešuje razvijanje groznice (pirogeno dejs tvo); sekretuju ga makrofagi

5.1.1.2. Citokinski receptori i signaling

Citokini svoj efekat ispoljavaju vezujui se sa velikim afinitetom za svoje receptore koji pripadaju

odredjenim strukturnim familijama. Aktivacija receptora stimuliše specijalizovane signalne puteve

kao što je npr. JAK/STAT signalni put (Janus tirozin Kinaze u citoplazmi koje fosforilišu STAT-

engl. Signal Transducer and Activator of Transcription).

Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili više transmembranskih proteina iji

ekstracelularni deo je odgovoran za vezivanje citokina, a citoplazmatski deo je odgovoran za

inciranje signalnih puteva. Ovo su tipini putevi signalne transdukcije koji se aktiviraju ligand-indukovanom aktivacijom receptora, približavajui citoplazmatske delove jedne ili više receptornih

molekula u procesu analognom signalingu preko T i B receptora (pogledati ranije u delovima o

aktivaciji T i B limfocita).





119

Najrasprostranjenija klasifikacija citokinskih receptora zasniva se na strukturalnoj homologijiekstracelularnih citokin-vezujuih domena. Prema ovoj klasifikaciji citokinski receptori su

podeljeni u pet familija (Slika 5.3A.).

Tip I citokinski receptori (hemopoetinski receptori), sadrže jednu ili više kopija

domena sa dve konzervisane cisteinske rezdue i membransku proksimalnu sekvencu triptofan-

serin-X-triptofan-serin (WSXWS), gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu. Ovi receptori vezuju

citokine koji nose 4 lanca -heliksa. Konzervirana struktura receptora je deo koji veže citokine sa

4 lanca -heliksa, dok se specifinost prema svakom tipu citokina determiniše amino kiselinskim

ostacima koji se razlikuju od jednog do drugog receptora. Ovi receptori sadrže unikatni lanac

ligand-vezujueg domena i jedan ili više tzv. signal-tansducing lanaca (deo molekule receptora

odgovoran za transdukciju/prenos signala) koji je esto isti kod receptora za razliite citokine

(Slika 5.3A).

Tip II citokinski receptori su slini tip I receptorima u organizaciji ekstracelularnih

domena sa konze-

rvisanim cisteinima,

ali ne sadrže WSXWS.

Ovi receptori imaju

jedan ligand vezujui

polipeptidni lanac i

jedan lanac za

signalnu transdu-

kciju.

Slika 5.3. Strukture citokinskih receptora.A – Receptori za razliite citokineklasifikovani su u familije na osnovu

konzervisane strukture ekstrace-lularnog domena (WSXWS: triptofan-serin-X-triptofan-serin); B - Razliiticitokinski receptori izgraeni su odspecifinog ligand-vezujueg lancakoji se nekovalentno asocira sasignalnom subjedinicom koja je

zajednika za receptore razliitihcitokina.

Citokinski receptori koji pripadaju Ig superfamiliji imaju ekstracelularni

imunoglobulinski (Ig) domen. Ovi receptori vezuju raznolike tipove citokina ime se aktiviraju





120

razliiti mehanizmi signalne transdukcije.

TNF receptori pripadaju familiji receptora (u kojoj neki lanovi nisu citokini) saekstracelularnim domenima bogatim cisteinima. Vezivanje liganda uslovljava da receptor aktivira

intracelularne proteine sa kojima je asociran, a koji indukuju apoptozu i/ili stimulišu ekspresiju.

GPCR (engl. G-Protein Coupled Receptors) ili receptori koji -heliksom sedam puta

prolaze/presecaju (engl. seven-transmembrane -helical receptors) elijsku membranu se još

nazivaju i serpentinski receptori izbog toga što njihov transmembranski domen ima oblik zmije i

sedam puta prolazi napred, nazad od spoljašnje do unutrašnje strane membrane i obratno. Naziv

GPCR potie od toga što njihov signalni put ukljuuje vezivanje GTP-vezujuih proteina tzv. G-

proteina. Genom sisara kodira veliki broj ovakvih receptora koji su ukljueni u prenošenju signala

iz elijskog okruženja. U imunom sistemu pripadnici ove klase receptora posreduju brze i prolazne

(tranzijentne) odgovore na citokine iz familije hemokina.

Citokinski receptori takodje mogu biti grupisani prema putevima signalne transdukcije koje

aktiviraju (Tabela 5.2.). Ovakvo grupisanje esto korelira sa strukturnom homologijim u

citoplazmatskom domenu signalnog lanca receptora. Drugim reima, lanovi familije definisani

prema ekstracelularnom domenu, aktiviraju sline puteve transdukcije signala u eliji.

Tabela 5.2. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptoraPUTEVI SIGNALNE

TRANSDUKCIJECITOKINSKI RECEPTOR KOJIKORISTI DATI SIGNALNI PUT SIGNALNI MEHANIZAM

JAK/STAT put Tip I i tip II citokinskih receptora JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT transkripcionih faktora

Signaling TNF receptorapreko TRAF

TNF familija receptora:TNR-RII, CD40

Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija transkripcionih faktora

Signaling TNF receptorapreko tzv. »death« domena

TNF familija receptora:TNR-RI, Fas

Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze

Tirozin kinaze povezane sareceptorima

M-CSF receptor

Receptor faktora stem elija (SCF)

Unutrašnja aktivnost tirozin kinaze u receptoru

G protein signaling Hemokinski receptoriGTP zamena i disocijacija G:GTP od G, G:GTP aktivira razliite

elijske enzime, ali i neke druge proteine(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

5.1.2. Citokini koji posreduju i regulišu urodjeni imunitet





121

Veoma važna komponeneta ranog/poetnog urodjenog imunog odgovora na viruse i bakterije je

sekrecija citokina koji posreduju u mnogobrojnim funkcijama urodjenog imuniteta (prirodneotpornosti organizma). Aktivirani makrofagi produkuju citokine koji posreduju u urodjenim

mehanizmima otpornosti: TNF i IL-1 (medijatori akutne inflamatorne reakcije); hemokini

(privlae leukocite do inflamatorne zone); IL-12 stimuliše produkciju IFN- koji aktivira makrofage

te time ima udela u mehanizmima kako urodjenog, tako i adaptivnog imunog odgovora.; tip I IFN

ima antiviralno dejsvo; IL-10 inhibitor makrofaga. Ove efektorne funkcije citokina u prirodnom

imunom odgovoru ispoljavaju se prema razliitim klasama mirkroorganizama.

Tabela 5.3. Citokini urodjenog imuniteta

CITOKIN VELIINA GLAVNI ELIJSKI IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE i BIOLOŠKI EFEKTI

TNF 17 kDa; 51-kDahomotrimer

Makrofage, T elije

Endotelijalne elije: aktivacija (inflamacija; koagulacija)Neutrofili: aktivacija

Hipotalamus: groznicaJetra: sinteza proteina akutne-fazeMišii i masno tkivo: katabolizamMnogi elijski tipovi: apoptoza

IL-117 kDa zrela forma33-kDa prekursor

Makrofage, endotelijalne elije,neke epitelijalne elije

Endotelijalne elije: aktivacija (inflamacija; koagulacija)Hipotalamus: groznicaJetra: sinteza proteina kutne-faze

Hemokini 8-12 kDa Makrofage, endotelijalne elije, Telije, fibroblasti, trombociti

Leukociti: hemotaksija; aktivacija; migracija u tkiva

IL-12 Heterodimer od:35-kDa+40-kDa

Makrofage, dendritske elije T elije: diferencijacija TH1 elija

NK elije i T elije: sinteza IFN-; poveanje citolitike aktivnosti

Tip I IFNs:IFN- IFN-IFN-: 15-21 kDaIFN-: 20-25 kDa

IFN-: makrofageIFN-: fibroblasti

Sve elije: doprinose antiviralnom stanju; poveanje ekspresije MHC I

IL-10 Homodimer od 30-40 kDa

Makrofage, T elije (uglavnom TH2)

Makrofage, dendritske elije: inhibicija produkcije IL-12i ekpresija kostimulatora i MHC II

IL-6 19-26 kDa Makrofage, endot elijalne elije,T elije

Jetra: sinteza proteina kutne-fazeB elije: proliferacija efektornih elija koje produkuju antitela

IL-15 13 kDa Makrofage, druge elije NK elije: proliferacija; T elije: proliferacija memorijskih CD8+ elia

IL-18 17 kDa Makrofage NK elije i T elije: sinteza IFN-;


5.1.2.1. Faktor nekroze tumora (engl. T umor N ecrosis F actor – TNF)





122

TNF je glavni medijator akutnog inflamatornog odgovora na gram-negativne bakterije i

druge infektivne mikroorganizme i odgovoran je za mnoge sistemske komplikacije u ozbiljniminfekcijama (TNF se još naziva TNF-

iz istorijskih razloga, da bi se razlikovao od blisko povezanog

TNF- ili limfotoksina). TNF je prvobitno identifikovan i nazvan kao supstanca prisutna u

serumu životinja tretiranih bakterijskim endotoksinom, lipopolisaharidom (LPS), koji prouzrokuje

nekrozu tumora u in vivo uslovima, a što je zapravo posledica patoloških komplikacija usled

velikih koncentracija TNF. Najvei elijski izvor TNF su aktivirani mononuklearni fagociti, iako

i antigenom-stimulisani T limfociti, NK elije i mastociti takodje mogu da sekretuju ovaj proteini.

Najsnažniji stimulus koji poveava produkciju TNF od strane makrofaga je LPS, a najvea

koliina TNF može biti produkovana u infekciji gram-negativnim bakterijama koje sekretuju LPS.

IFN- sekretovan iz T elija i NK elija, stimuliše sintezu TNF od strane LPS-stimulisanih

makrofaga.

Postoje dva razliita TNF

receptora koja se razlikuju po veliini

molekula: 55 kDa je tip I TNF receptor

(TNF-RI) ili p55 receptor, dok je 75

kDa tzv. tip II TNF receptor (TNF-RII)ili p75 receptor. Afinitet ovih

receptora za TNF je neobino mali, ali

su prisutni na membrani skoro svih

ispitivanih elija. TNF receptori su

lanovi velike familije proteina, od

kojih su mnogi ukljueni u imunom i

infalmantornom odgovoru. Aktivacija TNF receptora može da stimuliše

ekspresiju gena (Slika 5.4A) i/ili da

indukuje apoptozu (Slika 5.4B).

Slika 5.4. Signalna transdukcija preko TNF receptora.TNF-R1 može stimulisati ekspresiju gena (A) ili indukovari

apoptozu (B). Oba razliita efekta idu preko proteina adaptera(TRADD, TRAF, RIP) koji vode do ekspresije gena ili preko

adaptera FADD koji vodi eliju do apoptoze. Aktivacijom TNFreceptora dolazi do indukcije gena koji kodiraju medijatore

inflamacije, kao i gena koji kodiraju antiapoptotine proteine.

Biološki efekti TNF. Glavna fiziološka funkcija TNF je da stimuliše „regrutovanje“ i

„dopremanje“ neutrofila i monocita do mesta infekcije i da aktivira ove elije da iskorene

k ( l k ) d f k k i l ij k i i k l ih





123

mikroorganizme (Slika 5.5.). TNF posreduje ove efekte preko stimulacije aktivnosti vaskularnih

endotelijalnih elija i leukocita. TNF prouzrokuje da vaskularne endotelijalne elije ekspresujuadhezione molekule i time ine površinu endotela adhezivnom za leukocite, inicijalno samo za

neutrofile, a kasnije i za monocite i limfocite. Najvažniji adhezioni molekuli za pomenute elije su

selektini i ligandi za integrine. TNF stimuliše endotelijalne elije i makrofage da sekretuju

hemokine koji poveavaju afinitet leukocitnih integrina za njihove ligande, a i indukuje

hemotaksiju leukocita i njihovo „regrutovanje“ do mesta infekcije. TNF stimuliše mikorobicidnu

aktivnost neutrofila i makrofaga, a u in vitro uslovima indukuje apoptozu. U ozbiljnim

infekcijama TNF se produkuje u ogromnim koliinama i prouzrokuje sistemske klinike i

patološke abnormalnosti (preko hipota-

lamusa indukuje groznicu te se naziva

endogeni pirogen; u jetri poveava sintezu

serumskih proteina kao što su serum

amiloid A protein i fibrinogen, a koji su

ukljueni u akutnoj-fazi odgovora na

inflamatorne stimuluse; prouzrokuje

intravaskularnu trombozu; velikekoncentracije cirkulišueg TNF inhibišu

kontrakcije miokarda i tonus vaskularnih

glatkih mišia, kao i pad koncentracije

glukoze u krvi do niova nepodobnog za

život; itd).

Slika 5.5. Biološki efekti TNF.Pri niskoj koncentraciji TNF deluje na leukocite i endotelijum tako štoindukuje akutnu inflamaciju. Kako koncentracija raste TNF posreduje

u sistemskim efektima inflamacije. Pri visokim koncentracijama TNFizaziva patološke abnormalnosti i septiki šok.

5.1.2.2. Interleukin-1 (IL-1)

Glavna funkcija IL-1 je, slino kao i TNF, posredovanje u inflamatornom odgovoru

organizma na infekciju i druge inflamatorne stimuluse. Ovaj citokin, zajedno sa TNF funkcioniše

u urodjenom imunitetu i inflamaciji.

Glavni intraelijski izvor IL-1 su, kao i za TNF aktivirani mononuklearni fagociti. Za

razliku od TNF i neke druge elije (makrofagi, neutrofili, epitelijalne elije-keratinociti i

d t lij l lij ) d d k j IL 1 P d k ij IL 1 j ti li d t LPS i





124

endotelijalne elije) mogu da produkuju IL-1. Produkcija IL-1 je stimulisana od strane LPS i

TNF. Postoje dve forme IL-1: IL-1 i IL-1 sa manje od 35% medjusobne homologije, ali se vezujuza iste receptore na površini membrane elija. Oba se sintetišu od prekursora (33-kDa), a

sekretuju kao zrele forme proteina (17 kDa).

Okarakterisane su dve vrste membranskih receptora za IL-1 i obe su lanovi Ig

superfamilije. Tip I receptor je ekspresovan u skoro svim elijskim tipovima i on je glavni

receptor preko koga IL-1 posreduje odgovore. Tip II receptor je ekspresovan na membrani B

elija, ali njegova ekspresija može biti indukovana i u drugim elijama. Vezvanje IL-1 za tip I

receptor vodi ka aktivaciji kinaze koja se zove „sa IL-1 receptorom-asocirana kinaza“ (engl. IL-1

Receptor Associated Kinase - IRAK) i konano aktivaciji NF-kapaB i AP-1 transkripcionih faktora

(Slika 5.4.).

Biološki efekti IL-1 su vrlo slini kao i TNF i zavise od koliine produkovanog citokina.

Sekretovan u malim koncentracijama IL-1 funkcioniše kao medijator lokalne inflamacije i

aktivira endotelijalne elije da poveaju ekpresiju površinskih molekula (ligandi za integrine) koji

posreduju u adheziji leukocita. Sekretovan u veim koliinama IL-1 ulazi u cirkulaciju i

prouzrokuje endokrine efekte. Sistemski IL-1 slino kao TNF prouzrokuje groznicu, indukuje

sintezu proteina akutne-faze, itd. Slinost izmedjue efekata IL-1 i TNF je iznenadjujua s obziromda su ovi citokini i njihovi receptori strukturalno veoma razliiti. Prihvatljivo objašnjenje za sline

biološke efekte je da oba citokina vezujui se za svoje receptore aktiviraju sline puteve signalne

transdukcije i iste transkripcione faktore (Slika 5.4.).

5.1.2.3. Hemokini

Hemokini su velika familija strukturalno homologih citokina koji stimulišu kretanje

leukocita i regulišu migraciju leukocita iz krvi u tkiva. Ime hemokini je zapravo skraenica od„hemotaksini citokini“. Neki hemokini mogu biti produkovani od strane razliitih elija kao

odgovor na inflamatorne stimuluse i imati ulogu u regrutovanju leukocita do mesta infekcije.

Drugi hemokini se produkuju u normalnim, fiziološkim uslovima u razliitim tkivima i regrutuju

leukocite (uglavnom limfocite) do datih tkiva i u odsustvu inflamacije.

Svi hemokini su polipeptidi (8- do 12-kDa) koji sadrže dve internalne disulfidne petlje.

Identifikovano je oko 50 razliitih hemokina, a verovatno ih ima još mnogo više. Na osnovu broja i

lokacije N-terminalnih cisteinskih rezidua (ostataka) izvršena je klasifikacija hemokina u familije.

Dve najvee subfamilije su: CC (cisteinske rezidue su povezane) i CXC (cisteinske rezidue su

odvojene jednom amino kiselinom). U inflamaciji, hemokini CXC familije deluju uglavnom na

neutrofile, dok CC hemokini deluju na monocite, limfocite i eozinofile. Mali broj hemokina ima

j d i t i (C f ilij ) ili d i t i d j t i i ki li (CX C)





125

jedan cistein (C familija) ili dva cisteina razdvojena sa tri amino kiseline (CX3C).

Hemokini ukljueni u inflamatornu reakciju se produkuju od strane leukocita, a kaoodgovor na spoljašnje stimuluse. Hemokini koji regulišu elijsko kretanje/“elijski saobraaj“

(engl . cell traffick) kroz tkiva se produkuju konstitutivno u elijama datih tkiva. Hemokine CC i

CXC subfamilija produkuju leukociti, kao i nekoliko tipova tkivnih elija (endotelijalne elije,

epitelijalne elije i fibroblasti). U mnogim od ovih elija sekrecija hemokina je indukovana

mikroorganizmima i inflamatornim citokinima (uglavnom TNF i IL-1). Nekoliko CC hemokina je

produkovano od strane antigenima-stimulisanih T elija, te na taj nain ovi citokini predstavljaju

vezu izmedju adaptivnog imuniteta i regrutovanja inflamatornih leukocita. Neki hemokini se

produkuju konstitutivno (bez ikakvog inflamatornog stimusa) u limfoidnim organima i oni su

ukljueni u regulaciju fiziološkog kretanja/“saobraaja“ limfocita kroz organe.

Identifikovano je skoro deset odvojenih i razliitih receptora za CC hemokine (CCR1 do

CCR10) i šest za CXC hemokine (CXCR1 do CXCR6), a smatra se da lista receptora nije

kompletna. Hemokinski receptori su ekspresovani na leukocitima, a posebno je velika

raznovrsnost ovih receptora na T elijama. Receptori ispoljavaju preklapanje u specifinosti prema

citokinima, a obrazac elijske ekspresije receptora determiniše koji tip elija e odgovoriti na koji

hemokin, a time i kakav e biti biološki efekat. Svi hemokinski receptori imaju karakteristinustrukturu sa sedam-transmembranskih -heliks domena (GPCR).

Biološki efekat hemokina. Hemokini su otkriveni na osnovu njihove sposobnosti da budu

hemoatraktanti leukocita, ali se danas zna da oni obavljaju veliki broj važnih funkcija u imunom

sistemu, kao i u drugim sistemima u organizmu. Hemokini regrutuju odbrambene elije

organizma domaina do mesta infekcije; regulišu kretanje limfocita i drugih leukocita kroz

periferna limfatina tkiva; ukljueni su u razvoj razliitih ne limfatinih organa ( „knock-out“

miševi za CXCR4 receptor ispoljavaju fatalan poremeaj u razvoju srca i cerebeluma) itd.


IL-12 je glavni medijator ranog urodjenog imunog odgovora na intracelularne

mikroorganizme, ali i kljuni podstreka/inducer elijama-posredovanog imuniteta tj. adaptivnog

imunog odgovora na date mikroorganizme.

IL-12 postoji kao heterodimer od 35-kDa (p35) i 40-kDa (p40) subjedinica povezanih

disulfidnim mostom. Glavni izvor IL-12 su aktivirani mononuklearni fagociti i dendritske elije.

Mnoge elije sintetišu p35 subjedinicu, ali jedino pomenute APC produkuju komponentu p40, te

time i biološki aktivnu heterodimernu molekulu IL-12. Produkcija ovog citokina je indukovana

tokom urodjenog imunog odgovora, a kao odgovor na stimulaciju mikroorganizmima, ukljuujui i

LPS infekciju intracelularnim bakterijama kao i virusnu infekciju Takodje antigenima





126

LPS, infekciju intracelularnim bakterijama, kao i virusnu infekciju. Takodje, antigenima-

stimulisane T elije pomonice indukuju produkciju IL-12 iz makrofaga i dendritskih elija,uglavnom preko CD40 liganda koji interaguje sa CD40 na makrofagima i dendritskim elijama.

Receptor za IL-12 je je hetero-dimer sastavljen od 1 i 2 subjedinice. Oba lanca su

neophodna za veliki afinitet prema citokinu, a 2 je ukljuen u signaling. Ovaj receptor prenosi

signal preko JAK/STAT puta. U ovom signalnom putu vezivanje citokina za receptor aktivira

tirozin kinaze koja su

asocirane sa receptorom i

zovu se Janus kinaze (engl.

JAnus Kinases – JAKs), što

konano vodi ka aktivaciji

transkripcionih faktora koji

se zovu signal transduceri i

aktivatori transkripcije

(Signal Transducers and

Activators of Transcription –

STATs). Mnogi citokinikoriste ovaj put da indukuju

odgovore u ciljnim elijama,

a razliiti citokini aktiviraju

razliite kombinacije JAKs i

STATs (Slika 5.6.).

Slika 5.6. Transdukcija signala od IL-12aktiviranog receptora preko JAK/STATsignalnog puta.Vezivanje citokina za receptor vodi aktivaciji JAKi fosforilaciji receptora koji vezuje STAT. JAKfosforiliše STAT, dolazi do dimerizacije i

migracije STAT u nukleus koji aktiviratranskripciju gena.

Biološki efekti IL-12. Ovaj citokin je neophodan za indukovanje niza odgovora koji ukljuuju

makrofage, NK elije i T limfocite, a koji kao rezultat imaju iskorenjivanje intraelijskih

mikroorganizama ili antigena (Slika 5.7.). IL-12 stimuliše NK elije i T limfocite da produkuju

IFN-. Makrofagi produkuju IL-12 kao odgovor na mnoge mikroorganizme. Sekretovani IL-12

stimuliše NL elije i T elije da produkuju IFN- koji onda aktivira makrofage da ubiju fagocitirani

mikroorganizam (Slika 5 7 ) Prema





127

mikroorganizam (Slika 5.7.). Prema

tome, urodjeni imunitet je posredovancitokinima po navedenom sledu

reakcija: mikroorganizamodgovor

makrofagaIL-12IFN-aktivacija

makrofaga uništavanje mikroorga-

nizama. IL-12 stimuliše diferenci-

jaciju CD4+ pomonih T limfocita u

IFN-

produkujue TH1 elije. Takodje,

pojaava citolitiku funkciju aktivi-

ranih NK elija i CD8+ citolitikih T

limfocita (CTLs). IL-12 je veoma važna

spona izmedju urodjenog i adaptivnog

imuniteta jer se produkuje tokom rane

reakcije urodjenog imuniteta na

intracelularne mikroorganizama, a

stimuliše adaptivni imuni odgovor kojištiti organizam domaina od tih datih

mikroorganizama.

Slika 5.7. Biološki efekti i uloga IL-12.IL-12 produkuju makrofagi i dendritske elije kojeodgovaraju na mikrobe i na signale T elija. IL-12 delujena T limfocite i elije prirodne ubice i stimuliše ih na

citotoksinu aktivnost kao i da produkuju INF-.

5.1.2.5. Tip I interferoni (IFNs)

Tip I interferoni posreduju u ranom odgovoru urodjenog imunog sistema na viralne

infekcije. Interferone tipa jedan ine dve razliite grupe proteina: IFN- i IFN-. IFN- predstavlja

zapravo familiju od 20 strukturalno slinih polipeptida od kojih je svaki kodiran odvojenim

genom. Osnovni izvor IFN- su mononuklearni fagociti, a IFN- se ponekada naziva leukocitni

interferon. IFN- je jedan protein koga produkuju razne elije, ukljuujui i fibroblaste, pa se

nekada naziva fibroblastni interferon. Najvei stimulus za sintezu interferona tipa I je viralna

infekcija, a posebno dvostruki lanac RNK koga produkuju virusi tokom njihove replikacije u

inficiranoj eliji. Ovaj fenomen se esto koristi u eksperimentalne svrhe sa sintetikim dvostrukim

lancem RNK koji mimikrira signal produkovan tokom viralne infekcije Takodje antigenima





128

lancem RNK koji mimikrira signal produkovan tokom viralne infekcije. Takodje, antigenima-

aktivirane T elije stimulišu mononuklearne fagocite da sintetišu interferone tipa I.Iako su IFN- i IFN- strukturalno razliiti oni se vezuju za isti receptor na površini

membrane elija i indukuju sline biološke odgovore. Receptor za interferon tip I je heterodimer

sastavljen od dva polipeptida slinih struktura (oba lanca pripadaju citokinskim receptorima

tip II), pri emu jedan vezuje citokin, a drugi prenosi signal preko JAK/STAT signalnog puta.

Biološki efekti interferona tip I su usmereni u pogledu zaštite organizma od viralnih

infekcija i stimulaciji elijama-posredovanog imuniteta protiv mikroorganizama (Slika 5.8.).

Ovi interferoni inhibišu viralnu replikaciju tako što produkuju paletu enzima (npr. 2',5'

oligoadenilat sintetaza) koji remete transkripciju viralne RNK ili DNK i viralnu replikaciju.

Antiviralni efekat interferona tip I je primarno parakrini efekat u kojem virusima-inficirana elija

sekretuje interferone tipa I u cilju zaštite susednih elija koje još uvek nisu inficirane. Za eliju

koja je odgovorila na interferone tipa I i rezistentna je na viralnu infekciju se kaže da je u

„antiviralnom stanju“. Interferoni tipa I

sekretovani od strane inficirane elije

mogu takodje, u autokrinom maniru,

inhibisati viralnu replikaciju u samojeliji koja ih je produkovala. Interferoni

tipa I poveavaju ekspresiju klase I

MHC molekula; stimulišu razvoj TH1

elija; u in vitro uslovima inhibišu

proliferaciju nekih elija, ukljuujui i

limfocite; itd. Prema tome, glavna

aktivnost funkcije interferona tipa I jeusmerena ka radikalnom iskorenjivanju

viralne infekcije. Knock-out miševi kojima

nedostaje receptor za interferone tipa I su

veoma podložni viralnim infekcijama.

Slika 5.8. Biološki efekti interferona tipa I.Produkuju ih makrofagi i elije zaražene virusom. Inhibirajuvirusnu infekciju i poveavaju aktivnost citotiksinih T limfocita

(CTL) protiv virusom zaraženih elija.

IFN- se primenjuje u klinici kao anti-

viralni agens u specifinim formama hepaitisa, dok se IFN- koristi u terapiji multiple skleroze, ali

mehanizam kojim on postiže ovaj veoma koristan efekat nije poznat.





129


Ovaj citokin je inhibitor aktivacije makrofaga i dendritskih elije, te je zbog toga

ukljuen u kontrolu reakcija i mehanizama urodjenog imuniteta, ali i elijama-posredovanog

adaptivnog imunog odgovora. IL-10 ima 4--helinu globularnu domensku strukturu i vezuje se

za tip II citokinski receptor. Produkuje se uglavnom od strane aktiviranih makrofaga, a zato što

imhibiše funkciju makrofaga koji su ga sintetisali lep je primer negativne povratne sprege u

imunom sistemu. Nije jasno pokazano da li razliiti stimulusi mogu da deluju na makrofage i

indukuju produkciju regulatornih citokina kao što je IL-10 i efektornih citokina kao što su TNF i

IL-12, ili isti stimulusi uslovljavaju produkciju svih ovih citokina, ali razliitom kinetikom. T

limfociti takodje produkuju IL-10, a on je takodje sekretovan i od strane nekih nelimfatinih

tipova elija (npr. keratinocita).

Biološki efekti IL-10 su rezultat njegove sposobnosti da inhibiše mnoge funkcije

aktiviranih makrofaga. Kao što je ranije napomenuto, makrofagi odgovaraju na mikroorganizme

sekrecijom citokina i ekspresijom kostimulatora koji pojaavaju aktivaciju T elija i elijama-

posredovani imuni odgovor. IL-10 deluje na aktivirane makrofage u smislu terminacije odgovora

i iniciranja povratka u stanje mirovanja nakon što je infekcija iskorenjena. IL-10 inhibišeprodukciju IL-12 preko aktivacije makrofaga i dendritskih elija. S obzirom da je IL-12 najvažniji

stimulator sekrecije INF- i pojaiva i urodjenog i elijama-posredovanog imunog odgovora

uperenog protiv intracelularnih antigena, IL-10 funkcioniše tako što inhibiše sve ove reakcije,

delujui kao inhibitor IL-12 (tako je i otkriven). IL-10 inhibiše ekspresiju kostimulatora i klase

II MHC molekula na makrofagama i dendritskim elijama i zbog ove funkcije se koristi u

inhibiciji aktivacije T elija i elijama-posredovanih imunih reakcija. Interesantno je da Epstein-

Barr virus sadrži gen homolog humanom IL-10 i da viralni IL-10 ispoljava iste aktivnosti kaoprirodni citokin. Ovo saznanje je otvorilo intrigantnu mogunost da je tokom evolucije virusa

sticanje IL-10 gena dalo virusu mogunost da inhibiše imunitet domaina, a time i savlada

prepreke i preživi u elijama inficiranog organizma.

5.1.2.7. Drugi citokini urodjenog imuniteta

Pored prethodno navedenih, itava plejada drugih citokina, ija funkcija još uvek nije

precizno definisana uetvuje u mehanizmima koje urodjeni imuni sistem koristi da bi se odbranio

od štenih agenasa, a neki od njih uestvuju i u adaptivnom imunom odgovoru.

IL-6 stimuliše sintezu proteina akutne-faze u urodjenom imunitetu te doprinosi

sitemskom efektu inflamacije tzv. odgvoru akutne-faze (engl. acute-phase response); zajedno sa

kolonija-stimulirajuim faktorima (engl Colony Stimulating Factors - CSFs) stimuliše produkciju





130

kolonija stimulirajuim faktorima (engl. Colony Stimulating Factors CSFs) stimuliše produkciju

neutrofila od progenitornih elija kosne srži; u adaptivnom imunitetu stimuliše rast Blimfocita; itd. IL-15 stimuliše proliferaciju NK elija; deluje kao faktor rasta i preživljavanja T

elija, a posebno dugo-živeih memorijskih CD8+ elija. IL-18 je strukturalno homolog IL-1 i

prenosi signal preko slinih receptor-asociranih kinaza (IRAK), ali ima razliite funkcije. IL-18

stimuliše NK elije i T elije da produkuju IFN- i deluje sinergistiki sa IL-12 u pogledu ovog

efekta. Zbog toga je on inducer elijama-posredovanog imuniteta, posebno u kombinaciji sa IL-12.

Neki od citokina (IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 i IL-26) su identifikovani po sekvenci koja je

homologa familiji IL-10 slinih citokina. Smatra se da oni regulišu inflamatornu reakciju u

tkivma, ali specifine fiziološke funkcije nisu precizno definisane. IL-23 i IL-27 su po strukturi

slini IL-12 i kao IL-12 stimulišu produkciju IFN- od strane NK elija i T elija. Neka istraživanja

pokazuju da je IL-12 veoma važan za fiziološku funkciju odbrane uperene protiv intracelularnih

mikroorganizama, dok je IL-23 više važan u TH1-posredovanoj inflamatornoj reakciji.

5.1.2.8. Uloga citokina u urodjenom imunitetu i inflamaciji

S obzirom da su u ranijem tekstu pojedinano opisani citokini urodjenog imuniteta, korisno je

integrisati ove informacije i razmotriti kako i u kolikoj meri pomenuti citokini doprinosereakcijama urodjenog imunog odgovora uperenog protiv antigena. Razliiti citokini igraju kljune

uloge u urodjenom imunitetu prema razliitima klasama mikroorganizama. Citokini koji posre-

duju u urodjenom imunom odgovoru su

sekretovani uglavnom od strane aktiviranih

makrofaga. TNF i IL-1 su medijatori akutne

inflamacione reakcije na mikrobe; hemo-

kini regrutuju leukocite na mesto inflama-cije; IL-12 stimuliše produkciju IFN-; tip I

interferoni su antiviralni citokini i IL-10 je

inhibitor makrofaga.

Slika 5.9. Uloga citokina u urodjenom imunitetu.LPS deluje na makrofage tako što indukuje sekreciju brojnih citokina,(TNF, IL-1, IL-2, TNF i IL-1) koji stimulišu akutnu inflamaciju deluju i na

endotelijalne elije i leukocite. IL-12 stimuliše produkciju IFN-. U serumu

se mogu odreivati TNF, IL-1, IL-12 i IFN- . Antagonisti TNF, IL-12 i IFN- smanjuju patološke komplikacije sepse, a opada i smrtnost vezana zaseptini šok.

Citokin koji se u najveoj koliini produkuje iz aktiviranih makrofaga, a kao reakcija na

razliite mikroorganizme, odgovoran je za prirodu odgovora urodjenog imuniteta prema

mikroorganizmu koji je prouzrokovao aktivaciju makrofaga.





131

mikroorganizmu koji je prouzrokovao aktivaciju makrofaga.

5.1.3. Citokini koji posreduju i regulišu adaptivni imunitet

Citokini posreduju u proliferaciji i diferencijaciji limfocita nakon prepoznavanja antigena u

aktivacionoj fazi adaptivnog imunog odgovora i posreduju u aktivaciji specijalizovanih

efektornih elija u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora. Produkcija citokina je glavni

odgovor T limfocita na prepoznavanje antigena. Izlaganje razliitim tipovima antigena može

indukovati diferencijaciju CD4+ pomonih T elija u razliite efektorne populacije kao što su T H1 i

T H2, koje produkuju razliite setove citokina i obezbedjuju razliite funkcije (Tabela 5.4.)

Tabela 5.4. Citokini adaptivnog imuniteta

CITOKIN VELIINA GLAVNI EL. IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE i BIOLOŠKI EFEKTI

IL-2 14-17 kDa T elije

T elije: proliferacija; poveana sinteza citokina; potencirana Fas-ind. apoptoza

NK elije: proliferacija; aktivacija

B elije: proliferacija; sinteza antitela (in vitro)

IL-4 18 kDa

CD4+ T elije (TH2)

Mastocite

B elije: »isotype swiching« u IgE; T elije: difrencijacija TH2; proliferacija

Makrofage: inhibicija IFN--posredovane aktivacije;Mastocite: proliferacija (in vitro)

IL-5 45-50 kDa od20-kDa subjed.

CD4+ T elije (TH2) Eoz inof il i: akt ivac ija; poveana produkcija B elije: proliferacija; produkcija IgA

IFN-50 kDa glikozilisani

homodimer od

21- 24- kDa subj.

T elije (TH1, CD8+ T elije)

NK elije

Makrofage: aktivacija (poveanje mikrobicidne funkcije)B elije: »isotype swiching« u opsoniz. i komplemenom-fiksiranim IgG subklas.T elije: TH1 diferencijacija

Neke druge elije: poveavaju ekspresiju MHC I i MHC II; poveavajuprocesovanje i prezentaciju T elijama

TGF-

25 kDahomodimer od

12.5- kDa subjed.

T elije

makrofagedrugi tipovi elija

T elije: inhibicija proliferacije i efektorne funkcije

B elije: inhibicija proliferacije; produkcija IgAMakrofage: inhibicija

LT21-24 kDa heterotrimer

Ili vezan sa LT2

T elije (uglavnom TH2 Regrutovanje i ak tivaci je neutrofi la

Limfoidna organogeneza

IL-13 15 kDa CD4+ T elije (TH2) B elije: »isotype swiching« u Ig E; Epitelijalne elije: poveanje produkcijemukusa; Makrofage: inhibicija



IL-2 je faktor rasta za antigenima-stimulisane T limfocite i odgovoran je za klonalnu

ekspanziju T elija. Zbog ove osobine se nakon otkrivanja zvao faktor rasta T elija. Ovaj citokin





132

p j j g j j j

u najveoj meri produkuju T

elije, a deluje uglavnom na

elije koje su ga produkovale tj. kao

autokrini faktor rasta.

IL-2 je glikoprotein u formi globularnog proteina koji sadrži 4--heliksa i prototip je

citokina koji u svojoj strukturi imaju 4-

-heliksa a interaguju sa citokinskim receptorima tip

II. Ekspresija funkcionalnih receptora je pojaana stimulacijom sa antigenom (Slika 5.10.). Stoga

su T elije koje prepoznaju antigen one koje prve proliferišu kao odgovor na produkciju IL-2 tokom

adaptivnog imunog odgovora. Vezivanje IL-2 za njegov receptor rezultuje aktiviranjem velikog

broja puteva transdu-

kcije signala, ukljuu-

jui JAK/STAT (ugla-

vnom JAK1 i JAK3

aktiviraju STAT5) koji

je unikatni za citokine,

ali i fosfatidil-inozitol-

3 kinazu i Ras-MAP

signalne puteve koji seaktiviraju velikim bro-

jem receptora.

Slika 5.10. Regulacija ekspresijeIL-2 receptora.Naivni T limfociti ekpresuju IL-2Rkompleks koji ima umereni afinitet

prema IL-2. Aktivacija T elija

antigenom, kostimulatori, kao i IL-2 sampo sebi indukuju ekspresiju vee

koliine IL-2R lanca i formiranju IL-

2R kompleksa velikog afiniteta.

Biološki efekti IL-2 se, pored stimulacije rasta i klonalne ekspanzije T elija, ogledaju u

nekoliko veoma važnih uloga u adaptivnom imunom odgovoru (Slika 5.11.). IL-2, produkovan kao

odgovor na prepoznavanje antigena od strane T elija, je odgovoran za proliferaciju antigen-

specifinih elija. Izlaganje T elija IL-2 dovodi do veoma brzog porasta u koncentraciji ciklina

koji su asocirani i aktiviraju razliite ciklin-zavisne kinase, što konano dovodi do fosforilacije

proteina kao što su Rb koji stimuliše tranziciju od G1 do S faze u elijskom ciklusu. Pored toga,

IL-2 stimuliše proliferaciju i diferencijaciju drugih elija imunog sistema: stimuliše rast NK

elija, i pojaava njihovu citolitiku funkciju i stimuliše nastajanje tzv. limfokinima-aktiviranih

ubilakih elija (engl. L imphokine-





133

j ( g p

Activated Killer cells – LAK cells ). IL-2 ima funkciju „terminatora“ imu-

nog odgovora preko stimulacije

razvoja i funkcije regulatornih T

elija i potenciranja apoptoze T

elija preko Fas signalnog puta.

Slika 5.11. Biološki efekti IL-2.IL-2 stimuliše proliferaciju i diferencijaciju T i B limfocita i NKelija. IL-2 takoe funkcioniše kao inhibitor imunog odgovora(protiv sopstvenih antigena) promovišui Fas-posredovanu

apoptozu T elija i stimulišui aktivnost regulatornih T elija(ovde nije prikazano).


IL-4 je glavni stimulus za produkciju IgE antitela i za razvoj TH2 elija od naivnih

CD4 pomonih T elija. IL-4 je „zaštitni znak“ i obeležje TH2 elija i funkcioniše i kao citokin koji

indukuje razvoj ovih elija (inducer), ali i kao posrednik u njihovom efektu (efektor). Glavni izvorIL-4 su CD4+ T limfociti iz podgrupe TH2, kao i aktivirani mastociti i bazofili.

IL-4 je prototip citokina koji u svojoj strukturi imaju 4--heliksa, te i pripada familiji

citokina sa 4-

-helikalnom strukturom. IL-4 receptor pripada familiji tip I citokinskih

receptora. Struktura IL-4 receptora limfatinih elija sadrži citokin-vezujui lanac i asociran

je sa c lancem zajednikim za sve citokinske receptore. IL/4 receptor transdukuje signal preko

JAK/STAT puta (JAK3 ili4/STAT6), kao i preko signalnih puteva koji ukljuuju supstrat koji je

odgovoran za insulin (engl. Insulin Responsible Supstrate - IRS) IRS-2. IL-4 je jedini citokin kojiaktivira STAT6 protein koji aktivira transkripciju gena odgovornih za mnoge efekte IL-4 kao što

su diferencijacija TH2 elija, kao i produkcija IgE. Aktivacija IRS-2 signalnog puta je odgovorna

za IL-4 indukovanu proliferaciju elija. U nelimfatinim elijama lanac IL-4 receptora nije

asociran sa c lancem, nego sa signalnim lancom koji je takodje komponeneta receptora za IL-13.

Biološki efekti IL-4 ukljuuju stimulaciju IgE i mastocitima/bazofilima posredovane

reakcije, kao i supresija reakcija zavisnih od makrofaga (Slika 5.12.). IL-4 je glavni citokin koji u B

limfocitima stimuliše „premeštanje“ tj. „class switching“ teškog Ig lanca u IgE izotip (videti tekst u

prethodnim poglavljima). IgE antitela imaju ulogu u eozinofilima-posredovanoj odbrani uperenoj

protiv infekcija helmintima i artropodama. IgE je takodje glavni medijator alergijskih reakcija, a

produkcija IL-4 je veoma važna za razvoj alergija. IL-4 stimuliše razvoj TH2 elija od naivnih

CD4+ T elija i funkcioniše kao autokrini faktor rasta za razliite TH2 elije, te je tako

odgovoran za indukcijiu i klonsku





134

g j

ekspanziju ove podgrupe Telija.

IL-4 antagonizira efekat IFN- u

pogledu aktivacije makrofaga, pa

time zapravo inhibiše elijama-

posredovane reakcije.

Slika 5.12. Biološki efekti IL-4.IL-4 stimuliše B elije na tzv. „isotype class switching“ u

neke imunoglobulinske klase (npr. IgE); IL-4 stimulišediferencijaciju naivnih T elija u TH2; IL-4 inhibiše IFN-

indukovanu aktivaciju makrofaga; IL-4 je faktor rastamastocita, a posebno u kombinaciji sa IL-3.


IL-5 je aktivator eozinofila i služi kao link/veza izmedju aktivacije T elija i eozinofilne

inflamacije. Glavni izvor ovog citokina su elije TH2 podgrupe CD4+ T elija i aktivirani mastociti.

IL-5 je homodimer, a svaka od subjedinica sadrži 4--helikalni domen. IL-5 receptor je tip

I citokinskog receptora. Ovaj receptor asocira sa 150-kDa signal-transdukcionom subjedinicomkoju imaju i IL-3 i GM-CSF, a ponekad se zove uobiajeni/jednaki lanac. IL-5 signaling je

posredovan JAK/STAT signalnim putem.

Glavni biološki efekti IL-5 su da stimuliše razvoj i diferencijaciju eozinofila i da aktivira

zrele/maturirane eozinofile. Aktivirani eozinofili imaju sposobnost uništavanja helminata.

Eozinofili ekspresuju Fc receptore koji su specifini za IgE antitela i veoma su sposobni da vežu

IgE-obložene mikrobe i helminte. Prema tome, dva glavna citokina T H2 elija, IL-4 i IL-5

funkcionišu po narednom sledu dogadjaja: IL-4 stimuliše rodukciju IgE koji opsonizuje helminte ivezuje eoznofile, dok IL-5 aktivira eoznofile da unište parazita. Knock-out miševi kojima nedostaje

gen za IL-5 imaju deficit eozinofilnog odgovora i veoma su podložni infekcijama sa helmintima. IL-

5 stimuše proliferaciju B elija i produkciju IgA (tako je prvi put identifikovan).

5.1.3.4. Interferon-

(IFN-

)

IFN- je glavni citokin koji aktivira makrofage i ima kritinu i veoma važnu ulogu i u

urodjenom i u adaptivnom elijama-posredovanom imunitetu. IFN-

se još naziva

imuni ili tip II

IFN. Poseduje neku antiviralnu aktivnost, ali nije potentan antiviralni interferon, te funkcioniše

uglavnom kao efektorni citokin imunog odgovora. Produkuju ga NK elije, CD4+ TH1 elije i CD8+

T elije i obeležje je TH1 podgrupe pomonih T elija.

IFN- je homodimerni protein. Njegov receptor (tip II familija citokinskih receptora) se





135

sastoji od dva strukturno homologa polipeptida od kojih jedan veže citokine, a drugi participira usignalingu. Vezivanje citokina aktivira STAT1 koji onda stimuliše transkripciju „IFN--responsive“

gena (ukljuujui i gene koji kodiraju MHC molekule i B7 kostimulatore), enzima koji sintetišu

mikrobicidalne supstance (azot oksid) i citokine (p40 subjedinica IL-12). Razliiti „IFN--

responsive“ geni se aktivraju ili direktno STAT1 proteinom ili indirektno STAT1-indukovanom

aktivacijom druga dva transkripciona faktora (engl. INF response factor-1; class II transactivator).

STAT1 knock-out miševi su apsolutno nesenzitivni na delovanje IFN-.

Biološki efekti IFN- su veoma važni u elijama-posredovanom imunitetu uperenom

protiv intracelularnih antigena (Slika 5.13.). IFN- je tzv. makrofaga-aktivirajui citokin što daje

objašnjenje naina kojim T limfociti i NK elije aktiviraju makrofage u cilju uništavanja fagocitiranog

mikroorganizma. IFN- pojaava mikrobicidnu funkcju makrofaga stimulacijom sinteze reaktivnih

kiseoninih intermedijera/radikala i

azot oksida. Ovaj efekat se ostvaruje

aktivacijom transkripcije gena koji

kodiraju enzime neophodne za

stvaranje reaktivnih kiseoninihintermedijera (npr. oksidaza fago-

cita) i reaktivnih azotnih interme-

dijera (npr. inducibilna azot oksid

sintaza). Ovi reaktivni molekuli se

produkuju u lizozomima i oni uni-

štavaju mikroorganizme koji se

nalaze u sklopu fagozoma (detaljnijeo ovom efektornom mehanizmu u na-

rednom poglavlju).

Slika 5.13. Biološki efekti IFN-IFN- aktivira fagocite i APC i indukuje B elije kojeoslobaaju odreene izotipove Ig (koji esto vezujukomplement i Fc receptore na fagocitima i razlikuju seod izotipova indukovanih putem IL-4). TH1-indukujui

efekat IL-4 može biti indirektan, posredovan poveanomprodukcijom IL-12 i ekspresijom receptora.

IFN- stimuliše ekspresiju klase II MHC molekula i kostimulatora APCs . IFN- potpomaže

diferencijaciju naivnih CD4+ T elija u TH1 i inhibiše proliferaciju TH2 elija. Deo efekta na

indukciju T H1 elija je posredovan indirektno, aktiviranjem mononuklearnih fagocita da





136

produkuju IL-12 koji je glavni induktorni citokin T H1elija. IFN- deluje na B

elije i stimuliše

„switching“ (prebacivanje) u odredjene IgG subklase (IgG2a kod miševa) i inhibiše „switching“

u IL-4 zavisne tipove kao što su IgE i IgG1. IFN- aktivira neutrofile i stimuliše citolitiku

aktivnost NK elija. Sumirani efekat aktivnosti IFN- je da stimuliše makrofagima-bogato

obskrbljenu inflamatornu reakciju istovremeno inhibišui IgE-zavisnu eozinofilima-bogatu

rekciju. Knock-out miševi kojima nedostaje IFN- ili njegov receptor su veoma podložni

infekcijama prouzokovanim intracelularnim mikroorganizmima (npr. mikobakterija) zbog defekcije

u aktivaciji makrofaga.

5.1.3.5. Faktor transformacije rasta ( engl. T ransforming G rowth F actor- TGF-

)

Glavni efekat TGF- u humanom imunom sistemu je da inhibiše proliferaciju i

aktivaciju limofocita i drugih leukocita. Ovaj citokin je otkriven kao tumorski produkt koji

promoviše preživljavanje elija u poluvrstim medijumima za kultivisanje. Postoji zapravo familija

blisko povezanih molekula koji su kodirani razliitim genima a naješe se imenuju kao TGF-,

TGF- i TGF-. elije imunog sistema (antigenima-stimulisane T elije; LPS-aktivirani

mononuklearni fagociti i dr.) sintetišu uglvanom TGF-. TGF- je homodimer koji se sintetiše kao prekursor i aktivira proteolitikim „cepanjem“.

TGF- receptori su polipeptidi (tip I i tip II) velikog afiniteta za ovaj citokin, a singnaling je vezan

za serin/treonin kinazni domen, što na kraju rezultira fosforilacijom tzv. SMAD

transkripcionih faktora (SMADa).

Biološki efekti TGF- ukljuuju inhibiciju proliferacije i diferencijacije T elija i

aktivaciju makrofaga; stimulaciju produkcije IgA antitela koja su važna za mukozni imunitet

i ublažavanje efekta proinflamatornih citokina na neutrofile i eozinofile. TGF- ispoljava fiziološkepromene i na elije koje ne pripadaju imunom sistemu inhibišui ili stimulišui njihov rast i

proliferaciju. Ponekada ak u in vitro uslovima može da stimuliše ili inhibiše rast iste elijske

linije zavisno od uslova kulture i prisutnosti drugih biološki aktivnih molekula. TGF-

prouzrokuje sintezu proteina ekstracelularnog matriksa (kolagen), matriks-modifikujuih

enzima (matriksne metaloproteaze), kao i elijskih receptora za matriksne proteina (integrin), što

promoviše oporavak tkiva nakon lokalne imune reakcije, te inflamatorna reakcija može biti

kontrolisana.

5.1.3.6. Drugi citokini adaptivnog imuniteta

Pored navedenih, otkriven je i definisan znatan broj drugih citokina i njima slinih





137

molekula koji imaju funkciju u adaptivnom imunitetu.Limfotoksin (LT) je citokin koga produkuju T limfociti, ali ponekada i druge elije.

Strukturalno je slian (30% homologije) TNF i ima dosta slinih funkcija, te se stoga zove i TNF-.

Skretovana forma LT (nekada se zove LT ) je dimer, slino kao TNF, i vezuje se za TNF receptore.

LT je takodje ekspresovan i kao membranski protein kod koga je jedan lanac sekretovane forme

povezan sa dve subjedinice strukturalno-slinog membranskog proteina koji se zove LT (vezuje

se za razliite receptore koji takodje pripadaju TNF receptrskoj familiji). LT aktivra endotelijalne

elije i neutrofile, te je stoga medijator akutnog inflamatornog odgovora, obezbedjujui vezu

izmedju aktivacije T elija i inflamacije. Ovaj efekat je isti kao i efekat TNF zato što se vezuju

za iste receptore, ali je koliina cirkulišueg LT koji je produkovan od antigen-stimulisanih T elija

mnogo manji od koliine TNF produkovanog iz LPS-stimulisanih mononuklearnih fagocita. LT je

citokin koji obino lokalno deluje i nije medijator sistemske infekcije. Istraživanja na knock-out

miševima su pokazala da je LT neophodan za normalan razvoj limfoidnih organa. Miševi kojima

nedostaje membranski LT ili njegov receptor ispoljavaju brojne defekte u formiranju limfnih

vorova, Payer-ovih ploa i bele pulpe slezine. Kod ovih životinja nije normalan razvoj zone B elija

u limfnim organima i nema germinativnog centra u slezini. Smatra se da LT ima funkciju ulimfoidnoj organogenezi preko produkcije hemokina koji promovišu migraciju limfocita u posebne

delove limfnih organa.

Interleukin-13 (IL-13) je strukturno slian IL-4, a produkuju ga T H2 CD4+ T elije i neke

epitelijalne elije. Njegov receptor se uglavnom nalazi na nelimfoidnim elijama, kao što su

makrofagi, a može biti aktiviran vezivanjem ili IL-13 ili IL-4. IL-13 oponaša efekte IL-4 na

makrofage, ali ispoljava slabiji efekat na T ili B limfocite. Glavno delovanje je inhibicija aktivacije

makrofaga antagonistikim efektom na IFN-. IL-13 stimuliše produkciju mukusa od straneepitelijalnih elija plua, a smatra se promoviše produkciju IgE u alergijskim reakcijama.

Opisan je znaajan broj citokina ija fiziološka fukcija nije precizno definisana i nije

potpuno jasno da li se sekretuju i u fiziološkim uslovima ili su posledica patološko stanja

organizma: IL-16 (hemoatraktant eozinofila), IL-17 (stimuliše produkciju proinflamatornih

citokina, kao što su TNF, IL-1 i hemokin); IL-25 (stimuliše produkciju IL-4, IL-5 i IL-13);

migracije inhibišui faktor-MIF (imobiliše mononuklearne fagocite; ovo je bila prva opisna

citokinska aktivnost, ali se pokazala veoma komplikovanom biohemijska karakterizacija citokina

sa ovom funkcijom).

5.1.3.7. Uloga citokina T elija u specijalizovanom adaptivnom imunom odgovoru

Citokini adaptivnog imuniteta su kljuni za razvoj imunog sistema i aktivaciju efektornih elija





138

koje služe u eliminaciji mikroorganizama. Veliki broj specijalnosti adptivnog imunog sistema jerezultat delovanja citokina. Mnogi intracelularni mikroorganizmi (virusi i bakterije) indukuju

razvoj TH1 elija koje produkuju IFN- koji aktivira fagocite da unište mikroorganizam-okida

odgovora/reakcije i stimuliše produkciju antitela za opsonizaciju koja olakšavaju fagocitozu.

Suprotno, helmintski paraziti stimulišu razvoj TH2 koje produkuju IL-4 i IL-5, što dovodi do

pojaane produkcije za parazite specifinih IgE antitela (IL-4) koja oblažu parazite, kao i

aktivacije eozinofila (IL-5) koji vezuju IgE-opsonizovane parazite i uništavaju ih. Citokine su

neophodni za razvoj i efikasnog adaptivnog imunog odgovora. Sumirano, citokine koji posreduju i

regulišu funkcije adaptivnog imunog odgovora produkuju uglavnom antigen-stimulisani T

limfociti: IL-2 (osnovni faktor rasta T limfocita); IL-4 (stimuliše produkciju IgE i razvoj T H2 elija

pomonica od naivnih T H elija pomonica); IL-5 aktivira eozinofile; IFN- funkcioniše kao

aktivator makrofaga; TGF- inhibiše proliferaciju T limfocita i aktivaciju leukocita.

5.1.4. Citokini koji regulišu hematopoezu („hematopoezni“ citokini)

Citokini su neophodni za normalnu hematopoezu u kosnoj srži i obezbedjuju kosnoj srži

mogunost veoma preciznog i tananog naina odgovora na stimulaciju i regulaciju njene funkcije.

Neki od ranije pomenutih citokina koji se generišu tokom urodjenog i adaptivnog imunog

odgovora stimulišu rast i diferencijaciju progenitornih elija kosne srži, te tako imune i

inflamatorne reakcije koje „troše“ leukocite takodje pomažu produkciju novih leukocita. Zreli

leukociti nastaju od pluripotentne progenitorne stem elije opredeljivanjem i diferencijacijom

prema specifinoj liniji i progresivnom ekspanzijom progenitora (Slika 5.14.). Diferencijacija iekspanzija progenitornih elija kosne srži je stimulisana citokinima koji se zovu kolonija

stimulirajui faktori (engl. Colony Stimulating Factors - CSFs) zbog sposobnosti da stumulišu

formiranje kolonija u kulturi kosne srži. Delovanjem specifinih CSFs ove kolonije dobijaju

karakteristike specifinih linija (polimorfonuklearni fagociti, mononuklearni fagociti, limfociti i sl.),

te ime vezano za pojedini CSF (stem elija faktor je SCF; granulocita-monocita CSF je GM-CSF;

granulocita CSF je G-CSF; monocita CSF je M-CSF) reflektuje tip kolonija koji se dobija njegovim

delovanjem. Pored CSF, i interleukin-3 (IL-3) i interleukin-7 (IL-7) su citokini koji uestvuju u

regulaciji hematopoeze. U ovoj skripti su opisani samo oni citokini koji su važni za razvoj limfocita

(Tabela 5.5.), dok su citokini koji stimulišu maturaciju drugih e-lijskih linija uoblie-nih

elemenata krvi predmet tekstova iz hematologije (osnovni pojmovi o ovome se mogu nai u tekstu

skripte iz Uporedne fiziologije životinja; WUS Austria 2005).





139

Slika 5.14. Uloga citokina u hematopoezi.

CSF – colony-stimulating factor.CFU – colony-forming unit.

Tabela 5.5. Citokini koji regulišu hematopoezu

CITOKIN VELIINA GLAVNI EL. IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE GLAVNA POPULACIJA EL.





140

KOJU INDUKUJUFaktor stem elija 24 kDa Stromalne eli . kos . s rž i Pluripotentne stem elije Sve elije

IL-3 20-26 kDa T elije Nezreli progenitori Sve elije

IL-7 25 kDaFibroblasti, stromalne

elije kosne sržiNezreli limfoidni progenitori B i T limfocit i

GM-CSF 18- 22 kDaT elije, makrofagi,

endotelijalne . fibroblastiNezreli opredeljeni progenitori zreli/maturirani makofagi

Granulociti i monociti Aktivacija mak rofaga

M-CSF Dimer od: 70-90 kDa;40-kDa subj. Makrofagi, endotelijalne .,elije kosne srži, fibroblasti Opredeljeni progenitori Monociti

G-CSF 19 kDa Makrofagi, fibroblasti,endotelijalne elije

Opredeljeni progenitori Granulociti


5.1.4.1. Faktor stem elija (c-kit ligand)

Faktor stem elija sintetišu stromalne elije kosne srži u formi membranskog ili

sekretornog proteina kao produkt jednog gena (engl. alternative splicing of the RNA). Faktor stem

elija ili C-kit ligand je protein koji interaguje sa tirozin-kinaznim membranskim receptornim

proteinom (engl. c Kit or stem cell factor receptor) koji je produkt elijskog c-kit proto-onkogena, a

ekpresovan je na pluripotentnim stem elijama. Smatra se da je faktor stem elija neophodan i

odgovoran da uini stem elije kosne srži dostupnim za delovanje CSFs i omogui im odgovor na

druge CSFs, ali da sam po sebi ne prouzrokuje formiranje kolonija.


Ovaj interleukin se još zove faktor koji stimuliše formiranje nekoliko kolonijskih linija (engl.multilineage colony-stimulating factor or multi-CSF). Produkt je CD4+ T elija koje deluju na

nezrele progenitore u kosnoj srži i pomovišu ekspanziju elija koje se diferenciraju u sve zrele

elijske tipove. U strukturi IL-3 ima 4--helikalna lanca, a receptor se sastoji od citokin-vezujue

kompnente (tip I familija citokinskih receptora) i domena za transdukciju signala koji je isti kao i

kod IL-5 i GM-CSF receptora (kod oveka) ili unikatni (kod miša). Signaling IL-3 receptora ide

preko JAK/STAT puta. Pored stimulisanja razvoja veeg broja razliitih linija kolinija, IL-3

stimuiše rast i razvoj mastocita od progenitora, a ovaj efekat je pojaan IL-4.


Ovaj citokin je sekretovan od strane stromalnih elija u mnogim tkivima koja stimulišu

preživljavanje i ekspanziju nezrelih prekursora opredeljenih u pravcu B i T limocita. Strukturalno,





141

IL-7 sadrži 4--helikalna lanca, a receptor se sastoji od unikatnog IL-7 vezujueg domenaasociranog sa c lancem koji je prvi put identifikovan kao komponeneta IL-2 receptora. Signaling

IL-7 receptora ide preko JAK3 kinaze. Ovaj citokin je esencijalan za preživljavanje naivnih i

memorijskih T ellija, a posebno CD4+ memorijske elije.

5.1.4.4. Drugi hematopoezni citokini

GM-CSF, M-CSF i G-CSF su citokini produkovani od strane aktivirnih T elija, makrofaga,

endotelijalnih elija i elija kosne srži strome, a deluju na progenitore u cilju poveavanja

produkcije inflamatornih leukocita. CSF faktori su identifikovani i nazvani po njihovoj sposobnosti

da stimulišu rast kolonija leukocita u kulturi, a stimulišu i regulišu produkciju i razvoj leukocita

u koštanoj srži (leukopoezu). Oni imaju sposobnost da stimulišu deobu elija (mitozu) ali i

sazrevanje matinih elija. Maturirani (zreli) leukociti gube sposobnost mitoze. GM-CSF promoviše

maturaciju progenitora u dendritske elije i monocite. G-CSF se genenriše na mestu infekcije i

deluje kao endokrini regulator (hormon) u mobilizaciji neutrofila iz kosne srži koji bi zamenili

one koji su potrošeni u iinflamatornoj reakciji. Zahvaljujui tehnologiji rekombinantne DNK danas

je u klinikoj primeni nekoliko genetikim inženjeringom dizajniranih CSF (sargramostin ifilgrastim). Rekombinantne forme GM-CSF i G-CSF se koriste u stimulaciji kosne srži nakon

hemoterapije kancera ili transplantacije kosne srži Fascinantan aspekt hematopoeze je da je

produkcija leukocita delom regulisana ve postojeim leukocitima. Ova forma kontrole omoguava

da razvoj leukocita bude voma specifian i usmeravan prema potrebama organizma. Npr. ukoliko

postoji bakterijska infekcija, citokini koji se sekretuju od strane aktivniranih leukocita uestvuju

u sanaciji infekcije i stimulišu produkciju veeg broja neutrofila i makrofaga. Kompleksan proces

kojim se produkcija leukocita “poklapa” sa potrebama organizma još uvek nije jasan i razjašnjen.Svaki od CSF-a ima predominantna dejstva, ali svi CSF-i i interleukini imaju i meusobno

isprepletana dejstva. Dodatno, oni aktiviraju i održavaju zrele krvne elije. Interesantno je da su

geni za mnoge od ovih faktora locirani zajedno na dugom kraku hromozoma 5, pa je mogue da su

nastali duplikacijom predakog gena. Pored toga, interesantno je da je bazalna hematopoeza

normalna kod miševa kojima nedostaje GM-CSF, što ukazuje da gubitak jednog faktora može biti

nadomešten drugim, ali ne u svim funkcijama (npr. odsustvo GM-CSF dovodi do akumulacije

surfaktanata u pluima).

Interleukin-9 (IL-9) je citokin koji stimuliše rast T elijskih linija i progenitore mastocita u

kosnoj srži. Ovaj citokin ima c subjedinicu za signaling i koristi JAK/STAT signalni put.

Fiziološka funkcija ovog citokina nije jasno definisana.





142

Interleukin-11 (IL-11) produkuju stromalneelije kosne srži. Za transdukciju signalakoristi istu subjedinicu za signaling (gp130) kao IL-6 i JAK/STAT signalni put. Stimuliše

megakariocitopoezu, te se koristi u klinikom tretiranju pacijenata koji boluju od trombocitne

deficijencije nastale usled hemoterapije kancera.

Citokini obezbedjuju široki spektar raznovrsnih funkcija koji su kljuni za odbranu od patogena,

ali su i spona izmedju mehanizama prirodne i adaptivne otpornosti. Oni doprinose

specijalizaciji imunog odgovora aktivacijom specifinih tipova razliitih efektornih elija.

Pored toga, regulišu veliinu/snagu i prirodu imunog odgovora utii na rast i diferencijaciju

limfocita. I na kraju, citokini obezbedjuju veoma važan amplifikacioni mehanizam koji

omoguava malom broju limfocita koji su specifini za bilo koji pojedinani, specifini antigen,

široki spektar efektorinih mehanizama za eliminaciju antigena.

5.2. EFEKTORNI MEHANIZMI URODJENOG/NESPECIFINOG IMUNOG ODGOVORA

Urodjeni imunitet je prva odbrambena linija organizma. Svi višeelijski organizmi, ukljuujui





143

biljke, beskimenjake i ki

menjake poseduju urodjene mehanizme koji ih štite odmikroorganizama. Obzirom da su svi elementi kojima se ostvaruju ti mehanizmi ve prisutni u

organizmu i spremni da prepoznaju stranog agensa, oznaavaju se kao prirodni, urodjeni ii

nespecifini imunitet, odnosno urodjena otpornost. Urodjeni mehanizmi odbrane su

filogenetski stariji i u pripravnosti su za efikasno delovanje pre bilo kakve naznake o tome da e

homeostaza biti poremeena stranim agensom. U ovom tipu imunog odgovora reakcija organizma

na štetni agens je uvek jednako brza i efikasna i svaki put sa jednakom efikasnoš u aktiviraju

raspoložive resurse elija i molekula iako se komponente ovog sistema nisu prethodno srele sa

stranim agensom. Mehanizmi prirodnog imunog odgovora su usmereni relativno nespecifino

protiv stranih agenasa, odnosno, prepoznaju, generalno, motive makromolekula koji grade

zid bakterijskih elija i sl. (sekvencu ugljenih-hidrata koja je prisutna u zidu bakterijskih elija),

ali ne specifine funkcionalne grupe. Razlikuju strano od sopstvenog (prisutnog u

homeostazi), ali nikako ne razlikuju vrstu stranog agensa i ne ostavljaju nikakav memorijski

zapis o susretu sa stranim agensom. Prirodna otpornost je znaajan odbrambeni mehanizam

koji deluje pre no što se aktiviraju mehanizmi steenog imuniteta. S druge strane, steeni

imunitet koristi mehanizme i prirodnog imuniteta u cilju odbrane organizma. U ovom poglavlju ebiti opisane komponenete, specifinost i funkcije urodjenog imunog sistema. Ovaj kompleksni

sistem odbrane ima tri veoma važne i kljune funkcije.

(1) Urodjeni imunitet je inicijalni/poetni/prvi odgovor na mikroorganizme koji spreava

infekciju organizma domaina i mnogo puta može da eliminiše štetni agens.

(2) Efektorni mehanizmi urodjenog imunog sistema se esto koriste da bi se eliminisali

mikroorganizmi i/ili antigeni i u adaptivnom imunom odgovoru. U elijama-posredovanom

imunitetu, T limfociti produkuju citokine koji aktiviraju važne efektorne mehanizme urodjenogimuniteta, specifino fagocite. U humoralnom imunitetu, B limfociti produkuju antitela koja

koriste efektorne mehanizme urodjenog imuniteta (fagocite i sistem komplementa) da bi

eliminisali mikroorganizme i/ili antigen.

(3) Urodjeni imunitet prema mikrobima stimuliše adaptivni imuni odgovor i može uticati na

prirodu adaptivnog imunog odgovora inei ga optimalno efikasnim protiv razliitih tipova

mikroorganizama. Prema tome, urodjeni imunitet ne samo da ima odbrambenu funkciju ubrzo

nakon infekcije, nego “šalje upozorenje” da je infekcija prisutna i alarmira adaptivni imuni sistem.

Neke komponenete urodjenog imunog sistema su funkcionalne sve vreme, ak i pre infekcije i one

ukljuuju barijere za mikroorganizme i druge štetne agense koje ini površina epitela kože,

respiratornog i digestivnog trakta. Druge komponente urodjenog imuniteta su normalno inaktivne





144

(fagociti; sistem komplementa) ali se veoma brzo aktiviraju i reaguju u prisustvu štetnog agensa.

Tabela 5.6. Poreenje prirodnog, humoralnog i elijskog imunog odgovora

KARAKTERISTIKE PRIRODNI IMUNI ODGOVOR HUMORALNI IMUNI ODGOVOR ELIJSKI IMUNI ODGOVORPrimarne elije Neutrofilni, eozinofilni i bazofilni

granulociti, mastociti, monociti imakrofagi

B elije T elije

Poreklo elija Crvena koštana srž Crvena koštana srž Crvena koštana sržMesto maturacije Crvena koštana srž (neutrofilni,

eozinofilni i bazofilni granulociti imonociti) i tkiva (mastociti i makrofagi)

Crvena koštana srž Timus

Mesto gde senalaze zrele elije

Krv, vezivno tkivo, limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo

Produkti primarnesekrecije

Histamin, kinini, komplement,prostaglandini, leukotrijeni, interferon

Antitela Citokini

Primarno dejstvo Inf lamatorni odgovor i fagoci toza Zašti ta od ekstracelularnihantigena (bakterije, toksini,paraziti, virusi)

Zaštita od intracelularnih antigena (virusi,intracelularne bakterije i gljive) i tumora:regulacija antitelo-posredovanog i elijskogimunog odgovora (T elije pomonice i

supresorske T elije)Reakcijehipersenzitizacije(preosetljivosti)

Nema Trenutna hipersenzitivnost(atopija, anafilaksija,citotoksine reakcije,

kompleksni imuni poremeaji)

Odložena hipersenzitivnost (alergija ili infekcija ikontaktna hipersenzitivnost)

Urodjeni imuni odgovor, kao i adaptivni imuni odgovor, ima fazu prepoznavanja, aktivacije i

efektronu fazu. U tekstu e biti generalno opisano kako urodjeni imuni sistem prepoznaje

mikroorganizme, zatim e biti pomenute osnovne komponenete urodjenog imunog sistema i

njihova funkcija u odbrani organizma.

5.2.1. Karakteristike urodjenog imunog prepoznavanja

Urodjeni imuni sistem ima unikatnu specifinost za produkte mikroorganizama koje se razlikuju

od specifinosti adaptivnog imunog odgovora (Tabela 5.6; Slika 5.15). Komponenete urodjenog

imuniteta prepoznaju strukture koje su karakteristine za patogene i koje nisu prisutne kod

sisarskih elija. Urodjeni imuni sistem nije sposoban da prepozna nemikrobialne supstance, dok

je adaptivni imuni sistem sposoban da prepozna mnogo širi spektar stranih agensa bez obzira da

li su ili nisu produkti mikroorganizama.





145

Slika 5.15. Specifinosti urodjenog i adaptivnog imunitetaRazliiti imuni odgovori mogu biti specifini za strukture koje su zajednike za razliite klase

mikroorganizama (Tabela 5.7.). Ove structure ukljuuju aminokiseline koje su unikatne za

mikrobe, kao što je RNK dvostrukog lanca (engl. double-stranded RNA - dsRNA) pronadjene kod

virusa koji se replikuju; nemetilovana sekvenca CpG nadjena kod bakterija; specifini proteini

karakteristini za bakterije (N-formilmetionil peptidi); kompleksi lipida i ugljenih-hidrata koje

sintetišu iskljuivo elije mikroorganizama, ali ne i sisarske elije (LPS kod gram-negativnih

bakterija; tehoina kiselina kod gram-pozitivnih bakterija; manozom-bogati glikoproteini). Motivi

koji se prepoznaju na mikroorganizama od strane urodjenog imunog sistema opisani su kao

molekularni obrazci/motivi (engl . molecular patterns), a receptori koji vezuju ove konzervisane

strukture se nazivaju receptori za prepoznavanje obrazca/motiva (engl. pattern recognition

receptors). Razliiti mikroogranizmi ekspresuju razliite molekularne obrazce koji bivaju

prepoznati od strane razliitih receptora za prepoznavanje ovih obrazaca, a koje poseduju elije u

organizmu domaina ili se nalaze u cirkulaciji. Zbog ovih specifinosti i urodjeni imuni sistem je,

kao i adaptivni, sposoban da razlikuje sopstveno od stranog. U sluaju urodjenog imunog

sistema to je samo do nivoa razlikovanja (strano) od sisarskih (sopstveno) molekula, ali zato nije

sposoban da reaguje protiv sopstvenog, te bolje razlikuje sopstveno od stranog.

Tabela 5.7. Primeri molekularnih obrazaca mikroorganizama i receptornog obrazca prepoznavanja urodjenog imuniteta





146

g p g p p j j g

MOLEKULARNI MOTIV MIKROBA IZVOR RECEPTOR URODJENOG IMUNITETAKOJI PREPOZNAJE OBRAZAC/MOTIV

GLAVNI URODJENI IMUNI ODGOVOR

dsRNA Virusi koji se replikuju Toll-like receptor? Produkcija interferona tip I iz inficirane el.

LPS el. zid gram- negativnih bakterija Toll-like receptor/CD14 Aktivacija makrofaga

Nemetilisani CpG nukleot. Bakterijska DNK Toll-like receptor Aktivacija makrofaga

N-formilmetionil peptidi Bakterijski proteini N-formilmetionil Aktivacija neutrofila i makrofaga

Manozom bogati glikani Mikrobijalni glikoprot. I glikolipidi

1. Manozni receptor makrofaga

2. Manoze-vezujui lektin plazme

1. Fagocitoza

2. Opsonizacija; aktivacija komplementa

Fosforilholin i srodnii molekuli Membrane mi kroorganizama C-reaktivni p rotein plazme Opsonizacija; a ktivacija komplementa

Skraenice: dsRNK - dvostruki lanac RNK; LPS- lipopolisaharidi; (preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Urodjeni imuni sistem esto prepoznaje produkte mikroorganizama koji su neophodni za

njihovo preživljavanje. Ova adaptivna karakteristika organizma domaina je veoma važna jer

osigurava urodjenom imunom sistemu „pronalaženje“ cilja, s obzirom da mikrobi ne mogu

odbaciti ovo svoje svojstvo jer bi ih to uništilo (npr. viralna RNK dvostrukog lanca je esencijalna zareplikaciju nekih virusa i oni ne mogu izbei da je ekspresuju kako bi je „sakrili“ od receptora za

njeno prepoznavanje u sklopu urodjenog imunog sistema; LPS su neophodna komponenete zida

bakterijskih elija i esencijalna za preživljavanje, te nikako ne mogu biti odbaeni). Receptori na

elijama urodjenog imunog sistema su kodirani funkcionalnim genima nasledjene DNK (još

u stadijumu klice, zametka). Receptori na elijama adaptivnog imunog sistema se generišu

rekombnacijom i rearanžiranjem somatskih gena, što daje mnogo veu mogunost kombinacija,

raznovrsnosti i specifinosti. Procenjeno je da urodjeni imuni sistem može da prepozna oko 1000

molekularnih obrazaca mikroba, dok je adaptivni imuni sistem sposoban da prepozna 10000

puta više (107) ili ak i više razliitih antigena. Takodje, adaptivni imunitet razlikuje antigene

razliitih mikroorganizama u okviru iste klase ili ak i jednog mikroba, dok urodjeni umunitet

razlikuje jedino klase mikroorganizama. Stepen i intenzitet odgovora kojima urodjeni imuni

sistem reaguje na susrete sa mikroorganizmom su uvek isti (nema imunološke memorije), dok

adativni imuni sistem ima sposobnost pameenja i prilagodjavanja upravo zbog fenomena

imunološke memorije. Urodjeni imuni sistem ne reaguje na sopstveno zbog specifinosti

urodjene imunosti da razlikuju molekularne obrazce elija mikroorganizama, ali ne i sisara, a i

zbog toga što elije sisara ekspresuju regulatorne molekule koje spreavaju delovanje

mehanizama urodjene imunosti.

5 2 2 Komponenete urodjenog imunog sistema





147

5.2.2. Komponenete urodjenog imunog sistema

Osnovne komponente urodjenog imunog odgovora kod kimenjaka su: (1) mehanike tj. fizike

ili anatomske barijere koje onemoguavaju prodor mikroorganizama ili ih uklanjaju sa površine

tela; (2) elije u cirkulaciji i u tkivima koje imaju sposobnost fagocitoze ili uestvuju u fagocitozi

i/ili produkciji hemijskih medijatora koji participiraju u imunom odgovoru; (3) hemijski

medijatori (sekretorne molekule) koje deluju direktno protiv štetnih agenasa i/ili aktiviraju

druge mehanizme (Tabela 5.8.).

Tabela 5.8. Komponenete urodjenog imuniteta

KOMPONENTA GLAVNA FUNKCIJABarijereEpitelijalni sloj Onemoguavanje ulazaka mikroorganizamaDefenzini Uništavanje mikroorganizamaIntraepitelijalni limfociti Uništavanje mikroorganizama

Cirkulišue efektorne el.Neutrofili Rana fagocitoza i inflamatorni procesi; Uništavanje mikroorganizamaMakrofagi Najmonija fagocitoza i uništavanje mikroorganizama; Sekrecija citokina koji stimulišu inflamaciju

NK elije Liziranje tumorskih elija i elija inficiranih virusima; Aktiviranje makrofage

Cirkulišui efektorni prot.Komplement Uništavanje mikroorganizama; Opsonizacija mikroorganizama; Aktivacija leukocita

Lektin koji vezuje manozu (kolektin) Opsonizacija mikroorganizama; Aktivacija komplementa (lektinski put)C-reaktivni prot. (pentraksin) Opsonizacija mikroorganizama; Aktivacija komplementa (lektinski put)Faktori koagulacije Oblažu inficirano tkivo

CitokiniTNF, IL-1, hemokini Inflamacija

IFN-, IFN- Rezistencija na viralne infekcije

IFN- Aktivacija makrofagaIL-12, IL-18, IL-23 Stimulacija produkcije IFN- od strane NK elija i T elija

IL-5 Proliferacija NK elija

IL-10, TGF- Kontrola inflamacije(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Glavne efektorne elije urodjenog imuniteta su neutrofili, mononuklearni fagociti i NK elije. One

napadaju mikroorganizme koji su prošli epitelijalnu barijeru i ušli u tkiva i/ili cirkulaciju. Svaki

od ovih elijskih tipova ima posebnu ulogu u odgovoru na mikroorganizme. Makrofage i NK elije

sekretuju citokine koji aktiviraju fagocite i stimulišu elijsku reakciju urodjenog imuniteta kojase zove inflamatorni odgovor. Inflamacija se sastoji od regrutovanja leukocita i izlaska nekoliko

cirkulišuih proteina plazme na mesto infekcije, te stimulaciju/aktiviranje ovih leukocita i

proteina da eliminišu infektivni agens. Ukoliko ovaj sistem ne uništi infektivni agens, inflamacija

mobiliše imuni sistem i na neki nain «izoluje» mikroorganizme do momenta dok ne budu

uništeni mehanizmima adaptivnog imunog odgovora Ukoliko mikroorganizmi prodru u





148

uništeni mehanizmima adaptivnog imunog odgovora. Ukoliko mikroorganizmi prodru u

cirkulaciju oni bivaju „uhvaeni“ razliitim proteinima plazme (proteini sistema komplementa;

lektin koji vezuje manozu i drugi proteini koji prepoznaju molekularne obrazce mikroorganizama).

Inflamatorni odgovor predstavlja kompleksnu sekvencu dogadjaja koja ukljuuje

sinhronizovano, multidirekciono delovanje efektornih elija i proteina urodjenog imunog sistema i

njihovih produkata. Bakterije, ili ošteeno tkivo izazivaju oslobadjanje ili aktivaciju hemijskih

medijatora (histamin, prostaglandini, leukotrieni, kinini itd.), što prouzrokuje seriju paralelnih

efekata: 1) vazodilataciju koja poveava protok krvi i doprinosi kretanju fagocita i drugih leukocita

do inficiranog regiona; 2) hemotaksino privlaenje fagocita koji napuštaju krv i ulaze u tkiva; 3)

poveanje vaskularne propustljivosti koja dopušta da fibrinogen i komplement iz krvi izlaze u

tkivo. Fibrinogen se konvertuje u fibrin, što spreava širenje infekcije formiranjem izolacionog zida

oko inficiranog mesta. Proteini sistema komplementa dodatno pojaavaju inflamatorni odgovor i

privlae novu koliinu fagocita. Proces oslobadjanja hemijskih medijatora i privlaenja fagocita

traje dok se ne unište bakterije. Fagociti (uglavnom makrofagi) uklanjaju mikroorganizme i mrtvo

tkivo, a ošteeno tkivo se obnavlja proliferacijom i remodelovanjem pod uticajem brojnih himoza itriptaza. Inflamacija može da bude lokalna ili sistemska. Simptomi lokalne inflamacije su

ogranieni na specifian prostor u organizmu i ukljuuju crvenilo, oticanje, toplota, bol, gubitak

funkcije tkiva u kome se inflamacija dogadja. Crvenilo, toplota, oticanje nastaju kao rezultat

poveanog protoka krvi i poveanja vaskularne permeabilnosti. Bol je posledica otoka i delovanja

hemijskih medijatora na senzorne receptore ili receptore za bol. Gubitak funkcije tkiva se javlja

kao posledica tkivne destrukcije, otoka i bola. Sistemska inflamacija je inflamatorni odgovor koji

zahteva vei broj podru

ja u organizmu. U sistemskoj inflamaciji, pored lokalnih simptoma namestima inflamacije postoje i tri dodatne pojave: (1) crvena koštana srž produkuje i oslobadja

velike koliine neutrofila koji stimulišu i pojaavaju fagocitozni odgovor; (2) pirogeni (hemijske

materije sekretovane od strane mikroba, makrofaga, neutrofila i dr. ) stimulišu produkciju toplote

utii na mehanizme za regulaciju temperature u hipotalamusu tako da se konzerviše toplota i

poveava temperatura tela (poveana temperatura i groznica promovišu aktivnost imunog sistema

preko stimulacije fagocitoze, a inhibicije rasta nekih mikroorganizama); (3) u nekim sluajevima

sistemske inflamacije vaskularna popustljivost je toliko pojaana da se velike koliine tenosti

gube iz cirkulacije u tkiva, ime se smanjuje volumen krvi, što može prouzrokovati šok, a nekada i

smrt.

5.2.2.1. Epitelijalne barijere





149

5.2.2.1. Epitelijalne barijere

Intaktna epitelijalna površina formira fiziku barijeru izmedju mikroorganizama u spoljašnjem

okruženju i organizma domaina. Uobiajena mesta na kojima mikroorganizmi ulaze u organizam

životinja jesu koža, gastrointestinalni trakt i plua, kroz koje mogu da udju putem fizikog

kontakta, udisanja i ingestijom. Ove dodirne površine su zaštieni epitelom koji pruža fiziku i

hemijsku barijeru protiv infekcije. Koža i mukozne membrane uklanjaju mirkroorganizme i

druge agense sa površine tela na nekoliko naina:

ispiranjem oiju suznom tenošu, usne duplje

pljuvakom, urinarnog trakta urinom. Pored toga,

elije mukozne membrane poetnih delova

respiratornog trakta su bogate cilijama koje svojim

pokretima guraju strane agense u mukus i

usmeravaju ga ka ždrelu, odakle e biti progutan.

Kašljanje i kijanje takodje uklanja mirkoorganizme i

druge agense iz respiratornog sistema. Pored toga,

epitelijalne elije lue aktivne peptide koji ubijajumikroorganizme, a telesne šupljine sadrže tenost

(suzna tenost, HCl, vaginalni sekret i sl.) koja u

svom sastavu ima razliite bakteriostatike i

baktericidne materije.Slika 5.16. Funkcija epitela u urodjenom imunitetuPredstavlja fiziku barijeru za prolaz mikroba, produkuje antimikrobne supstance i sadrži intraepitelijalne limfocite koji ubijaju mikrobe i zaražene elije.

Epitel produkuje peptide koji imaju prirodnu antibiotsku fukciju. Najpoznatiji su defensini,(cisteinima bogati peptidi od 29 do 34 aminokiseline) prisutni u koži mnogih vrsta ukljuujui i

sisare. Ima ih takodje u granulama neutrofila. Defensini su antibiotici širokog spektra delovanja

koji imaju sposobnost uništavanje raznovrsnog i velikog broja bakterija i gljiva. Epitel intestinuma

sekretuje kriptocidine, potentne antimikrobijalne peptide, koji imaju sposobnost lokalne

sterilizacije lumena intestinuma, posebno prostora izmedju intestinalnih kripti. Keratinociti

produkuju nekoliko citokina (IL-1), te doprinose nespecifinim efektornim reakcijama,

inflamatornom odgovoru, ali mogu biti i pomagaki hemijski medijatori uklju

eni u efektornemehanizme adaptivnog imunog odgovora.

Epitelijalna barijera i serozne šupljine sadrže intraepitelijalne T limfocite i B-1 podgrupu B

elija i ove elije mogu da prepoznaju i odgovore na mikroorganizme koji uestalo ulaze.

Intraepitelijalni T limfociti su prisutni u epidermisu kože i mukoznom epitelu. Ove elije, kao i

sve druge T elije imaju receptore za prepoznavanje antigena, te stoga pripadaju elijskoj





150

s e d uge e je aju ecepto e a p epo a a je a t ge a, te stoga p padaju e js oj

populaciji adaptivnog imunog sistema. Sa druge strane, intraepitelijalne T limfociti ekspresuju

limitirano raznolike receptore kodirane funkcionalnim genima nasledjene DNK bez velike varijacije

u komplementarno-determinišuim regionima. Stoga, neuobiajena priroda receptora i antigena

koje prepoznaju odvaja intraepitelijalne T limfocite u posebnu kategoriju T elija koje više lie

efektornim elijama urodjenog nego adaptivnog imuniteta. One uestvuju u odbrani organizma

sekrecijom citokina, aktivacijom fagocita i uništavanjem inficirane elije. Peritonealna šupljina

sadrži populaciju B limfocita koja se zove B-1 elije. Antigeni receptori ovih elija jesu

imunoglobulinske molekule, kao i kod drugih B limfocita, ali B-1 elije imaju limitiranu

raznovrsnost u prepoznavanju antigena, kao i antigeni receptori intraepitelijalnih T limfocita.

Neke B-1 elije produkuju IgM antitelo pecifino za polisaharide i lipidne antigene, kao što su

fosforilholin i LPS karakteristini za mnoge bakterije. Interesantno je da normalne individue

sadrže cirkulišua antitela protiv ovakvih molekularnih obrazaca bakterija (najvei broj se nalazi

u intestinumu) bez ikakve druge naznake o infekciji. Stoga se ova antitela nazivaju prirodna

antitela, a smatra se da su u najveoj meri produkti aktivnosti B-1 elija. Trea populacija elija

prisutnih subepitelijalno i u seroznim šupljinama su mastociti koji raguju na mikroorganizme injihove produkte sekrecijom razliitih

hemijskih medijatora koji stimulišu

infalmaciju. Mastociti su granulisane

elije pronaene u delovima bogatim

vezivnim tkivom, a naroito su brojni u

subepitelijalnom prostoru. Na membrani

mastociti imaju receptore za IgE i C5a iC3a proteine sistema komplementa.

Receptori za IgE na elijskoj membrani

omoguavaju proces degranulacije ako se

kompleks antigen-IgE veže za njihovu

površinu.

Slika 5.17. Mastocit kaointegrator urodjenog isteenog imunog odgovora,a i kao amplifikatori imunosti

Citoplazma je bogata biološki aktivnim materija koje omoguavaju mastocitima široki spektar

efektornih funkcija, ne samo u mehanizmima imunog odgovora nego i brojnim drugim procesima.

Granule sadže citokine, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-16, leukotriene, prostaglandine i dr., što

omoguava aktivaciju elija koje uestvuju u steenom imunom odgovoru. Istovremeno, ukljueni





151

g j j j j g , j

su u inflamatorni odgovor koji je iniciran od strane imunoglobulina IgE i IgG, kao i hemokina,

histamina i dr. Osim efektornih funkcija u steenom imunitetu, mastociti oslobaaju TNF- kao

odgovor na bakterijske produkte (mehanizam nezavistan od antitela) i stoga uestvuju u

prirodnom imunom odgovoru. Njihove granule sadrže heparin i predpostavlja se da heparin ima

ulogu u obrazovanju granula. Pored toga, granule sadrže brojne proteaze, himoze i triptaze,

enzime koji su ukljueni u proliferaciju i remodeliranje vezivnog tkiva, kao i dopamin i serotonin.

Sve napred navedeno omoguava mastocitima da funkcionišu kao integratori urodjenog i steenog

imunog odgovora, a i kao amplifikatori imunosti (Slika 5.17.).

Veoma važna osobina koju poseduju sve elije koje uestvuju u urodjenom imunom odgovoru je

sposobnost amboidnog kretanja koja im omoguuje da dospevaju do mesta infekcije. Pored toga,

ispoljavaju sposobnost hemotaksije, odnosno detektuju male razlike u koncentraciji

hemotaksinih faktora. Hemotaksini faktori su sekretorni produkti mikroba koji samostalno ili

u interakciji sa hemijskim materijama produkovanim od strane okolnih elija menjaju

koncentracijsku homeostazu inficiranog tkiva i privlae leukocite koji ameboidnim kretanjemdospevaju do mesta inflamacije. Hemotaksini faktori, pored navedenih, mogu biti i proteini

sistema komplementa, leukotrijeni, kinini, histamin i dr.

5.2.2.2. Fagociti: Neutrofili i makrofagi

Fagocite su elije ija je primarna funkcija da identifikuju, fagocituju i unište mikroorganizme.

Sve fagocitne elije na svojoj membrani imaju receptore karakteristine za elije koje uestvuju u

urodjenim-nespecifinim mehanizmima imunog odgovora. Naj

eši su receptori za sekvencuugljenih-hidrata koja je prisutna u zidu bakterijskih elija (manozni receptor; receptor za

lipopolisaharide-LPS; N-formil-metionil receptor; tzv. »scavenger« receptor i dr.); receptori za Fc

fragment; IgG komplement (C3b, C5a); interferon; TNF i odredjene bakterijske komponenete. Ovi

receptori omoguavaju interakciju fagocita sa nekim humoralnim faktorima kao što su TNF, neki

proteini komplementa (C3b, C5a), IL-2 i dr., ime se poveava fagocitna sposobnost i funkcija. U

fagocitne elije se ubrajaju elije koje imaju izraženu monu fagocitnu sposobnost, a to su

polimorfonuklearni leukociti - neutrofili i mononuklearni leukociti – monociti i makrofagi.

Neutrofilni polimorfonuklearni leukociti – Neutrofili.

Neutrofili ine oko 90% granulocita u perifernoj cirkulaciji oveka. Njihov dijametar je od 12m-

15m (u cirkulaciji). Obeležava ih prisutnost višerežnjevitog jedra (4-6 segmenata) iji su lobulusi

spojeni hromatinom (Slika 5.18.), kao i dve vrste neutrofilnih granula: primarne ili azurofilne





152

p j ( ), g p

granule (lizozomi veliine 0.5 m) i sekundarne ili specifine granule. Neutrofili sadrže u svojoj

citoplazmi i glikogen koji se razgradjuje glikolizom i heksoza-monofosfatnim putem oksidacije

glukoze da bi se dobila energija. S obzirom na mali broj mitohondrija u ovim elijama, ciklus

limunske kiseline je manje važan i slabije zastupljen. Sposobnost neutrofila da prežive u

anaerobnoj sredine je velika adaptivna prednost jer im omoguava da unište bakterije i pomognu

pri uklanjanju ostataka raspadnutih elija u slabije oksigenisanim podru jim, kao što je

inflamatorno ili nekrotino tkivo. Proseni životni vek neutrofila u cirkulaciji je 6 sati, a u

vezivnom tkivu 1-4 dana gde potom odumiru procesom apoptoze (programirane elijske smrti).

Da bi se održao normalan nivo neutrofila u krvi neophodno je da se produkuje 100 biliona

neutrofila na dan. Osnovna funkcija neutrofila je odbrambena. Ona se ostvaruje fagocitozom i

sekrecijom specifinih biološki aktivnih materija, pa se uz monocite i makrofage, nazivaju i tzv.

»profesionalnim fagocitima«. Cirkulišui neutrofili su inaktivni i loptastog oblika, ali nakon što

se privrste za vrst supstrat, kao što je kolagen ekstracelularnog matriksa, ispoljavaju

sposobnost ameboidnog kretanja. Mnogi od njih napuštaju cirkulaciju procesom dijapedeze i

ulaze u tkiva, a odatle se preko gatrointestinalnog trakta (GIST) ekskretuju iz organizma. Ukolikose cirkulišui neutrofili ne regrutuju na mesto infekcije oni ulaze u programiranu elijsku smrt i

obino su fagocitirani od strane rezidualnih makrofaga u jetri.

Slika 5.18. Fagocitne elije urodjenog imunog sistema

Neutrofil Monocit

Mononuklearni leukociti – Monociti - makrofagi

Monociti nastaju u koštanoj srži iz opredeljene progenitorske elije monoblasta, opredeljene

matine elije mijeloidne loze, koja se po svom morfološkom izgledu bitno ne razlikuje od

mijeloblasta. Diferencijacijom monoblasta nastaje promonocit, velika elija (dijametra 18 m) sa





153

j j j j p j ( j )

bazofilnom citoplazmom i velikim, blago ugnutim jedrom. Hromatin je rastresit, a jedarca vidljiva.

Promonociti prolazi dve elijske deobe tokom svog razvoja u monocite. Monociti u cirkulaciji imaju

dijametar od 12m-20m, a nukleusi su im ovalni, u obliku potkovice ili bubrežasti, i obino

smešteni ekscentrino. Hromatin je manje kondenzovan nego hromatin u limfocitima, te se zbog

tog rastresitog hromatina jedra monocita boje svetlije od jedara velikih limfocita. Citoplazma

monocita je bazofilna i sadrži sitne azurofilne granule (lizozome) od kojih su neke jedva vidljive

svetlosnim mikroskopom. Te granule su rasporedjene po itavoj citpolazmi i daju joj na obojenim

razmazima plaviasto-sivu boju. Pod elektronskim mikroskopom se uoava da jedro ima jedno ili

dva jedarceta, a u citoplazmi se vidi dobro razvijen granulirani endoplazmatski retikulum,

poliribozomi i mnogo malih mitohodrija. Pored toga, uoava se i dobro razvijen Goldži-jev

kompleks u kome se kondenzuje sadržaj citoplazmatskih granula. Te granule su primarni

lizozomi koji se u monocitima opisuju kao sitne azurofilne granule. Sve nabrojane morfološke

karakteristike ukazuju na veliku sekretornu potenciju ovih elija. Od svih uoblienih elemenata

krvi, monociti prvi ulaze u cirkulaciju i tu se zadržavaju oko 72 sata. Nakon toga oni odlaze u

veliki broj tkiva u organizmu, gde postaju tkivni makrofagi i ine moni fagocitni sistem tkivnihmakrofaga (sistem mononuklearnih makrofaga). Specifini tkivni makrofagi su Langerhans-ove

dendritske elije kože, Kupferove elije jetre, plune alveolarne makrofage, elije mikroglije u

mozgu, M elije u submukozi GIST-a i dr. Sistem makrofaga i njihovih cirkulišuih prekursora,

monocita, se ranije oznaavao kao retikuloendotelni sistem, dok se danas naziva sistem tkivnih

makrofaga. Njihov životni vek u tkivima je nepoznat, ali transplantacija koštane srži ukazuje da

mogu živeti oko 3 meseca. Dosadašnja saznanja ukazuju na to da se ne vraaju u cirkulaciju.

Makrofage aktiviraju limfokini osloboeni od strane T limfocita. Aktivirani makrofagi migriraju,kao odgovor na hemotaksne stimuluse, proždiru i ubijaju bakterije u principu slinim procesima i

mehanizmima kojim to ine neutrofili. Makrofagi imaju sposobnost da sekretuju preko 100

razliitih biološki aktivnih molekula, ukljuujui faktore koji utiu na limfocite i druge elije,

prostaglandine E serije, faktore koji podstiu zgrušavanje i dr. Zahvaljujui svojoj specifinoj

funkcionalnoj organizaciji i širokoj paleti aktivnih materija koje sekretuju, makrofagi su moni

fagociti. Pored toga, imaju sposobnost da štetne agense koji su “nepoznati” i ne prepoznaju se od

strane komponenti specifinog imunog sistema, obrade (procesuju) i iskažu (prezentuju) na svojoj

površini u formi prepoznatljivoj za druge elije imunog sistema, te se zbog toga nazivaju antigen

prezentujue elije (APC). Dakle, makrofagi i njihovi cirkulišui prekursori monociti imaju

kljunu ulogu u imunom odgovoru organizma i predstavljaju sponu izmedju urodjenog (prirodnog,

ne specifinog) i adaptivnog (steenog, specifinog) imuniteta. Efektorne funkcije makrofaga u

prirodnom imunom odgovoru su fagocitoza, kao i produkcija hemijskih medijatore koji aktiviraju





154

druge elije imunog sistema ili na neki drugi nain uestvuju u eliminaciji štetnog agensa.

Efektorne funkcije u adaptivnom imunom odgovoru su fagocitoza mikroba i prezentacija

mikrobnih antigena limfocitima koji se nikada pre nisu sreli sa tim antigenom.

Migracija neutrofila na mesto infekcije, kao i pokretanje elija u fagocitozi, ukljuuju mikrotubule

i mikrofilamente i interakciju aktina sa miozinom–I na unutrašnjoj strani elijske membrane.

Proces dijapedeze se ostvaruje tako što se neutrofili privueni selektinima sa površine

endotelijalnih elija vrsto vezuju za neutrofil-adhezioni molekul (pripada familiji integrinskih

receptora) i provlae se kroz zid kapilara izmeu endotelnih elija. Ova sposobnost im omoguava

da brže stignu do mesta gde se, kao rezultat invazije bakterija, razvija inflamatorna reakcija. Put

neutrofila od izlaska iz cirkulacije do inficiranog mesta obezbedjuje hemotaksija, odnosno

prisustvo bakterijskih produkata na inficiranom mestu. I ne samo to, nego postoji interakcija

izmedju bakterijskih produkata, faktora iz plazme, kao i onih sekretovanih iz okolnih elija. Ti

hemotaksini agensi su brojni i ukljuuju hemokine, neke komponente sistema komplementa

(C5), leukotrijene, polipeptide poreklom iz limoficta, mastocita, bazofila, ali i mnoge druge. Sve temolekule u razliitim kombinacijama omoguuju uslove za privlaenje leukocita, ali i što

efikasniju fagocitozu bakterije. Jedan od naina je opsonizacija (okruživanje, pojaano vezivanje)

imunoglobulinima (Ig), a naroito IgG, kao i proteinima sistema komplementa (C3b). IgG se kao

opsonin vezuje za bakterijsku eliju svojim Fab regionom (engl. antigen binding fragment – Fab),

dok je Fc fragment slobodan i “primamljiv” za fagocite koji e se preko svog receptora za Fc (gore

pomenuti Fcg) vezati za tako okruženu bakterijsku eliju i fagocitirati je. Dobar opsonin je i C3b

protein sistema komplementa koji se nespecifino vezuje za strane organizme, a koga takodje“prepoznaju” fagocite preko svog receptora. Na taj nain, antitela (IgG) i C3b “markiraju”

mikroorganizam za fagocitozu i destrukciju. Aktivacija receptora na elijskoj membrani neutrofila,

preko G-proteinom posredovanog odgovora, injicira poveanje motorne aktivnosti elije,

egzocitozu aktivnih materija i naglo poveanje preuzimanja kiseonika i produkcije

reaktivnih kiseoninih radikala tzv. “respiratornu eksploziju” (engl. respiratory burst).

Poveanje motorne aktivnosti e dovesti do brze ingestiji bakterija endocitozom, odnosno

fagocitozom. Zbog širokog spektra aktivnih materija koje produkuju fagociti ispoljavaju efektorne

funkcije i u prirodnom, ali i u adaptivnom imunom odgovoru. Kao što je napomenuto, u

urodjenim odbrambenim mehanizmima uestvuju kao moni fagociti, ali i kao izvor brojnih

aktivnih materija koje ili aktiviraju druge elije imunog sistema, ili imaju funkcije u dijapedezi,

hemotaksiji ili nekim drugim mehanizmima kojim se olakšava eliminacija štetnog agensa. Pored

toga, sekrecija biološki aktivnih materija i njihove funkcije imaju znaaja u efektornim reakcijama





155

adaptivnih odbrambenih mehanizama.

Funkcionalni odgovor fagocita u odbrani organizma se sastoji od pojedinanih koraka/faza:

aktivnog regrutovanja elija do mesta infekcije; prepoznavanja mikroorganizma; fagocitoze i

destrukcije usvojenog digeriranog miroorganizma. Pored toga, makrofagi produkuju citokine koji

imaju veliki broj važnih uloga u urodjenom i adaptivnom imunom odgovoru.

Regrutovanje leukocita do mesta infekcije

Neutrofili i monociti se regrutuju (obnavljaju) iz krvi do mesta infekcije vezivanjem za adhezione

molekule na endotelijalnim elijama i hemoatraktantima produkovanim kao odgovor na infekciju. Ovi

leukociti normalno cirkulišu krvotokom i ne migriraju u tkiva. Njihovo regrutovanje do mesta

infekcije je multifazni proces koji ukljuuje »lepljenje« za endotelne elije i migraciju kroz endotel

(Slika 15.19.). Rezidentni tkivni makrofagi koji prepoznaju mikrobe sekretuju TNF, IL-1 i

hemokine. TNF deluje na endotelijalne elije postkapilarnih venula i indukuje ekspresiju nekoliko

adhezivnih molekula. Tokom 1-2 h endotelijalne elije poinju da ekspresuju E-selektin, dokleukociti ekspresuju na vrhu svojih mikroizraštaja/mikrovilusa (engl. microvilli) ugljenohidratne

ligande za selektine koji se vezuju sa selektinima na endotelnim elijama. Ovo vezivanje je slabo i

veoma esto je poremeeno silom protoka krvi, te se leukociti lako odvoje od endotelijalnih elija,

a potom vežu za druge i tako se kotrljaju/rolaju po površini endotela. TNF i IL-1 takodje indukuju

ekspresiju liganada za integrine i to uglavnom vaskularnih elija adhezioni molekul-1 (engl.

Vascular Cell Adhesion Molecule-1 – VCAM-1; koji je ligand za VLA-4 integrin) i intracelularni

adhezioni molekul-1(engl. Intracelular Adhesion Molecule-1 – ICAM-1; koji je ligand za LFA-1 iMac-1 integrine). Leukociti ekspresuju ove integrine u stanju malog afiniteta. Istovremeno,

hemokini koji se produkuju na mestu infekcije ulaze u cirkulaciju, vezuju se za heparin-

glikosaminoglikane endotelijalnih elija i izlažu se u velikim koncentracijama. Ovi hemokini

deluju na »kotrljajue« leukocite (engl. rolling leucocytes) i aktiviraju ih. Kao posledica aktivacije

dolazi do konverzije VLA-4 i LFA-1 integrina iz stanja slabog afiniteta u stanje visokog afiniteta.

Kombinacija idukovne ekspresije integrinskih liganada i aktivacije integrina na leukocitima

rezultuje u stabilnom integrinima posredovanom vezivanju leukocita za endotel na mestu

infekcije. Leukociti prestaju da se kotrljaju, njihov citoskelet se reorganizuje i oni se rasporedjuju

po površini endotela. Tada hemokini deluju na adherirane leukocite i stimulišu ih da migriraju

kroz interendotelijalni prostor (prostor izmedju elija endotela) prema »hemotaksinom«

koncentracijskom gradijentu prema mestu infekcije. Neto rezultat svega je da se prvo

neutrofili, a potom i monociti rapidno nakupljaju u inficiranom tkivu. Ova rekacija je





156

centralna komponeneta procesa inflamacije i tipina je za mikrobijalne infekcije, ali i nekim

neinfektivni stimulusi mogu da je iniciraju. Neutrofili i monociti dospeli u tkivo (sada se zovu

makrofagi) prepoznaju mikroorganizme i funkcionišu u smislu iskorenjivanja infekcije.

Slika 5.19. Regrutovanjeleukocita.Na mestu infekcjie, makrofagkoji je fagocitirao mikroorgani-

zam, produkuje citokine (TNF iIL-1) koji aktiviraju endotelijalneelije u okolini venule daprodukuju selektine (ligande zaintegrine) i hemokine. Selektiniposreduju slabo »sapinjanje« irolanje/ valjanje leukocita u krvipo endotelu; integrini posredujuvrstu adheziju neutrofila;hemokini poveavaju afinitetneutrofila za integrine istimulišu

migraciju elija kroz endotel domesta infekcije. Cirkulišuineutrofili, monociti i aktivirani Tlimfociti koriste skoro istovetnemehanizme migracije do mestainfekcije

Prepoznavanje mikroorganizama od strane makrofaga

Neutrofili i makrofagi ekspresuju površinske receoptore koji preoznaju mikrobe u krvi i

tkivu i stimulišu fagocitozu i uništavanje mikroba. Mehanizmi za uništavanjemikroogranizama (mikrobicidni mehanizmi) su uglavnom odvijaju kompartmenski odvojeni u

intraelijske formacije, lizozome i fagolizozome, kako bi elija zaštitila sebe od ošteenja.

»Uvlaenje« ili ingestija mikroba u ove strukture je neophodno da bi se mikrobi uništili, a ingestiji

prethodi prepoznavanje mikroba preko razliitih površinskih receptora na makrofagama. Pored

toga, neutrofili i makrofagi ekspresuju i neke receptore koji aktiviraju elije da produkuju citokine

i mikrobicidne supstance i receptore koji stimulišu migraciju elija do mesta infekcija. Postoji

nekoliko klasa receptora (manozni receptori i receptori hvatai; receptori za opsonine, »tool-

like«-receptori; GPCR receptori) na fagocitima (fagocitnih receptora) koji vezuju mikrobe i

posreduju njihovu internalizaciju (Slika 5.20).

Manozni receptori i receptori tzv. hvatai (engl . scavenger receptors). Manozni

receptori su makrofagni lektini koji vezuju terminalne manozne i fruktozne rezidue glikoproteina





157

glikolipida. Ovi šeeri su tipini molekuli elijskog zida mikroba, dok glikoproteini membrana

elija sisara sadrže kao rezidue salicilnu kiselinu i N-acetilgalakotsamine. Na ovaj nain manozni

receptor makrofaga prepoznaje elije mikroba i razlikuje ih od sopstvenih elija. Receptori hvatai

su originalno definisani kao receptori koji vezuju i posreduju endocitozu oksidovanih ili

acetilovanih partikula lipoproteina male gustine (engl. L ow Density L ipoproteins) koji ne mogu

više da interaguju sa konvencionalnim LDL receptorom. Receptori hvatai vezuju razliite

mikrobe, kao i modifikovane LDL partikule. Neki integrini makrofaga, kao što je Mac-1

(CD11bCD18)takodje mogu

da vezuju mikro

organizme.

Slika 5.20. Receptori i odgovor fagocita.Neutrofili i makrofagi

koriste veliki broj razli-itih receptora da pre-poznaju mikrobe, mikro-bijalne produkte isupstance koje produ-kuju elije domaina uinfekciji. Ovi receptoriaktiviraju elijski odgo-vor koji funkcioniše usmislu stimulacije infla-macije i iskorenjivanja

mikroba. Prikazne susamo neke od klasareceptora.

Receptori za opsonine promovišu fagocitozu mikroba obloženih razliitim proteinima.

Opsonizacija predstavlja proces oblaganja mikroba u cilju fagocitoze, a supstance koje oblažu

površinu elije mikroorganizma nazivaju se opsonini. Ove supstance mogu biti antitela, proteini

sistema komplementa i lektini. Jedan od najefikasnijih sistema za opsonizaciju je oblaganje sa

IgG antitelom koji se zbog toga i naziva specifian opsonin i koji se prepoznaje od strane Fcgreceptora visokog afininiteta (FcgRI). Komponenete sistema komplementa, posebno fragmenti C3

proteina komplementa, su takodje potentni opsonini zbog toga što fagociti ekspresuju receptore

koji se zovu tipi I komplement receptori (engl. Complement Receptors I - CRI) koji prepoznaju

produkte razgradnje C3. Veliki broj proteina plazme, ukljuujui manoze-vezujui lektin,

fibronektin, fibrinogen, kolagen i C-reaktivni protein može da oblaže i da bude prepoznat od





158

strane receptora na fagocitima.

Toll-L ike Receptori (TCRs) su homologi proteinu koji se zove Toll kod Drosofila i koji

funkcioniše kao aktivator fagocita u odgovoru na razliite tipove i komponenete mikroba.

Identifikovano je deset tipova sisasrskih TCRs i smatra se da je svaki tip odgovoran i

neophodan da bi se adekvatno odgovorilo na razliite klase infektivnih patogena. Razliiti

TCR imaju esenci-

jalnu ulogu u e-

ljskom odgovoru narazliite funkcio-

nalne grupe kara-

kteristine iskljui-

vo za bakterije

(LPS; bakterijski

proteoglikani; ne-

metilisani CpG nu-kleotidi).

Slika 5.21. Sisarski Tollproteinu slini receptori(TCRs).A - Tipini TLR sadržikonzervisane ekstracelularne icitoplazmatske domene. Ra-zliiti TLRs sadrže razliit broj i

razliitu organizaciju ekstrace-

lularnih leucinima-bogatih icisteinima-bogatih motiva. TIR -Toll/IL-1 receptor. B - RazliitiTLRs su ukljueni u odgovore narazliite mikrobijalne produkte.Neki od njih zahtevaju hete-rodimerizaciju sa drugim TLRs

(npr. TLR 2 sa TLR 6). C -Signalni put preko TLR rezultira ugenerisanju NF-kB transkripci-onog faktora. U ovaj signalni putmože biti ukljuen i adapterni

protein MyD88. TLRs su takoeukljueni u aktivaciju AP-1.

TCR receptori funkcionišu zajedno sa receptor-asociranim kinazama, što konano dovodi do

stimulacije produkcije mikrobicidnih supstanci i citokina od strane fagocita (Slika 5.20.).TCRs

takodje mogu biti asocirani i sa drugim molekulima koji participiraju u direktnom prepoznavanju

mikrobija-lnih produkata. Odgvor elije do-maina na LPS ilustruje mnoge funkcionalne





159

konsekvence prepoznavanja produkata mikroba preko TLRs i asociranih proteina (Slika 5.21.).

Receptori sa sedam-transmembranskih

-heliksa ili receptori vezani sa G-proteinima

(engl. G Proteins Coupled Receptors – GPCRs) se ekspresuju na leukocitima i prepoznaju

mikorobe i neke medijatore koji se produkuju kao odgovor na infekciju, a funkcionišu uglavnom

kao stimulatori migracije leukocita na mesto infekcije. Ovi receptori se nalaze na neutrofilima,

makrofagima, a i nekim drugim tipovima leukocita, i prepoznaju široki spektar razliitih liganada.

Receptori ove klase prepoznaju kratak peptid koji sadrži N-formilmetionil ostatke. S obzirom da

svi bakterijski proteini, a samo neki sisarski (oni sintetisani u mitohondrijama), poinju sa N-formilmetioninom, ovaj receptor omoguava neutrofilima da odgovaraju na bakerijske proteine.

Neutrofili i neki prostiji oblici makrofaga ekspresuju GPCR receptore za neke CXC hemokine (a

posebno IL-8, videti prethodno poglavlje); proteolitike produkte sistema komplementa (C5, videti

kasnije); razliite lipidne medijatore inflamacije (faktore aktivacije trombocita, prostaglandin E,

leukotrijene i dr.). Vezivanja liganda (npr. mikrobijalni produkti, hemokini i dr.) za GPCR indukuje

migraciju elija iz krvi kroz endotel i produkciju mikrobicidalnih supstanci aktivacijom produkcije

velike koliine reaktivnih kiseoninih radikala (tzv. respiratorni prasak; engl. respiratory burst).Receptor inicira intraelijski odgovor preko aktivacije trimernih G proteina (proteini koji vezuju

GTP). U neaktiviranom stanju, receptori su asocirani sa G proteinima u stabilnom inaktivnom

kompleksu koji ima i GDT vezan za G subjedinicu. Okupiranje receptora od strane liganda

rezultira zamenom GDP za GTP. Forma G-protein-GTP aktivira veliki broj elijskih enzima,

ukljuujui izoformu fosfatidilinozitol-specifine fofolipaze C (PLC) ija je funkcija da poveava

koncentraciju intracelularnog kalcijuma i da aktivira protein kinazu C (PKC). GPCR takodje

stimuluišu promene u citoskeletu što rezultira poveanjem motiliteta elija.

Fagocti ekspresuju receptore za citokine koji se produkuju u reakciji na mikrobe. Jedan

od najvažnijih citokina ovakvog tipa i tzv. glavni citokin koji aktivira makrofage je IFN-. Kao

što je naglašeno u prethodnom poglavlju, njega sekretuju NK elije tokom urodjenog imunog

odgovora i antigenima-aktiviranih T elija tokom adaptivnog imunog odgovora.

Fagocitoza mikroorganizama

Neutrofili i makrofagi uvlae vezane mikroorganizme u specijalne kompartmente gde se mikrobi

uništavaju (Slika 5.22). Fagocitoza je

proces »gutanja« veih partikula (> 0.5

mm dijametra) zavistan od citoskeleta.

i i k i li i i k





160

Fagociti koriste razliite površinske

receptore za vezivanje mikroba. Akti-

vacija receptora na elijskoj membrani,

injicira poveanje motorne ativnosti

elije što dovosti do brze ingestiji

bakterija endocitozom. Prvo se od pla-

zmaleme elije za koji je vezan mikrob

formira ašolika tvorevina oko vezanogmikroba, a kada ona potpuno obavije

mikrob i »zarobi ga« formira se intra-

elijska vezikula koja se naziva

fagozom i koja ima ovojnicu kao

plazmalema, a sadži ingestirani mikrob.

Površinski receptor fagocita preko svog

signalinga aktivira mehanizme zauništavanje fagocitiranog mikroba.

Paralelno sa uništavanjem mikroba,

njegovi peptidi generisani razlaganjem

mikrobijalnih proteina se prezentuju T

limfocitima kako bi inicirali adaptivni

imuni odgovor.

Slika 5.22. Fagocitoza i intracelularna destrukcija mikroorganizma.

Mikrobi mogu da se vežu za razliite membranske receptore

fagocita. Neki direktno vezuju mikrobe a drugi vrše opsonizacijumikroba (npr. Mac-1 integrin sa proteinima komplementa vršiopsonizaciju mikroba; nije prikazano). Mikrobi se internalizuju ufagozome, koji se fuziraju sa lizozomima i nastaju fagolizozomi ukojima se mikrobi ubijaju reaktivnim kiseonikom i nitrogenintermedijatima. iNOS, inducibilna azot oksid sintaza; NO, azotoksid; ROIs, reaktivni kiseonini intermedijati.

Uništavanje fagocitovanih mikroorganizama

Aktivirani neutrofili i makrofagi ubijaju fagocitovane mirkoorganizme produkujui mikobicidne

molekule u fagolizozome (Slika 5.22.). Nekoliko receptora koji prepoznaju mikrobe ukljuujui

TLRs, GPCRs, Fc i C3 receptore, receptore za citokine (uglavnom IFN-) funkcionišu kooperativno

u aktivaciji fagocita u smislu uništavanja mikroba. Fuzija primarne fagocitne vakuole (fagozoma)

li i lti f i j f li d k t i i i h i i





161

sa lizozomima resultira formiranjem fagolizozoma gde su koncentrisani svi mehanizmi za

uništavanje mikroorganizama. Aktivirani neutrofili i makrofagi konvertuju molekularni kiseonik

u reaktivne kiseonine radikale (engl. Reactive Oxygen Species - ROSs) odnosno reaktivne

kiseonine intermedijere (eng. Reactive Oxygen Intermediates – ROIs) koji su veoma reaktivne

molekule sposobne da unište bilo koju eliju, pa i eliju mikroorganizma. Primarni sistem koji

generiše slobodne radikale je sistem fagocitnih oksidaza koji se nalazi na membrani fagolizozoma.

Ovaj sistem enzima se indukuje i aktivira od strane velikog broja stimulusa ukljuujui IFN- kao

i signale od TLRs, a funkcija mu je da redukuje molekularni kiseonik u reaktivne kiseonineradikale/intrmedijere kao što je super-oksid radikal (O2

-) koristei kao kofaktor redukovanu formu

nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADPH). Super-oksid se u reakciji dismutacije prevodi u

vodonik peroksid uz katalitiko delovanje enzima katalaze. Vodonik preoksid koristi enzim

mijeloperoksidaza da konvertuje normalno nereaktivan halidni jon u veoma reaktivnu hipohalitnu

kiselinu koja je toksina za bakterije. Pored reaktivnih kiseoninih radikala, makrofage produkuju

i reaktivne azotne radikale, i to uglavnom azot-oksid (NO) koji može reagovati sa kiseoni nim

radikalima (hidroksilnim anjonom) i davati jos reaktivnije produkte (peroksinitril). Azot-oksid sedobija enzimatskim delovanjem azot-oksid sintaza (engl. Nitric Oxide S ynthase – NOS). Jedna

forma ovog enzima se indukuje (iNOS) vezivanjem LPS za odgovrajue receptore. iNOS je enzim

koji nije prisutan u makrofagima koji nisu aktivirani, ali može biti indukovan kao odgovor na LPS

stimulaciju i druge produkte mikroba koji aktiviraju TLRs, posebno u kobinaciji sa IFN-.

Tabela 5.09. Sadržaj granula u polimorfonuklearnim leukocitima (granulocitima) oveka

Tip elija Specifine granule Azurofilne granule

Neutrofili alkalna fosfatazakolagenaza

laktoferinlizozimnekoliko nenezimskih antibakterijskih baznih proteina

kisela fosfataza

-manozidazaarilsulfataza

-galaktozidaza

-glukuronidaza

katepsin5’-nukleotidaza

elastazakolagenazamijeloperoksidazalizozim

antibakterijski katjonski proteini

Sve fagocitne elije funkcionišu na slian nain i koriste, u kombinacijama, tri modela

intracelularnog uništavanja patogena:

(1) Lizozomalne antibakterijske supstance ukljuujui veliki broj hemijskih medijatora sa

širokim spektrom funkcija (lizozim-razlaže mukopeptide u zidu bakterijske elije; proteolitiki i

hid litiki i i di i j ik b l kt f i d i ždj k t i i j





162

hidrolitiki enzimi-digeriraju mikrobe; laktoferin-odzima gvoždje; katepsin-imaju ga samo

makrofage-ošteuje elijsku membranu i uestvuje u prezentaciji antigena; i dr.) koje

omoguavaju efikasno uništavanje patogena (Tabela 5.09.).

2) O2-zavisni/mijeloperoksidaza-zavisni mehanizmi ukljuuju procese halogenacije

bakterijskih proteina koji su katalisani mijeloperoksidazom, ali i ueše H2O2 i drugih reaktivnih

kiseoninih radikala (Tabela 5.10.).

3) O2-zavisni/mijeloperoksidaza-nezavisni mehanizmi ukljuuju reaktivne kiseonine radikale

(O2-, OH-, H2O2 i dr.), ali bez ueša mijeloperoksidaze. Antioksidativni enzimi fagocita (katalaza iglutation-S-transferaza) uklanjaju reaktivne kiseoine radikale kako ne bi oštetili njihovu elijsku

membranu (Tabela 5.10.).

Tabela 5.10. Medijatori antimikrobijalne i citotoksine aktivnosti neutrofila i makrofaga

O2 – ZAVISNO uništavanje O2 – NE ZAVISNO uništavanje

Reaktivni kiseonini radikali (posrednici)O2

- (superoksidni anjon)

OH- (hidroksil radikal)H2O2 (vodonik peroksid)

ClO- (hipohloritni anjoni)

Defenzini

TNF (samo u makrofagama)

Reaktivni azotni radikali (posrednici) NO (azot oksid)

NO2 (azot dioksid)HNO3 (azotna kiselina)

Lizozim

OstaliNH4Cl (monohloramin) Hidrolitiki enzimi

Kao što je ranije objašnjeno, proces dijapedeze se ostvaruje tako što se fagociti privueniselektinima sa površine endotelijalnih elija vrsto vezuju za fagocita-adhezioni molekul (pripada

familiji integrinskih receptora) i provlae se kroz zid kapilara izmeu endotelnih elija. Ova

sposobnost im omoguava da brže stignu do mesta gde se, kao rezultat invazije bakterija, razvija

inflamatorna reakcija. Put fagocita od izlaska iz cirkulacije do inficiranog mesta obezbedjuje

hemotaksini koncentracijski grandijent koga stvaraju bakterijski produkti, ali i produkti koje

elije organizma domaina izbacuju kao odgovor na infekciju. I ne samo to, nego postoji

interakcija izmedju bakterijskih produkata, faktora iz plazme, kao i onih sekretovanih iz okolnihelija. Ti hemotaksini agensi su brojni i ukljuuju hemokine, neke komponente sistema

komplementa, leukotrijene, polipeptide poreklom iz limfocita, mastocita, bazofila, ali i mnoge

druge. Sve te molekule u razliitim kombinacijama omoguuju uslove za što efikasniju fagocitozu

bakterije. Kako je ranije napomenuto, jedan od naina je opsonizacija (oblaganje, okruživanje)

imunoglobulinima (Ig), a naroito IgG, kao i proteinima sistema komplementa (C3b). IgG se kao

opsonin vezuje za bakterijsku eliju svojim Fab regionom dok je Fc fragment slobodan i





163

opsonin vezuje za bakterijsku eliju svojim Fab regionom, dok je Fc fragment slobodan i

“primamljiv” za fagocite koji e se preko svog receptora za Fc (ranije pomenuti Fc) vezati za tako

okruženu bakterijsku eliju i fagocitirati je. Dobar opsonin je i C3b protein sistema komplementa

koji se nespecifino vezuje za strane organizme, a koga takodje “prepoznaju” fagocite preko svog

receptora. Na taj nain, antitela (IgG) i C3b “markiraju” mikroorganizam za fagocitozu i

destrukciju. Aktivacija receptora na elijskoj membrani neutrofila, preko G-proteinom

posredovanog odgovora, injicira TCRs i drugih receptora, poveanje motorne aktivnosti elije,

egzocitozu aktivnih materija i naglo poveanje preuzimanja kiseonika i produkcije

reaktivnih kiseoninih radikala tzv. “respiratornu eksploziju” (engl. respiratory burst).

Poveanje motorne aktivnosti e dovesti do brze ingestije bakterija endocitozom (fagocitoza). Prvo

se formira primarna fagocitna vakuola-fagozom koja ima membranu koja potie od plazmaleme

neutrofila. Potom dolazi do fuzije lizozoma sa fagozomom i degranulacije neutrofilnih granula koje

su bogate enzimima. Pomou protonske pumpe u membrani fagozoma pH te vakuole se spusti do

oko 5.0, što je optimalan pH za maksimalnu aktivnost lizozomalnih enzima. Potom dolazi do

degranulacije azurofilnih granula, te enzimi koji se otpuštaju omogue digestiju fagocitovanogmikroorganizma. Pored specifinih enzima, granule sadrže i antimikrobijalne proteine tzv.

defenzine. Kod sisara su identifikovana dva tipa defenzina, i , dok su drugi tipovi pronaeni

kod beskimenjaka i biljaka. Dodatno se aktivira i membranski vezan enzim NADPH oksidaza i

dolazi do produkcije toksinih kiseoninih metabolita. Kombinacija toksinih kiseoninih

metabolita, toksinih reaktivnih azotnih radikala i proteolitikih enzima poreklom iz granula ini

fagocite veoma efektivnim pri uništavanju bakterija. U toku fagocitoze se naglo poveava potrošnja

kiseonika zbog aktivacije Ovo je uzrokovano aktivacijom NADPH oksidaze; asocirana je sa

poveanim preuzimanjem i potrošnjom kiseonika u fagocitima (respiratorna eksplozija), što

dovodi do stvaranja vema reaktivnih kiseoninih radikala. Gubitkom jednog elektrona od O2

nastaje superoksidni anjon (O2-). O2- je slobodni radikal kiseonika koji nastaje adicijom jednog

elektrona molekulskom kiseoniku i koji je kratkog veka, ali veoma reaktivan. 2O2- reaguju sa

2H+ i nastaje vodonik peroksid (H2O2) u reakciji koju katališe citoplazmatska forma superoksid

dismutaze (SOD-1):

SOD-1

NADPH + H+ + 2O2 NADP+ + 2H+ + 2O2- O2- + O2- + H+ + H+ H2O2 + O2

O2- i H2O2 su jaki oksidanti i efektivni baktericidni agensi. H2O2 se konvertuje u H2O i O2 uz

eše enzima katalaze. Citoplazmatska forma superoksid dismutaze (SOD-1) je identifikovana u

mnogim elijama. Mutacija gena za ovaj enzim dovodi do nasledne forme amiotrofine lateralne

skleroze, jer se verovatno O2- akumulira u motoneuronima i uništava ih. Pored navedenih enzima,

fagociti poseduju i enzim mijeloperoksidazu koja katališe konverziju Cl Br I i SCN u





164

fagociti poseduju i enzim mijeloperoksidazu, koja katališe konverziju Cl-, Br-, I- i SCN- u

odgovarajue kiseline (HOCl, HOBr, itd.), koje su takoe potentni oksidanti. O2- i H2O2 , sa

mijeloperoksidazom ili bez nje, uz sadejstvo halidnih anjona stvaraju snažan citotoksini sistem.

Osim mijeloperoksidaze i defenzina, granule fagocita sadrže i elastazu, dve

metaloproteinaze koje razlažu kolagen, kao i druge razliite proteaze koje potpomažu

uništavanje invazivnih organizama. Pored toga, lizozim deluje specifino cepanjem veze unutar

peptidoglikana koji je sastavni deo elijskog zida nekih gram-pozitivnih bakterija, što dovodi do

smrti tih bakterija. Još jedan uzronik odumiranja bakterija je i lakotoferin koji u velikimkoliinama vezuje za sebe gvoždje i time ga uskrauje bakterijama koje ga koriste u ishrani. Kiseli

sadržaj fagozoma može sam po sebi da prouzrokuje injiciranje apoptoze i smrt mikroorganizama.

Kombinacija navedenih mehanizama, zajedno sa O2- , H2O2 i HOCl, koji nastaju dejstvom NADPH

oksidaze i mijeloperoksidaze, formiraju “smrtonosnu zonu” oko aktiviranih fagocita i tako

uništavaju štetne agense, koji se potom digeriraju putem lizozomalnih enzima.

Iako je navedena zona efektivna u uništavanju invazivnih organizama, u nekim patološkim

stanjima (npr. reumatoidni artritis), fagociti mogu takoe prouzrokovati lokalnu destrukcijusopstvenog tkiva. Izumrli neutrofili, bakterije i nepotpuno digerirana materija stvaraju viskoznu,

obino žukastu, tenu masu – gnoj za koju se kaže da je groblje neutrofila.

Kada su neutrofili i makrofagi izuzetno snažno aktivirani mogu oštetiti i normalno tkivo organizma

otpuštanjem reaktivnih kiseoninih radikala, azot oksida i/ili lizozomalnim enzimima.

Druge efektorne funkcije aktiviranih makrofaga

Pored uništavanja fagocitiranih mikroorganizama, aktivirani makrofagi imaju i veliki broj drugih

funkcija, ukljuujui aktivaciju inflamatornih medijatora, kao i stimulaciju remodeliranja tkiva

nakon infekcije u zoni ozlede (Slika 5.23.). Veliki broj ovih funkcija je posredovan citokinima koje

sekretuju aktivirani makrofagi, a koji posreduju u urodjenom imunom odgovoru (Tabela 5.11.).

Pored toga, aktivirani makrofagi produkuju faktore rasta koji deluju na endotelijalne elije i

fibroblaste koji uestvuju u remodeliranju tkiva nakon infekcije i povrede.

Tabela 5.11. Funkcije nekih hemijski medijatori koje sekretuju aktivirani makrofagi

HEMIJSKI MEDIJATOR FUNKCIJA

Interleukin-1 (IL-1) St imul iše inflamatorni odgovor i groznicu

Interleukin 6 (IL 6) Stimulišu adaptivni imuni odgovor i eliminaciju





165

Interleukin-6 (IL-6)

TNF

Stimulišu adaptivni imuni odgovor i eliminaciju

patogena

Proteini sistema komplementa Stimulišu inflamatorni odgovor i eliminaciju patogena

Hidrolitiki enzimi Stimulišu infalmatorni odgovor

Interferon- (IFN-) Stimulišu sintezu antiviralnih proteina u elijama

TNF Uništavaju tumorske elije

GM-CSF; G-CSF; M-CSF Stimulišu indukovanu hematopoezu

Slika 5.23. Efektorne funkcije makrofaga.Makrofagi se aktiviraju

mikrobialnim produktimakao što su lipopolisaharidi

(LPS) i IFN- kog

produkuju NK elije.

Proces aktivacije makro-faga vodi aktivaciji tra-nskripcionih faktora, tra-nskripciji razliitih gena isintezi proteina koji po-sreduju u funkcionisanju tih

elija. U adptivnom elijskom imunitetu, makrofagise aktiviraju stimulusima odT limfocita (CD40 ligand i

IFN-) i odgovaraju u

osnovi na isti nain.

5.2.2.3. Urodjeno-ubila ke elije - elije prirodne ubice - NK (engl. »Natural Killer«) elije

NK elije su podgrupa limfocita koja ubija inficirane elije i elije koje su izgubile sposobnost

ekspresije klase I MHC molekula, a istovremeno i sekretuju citokine i to uglavnom IFN- Osnovna

fiziološka uloga ovih elija je odbrana od infekcija nastalih virusima i nekih drugij intracelularnih

mikroba Termin urodjeno-ubilake elije je nastao zbog injenice da ako se ove elije izoluju iz





166

mikroba. Termin urodjeno ubilake elije je nastao zbog injenice da ako se ove elije izoluju iz

krvi ili slezine imaju sposobnost da uništavaju ciljne elije bez iakakve potrebe za dodatnom

aktivacijom (suprotno ovome CD8+ T limfociti moraju biti aktivirani pre nego što se diferenciraju u

citolitike T limfocite sa sposobnošu da unište targetni antigen).

NK elije su derivati pluripotentne progenitorne stem elije kosne srži i ine 5% do 20% od

ukupnih mononuklearnih elija u krvi i slezini, a veoma retko se nalaze u drugim limfoidnim

organima. U perifernoj cirkulaciji oveka ine oko 15% od ukupnog broja limfocita a od T i B elija

se razlikuju, izmedju ostalog, i po tome što ne poseduju iste receptore za antigene tj. TCR i BCR.Od površinskih markera obeležava ih prvenstveno prisustvo CD16 markera (receptor za Fc

fragment IgM – FcgRIII) i CD56 markera (adhezijski molekul). Vei broj NK elija se i morfološki

razlikuje od T i B limfocita po sledeim osobinama: vei su; imaju srazmerno više citoplazme;

jedro nije okruglo nego je na jednom delu spljošteno; u citoplazmi postoje azurofilne granule

(stoga se ove elije još nazivaju i velikim granuliranim limfocitima). Neki autori smatraju da oni i

nisu pravi limfociti, nego posebna populacija elija koja se s obzirom na svoj razvoj nalazi izmedju

limfocita i monocita. Osnovna fiziološka funkcija NK elija je delovanje protiv virusom zaraženih ilimaligno-transformisanih elija.

Prepoznavanje inficirane elije od strane NK elija.

Aktivacija NK elija je regulisana balansom izmedju signala koji se generišu od aktiviranih receptora i

inhibiranih receptora (Slika 5.24.). Postoji nekoliko familija ovih receptora, a oni se sastoje od

ligand-vezujueg lanca i lanca za signaling (signaling-lanca). Ligandi koji aktiviraju receptore

ukljuuju molekule koji su ekpresovani na površini inficiranih, ili na drugi nain stresiranih elija

organizma domaina, promovišu aktiviranje NK elija. Inhibitorni receptori NK elija vezuju

sopstvene molekule MHC I kompleksa koji su ekpresovani na veini normalnih elija. Kada su

inhibitorni receptori vezani, NK elija nije aktivirana i ovo je mehanizam koji je prevencija za

uništavanje normalnih elija domaina. Infekcija elija domaina mikrobima, a posebno virusima,

veoma esto prouzrokuje inhibiciju ekspresije klase I MHC molekula, a time su liganadi za

inhibitorne receptore nedostupni, što kao rezultat ima »oslobadjanje« NK elija iz njihovog

normalnog inhibisanog/inaktivnog stanja. Istovremeno, ligandi za aktivirajue receptore su

ekspresovani, te postoji mogunost da se uništi inficirana elija, što se i realizuje. Karakteristina

i zajednika osobina aktivirajuih receptora NK elija je prisustvo signaling molekule sa imuno-

receptornim aktivacionim motivima koji u osnovi imaju tirozin (engl. Imuno-receptor T yrosine-

based Activation Motif - ITAMs) i smešteni su u citoplazmatskom repu receptora, kao u sluaju

signalnih komponenti antigenih receptora T i B limfocita. Zbog toga nije zaudjujue što i signalni

putevi vezani za aktivirajue receptore NK elija ukljuuju regrutaciju tirozin kinaze i adapternih

proteina a potom aktivaciju genske





167

proteina, a potom aktivaciju genske

ekspresije i reorganizaciju cito-

skeleta, slino dogadjajima u T i B

limfocitima tokom prepoznavnja

antigena. Zajednika osobina inhi-

birajuih receptora NK elija je

prisustvo signaling molekule sa

imuno-receptornim inhibicionimmotivima koji u osnovi imaju tirozin

(engl. Imuno-receptor T yrosine-

based Inhybiory Motif - ITIMs) na

citoplazmatskom repu receptora.

Vezivanjem liganda za receptore ovi

ITIMs postaju fosforilisani na

tirozinskim ostacima i vezuju tirozinfosfataze, kao što je SHP-1, koje

potom defosforilišu signalne mo-

lekule koje posreduju u aktiva-

cionom putu.

Slika 5.24. Aktivirajui i inhibirajui receptori NKelija.

A - Aktivirajui receptori NK elija prepoznaju ligande

target elija i aktiviraju protein tirozin kinazu (PTK), ija je aktivnost inhibisana preko inhibitornog receptora kojiprepoznaje klasu I MHC molekula i aktivira proteintirozin fosfatazu (PTP). Kao rezultat, NK elije nisuefikasne u uništavanju ciljnih elija koje ekspresujuklasu I MHC molekula.

B - Ako virusna infekcija inhibira ekspresiju klase I MHCmolekula kod inficiranih elija, inhibrajui receptori NK elija

nisu vezani i aktivirajui receptor funkcioniše ne ometeno iinicira odgovore NK elija, kao što su citoliza i sekrecijacitokina.

NK elije prepoznaju antitelima-obložene targetne molekule preko receptora FcRIIIa(CD16) koji je receptor slabog afiniteta za Fc segment IgG i IgG3 antitela. Kao rezultat ovih

prepoznavanja NK elije ubijaju ciljnu eliju koja je obložena molekulima antitela. Ovaj proces se

naziva od antitela-zavisna elijama-posredovana citotoksinost i bie objašnjena u poglavlju o

efektornim mehanizmima humoralnog adaptivnog imunog odgovora. Ekspanzija i aktivnost NK

elija su stimulisane citokinima, i to uglavnom IL-15 i IL-12.





168

Efektorne funkcije NK elija

Efektorne funkcije NK elija su uništavanje inficiranih elija i aktivacija makrofaga u cilju uništavanja

fagocitovanog mikroorganizma (Slika 5.25.).

Mehanizam NK elijama posredovane citolize je u

osnovi isti kao i citoliza posredovana citolitinim

T limfocitima (engl. C ytolytic T L ymphocytes –

CTLs) što e detaljnije biti opisano u narednompoglavlju. NK elije imaju granule koje sadrže

proteine koji se nazivaju perforini koji formiraju

pore u membrani ciljne elije, kao i enzime koji

se zovu granizimi i koji ulaze kroz membranu

ciljne elije i indukuju apoptozu ciljne elije.

Uništavajui virusima ili intracelularnim

bakterijama inficiranu eliju NK elije eliminišurezervoar infekcije.

Slika 5.25. Funkcije NK elija.A - NK elije ubijaju inficirane elije, te stoga eliminišu širenje infekcije.

B – NK elije odgovaraju na IL-12 kog produkuju makrofagi, i sekretuju IFN-, koji

aktivira makrofage da ubiju fagocitirane mikrobe.

Neki tumori, posebno oni poreklom od hematopoetinog tkiva su takodje targeti za NK elije,

verovatno zbog toga što tumorske elije ne ekspresuju MHC molekule klase I. S obzirom da su NKelije sposobne da eliminišu neke tumorske elije postoje predpostavke da NK elije imaju ulogu u

organizmu u smislu ubijanja malignih klonova elija in vivo .

Pored pomenutih NK elija, postoje dve populacije elija koje su im sline, ali još uvek

nedovoljno precizno definisane funkcije. Limfokinima aktivirane elije ubice (engl.

L ymphokines Activated Killer cells - LAK cells) su po osobinama sline NK elijama i na slian

nain i funkcionišu. Pokazano je da su LAK elije efikasnije od NK elija te da mogu da unište i

maligno transformisane, ali i transformisane ne maligne elije. Populacija K elija (engl. Killer)nije potpuno morfološki opisana. Pokazano je da se K elije zakae za ciljnu eliju koja je

okružena IgG antitelima preko receptora za Fc fragment IgG i mogu da liziraju opsonizovanu

eliju. S obzirom da imaju receptore za Fc makrofage mogu da funkcionišu kao K elije i tako

aktivirane mogu da ubiju malignu eliju bez ukljuivanja u taj proces antitela.

5.2.2.4. Sistem komplementa





169

p

Sistem komplementa ini nekoliko plazma proteina koji se aktiviraju mikoorganizmima i promovišu

destrukciju mikorba i inflamaciju. Sistem komplementa ini grupa od oko 25 proteina cirkulišuih

proteina (ine 10% globulinske komponenete seruma) oznaenih od C1 do C9 (sa podgrupama

obeleženim malim slovima abecede) i faktorima B, D i P (properdin). Ovi proteini mogu biti

produkovani u razliitim tkivima/elijama, ukljuujui hepatocite, makrofage i epitelijalne elije

GIST-a. Svi se nalaze u serumu u

neaktivnoj formi, odnosno, u odsustvuinfekcije cirkulišu u krvi u inaktivnom

stanju. Oni postaju aktivni u reakciji

kaskade komplementa u kojoj

aktivirana komponenta u seriji aktivira

narednu u nizu. Aktivacija izaziva

kaskadnu reakciju koja vodi ka aktivaciji

C5 konvertaze (C5b koja je esencijalnaza lizu membrane liza patogena).

Nedostatak jedne komponente u

kaskadnoj reakciji vodi ka terminaciji

reakcije. Reorganizacija i destrukcija

mikoba se ostvaruje preko tri puta

aktivacije komplementa: alternativnim,

klasinim i lektinskim (Slika 5.26.).

Slika 5.26. Aktivacija kaskadne reakcije sistemakomplementa Aktivacija sistema komplementa može biti inicirana razliitimputevima, ali svi oni vode ka produkciji C3b proteina (rana faza). C3binicira kasnije faze u aktivaciji komplementa, a kulminacija je

produkcija peptida koji stimulišu inflamaciju (C5a) i polimerizacija C9koja formira kompleks koji napada membranu (engl. membraneattack complex), a tako se zove jer pravi rupe u plazma membrani.Osnovne funkcije glavnih proteina u sistemu komplementa su date

na slici. Aktivacija, funkcija i regulacija sistema komplementa jeobjašnjena sa više detalja u poglavju o efektornim reakcijamahumoralnog imunog odgovora.

Prepoznavanje mikroba od strane komplementa se odvija na tri naina: Aktivacija sistema

komplementa se ostvaruje preko dva puta:

(1) alternativni tj. tzv. “properdinski” put je filogenetski najstariji i aktivira se direktnim

prepoznavanjem odredjenih struktura na površini membrane mikroba i komponeneta je urodjenog

imunog odgovora. Ovaj put aktivacije komplementa se injicira preko faktora B, D, P i dr, koji





170

g g j p j p j p , , , j

prouzrokuju “spontanu” aktivaciju C3 proteina u sistemu komplementa, odnosno aktivaciju C3

bez uticaja predhodno aktiviranih elemenata sistema komplementa (C1 i C2). Ova reakcija

aktivacije kaskade komplementa preko C3 predstavlja komponenetu reakcija efektornih

mehanizama prirodnog imunog odgovora. Uobiajeno je da se spontano aktivirani C3 brzo

inaktiviše proteinima na površini tela elije. Medjutim, ponekada se aktivirani C3 kombinuje sa

stranim supstancama, kao što su delovi bakterijske elije ili virusa, pa može postati stabilan i

prouzrokovati aktivaciju kaskade komplementa.(2) klasian put (tako je imenovan jer je prvi otkriven) se injicira kompleksom antigen-antitelo,

odnosno vezivanjem dela molekule antitela koji se naziva Fc fragment za C1 protein sistema

komplementa. Ovaj put koristi plazma protein C1 u detekciji IgM, IgG1 ili IgG3 antitela vezanih za

površinu mikroba ili drugih struktura. Reakcija aktivacije kaskade komplementa preko C1

proteina predstavlja komponenetu reakcija efektornih mehanizama adaptivnog imunog

odgovora.

(3) lektinski put se aktivira plazma proteinom koji se zove manoze-vezujui lektin (engl.Mannose-Binding L ectin – MBL ) i koji prepoznaje ostatke manoze u glikoproteinima i glikolipidima

mikroorganizama. MBL vezan za microbe aktivira (u odsustvu antitela) jedan od proteina

klasinog puta aktivacije komplemetna, preko stimulacije asociranih serin proteaza.

Prepoznavanje mikroba bilo kojim od ovih puteva inicira seriju kaskadnih reakcija,

kaskadnu regrutaciju/aktivaciju drugih komponeneti sistema, te pridruživanje aktiviranih

proteina lanova komplementa proteaznim kompleksima. Centralni protein sistema

komplementa je C3 koji se cepa, a njegov vei, C3b fragment se “smešta” na površinu mikroba

gde se komplement aktivira. C3b se kovalentno vezuje za funkcionalne grupe na površini

mikroba i, kao što je ranije navedeno, ima funkciju opsonina u promociji fagocitoze mikroba.

Manji fragment C3, C3a se otpušta i stimuliše inflamaciju delujui kao hemoatraktant za

neutrofile. C3b vezuje druge proteine komplementa da bi se formirala proteaza koja cepa protein

C5 i generiše manji fragment C5a koji se otpušta i vei fragment C5b koji ostaje vezan za

membranu elije mikroba. C5a stimuliše influks neutrofila na mesto infekcije, kao i vaskularne

komponenete inflamacije. C5b inicira formiranje kompleksa proteina C6, C7, C8 i C9 sistema

komplementa u formi pore na membrani mikroba, a to rezultira lizom elije na kojoj je

komplement aktiviran. Sisarske elije ekspresuju nekoliko regulatornih proteina koji blokiraju

aktivaciju komplementa, te time preveniraju ošteenje elija domaina.

Aktivirani proteini sistema komplementa obezbedjuju zaštitu na nekoliko naina: neki

elementi sistema se mogu vezati za membranu bakterijske elije izazivajui lizu elije; neki se

vezuju za površinu bakterijske elije i omoguavaju i olakšavaju fagocitozu, a uz to i stimulišu





171

makrofage da fagocitiraju bakterijsku eliju; vrše opsonizaciju mikroorganizama; uestvuju u

hemotaksiji elija imunog sistema do mesta infekcije; podstiu inflamatorne reakcije i sl.

Važno je još jednom naglasiti da se kaskadna reakcija sistema komplementa može aktivirati i kao

efektorni mehanizam prirodnog, kao i u efektorni mehanizam steenog imunog odgovora. Sistem

komplementa e biti opisan sa više detalja u poglavlju o efektornim mehanizmima humoralnog

imunog odgovora.

5.2.2.5. Drugi cirkulišu i proteini urodjenog imuniteta

Mnogi proteini plazme, pored lanova sistema komplementa, su ukljueni u urodjenom imunom

odgovoru na mikrobe (Tabele 5.08. i 5.12). Mnogi hemijski medijatori koji uestvuju u

urodjenom (prirodnom) imunom odgovoru su i “pomagai” u steenom (adaptivnom) imunom

odgovoru. Hemijski medijatori su molekule koje su ukljuene u razvoju imunog odgovora (Tabela

5.12.).

Tabela 5.12. Hemijski medijatori koji uestvuju u urodjenom (a i stenom) imunom odgovoru i njihova funkcija

Jedinjenje Opis Jedinjenje Opis

Hemijske materijena površini i utelesnimšupljinama

Lizozim (u suzama, pljuvaki, sekretu nosne duplje i znoju)

prouzrokuje lizu razliitih elija; kiseli sekreti (sebum kožnihžlezda i hlorovodonina kiselina želuca) ubijajumikroorganizme i spreavaju njihov rast; mukus na mukoznimmembranama veže mikroorganizme pre njihovog uništavanja

Komplement

Grupa proteina plazme; poveavaju propustljivost

krvnih sudova, stimulišu oslobaanje histamina,aktiviraju kinine, lizu elija, pospešuju fagocitozu,privlae neutrofilne i eozinofilne granulocite,monocite i makrofage

Histamin

Amin koga oslobaaju mastociti, bazofilni granulociti i

trombociti; izaziva vazodilataciju, poveava propustljivostkrvnih sudova, stimuliše sekreciju žlezda (naroito produkciju

mukusa i suza), izaziva kontrakcije glatke muskulaturebronhiola u pluima, privlai eozinofilne granulocite

Prostaglandini

Grupa lipida (PGEs, PGFs, tromboksani i

prostaciklini); produkuju ih mastociti; izazivajurelaksaciju glatke muskulature i vazodilataciju,

poveavaju propustljivost krvnih sudova, stimulišureceptore za bol

KininiPolipeptidi koji nastaju od proteina plazme; izazivaju

vazodilataciju, poveavaju propustljivost krvnih sudova,stimulišu receptore za bol, privlae neutrofilne granulocite Leukotrijeni

Grupa lipida, prvenstveno ih produkuju mastociti i

bazofilni granulociti; produžuju trajanje kontrakcijeglatke muskulature (naroito u bronhiolamaplua), poveavaju propustljivost krvnih sudova,privlae neutrofilne i eozinofilne granulocite

Interferoni Proteini, produkuju ih mastocite i druge elije, a uestvuju u

viralnim infekcijam

Pirogeni Oslobaaju ih neutrofilni granulociti, monociti i

druge elije; stimulišu nastajanje groznice

Neki hemijski medijatori (npr. lizozim, sebum i mukus), se nalaze na površini elije i uništavaju

štetni agens ili onemoguavaju njegov ulazak u eliju, dok drugi (npr. histamin, prostaglandini,

leukotrijeni, heparin, pirogeni itd), promovišu inflamaciju preko vazodilatornog efekta,

poveanja vaskularne permeabilnosti, privlaenja leukocita, stimulacije fagocitoze i sl.

Manoze-vezujui lektin (MBL ), koji je pominjan ranije je plazma protein koji funkcioniše





172

kao opsonin. Pripada familiji kolektina (engl. collectin), tako nazvanoj zbog toga što proteini ove

familije imaju kolagenu-slian domen odvojen »vratnim« regionom od kalcijum-zavisnog (C-tip)

lektinskog (tj. ugljenih hidrata vezujueg) domena. Cirkulišui MBL (MBL plazme), kao i manozni

receptor makrofaga, vezuje ugljene hidrate sa terminalnim manoznim i fruktoznim ostacima, koji

su tipini za glikoproteine i glikolipide membrana na površini elija mikroorganizama. Prema

tome, MBL je solubilni receptor koji prepoznaje molekularne obrazce (engl. soluble pattern

recoginition receptor) koji se vezuje za mikrobijalne, ali ne i sisarske elije. MBL je heksamer koji je strukturalno slian komponenti C1q sistema komplementa. MBL se vezuje za receptore na

površini makrofaga koji se zovu C1q receptori (vezuju C1q komponentu sistema komplementa).

Ovaj receptor posreduje u fagocitozi bakterija opsonizovanih manoza-vezujuim lektinom. Pored

toga, MBL može aktivirati sistem komplementa.

C-reaktivni protein je plazma protein identifikovan i nazvan zbog svoje sposobnosti da se

vezuje za kapsulu pneumokoknih baterija. Pripada pentraksinskoj familiji plazma proteina,

tako nazvanoj jer sadrže pet identinih globularnih subjedinica. Tipi

no za C-reaktivni protein je

da se veže za bakterijske fosfolipide, kao što je fosforilholin. Funkcioniše i kao opsonin-vezujui

C1q i interagujui sa C1q receptorom na fagocitima ili vezujui se direktno za Fc receptore. Pored

toga, C-reaktivni protein može doprinositi aktivaciji sistema komplementa preko vezivanja za C1q,

te aktivacije klasinog puta. C-reaktivni protein se još naziva i akutne-faze reaktant zbog toga što

je njegov nivo u plazmi povean tokom aktune faze mnogih infekcija.

Faktori koagulacije su plazma proteini ija je osnovna funkcija da spree hemoragiju

(iskrvavljenje) formiranjem koaguluma/tromba (krvnog ugruška) kada je integritet krvnih sudova

narušen. Proteaze, kao što je trombin, koje se generišu u kaskadnim reakcijama koagulacije krvi i

formiranja koaguluma, iniciraju inflamatornu reakciju. Pored cirkulišuih proteina, proteini

surfaktanta plua, koji takodje pripadaju familiji kolektina, štite vazdušne puteve od infekcije.

5.2.2.6. Citokini

Citokini urodjene imunosti regrutuju i aktiviraju leukocite, ali i stimulišu sistemske promene,

ukljuujui poveanu sintezu efektornih elija i proteina koji potenciraju antimikrobijalni odgovor. U

urodjenom imunom odgovoru, glavni izvor citokina su makrofagi, neutrofili i NK elije, ali i elije

epitela, kao što su keratinociti koje produkuju mnoge takve iste proteine. Kao i u adaptivnom

imunom odgovoru, citokini imaju ulogu u medjusobnoj komunikaciji inflamatornih elija, kao i u

komunikaciji izmedju inflamatornih elija i elija tkiva koje odgovaraju na infekciju, kao što su

elije vaskularnog endotelijuma. Citokini urodjenog imuniteta su opisani u prethodnom poglavlju

i ukljuuju citokine koji kontrolišu viralne infekcije, i to uglavnom IFN-

i IFN-

; citokine koji





173

posreduju u inflamaciji, najviše TNF, IL-1 i hemokini; citokini koji stimulišu proliferaciju i

aktivaciju NK elija, uglavnom IL-15 i IL-12; citokine koji aktivraju makrofage, a posebno NK

elijama produkovani

IFN-; kao i citokini koji

imaju ulogu da limi-

tiraju aktivaciju ma-

krofaga, a posebno IL-10. Pored toga, neki

citokini urodjene imuno-

sti, kao što je IL-6,

poveavaju produkciju

neutrofila u kosnoj srži

i stimulišu sintezu

razliitih proteina (npr.C-reaktivni protein) koji

su ukljueni u odbranu

elija domaina od

infekcije.

Slika 5.27. Zajedniki i sinergi-stini odgovor komponenitiurodjenog imunog odgovoraprotiv invazivne mreže patogena

5.2.3. Uloga urodjenog imuniteta u stimulaciji adaptivnog imunog odgovora

Urodjeni imuni odgovor obezbedjuje signale koji funkcionišu, u odnosu na antigen, u smislu

stimulacije proliferacije i diferencijacije antigen-specinih T i B limfocita (Slika 5.28.). Hipoteza

dva signala, pomenuta u poglavlju o funkcionalnoj organizaciji imunog sistema, opisuje da je prvi





174

signal (signal 1) uvek antigen, a da je drugi signal (signal 2) ili komponenta/produkt mikroba ili

urodjenog imunog odgovora koji identifikuje da je antigen produkt mikroba. Prema tome, urodjeni

imuni odgovor služi kao inicijalno upozorenje za adaptivni imuni sistem da se pripremi za

odbranu i omogui zaštitu organizma domaina. Mikroorganizmi koji naseljavaju organizam

domaina bez aktivacije lokalne inflamatorne reakcije, mogu biti neuspešni i u aktiviranju

adptivnog imunog odgovora, kao posledice inflamatorne reakcije. Molekule koje se produkuju u

reakcijama urodjenog imunogodgovora i koje funkcionišu

kao drugi signali za aktivaciju

leukocita su kostimulatori,

citokini i fragmenti/produkti

cepanja komponenti sistema

komplementa.

Slika 5.28. Stimulacija komponenti adapti-vnog imunog odgovora od straneurodjenog imunog odgovora.A -Makrofage i dendritske elije odgovaraju nafagocitirane (sa elijama asocirane) mikrobeekspresujui kostimulatore (kao što je B7 protein,kog prepoznaju CD28 receptori T elija) i sekretujui

citokine (kao što je IL-12). Kostimulatori i IL-12funkcionišu zajedno sa prepoznavanjem antigena u

aktivaciji T limfocita.B - Sistem komplemenata se aktiviraekstracelularnim mikrobima i generiše proteinima

kao što je C3d koji se vezuje za mikrobe. B limfocitiprepoznaju antigene mikroba preko svojih antigen-receptora i prepoznaju C3d preko receptora koji sezove tip 2 receptor komplementa (CR2). Signali sa

receptora za antigen i CR2 funkcionišu koperativno uaktivaciji B elija.!!! Obratiti pažnju: u oba primera je drugi(sekundrni) signal koji deluje na limfocite koji takodje

specifino prepoznaju antigene obezbedjen prvim

signalnom

Kostimulatori su membranski proteini ekspresovani na antigen prezentujuim elijama

(engl. Antigen Presenting Cells - APCs) koji funkcionišu zajedno sa iskazanim antigenom u

stimulaciji specifinih T limfocita. U prethodnim poglavljima su opisani kolstimulatori T limfocita,

a najbolje definisani su, strukturalno slini proteini, B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86). Kada APCs





175

dodju u kontakt, prepoznaju i “sukobe se” sa produktima mikroba, kao što su LPS, kao i sa IFN-

iz NK elija, APCs odgovaraju ekspresujui visoke nivoe B7-1 i B7-2 kostimulatora i tako dobijaju

mogunost da stimulišu odgovor T elija. U odgovoru na mikrobe, makrofage i dendritske elije

produkuju citokine koji promovišu rast i diferencijaciju T limfocita. Prototip ovakvih citokina je IL-

12 koji stimuliše diferencijaciju naivnih T limofocta u TH1 efektorne elije koje produkuju

IFN-. Prema tome, fagocitima produkovani IL-12 je kljuni induktor efektornih mehanizama

elijama-posredovanog imunog odgovora koji funkcionišu kao glavni iskorenjivai fagocitiranogmikroorganizma (videti u narednom poglavlju o efektornim mehanizmima elijama-posredovanog

imuniteta).

Najbolje definisani drugi signal za aktivaciju B elija je C3d protein komplementa

(fragment razgradnje C3 proteina komplementa). Mikroorganizmi aktiviraju komplement, ili

direktno ili vezujui se za antitela ili MBL u plazmi, i postaju obloženi sa produktima razgradnje

C3, ukljuujui C3d. Receptori za C3d se nazvaju tip 2 receptori komplementa (CR2 ili CD21) I

ekspresovani su na maturiranim B limfocitima. Kada B limfociti prepoznaju antigen mikrobasvojim receptorima za antigen i simultano prepoznaju i C3d preko receptora za komplement

(CR2), ove elije se aktiviraju. Kao rezultat ove aktivacije B elije produkuju antitela kao odgovor

na antigen. Kritina i kljuna uloga sistema komplementa u humoralnom imunom odgovoru je

pokazana kod knock-out miševa kojima nedostaje ili C3 protein sistema komplementa ili CR2.

Drugi signal koji se generiše tokom urodjenog imunog odgovora na razliite mikrobe ne samo

da pojaava magnitude reakcija adaptivnog imunog odgovora koje slede nego utie i na prirodu

mehanizama adaptivnog imunog odgovora (Slika 5.28.). U infekcijama sa intracelularnim

mikrobima, makrofagi fagocitiraju ili prepoznaju mikorbe i odgovaraju ekspresovanjem

kostimulatora i produkcijom citokina koji stimulišu T elijama-posredovani imuni odgovor.

Osnovna funkcija elijama-posredovanog imuniteta je aktivacija makrofaga u cilju uništavanja

intracelularnih mikroba. Na suprot tome, veina ekstracleularnih mikroba/antigena koja udje u

krv aktivira cirkulišue proteine komplementa, koji kao odgovor, poveavaju produkciju antitela iz

B limfocita, odnosno, humoralni imuni odgovor funkcioniše u smislu eliminisanja

ekstracelularnih mikroba. Prema tome, kooperacija izmedju urodjenog imunog odgovora i

adaptivnog imunog odgovora je bidirekciona, pri emu se komponenete, kao i efektorni

mehanizmi, i jednog i drugog sistema medjusobno funkcionalno “oslanjaju”, pomažu i dopunjuju,

a sve u cilju optimizacije mehanizama odbrane organizma domaina od infekcije (Slika 5.29).





176

Slika 5.29. Specifinosti urodjenog imuniteta i adaptivnog imuniteta: najznaajnije interakcije u odgovoru na antigen.

5.3. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA POSREDOVANOG ELIJAMA

elijama-posredovani imunitet je efektorna funkcija T limfocita i funkcioniše kao odbrambeni

mehanizam uperen protiv mikroba koji prežive fagocite ili protiv inficiranih nefagocitnih elija.





177

5.3.1. Tipovi elijama-posredovanih imunih reakcija

Razliiti tipovi mikroorganizama iniciraju raznolike odgovore T elija, a u cilju zaštite organizma

domaina (Slika 5.30). Generalno, dve su osnovne forme elijama-posredovanih imunih reakcija:

(1) CD4+, kao i CD8+ T elije

prepoznaju antigen mikroba koji je

ingestovan fagocitima i aktiviraju

fagocite da unište mikrobe.(2) CD8+ citotolitiki T limfociti (CTL)

uništavaju bilo koju nukleiranu eliju

koja sadrži strane antigene

(mikrobijalne ili tumorske) u citoplazmi.

Slika 5.30. Tipovi T elijama-posredovanog imuniteta A – CD4+ TH1 elije i CD8+ T elije prepoznaju klasu II MHC-

asociranih peptidnih antigena ili klasu I MHC-asociranih peptidnihantigena fagocitiranih mikroba i produkuju citokine koji aktivrajumakrofage da unište mikkobe i stimulišu inflamaciju.B – CD8+ citolitini T limfociti (CTL) prepoznaju klasu I MHC-

asociranog peptidnog antigena mikroba koji se nalazi u citoplazmiinficirane elije i uništavaju eliju.

Adaptivni imuni odgovor na mikrobe koji se nalaze u okviru fagozoma fagocita je posredovan

T limfocitima koji prepoznaju antigen mikroba i aktiviraju fagocite da unište ingestirani

mikroorganizam. Mnogi mikrobi su razvili mehanizme koji im omoguavaju da prežive, pa

ak i da

se replikuju u fagocitima, te je stoga urodjeni imunitet ponekad nemoan da iskoreni

mikroorganizme. elijama-posredovani imuni odgovor funkcioniše u smislu da poveava

mikrobicidnu aktivnost fagocita i efikasnost eliminacije mikroba, pri emu je specifinost

odgovora u domenu funkcija T elija ali efektorna funkcija kojom se uništava mikrob je zapravo

rezultat aktivnosti fagocita. Ova kooperativnost T limfocita i fagocita ilustruje veoma važnu kariku

izmedju adaptivnog i urodjenog imuniteta. T-elijama posredovana aktivacija makrofaga koja se

ostvaruje preko IFN-, kao i inflamatorna reakcija, može u nekim sluajevima da ošteti tkivo

organizma domaina. Ova reakcija se naziva odloženi-tip hipersenzitivnosti (engl. Delayed-

T ype H ypersensitivity - DHT), termin hipersenzitivnost se u ovom sluaju odnosi na tkivo ošteeno

imunim odgovorom. DHT se esto koristi kao esej za ispitivanje elijama-posredovanih imunih

reakcija i esto prati zaštitu omoguenu elijama-posredovanim imunim odgovorom.

Adaptivni imuni odgovor uperen protiv mikroba koji su inficirali citoplazmu razliitih elija,

ukljuujui i nefagocitne elije, i u njoj se replikuju je posredovan CD8+ citolitinim T limfocitima

( l C l i T h CT ) CTL i h i i i i





178

(engl. C ytolytic T L ymphocytes - CTLs). CTLs su osnovni mehanizam zaštite uperen protiv virusa

koji inficiraju razliite tipove elija i imaju sposobnost replikacije u citoplazmi inficirane elije

domaina. Ukoliko elija nema i/ili izgubi sposobnost da uništi mikrob, jedini nain

iskorenjivanja infekcije je uništavanje inficirane elije. CTLs-posredovano uništavanje je takodje

mehanizam za eliminaciju mikroba koji su se iz nekog razloga “spasili” fagozoma i zašli u

citoplazmu gde su van domašaja mikrobicidnih mehanizama fagocita.

Adaptivni imuni odgovor na helmintske parazite je posredovan preko TH2 elija koje stimulišu

produkcju IgE antitela i aktiviraju eozinofile koji uništavaju IgE-obložene parasite. T H2 podgrupa

pomonih T elija takodje inhibiše aktivaciju makrofaga, te je stoga važna za limitiranje DHT

reakcije. Protektivan imuni odgovor prema virusima i drugim intracelularnim mikrobima takodje

ukljuuje i NK elije kao kompnenete urodjenog imunog odgovora (opisano u prethodnom

poglavlju o Efektornim reakcijama urodjenog imuniteta ).

5.3.2. Razvoj efektornih elijaelijama-posredovani imuni odgovor se sastoji od razvoja efektornih T elija od naivnih elija u

perifernim limfoidnim organima, migracije ovih efektornih T elija i drugih leukocita do mesta

infekcije, i na kraju, ili citokinima-posredovane aktivacije leukocita da unište mikrobe ili direktnog

uništavanja inficirane elije (Slika 5.31.). Naivne T elije migriraju iz krvi u limfoidne organe, a

onda iz jendog limofoidnog organa u drugi, sve dok ne dodju u kontakt sa mikrobom (videti ranije

o recirkulaciji limfocita u poglavlju elije i tkiva imunog sistema ). Naivne T elije ne produkuju

efektorne citokine ili molekule neophodne za uništavanje drugih elija. Za iskorenjivanje mikroba

naivne T elije moraju da se diferenciraju u efektorne elije da bi mogle dobiti funkcionalne

sposobnosti. Razvoj efektornih T elija ukljuuje sekvencu od nekoliko dogadjaja/procesa:

prepoznavanje antigena asociranog na elijama u perifernim limfoidnim organima; klonalna

ekspanzija i diferencijacija. Sve to je diskutovano ranije, a ovde e biti samo ukratko sumirano.

5.3.2.1. Prepoznavanje antigena od strane T elija i kostimulacija

Direfencijacija naivnih T limfocita u efektorne elije komponente elijama-posedovanog

imuniteta zahteva prepoznavanje antigena i kostimulaciju.





179

Slika 5.31. Indukcija i efektorna faza elijama-posredovanog imuniteta.Indukcija odgovora: CD4+ T elije i CD8+ T elije prepoznaju peptide koji se dobijaju od proteinskih antigena i prezentovani su putem profesionalnih antigen

prezentujuih elija u perifernim limfoidnim organima. T limfociti su stimulisani na proliferaciju i diferencijaciju i kao efektorne elije ulaze u cirkulaciju.Migracija T elija i drugih leukocita na mesto gde je prisutan antigen: efektorne T elije i drugi leukociti migriraju kroz krvne sudove u periferna tkiva preko

vezivanja za endotelne elije koje aktiviraju citokini produkovani kao odgovor na infekciju u tim tkivima.Efektorske funkcije T elija: efektorne T elije prepoznaju antigen u tkivima i odgovaraju tako što sekretuju citokine koji aktiviraju fagocite koji iskorenjuju infekciju.

T elijama produkovani citokini takodje stimulišu infekciju.

Odgovor i diferencijacija CD4+ T elija je iniciran prepoznavanjem antigena prezentovanog

od strane profesionalnih APCs. Paralelno sa prezentacijom antigena, mikrobi ili neki produkti

urodjenog imuniteta iniciraju urodjeni imuni odgovor. Ovo rezultira stimuliacijom APCs da

ekspresuju visok nivo kstimulatora (B7-1 i B7-2) što predstavlja drugi signal za aktivaciju T elija

i produkciju IL-12 koji stimuliše difrencijaciju T elija.

Od CD8+ T lj j t k dj i i i j ti k ji i k i k





180

Odgovor CD8+ T elja je takodje iniciran prepoznavanjem antigena koji su iskazani preko

profesionalnih APCs, ali neke karakteristike ih ine razliitim od drugih T elija. Prvo, antigeni

koji se prepoznaju od strane CD8+ T elija moraju biti u citoplazmi APCs i to se može dogoditi

ukoliko mikrob direkto inficira APCs. Drugo, diferencijacija naivnih CD8+ T elija u

funkcionalne CTLs može da zahteva dodatne signale od CD4+ pomonih elija. U sluaju

kada je jak urodjeni imuni odgovor na mikrobe ili je APCs inficirana, CD4+ T pomone elije

možda nisu potrebne. Medjutim, u sluaju kada je urodjeni imuni odgovor na mikrobe slab i kadaAPCs nisu inficirane, kao što je sluaj u latentnim viralnim infekcijama, transplantacijama organa

i tumorima, CD4+ pomone elije su esencijalne za punu aktivaciju CD8+ T elija. Pomone T

elije mogu da sekretuju citokine, kao što je IL-2, koji stimuliše proliferaciju i diferencijaciju CD8+

T elija. Antigenom-stimulisane pomone T elije ekspresuju CD40L koji se vezuje za CD40 na

APCs i aktivira ove

APCs u smislu

poboljšanja efikasno-sti u stimulaciji CD8+

T elija.

Slika 5.32. Uloga kostimu-latora i T elija pomonica udiferencijaciji CD8+ Tlimfocita.

Diferencijacija CD8+ T elija uefektorne citolitine T limfocite (CTL)zahteva prepoznavanje antigena(signal 1) i dodatne stimuluse (signal2). Sekundarne signale moguobezbediti kostimulatori, kao što je B7

molekul, ekspresovan naprofesionalnim APCs (slika A) ili prekocitokina produkovanih od strane CD4+T elija pomonica (slika B). CD4+ T

elije pomonice mogu takoeaktivirati APCs i uiniti ih sposobnim

da stimulišu CTL razvoj, npr.stimulišui ekspresiju B7 molekula.

Pomone T elije takodje promovišu preživljavanje CD8+ T elija, pa prema tome i memorijski

odgovor. Ova uloga CD4+ T elije je prihvaena kao objašnjenje defekta u generisanju CTLs kod

individua inficiranih HIV virusom kod kojih virus inficira i eliminiše jedino CD4+ T limfocite.

5.3.2.2. Klonalna ekspanzija T elija





181

5.3.2.2. Klonalna ekspanzija T elija

Nakon što naivne T elije budu izložene antigenu i kostimulatorima u perifernim limfatinim

oganima, one proliferišu uglavnom kao odgovor na autokrino produkovani IL-2. Antigenima-

stimulisane T elije proliferišu u veoma velikom

intenzitetu obezbedjujui ogromnu populaciju

antigen-specifinih limfocita sa kapacitetom I

sposobnostima da se diferencijraju u efektorneelije (Slika 5.33.).

Slika 5.33. Klonalna ekspanzija T elija.Ekspanzija T elija kao odgovor na infekciju podrazumeva da se neke diferencirajuu efektorne elije, a neke u memorijske elije, dok mnoge umiru. Kinetika i brojelija prikazani na slici su tipini za odgovor CD8+ T elija u slezini miša zaraženogsa virusom.

5.3.2.3. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u efektorne elije

CD4+ T elije mogu da se diferenciraju u podgrupu efektornih elija koje produkuju razliite i

raznovrsne setove citokina, pa prema tome realizuju i razliite efektorne funkcije (Slika 5.34.).

Jedan od najboljih primera specijalizacije adaptivnog imuniteta je sposobnost CD4+ T limfocita da

aktiviraju razliite efektrone mehanizme u odgovoru na razliite mikrobe. Osnova ove specija-

lizacije je heterogenost CD4+ T elija ilustrovana prisustvom podgrupa (T H1, T H2) koje se razlikuju

po nainu kako se indukuju, koje citokine produkuju i koje efektorne mehanizme aktiviraju.

Karakteristike TH1 i TH2 podgrupa efektornih T limfocita

Najbolje definisane podgrupe efektornih T elija CD4+ pomone linije su TH1 i TH2 elije, koje se

odlikuju karakteristinim citokinima: IFN- za TH1; IL-4 i IL-5 za TH2 (Tabela 5.2. i Slika 5.34.).

Populacije pomonih T elija koje se mogu razlikovati na osnovu citokina koje sekretuju su

otkrivene tokom ispitivanja velikog panela kloniranih elijskih linija dobijenih od antigenima-

stimulisanih CD4+ T elja miša. Danas je apsolutno jasno da pojedine T elije mogu daekspresuju razliite mešavine citokina i da postoji mogunost postojanja velikog broja

subpopulacija sa veom heterogenošu obrazca sekrecije citokina, posebno kod ljudi. Bez obzira

na to, u hroninim imunim reakcijama naješe dominiraju ili T H1 i T H2 populacije. Relativna

proporcija ovih elija indukovana tokom imunog dogovora je glavna determinanta zaštitne

funkcije i pataloških konsekvenci odgovora. T H1 i T H2 populacije se najjasnije razlikuju preko

citokina koje produkuju (Tabela 5.12. i Slika 5.34.).





182

Tabela 5.12. Osobine TH1 i TH2 podgrupa CD4+ T elija pomonica

OSOBINA TH1 PODGRUPA TH2 PODGRUPA

Produkcija citokinaIFN- + + + -

IL-4, IL-5, IL-13 - + + +IL-10 + / - + +

IL-3, GM-CSF + + + +

Ekspresija citokinskihreceptora

IL-12R lanac + + -

IL-18R + + -

Ekspresija hemokinskihreceptora

CCR4 + / - + +CXCR3, CCR5 + + + / -

Ligandi za E- i P-selektin + + + / -

Stimulisani izotipoviantitela

IgG2a (miš) IgE, IgG1 (miš)/ IgG4 (ovek)

Aktivacija makrofaga + + + -(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Do danas nije otkriven ni jedan drugi fenotipski marker koji bi omoguio definitivnu klasifikaciju.

Ove grupe ispoljavaju razlike u ekspresiji razliitih citokinskih receptora, ali ove razliitosti mogu

reflektovati samo aktivacioni status elija i ne moraju biti stabilne. Citokini sekretovani od strane

ovih populacija ne samo da determinišu efektorne funkcije ovih elija, nego takodje participiraju u

razvoju i ekspanziji odredjene podgrupe elija. IFN- sekretovan od strane T H1 elija promoviše

dalje, u autorkinom maniru, diferencijaciju T H1 elija, a inhibiše proliferaciju T H2 elija. Nasuprot

tome, IL-4 produkovan od strane T H2 elija promoviše diferencijaciju ovih elija (kao i nekih

drugih), a inhibiše aktivaciju T H1 elija. Prema tome, svaka podgrupa amplicira sebe samu, a

kros-reguliše u antagonistikom maniru recipronu podgrupu. Iz ovog razloga, kada se imuni

odgovor razvije u pravcu jednog puta postaje poveano polarizovan u tom pravcu, a ekstremnonajvea polarizacije je uoena u hroninim infekcijama ili pri hroninom izlaganju antigenima iz

okruženja kada je imuna stimulacija perzistenta. Ove populacije pomonih T elija pokazuju

razliite obrazce migracije do mesta infekcije, što je

posledica razlika u njihovom vezivanju za selektine

endotela kapilara, kao i njihovom odgovoru na

razliite hemokine (Tabela 5.12.)





183

Razvoj TH1 i TH2 pomonih T elija

TH1 i TH2 podgrupe se razvijaju od istog

prekursora koji su naivni CD4+ T limfociti, a obrazac

njihove diferencijacije je determinisan stimulusima

prisutnim u ranim fazama toka imunog odgovora.

Najvažniji stimulusi koji indukuju diferencijaciju sucitokini, sa IL-12 kao glavnim inducerom T H1 elija i

IL-4 kao glavniminducerom TH2 elija (Slika 5.35.).

Isti citokini mogu da funkcionišu i kao faktori rasta i

da prouzrokuju ekspranziju specifinih populacija.

TH1 put diferencijacije je odgovor na mikrobe koji

inficiraju ili aktiviraju makrofage, kao i one koji

aktiviraju NK elije. Diferencijacija antigenima-aktiviranih CD4+ Telija u T H1 efektore je stimulisana mnogim intracelularnim bakterijama (Listeria ), nekim parazitima

(Leishmania ) i virusima, i svi oni inficiraju makrofage. Zajednika karakteristika svih ovih

infekcija i uslova imunizacije je što svi mikrobi iniciraju urodjeni imuni odgovor sa produkcijom

IL-12. Neki od mikorba se vežu za tzv. Toll-like receptore (TLRs) na makrofagama i dendritskim

elijama i direktno aktiviraju ove elije da sekretuju IL-12 (Slika 5.36.). Drugi mikrobi mogu da

trigeruju sekreciju IL-12 indirektno, na primer, stimulacijom NK elija da produkuju IFN-, koji

potom može povratno da deluje na makrofage i indukuje sekreciju IL-12. T elije mogu dalje da

pojaavaju produkciju IL-12 preko razliitih CD40L na T elijama koji vezuju CD40 na APCs i

stimulišu transkripciju IL-12 gena. Ovaj citokin je glavni i odgovorni citokin u elijama-

posredovanom imunitetu. On se vezuje za svoje receptore na antigenima-stimulisanim CD4+ T

limfocitima i aktivira transkripcioni faktor STAT4 koji dalje promoviše diferencijaciju T elija u

T H1 elije (Slika 5.35.). Pored toga, drugi transkripcioni faktor, T-bet, takodje ima kljunu ulogu u

razvoju T H1 elija. T-bet se indukuje delovanjem IFN- te se na taj nain omoguavaju

amplifikacioni mehanizmi za odgovore T H1 elija. IFN- takodje promoviše razvoj TH1 elija

Slika 5. 34. TH1 i TH2podvrste CD4+ T elija

stimulišui produkciju IL-12 iz makrofaga, kao i ekspresiju funkcionalnih IL-12 receptora na T

limfocitima.

Diferencijacija TH2 populacije se odvija kao odgovor na helminte i alergene koji prouzrokuju

hroninu stimulaciju T elija, veoma esto bez znaajne indukcije urodjenog imunog odgovora ili

atkivacije makrofaga. Di-

ferencijacija antigenima-





184

ferencijacija antigenima

stimulisanih T elija u T H2

elije zavisi od IL-4 koji

funkcioniše preko aktiva-

cije STAT6 transkripcionog

faktora odgovornog za

razvoj T H2 elija. (Slika5.35). Drugi transkripci-

oni faktor, GATA-3, tako-

dje ima važnu ulogu u

razvoju TH2 elija, jer sti-

muliše transkripciju gena

za citokine koje produkuju

T H2elije. GATA-3 možebiti produkovan kao odgo-

vor na prepoznavanje anti-

gena, a njegova produkcija

može biti pojaana preko

IL-4, te se tako omoguava

amplifikacija mehanizama

za T H2 odgovore.

Slika 5.35. Razvoj TH1 i TH2 podvrsta CD4+ pomonih T elija.Citokini produkovani u uroenom imunom odgovoru na mikrobe ili rano u adptivnom imunom odgovoru utiu na diferencijaciju naivnih CD4+ T elijau TH1 i TH2 elije. IL-12 produkovan od strane aktiviranih makrofaga i dendritskih elija, indukuje razvoj TH1 elija preko STAT4-zavisnog puta. IL-4koga uglavnom produkuju same T elije, favorizuje indukciju TH2 elija STAT6-zavisnog puta. Transkripcioni faktor T-bet, produkovan kao odgovor

na IFN- pojaava TH1 odgovor, a GATA-3 je odgovoran za diferencijaciju TH2 elije. Drugi citokini koji mogu uticati na diferencijaciju pomonih Telija nisu prikazani na ovoj slici.

Pored citokina i neki drugi stimulusi mogu da utiu na obrazac diferencijacije pomonih T elija.

Ovi stimulusi su koliina antigena i kostimulatora koji su ekpresovani na APCs. Pored toga,

genetika osnova elije domaina je veoma važna determinanta obrazca diferencijacije T elija

(npr. neki sojevi miševa dobijeni

inbridingom razvijaju odgovore T H2

elija na iste mikrobe koji stimulišu

diferencijaciju T H1 elija kod veine

drugih sojeva).





185

Slika 5.36. Uloga IL-12 i IFN- u elijama-posredovanom imunom odgovoru. APCs sekretuju IL-12 kao odgovor na produkte mikroba kao

što su lipopolisaharidi (LPS). NK elije, T elije i CD40 elije

produkuju IFN-. IL-12 stimuliše diferencijaciju CD4+ T elija

pomonica u TH1 efektorne elije, koje produkuju IFN-, a kojipotom »povratno« aktivira makrofage da fagocitiraju mikrobe ida sekretuju još više IL-12.

Efektorne funkcije TH1 i TH2 pomonih T elija

Glavna efektorna funkcija TH1

elija je fagocitima-posredovana odbrana

od infekcije, posebno inicirane

intraceluarnim mikroorganizmima (Slika5.37.). IFN- produkovan iz T H1 elija

stimuliše mikrobicidnu aktivnost fago-

cita te tako promoviše intracelularnu

destrukciju fagocitovanog mikroba.

IFN- takodje stimuliše produkciju IgG

antitela koje ima sposobnost

opsonizacije i fiksacije komplementa,

ime se promoviše fagoctoza.

Slika 5.37. Efektorne funkcije TH1 elija.CD4+ T elije koje se diferenciraju u TH1 elije sekretuju IFN-,

limfotoksine (LT), TNF i IL-2. IFN- deluje na makrofagepoveavajui sposobnost fagocitoze i ubijanja mikroba ufagolizozomima, a na B limfocitima stimulišu produkciju IgG antitela,

sposobnog da opsonizira mikrobe i promoviše fagocitozu. LT i TNF

aktiviraju neutrofile i stimulišu inflamaciju. IL-2 je autokrini faktor rasta produkovan od strane TH1 podvrste T elija.

Glavna efektorna funkcija TH2 elija je u imunim reakcijama posredovanim IgE i eozinofilima

ili mastocitima (Slika 5.38.). Ove reakcije su indukovane preko IL-4, IL-5 i IL-1. T H2 elije su

odgovorne za odbranu od infekcija helmintskim parazitima, kao i za alergijske reakcije. Antitela

stimulisana T H2 elijama ne

promovišu fagocitozu, niti efikasno

aktiviraju komponenete sistema





186

aktiviraju komponenete sistema

komplementa. Pored toga, nekoliko

citokina koje produkuju TH2 elije

(IL-4, IL-13 i IL-10) antagonizuju

efekte IFN- i inhibišu aktivaciju

makrofaga. Ovo je razlog zbog ega

je razvoj T H2 elija asociran sadeficijencijom u elijama-

posredovanom imunitetu na

infekcije intracelularnim mikrobima

kao što su Leishmania i

mikobakterija.

Slika 5.38. Efektorne funkcije TH2 elija.CD4+ T elije koje se diferenciraju u TH2 elije sekretuju IL-4 iIL-5. IL-4 deluje na B elije i stimuliše ih na produkcijuantitela, kao što je IgE koji se vezuje za mastocite. IL-4deluje i kao autokrini faktor rasta i diferencijacije TH2 elija.IL-5 aktivira eozinofile. Citokini poreklom iz TH2 elija takoe

inhibišu aktivaciju makrofaga, kao i TH1-posredovane reakcije

5.3.2.4. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u citoliti ne T elije (CTLs)

Naivne CD8+ T elije se diferenciraju u CTLs koje su efektorne T elije sposobne da prepoznaju iunište ciljne elije koje ekspresuju strane antigene peptide asocirane sa klasom I MHC molekula.

Diferencijacija pre-CTLs elija u aktivne CTL elije ukljuuje »sklapanje i ukljuivanje« mašinerije

sposobne da omogui uništavanje inficirane ciljne elije. Najspecifinije obeležje CTLs difere-

ncijacije je razvoj membranski-vezanih citoplazmatinih granula koje sadrže proteine, ukljuujui

perforine i granizime, a ija je funkcija da unište druge elije. Signali koji stimulišu diferencijaciju

naivnih CD8+ T elija u CTLs su antigen, kostimulatori i pomone T elije.

5.3.3. Migracija efektornih T elija i drugih leukocita na mesto gde je antigen

Efektorne T elije migriraju na mesto infekcije i ostaju na tom mestu (Slika 5.39.).

Da bi se inicirala efikasna efektorna faza elijama-

posredovanog imuniteta, efektorne elije treba dadodju u kontakt sa fagocitom ili inficiranom





187

j g

elijom koja prezentuje antigene, inicijatore odgo-

vora. Da bi locirali mikrobe na bilo kom mestu, T

elije koje su se razvile u limfoidnim organima, kao

što su limfni vorovi, i ušle u cirkulaciju, treba da

napuste vaskularni prostor i da stignu do mesta

infekcije. Usmerena migracija efektornih T limfo-cita na mesto infekcije je deo generalnog procesa

regrutacije leukocita na mesto infekcije, a kao neto

rezultat je razvijanje lokalne inflamatorne reakcije.

Migracija leukocita do mesta infekcije je stimulisana

citokinima koji indukuju ekspresiju adhezionih

molekula na endotelijalnim elijama, kao i

hemotaksiju leukocita (Slika 5.39.). Citokini se

produkuju od strane makrofaga i endotelnih elija

stimulisanih produktima mikroba, a i kasnije u

reakciji odgovora T limfocita na antigen. Najvažniji

citokini u ovoj reakciji su TNF, IL-1 i hemokini.

Efektorni T limfociti ekpresuju adhezione molekule i

hemokinske receptore koji promovišu migraciju

elija do mesta infekcije i inflamaciju. Ova migracija

je posredovana istim adhezionim molekulima,

selektinima i integrinima, odgovornim za migraciju

leukocita kroz ctokinima-aktivirani endotel.

Slika 5.39. Migracija i zaostajanje (retencija) efektornih i memorijskih Telija na mestu infekcije.Prethodno aktivirane efektorne i memorijske T elije migriraju kroz endotel koji je

aktiviran preko citokina (npr. TNF) produkovanih na mestu infekcije. Uekstravaskularnim tkivima T elije koje specifino prepoznaju antigen su aktivirane i

zadržane, dok se T elije koje ne prepoznaju antigen vraaju u cirkulaciju, uglavnompreko limfatinih sudova (nije pokazano na slici).

Migracija efektornih T elija iz cirkulacije do perifernih mesta infekcije je u najveoj meri i najveem

broju sluajeva nezavisna od antigena, ali elije koje prepoznaju antigen u ekstravaskularnom tkivu

imaju tendenciju da se tu i zadrže (Slika 5.39.). Migracija elija kroz krv i limfatine sudove je

kortrolisana uglavnom adhezionim molekulima, a ne vezivanjem za antigene receptore. Prema

tome, proces migracije rezultira regrutovanjem cirkulišuih efektornih T elija na meto infekcije,bez obzira na antigenu specifinost. Ova adheziono-zavisna migracija osigurava da e maksimalno





188

g p g j g

mogui broj prethodno aktiviranih T elija imati mogunost da locira mikrob koji je inicirao

infekciju i da iskoreni infekciju. Neke memorijske elije takodje migriraju u periferna tkiva, ak i u

odsustvu infekcije i pretražuju/ispituju tkivo na mikrobe.

5.3.4. Efektorni mehanizmi elijama-posredovanog imuniteta

Nakon migracije efektornih T elija na periferna mesta infekcije ili izlaganja antigenima, one

prepoznaju antigen za koji poseduju specifine receptore i aktiviraju se kako bi bile spsobne da

izvršavaju svoje efektorne fukcnije. U elijama-posredovanom imunitetu glavna efektorna funkcija

CD4+ T elija je da stimuliše mikrobicidnu aktivnost makrofaga i drugih leukocita, dok je glavna

efektorna funkcija CD8+ CTLs da ubijaju inficiranu eliju i aktivišu fagocitozu.

5.3.4.1. T- elijama posredovana aktivacija makrofaga i drugih leukocita

Aktivirani makrofagi su efektorne elije imuniteta posredovanog elijama i funkcionišu u smislu

eliminacije fagocitovanih mikroorganizama. Monociti se regrutuju iz krvi u tkiva u kojima se izlažu

signalima koji potiu od T H1 efektornih elija i CD8+ efektornih elija, a kao odgovor na antigen u

tkivu. Ove interakcije rezultiraju transformacijom monocita u aktivirane makrofage koji su

sposobni da unište mikrobe. Aktivacija se sastoji u kvantitativnim promenama ekspresije

razliitih proteina koji na kraju aktiviraju makrofag omoguujui mu kapacitet da obavlja neke

funkcije koje ne mogu biti izvedene monocitom.

Stimulusi za aktivaciju makrofaga

CD4+ TH1 i CD8+ T elije aktiviraju makrofage preko kontaktom-posredovanih signala omoguenih

/isporuenih preko CD40L-CD40 interakcija, kao i preko citokina IFN- (Slika 5.40. i Tabela 5.13.).

Kada su efektorne T H1 elije i CD8+ T elije stimulisane antigenima one sekretuju citokine,

najviše IFN-, i ekspresuju CD40L. IFN- je glavni citokin koji aktivira makrofage, i to samostalno,

ili funkcionišui zajedno sa LPS, ili sa CD40 signalima, pri emu pokree neke druge imune

odgovore. Neophodnost CD40L-CD40 interakcije za aktivaciju makrofaga osigurava da su

makrofagi koji prezentuju antigen T elijama (tj. makrofagi koji nose intracelularne mikrobe)

takodje makrofagi koji e biti najefikasnije aktivirani T elijama. U nekim sluajevima, CD8+ T

elije mogu da aktiviraju makrofage istim mehanizmima i sa istim funkcionalnim

rezultatom. Ovo se dešava ukoliko T elije prepoznaju antigene mikroba prisutne u citosoluantigen-prezentujuih makrofa-





189

g p j

ga. Isti proces se inicira i

bakterijskim LPS u reakcijama

urodjenog imunog sistema, što

ukljuuje iste biohemijske

puteve kao CD40 i stimuliše NK

elije da sekretuju IFN-.

Slika 5.40. Aktivacija i funkcionisanjemakrofaga u elijama-posredovanomimunitetuMakrofagi se aktiviraju interakcijom CD40L-CD40 i

preko IFN- , i tako aktivirani ubijaju mikrobe, stimulišu

inflamaciju i poveavaju antigen-prezentujui kapacitetelija.

Efektorne funkcije akiviranih makrofaga

Kao odgovor na CD40 signale i IFN-, poveava se produkcija razliitih aktivnih molekula koji e

estvovati u efektornim reakcijama uništavanja mikroba. Ligacija CD40 aktivira transkripcione

faktore NF-kappaB i AP1, a IFN- aktivira transkripcione faktore STAT1 i IRF-1. Kao rezultat ovih

signala aktivirani makrofagi produkuju poveanu koliinu proteina odgovornih za efektorne

funkcije ovih elija u imunom odgovoru posredovanom elijama (Slika 5.40. i Tabela 5.13.).

Tabela 15. 13. Aktivacija i funkcija makrofaga u elijama-posredovanom imunitetu

ODGOVOR MAKROFAGA ULOGA U ELIJSKOM IMUNOM ODGOVORU

Produkcija reaktivnog kiseoninogposrednika, azot oksida, poveava nivo

lizozomalnih enzima

Uništavanje mikroba u fagolizozomima( efektorna funkcija makrofaga)

Sekrecija citokina( TNF, IL-1, IL-2)

TNF, IL-1: regrutacija leukocita(inflamacija)

IL-12: diferencijacija TH1, produkcija IFN-

Poveana ekspresija B7 kostimulatoraMHC molekula

Poveana aktivacija T elija (amplifikacija)


Efektorne funkcije aktiviranih makrofaga ukljuuju sledee:

Aktivirani makrofagi ubijaju fagocitovani mikrob uglavnom produkujui mikrobicidne

reaktivne kiseonine radikale/intermedijere, azot-oksid i lizozomalne enzime (ovi mehanizami su

detaljno objašnjeni u poglavlju o Efektornim mehanizmima urodjenog imunog odgovora) . Aktivacija

makrofaga poveava potrošnju kiseonika i vodi ka produkciji reaktivnih kiseoninih radikala iazot oksida koji su veoma potentni mikrobicidni agensi koji se produkuju u lizozomima i sposobni





190

su da ubiju ingestirane mikrobe. Pored toga, aktivirani makrofagi sadrže poveanu koliinu

lizozomalnih enzima koji uništavaju fagocitovani mikroorganizam nakon fuzije fagozoma sa

lizozomima. Pored toga, reaktivni kiseonini radikali, azot oksid i lizozomalni enzimi mogu biti

otpušteni u okolno tkivo gde takodje ubijaju mikrobe, ali ekstracelularne, ali mogu prouzrokovati i

ošteenje normalnog, neinficiranog tkiva.

Aktivirani makrofagi stimulišu akutnu inflamaciju preko sekrecije citokina, uglavnom TNF, IL-1 i hemokina, kao i kratko-živeih lipidnih medijatora kao što su trombocita-aktivirajui faktor,

prostaglandini i leukotrijeni. Kolektivno delovanje ovih makrofagima produkovanih citokina i

lipidnih medijatora prouzrokuje lokalnu inflamatornu reakciju bogatu neutrofilima sposobnim

da fagocituju i unište infektivne organizme.

Aktivirani makrofagi (i neutrofili) uklanjanju izumrla tkiva u cilju facilitiranja opravka nakon

kontrolisane infekcije. Oni indukuju formiranje oporavljenog tkiva i produkcijom faktora rasta koji

stimulišu proliferaciju fibroblasta (trobocitima-produkovani faktor rasta; engl. Platelet-Derived

Growth Factor - PDGF); sintezu kolagena (transformišui faktor rasta engl. Transforming

Growth Factor- TGF-) i formiranje novih krvnih sudova ili angiogenezu (faktor rasta fibroblasta;

engl. Fibroblast Growth Factor - FGF). Prema tome, aktivirani makrofagi imaju funkciju

«endogenog hirurga« koji »obradjuje« rane, eliminiše antigen i sanira inflamatornu reakciju.

Uloga TH2 elija i eozinofila u odbrani uperenoj protiv helminata

TH2 elije indukuju inflamatorne reakcije u kojima dominiraju eozinofili i mastociti (Slika 5.38.).

Ovaj tip imunog odgovora fukcioniše u smislu eliminacije infekcije izazvane helmintima, a takodje

može imati ulogu i u odbrani uperenoj protiv nekih ektoprazita. Helminti su previše veliki da bi

bili fagocitirani i rezistentniji su od veine bakterija i virusa na mikrobicidne efektorne mehanizme

aktiviranih makrofaga. Imuni odgovor uperen protiv helminata se sastoji uglavnom od T H2 elija

koje sekretuju IL-4, IL-5 i IL-13. IL-4 i IL-13 stimulišu produkciju IgE antitela koja su specifini

opsonini helminata. IL-5 aktivira eozinofile koji se razliitim Fc receptorima (specifinim za

teški lanac) vezuju za IgE-obložene helminte. Vezivanje aktivira eozinofile i oni oslobadjaju sadržaj

svojih granula (tzv. degranulacija eozinofila), ukljuujui veliki bazini protein i veliki

katjonski protein, koji imaju spsobnost da unište ak i veoma vrst integument helminta.

Mastociti takodje ekspresuju Fc receptor i reaguju na IgE-asocirane antigene

degranulacijom. Granule mastocita sadrže vasoaktivne amine, citokine kao što je TNF, kao i

lipidne medijatore koji indukuju lokalnu inflamatornu reakciju. Pored navedenih efektornih

reakcije, TH2 elije inhibišu elijama-posredovani imuni odgovor preko citokina koji supresujuaktivaciju makrofaga (videti ranije u poglavlju o Citokinima ). Ova uloga T H2 elija se ostvaruje





191

sekrecijom IL-4 i IL-13 koji deluju kao antagonisti IFN-, te tako blokiraju T elijama-

posredovanu aktivaciju makrofaga, ali i preko sekrecije IL-10, koji direktno inhibiše aktivaciju

makrofaga.

5.3.4.2. Mehanizmi CTL-posredovanog uništavanja inficiranih elija

Intracelularni mikrobi koji se na neki nain nadju izvan fagozoma ne mogu biti eliminisani T elijama-posrednom aktivacijom fagocita. Jeidni nain da se iskoreni uspostavljna infekcija ovim

mikrobima je ubijanje inficirane elije citolitinim T limfocitima (CTLs). Ovo ubijanje inficirane

elije od strane CTLs je antigen specifino i kontakt-zavisno. CTLs ubijaju ciljne elije koje ekspre-

suju iste antigene (asocirane za klasu I molekula) koji

su inicirali proliferaciju i diferencijaciju pre-CTLs, ali ne

ubijaju okolne neinficirane elije koje ne ekpresuju ovaj

antigen. I ne samo to, nego ak ni CTLs same nisu

ošteene tokom ubijanja ciljne elije koja ekspresuje

antigen. Ova specifinost u funkcionisanju CTLs

osigurava da normalne elije ne budu ubijene u CTLs-

reakciji protiv inficiranih elija. Ovo visoko-specifino

ubijanje se dešava zbog toga što je aktivnost CTLs

inicirana fizikim kontaktom sa njihovim targetnim

elijama i usmerena je ka ciljnoj eliji. Proces ubijanja

ciljne elije od strane CTLs se sastoji od prepoznavanja

antigena, aktivacije CTLs, »isporuivanja smrtonosnog

dodira/udara« koji ubija ciljnu eliju i otpuštanja CTLs

(Slika 5.41.).

Slika 5.41. Faze u CTLs / posredovanoj lizi ciljnih elija.CTLs prepoznaju antigen-ekspresujue ciljne elije i aktiviraju se, što rezultira oslobaanjemgranula iji je sadržaj smrtonosan za ciljne elije. Formiranjem konjugata izmeu CTL i ciljne

elije takoe zahteva interakciju izmeu akcesorne molekule (LFA-1, CD 8) na CTL ispecifinih liganada na ciljnim elijama (nije prikazano).

Prepoznavanje antigena i aktivacija CTLs

CTLs se vezuju za ciljnu eliju koristei receptor za antigen i akcesorne molekule, kao što su CD8

i LFA-1 integrin. Da bi bila efikasnije prepoznata od strane CTLs, ciljna elija mora da ekspresuje

klasu I MHC molekula u kompleksu sa peptidima (kompleks ima ulogu liganda za receptor na T

elijama i CD8 koreceptor), kao i intercelularni adhezioni molekul-1 (glavni ligand za LFA-1integrin). U konjugatu, CTL-ciljna elija, receptor za antigen na CTL prepoznaje MHC-asocirani





192

peptid na ciljnoj eliji. Ovo prepoznavnja indukuje grupisanje/klastering (engl. clustering)

receptora na T elijam u sinapsu i generiše biohemijske signale koji aktiviraju CTL. Biohemijski

signali su identini onima kojima se aktiviraju T elije pomonice (videti ranije u tekstu o

prepoznavanju i aktivaciji T limfocita). Kostimulatori i citokini koji su neophodni za diferencijaciju

naivnih CD8+ elija, nisu neophodni za iniciranje funkcje CTLs, odnosno za uništavanje ciljne

elije. Prema tome, kada su CD8+ specifine za dati antigen diferencirane u potpuno funkcionalneCTLs, one mogu ubiti/uništiti bilo koju nukleiranu eliju koja iskazuje antigen.

Ubijanje ciljne elije od strane CTLs

Nakon prepoznavanja targeta od strane CTLs, narednih nekoliko minuta, targetna elija prolazi

kroz promene koje e indukovati njenu smrt apoptozom. Smrt ciljne elije nastupa 2 do 6 sati i to

ak i ako se CTL odvoji od ciljne elije, pa stoga CTLs »isporuuju smrtonosan dodir/udar/hitac«

(engl. »kiss and death« contact) koji rezultira citolizom cilje elije, te ona umire. Osnovni mehanizam

CTL-posredovane citolize je isporuivanje citotoksinih proteinskih granula koje e inicirati apoptozu

ciljne elije (Slika 5.42.).

Slika 5.42. Aktivacija i funkcijamakrofaga u elijama-posredo-vanom imunitetuCitolitini T limfociti (CTLs) ubijaju targetelije preko dva glavna mehanizma:(1) Perforin se egzocitozira u CTLgranulama, polimerizuje se i gradi poru uplazma membrani ciljnih elija. Granzimise takoe egzocitiraju u CTL granulama,

ulaze u ciljne elije preko perforinskih porai indukuju apoptozu ciljne elije.Fas ligand (FasL) se ekspresuje na

aktiviranim CTL, vezuje Fas na površiniciljnih elija i indukuje apoptozu

Kada receptor za antigen na citotoksinim T limfocitima (CTL) prepozna MHC-asocirane

peptide na ciljnoj eliji, citoskelet CTL se reorganizuje tako da se mikrotubularno organizovani

centar CTL pomera u zonu citoplazme blizu kontakta sa ciljnom elijom. Takodje, citoplazmatine

granule CTL se nakupljaju i koncentrišu u istom regionu, membrana granula se fuzioniše sa

membranom CTL, a fuzija membrana rezultira egzocitozom granula na površinu ciljne elije.Granule CTLs i NK elija sadrže nekoliko molekula koji uestvuju u elijskoj apoptozi:





193

granizimi A, B i C (koji su serin-proteaze koje »seku« protein nakon aspartatskih ostataka);

perforini (molekul koji je homolog komponenti C9 sistema komplementa i koji narušava

strukturu membrane, engl. membrane-perturbing molecule); serglicin (sulfatovani proteoglikan

koji ima ulogu da poveže kompleks granizima i perforina). I granizimi i perforini su neophodni

za efikasno ubijanaje ciljne elije. Poznato je da perforini mogu funkcionisati i u olakšavanju

isporuivanja granizima na membranu ciljne elije, ali nema potvrde o preciznom mehanizmu.Prema jednom modelu, perforini se mogu polimerizovati i formirati vodene pore na membrani

ciljne elije kroz koje granizimi mogu da udju u ciljnu eliju, ali nije potvrdjeno da je ovaj proces

kritian za CTL-posredovano ubijanje ciljne elije. Prema dugom modelu, kompleks granizima,

perforina i serglicina se izbaci/ispali na ciljnu eliju i internalizuje se u endozome receptorom-

posredovanom endocitozom Perforin može da deluje na endozomalnu membranu u smislu

olakšavanja otpuštanja granizima u citoplazmu ciljne elije. Granizimi dospeli u citoplazmu

cepaju razliite substrate i inicraju apoptotiku smrt ciljne elije. Neki granizimima indukovani

signalni putevi koji posreduju u apoptozi ukljuuju kaspaze, a neki ne (npr. granizim B aktivira

kaspazu-3, dok se smatra da granizimi A i C indukuju apoptozu u maniru nezavisnom od

kaspaza).

Još jedan mehanizam CTLs-posredovanog uništavanja ciljnih elija je interakcija

membranskih molekula na CTLs i targetnim elijama. Nakon aktivacije CTLs ekspresuju Fas

ligand - FasL , membranski protein, koji se se vezuje za svoj ciljni protein, Fas protein,

ekspresovan na mnogim tipovima elija. Ova interakcija aktivira signaling preko kaspaza i

indukuje se apoptoza ciljnje elije.

U infekcijama uzrokovanim intracelularnim mikrobima ubilaka aktivnost CTLs je veoma

važna za iskorenjivanje rezervoara infekcije. Pred toga, kaspaze aktivirane granizimima i FasL

cepaju mnoge supstrate (nukleoproteine, enzime koji degradiraju DNK), ali ne prave razliku

izmedju proteina mikroba i proteina elije domaina. Prema tome, aktiviranjem puteva

apoptotike smrti u ciljnoj eliji CTLs može da inicira destrukciju mikrobijalne DNK, kao i genoma

ciljne elije, i na taj nain eliminiše potencijalno infektivnu DNK. Nakon isporuivanja letalnog

udarca CTLs se odvaja od ciljne elije. Ovaj proces može biti facilitiran smanjenjem afiniteta

akcesornih molekula za njihove ligande i esto se dešava ak i pre nego što ciljna elija pone da

umire. CTLs nije ošteena tokom procesa ubijanja ciljne elija. Najverovatniji razlog tome je što

usmerena/dirigovana egzocitoza granula isporuuje sadržaj granula na/u ciljnu eliju, udaljeno

od CTLs.

Sumirano, CD8+s CTLs ubijaju elije koje ekspresuju peptide derivate citosolnih antigena (npr.





194

viralnih antigena) prezentovane klasom I MHC molekula. CTLs-posredovano ubijanje se ostvaruje

u najveoj meri egzocitozom granula sa granizimima i perforinima. Perforini olakšavanju ulazak

granizima u citoplazmu ciljne elije, a granizimi aktiviraju nekoliko signalnih puteva koji »vode« u

apoptozu.Pored toga, CTLs ekspresuju FasL koji vezuje Fas protein na membrani ciljnih elija i

aktivira signalne puteve koji iniciraju apoptozu cilje elije

5.4. EFEKTORNI MEHANIZMI HUMORALNOG IMUNOG ODGOVORA

Humoralni imunitet je posredovan sekretovanim antitelim i njegova fiziološka funkcija je odbrana

uperena protiv ekstracelularnih mikroorganizama i njihovih toksina. Tipovi mikroba protiv kojih

su upereni mehanizmi humoralnog imunog odgovora su razne ekstracelularne bakterije, gljive, paak i obligatni intracelularni mikrobi kao što su virusu koji su target za anititela pre nego što





195

inficiraju elije domaina ili ukoliko se sekretuju iz inficirane elije. U ovom poglavlju e biti dat

pregled efektornih mehanizama koje koriste antitela da eliminišu antigene. Sama struktura

antitela, kao i proces produkcije antitela od strane B limfocita opisan je ranije (delovi 3 i 4).

5.4.1. Pregled humoralnog imunog sistema

Efektorne funkcije antitela su neutralizacija i eliminacija infektivnih mikroba i njihovih

toksina, Fc-receptor zavisna

fagocitoza i opsonizacija i

aktivacija sistema komplementa

(Slika. 5.43.). Antitelima-posredo-

vana eliminacija antigena zahteva

prisustvo drugih efektornih sistema

kao što su fagociti i sistem

komplementa. Pre nego što budu

opisane pojedini efektorni meha-

nizmi korisno je sumirati

najvažnije karakteristike efekto-

rnih funkcija antitela.

Slika 5.43. Efektorne funkcije antitela. Antitela protiv mikroba (i njihovih toksina, ali oni ovde nisu

prikazani) neutrališu ove štetne agense; opsonizuju ih zafagocitozu i od antitela-zavisnu elijama-posredovanu citoto-ksinost, kao i aktivaciju komplementa. Ove razliite

efektorne funkcije mogu biti posredovane razliitimizotipovima antigena.

Antitela produkuju B limociti i plazma elije limfoidnih organa i kosne srži, ali antitela

obavljaju svoje efektorne funkcije na mestima udaljenim od mesta njihove produkcije.

Anitetela koja posreduju zaštitni imunitet mogu biti produkovana od strane dugo-živeih

plazma elija generisanih prethodnim susretom sa antigenom, i/ili u sekundarnom imunom

odgovoru aktivacijom memorijskih B elija.Mnoge efektorne funkcije antitela su posredovane teškim lancem konstantnog regiona

i l b li (I ) l k l li i i i i i k l b lj j li i f k





196

imunoglobulina (Ig) molekula, a razliiti izotipovi teškog lanca Ig obavljaju razliite efektorne

funkcije (Tabela 5.14.).

Iako su mnoge efektorne funkcije antitela posredovane konstantnim regionom teškog lanca

Ig, sve ove funkcije su inicirane/«trigerovane« vezivanjem antigena za varijabilni region.

Tabela 5.14. Funkcije antitelaIZOTIP

ANTITELAIZOTIP- SPECIFINA EFEKTORNA FUNKCIJA

IgG

Opsonizacija antigena, pre njihove fagocitoze makrofagamaili neutrofilima

Aktivacija klasinog puta komplementa

Antitelo- zavisna elijama- posredovana citotoksinost(posredovana NK elijama i makrofagama)

Neonatalni imunitet: transport antitela majke kroz placentu i

creva

Inhibicija aktivacije B elija mehanizmom povratne sprege

IgM Aktivacija klasinog puta komplementa Receptor za antigene na naivnim B limfocitima

IgA

Mukozni imunitet: sekrecija IgA u lumen gastrointestinalnog irespiratornog trakta

IgE

Antitelo-zavisna elijama- posredovana citotoksinost, kojaukljuuje eozinofile

Degranulacija mastocita (neposredna reakcijahipersenzitivnosti)

IgD

Receptor za antigene na naivnim B limfocitima

(ova funkcija je posredovana preko membranski vezanog a ne sekretovanog antiela)


5.4.2. Neutralizacija mikroba i njihovih toksina

Antitela protiv mikroba i njihovih toksina blokiraju vezivanje ovih mikroba i toksina za elijske

receptore (Slika 5.44.). Na ovakav nain, antitela inhibišu ili “neutrališu” infektivne mikorobe.

Mnogi mikrobi ulaze u eliju organizma domaina vezujui se svojim površinskim molekulima za

proteine elije domaina. Na primer virus gripa koristi svoj hemaglutininski omota da inficira

respiratorni epitel, dok gram-

negativne bakterije koriste

specifine izraštaje za “zaka-ivanje” i inficiraju razno-

lij d i A ti





197

vrsne elije domaina. Anti-

tela koja se vezuju za ovakve

strukture interferiraju i re-

mete sposobnost mikroba da

interaguju sa elijskim rece-

ptorima. U nekim sluajevima samo mali broj

molekula antitela može da se

veže za mikorbe i indukuje

konformacione promene na

površini mikroba koje spre-

avaju mikrobe da se vežu za

receptore elije domaina.

Slika 5.44. Neutralizacija mikroba injihovih toksina antitelima.A – Antitela spreavaju vezivanje mikroba zaelije i prema tome blokiraju sposobnost mikroba

da inficiraju eliju domaina.B – Antitela inhibišu širenje mikoba od inficiraneelije.

C - Antitela blokiraju vezivanje toksina za elije,te prema tome inhibišu patološke efekte toksina.

Antitelima-posredovana neutralizacija mikroba i toksina zahteva jedino antigen-vezujui region

antitela. Ovakva neutralizacija može biti posredovana antitelima bilo kog izotipa u cirkulaciji i

mukoznim sekretima, a eksperimentalno može biti posredovana sa Fab ili F(ab’)2 fragmentima

specifinih antetala. Veina antitela za neutralizaciju u krvi su IgG izotipa, dok su u mukoznim

organima to IgA izotip. Najefikasnija antitela za neutralizaciju su ona koja imaju visoki afinitet za

svoje antigene. Ovakva antetela visokog afiniteta za svoje antigene se produkuju u procesu

afinitetne maturacije. Mnoge profilaktike vakcine funkcionišu tako što stimulišu produkciju

neutrališuih antetela visokog-afiniteta (Tabela 5.15.).

Tabela 5.15. Vakcinom-indukovan humoralni imunitet

INFEKTIVNA BOLEST VAKCINA MEHANIZAM ZAŠTITE IMUNITETA

Polio Oralna aplikacija oslabljenog poliovirus

Neutralizacija virusa mukoznim IgAantitelima





198

virus antitelima

Tetanus, difterija Toksoidi Neutralizacija toksina sistemskim IgGantitelima

Hepatitis A i B Rekombinanti proteini virusnogomotaa

Neutralizacija virusa sistemskim IgGantitelima

Pneumonia izazvana

pneumokokama, Haemophylus

Konjugovana vakcina, sastavljenaod bakterijskih lipopolisaharida

kapsule i proteina

Opsonizacija i fagocitoza posredovanaIgM i IgG antitelima, direktno ili

sekundarno ( preko aktivacijekomplementa)


5.4.3. Antitelima-posredovana opsonizacija i fagocitoza

Antitela IgG izotipa oblažu (opsonizuju) mikrobe i promovišu njihovu fagoctozu vezujui se za Fc

receptor fagocita. Mononukelarni fagociti i neutrofili ingestuju mikrobe i pripremaju ih zaintraelijsko ubijanje i degradaciju. Ovi fagociti ekspresuju površinske receptore koji direktno

vezuju mikrobe i fagocitiraju ih ak i bez prisustva anitetela, što je jedan od mehanizama

urodjenog imuniteta (videti poglavlje 5.2.). Efikasnost ovog procesa je veoma poveana ukoliko

fagociti mogu da vezuju partikule sa velikim afinitetom (Slika 5.45.). Mononukearni fagociti i

neutrofili ekspresuju receptor za Fc deo IgG antitela kojim se specifino vezuju za antitelima-

obložene (opsonizovane) partikule. Mikrobi takodje mogu biti opsonizovani i sa C3b produktom

aktivacije sistema komplementa i fagocitirane od strane leukocita koji se vezuju za C3b.

Slika 5.45. Neutralizacija mikro-ba injihovih toksina antitelima.A – Antitela odredjenih IgG podklasa koja se

vezuju za mikrobe bivaju prepoznata od straneFc receptora na fagocitima. Signalni putevi od Fcreceptora promovišu fagocitozu opsonizovanog

mikroba i aktiviraju fagocite da unište fagoci-tovani mikrob.

5.4.3.1. Fc receptor fagocita

Fc receptor na leukocitima promoviše fagocitozu opsonizovanih partikula i daje/emituje signale koji

stimulišu mikrobicidne aktivnosti leukocita. Fc receptori za razliite izotipove teškog lanca Ig su

ekpresovani na mnogim leukocitima i imaju veoma raznovrsne funkcije (Tabela 5.16.).

Tabela 5.16. Leukocitarni Fc receptori





199

FcR AFINITET ZA IMUNOGLOBULIN DISTRIBUCIJA ELIJA FUNKCIJA

FcRI(CD64)

Visok (Kd ~ 10-9 M); vezuje IgG1 i IgG3;može vezivati monomer IgG

Makrofage, neutrofili;kao i eozinofili

Fagocitoza; aktivacija fagocita

FcRIIA(CD32)

Nizak (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10-6 M) Makrofage, neutrofili;

Eozinofili, trombociti

Fagocitoza; aktivacija elija

(neefikasna)

FcRIIB(CD32)

Nizak (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10-6 M) B limfociti Inhibicija B elija mehanizmompovratne sprege

FcRIIIA(CD16)

Nizak (Kd ~ 5 x 10-5 M) NK elije Antitelo- zavisna elijamaposredovana citotoksinost

FcRIIIB(CD16)

Nizak (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10-6 M);

GPI- vezani protein

Neutrofili, druge elije Fagocitoza

(neefikasna)

FcRI Visok (Kd ~ 10-10 M);vezuje monomer IgE

Mastociti, bazofili,eozinofili

elijska aktivacija(degranulacija)

FcRII(CD23) Nizak (Kd ~ 10-7 M)

B limfociti, eozinofili,Langerhansove elije

Nepoznata

FcR(CD89)

Nizak (Kd ~ 10-6 M) Neutrofili, eozinofili,monociti

Aktivacija elija ?


Od svih ovih receptora oni koji su najvažniji za fagocitozu opsonizovanih partikula su receptori za

teški lanac IgG nazvani Fc

. Fagocitoza IgG-obloženih partikula je posredovana vezivanjem Fc

dela molekule antitela koje je opsonizovalo mikrob za Fc receptor fagocita. Podtipovi IgG koji senajbolje vezuju za ove receptore (IgG1 i IgG3) e najefikasnije promovisati fagocitozu. Vezivanje

opsonizovanih partikula za Fc receptor fagocita, posebno FCRI aktivira fagocite razliitim

signalima ostvarenim od Fc receptora ukljuivanjem razliitih signalnih puteva. Posledica je

aktivranje tirozin kinaza u fagocitima koje stimulišu produkciju mikrobicidnih molekula. Pored

toga, stimuliše se fagocitna oksidaza, enzim koji katalizuje intracelularno generisanje reaktivnih

kiseoninih intermedijera koji su toksini za fagocitovane mikrobe. Pored toga, leukociti sa

aktiviranim Fc receptorom sekretuju hidrolitike enzime i reaktivne kiseoni

ne intermedijere ueksternalno okruženje te su na taj nain sposobni da uništavaju mikrobe koji su previše veliki

da bi bili fagocitirani. Ovi isti toksini produkti mogu oštetiti i okolno, neinficirano tkivo

organizma domaina, te je ovaj mehanizam antitelima-posredovanog ošteenja tkiva veoma važan

kod bolesti hipersenzitivnosti.

Ekspresija FCRI na makrofagama je stimulisana IFN- Izotipovi antetela koja najbolje

vezuju FC receptore su produkovana kao rezultat IFN-posredovane stimulacije “swhitchinga”izotipova. Pored toga, kao što je ranije pomenuto (poglavlje 5.3.) IFN- direktno stimuliše

mikrobicidnu aktivnost makrofaga te je stoga IFN odlian primer citokina koji ima multiple efe





200

mikrobicidnu aktivnost makrofaga, te je stoga IFN- odlian primer citokina koji ima multiple efe-

kte koji funkcionišu kooperativno u jednom mehanizmu odbrane, eliminaciji mikroba fagocitozom.

5.4.3.2. elijama-posredovana citotoksi nost koja zavisi od antitela

NK elije i drugi leukociti se preko Fc receptora vezuju za antitelima-obložene elije i uništavaju ih.

Ovaj proces se naziva od antitela-zavisna elijama-posredovana citotoksinost (engl. Antibody-Dependent Cell-mediated C ytotoxicity – ADCC). Prvi put je opisana kao funkcija NK elija koje

koriste svoj Fc receptor, FcRIII, da se vežu za antitelima-obložene elije. FcRIII je receptor malog

afiniteta koji vezuju grupisane IgG molekule na površini elije, ali ne vezuje slobodne, cirkulišue

monomenre IgG. Prema tome, ADCC se ispoljava iskljuivo ukoliko je elija obložena molekulima

antitela, a slobodni, cirkulišui plazma IgG monomer, niti aktivira NK elije, niti kompetituje

efektivno sa IgG grupisanim na površini elija u vezivanju za FcRIII. Zauzimanje FcRIII sa

antitelima-obloženim elijama aktivira NK elije da sintetišu i sekretuju citokine (IFN-), kao i da

izbacuju sadržaj kojim se posreduje ubilaka funkcija ovih elija (videti ranije u poglavlju 5.2.).

Eozinofili posreduju specijalan

tip ADCC uperen protiv nekih

helmintskih parazita (Slika

5.46.).

Slika 5.46. Od antitela zavisna elijama-posredna citotoksinost.A – Antitela odredjenih IgG podklasa koja se vezuju zaelije (inficirane elije) i Fc region vezanog antitela bivaprepoznat od strane Fcg receptora NK elija. NK elije

se aktiviraju i ubijaju antitelima-obloženu eliju.B – IgE anitetla se vezuju za helmintske parazite, a Fc

region vezanog antitela biva prepoznat od strane Fc

repceptora na eozinofilima. FcRI-indukovani signalniputevi aktiviraju odgovor eozinofila u smislu izbacivanja

saržaja njihovih granula kojima se ubijaju paraziti.

Helminti su previše veliki da bi bili “progutani” od strane fagocita, a njihov integument je relativno

rezistentan na mikrobicidne produkte neutrofila i makrofaga, ali oni mogu biti ubijeni baznim

proteinom prisutnim u granulama eozinofila. IgE oblaže helminte, a eozinofili mogu da se vežu za

IgE preko svojih Fc receptora, FcRI. Eozinofili se aktiviraju preko FcRI-indukovanih signala i

otpuštaju sadržaj svojih granula, što kulminira ubijanjem helminta.





201

5.4.4. Sistem komplementa

Sistem komplementa je jedan od najvažnijih efektornih mehanizama humoranog imuniteta, a

takodje je veoma važan efektorni mehanizam i urodjenog imuniteta (videti ranije u poglavlju 5.2.).

Sistem komplementa se sastoji od proteina u serumu/plazmi i na površini elija koji interaguju me-

djusobno, kao i sa drugim molekulama imunog sistema u veoma visoko-regulisanom i koordinisanom

maniru. Proteini sistema komplementa su plazma proteina koji su normalno neaktivni, a

aktiviraju se pod odredjenim uslovima i generišu produkte koji posreduju razliite efektorne

funkcije komplementa.

Nekoliko karakteristika aktivacije komplementa su esencijalne za njegovo normalno fukcionisanje:

Aktivacija kompementa ukljuuje sekvencionalno-posledine-kaskadne proteolize proteina

kako bi se generisali enzimi sa proteolitikom aktivnošu. Kaskadni tip proteolize

omoguava neverovatno veliku amplifikaciju zbog toga što svaki enzimski molekul koji je

generisan/aktiviran u jednoj fazi može da generiše multiple-aktivirane enzimske molekule

u narednoj fazi.

Produkti aktivacije komplementa dobijaju sposobnost da se kovalentno vežu za površinu elije

mikroba ili antitelo vezano za mikrobe ili za druge antigene. U cirkulišuoj formi (fluidnoj

fazi) proteini komplementa su ili inaktivni ili prolazno aktivni (na sekunde), a oni postajustabilno aktivni nakon što se zakae za mikrobe ili antitela. Mnogi produkti razgradnje

komponenti sistema komplementa se takodje kovalnetno vezuju za mikrobe i antitela.

Aktivacija komplementa je inhibisana regulatornim proteinima koji su prisutni na normalnoj

eliji domaina, a nema ih na površini elija mikroba. Regulatorni proteini su adaptacija

normalnih elija koja minimizira komplementom-posredovana ošteenja elija domaina.

Mikorbima nedostaju ovi regulatorni proteini, te to dozvoljava aktivaciju komplementa koja

se dešava na površini mikroba.

5.4.4.1. Putevi aktivacije komplementa

Postoje tri osnovna puta aktivacije komplementa: klasini put, koji se aktivira odredjenim

izotipovima antitela vezanim za antigene; alternativni put, koji se aktivira molekulama i/ili grupama

molekula na površinim elija mikoba i u odsustvu antitela; lektinski put, koji se aktivira vezivanjem

plazma lektina za manozne ostatke na mikobima (videti Sliku 5.26. u poglavlju ). Iako su puteviaktivacije komplementa razliiti, svi oni generišu enzimske komplekse koji su sposobni da

“cepaju” najizraženiji protein sistema komplementa C3 Kao što je ranije napomenuto alternativni





202

cepaju najizraženiji protein sistema komplementa C3. Kao što je ranije napomenuto, alternativni

i lektinski put su efektorni mehanizmi urodjenog imuniteta, dok je klasini put aktivacije

komplementa efektorni mehanizam adaptivnog imuniteta.

Centralni dogadjaj u aktivaciji komplemeta je proteoliza komplementnog proteina C3 da bi se

generisao biološki aktivan produkt, a potom posledino kovalentno vezivanje C3b koji je produkt C3

za površinu mikroba ili antitelo vezano za antigen (Slika 5.47.). Aktivacija sistema komplementa sesastoji od ranijih faza koje rezultiraju proteolizom C3, i kasnijih faza koje vode formaciji prote-

inskog kompleksa koji lizira

eliju. U ranijim fazama

aktivacije komplementa gene-

rišu se dva proteolitika

produkta C3, tzv. C3a i C3b

(prema konvenciji proteolitiki

produkti se identifikuju malim

slovima u sufiksu, pri emu se

“a” odnosi na manji produkt, a

“b” na vei).

Slika 5.47. Ranije faze - “koraci” aktivacijekomplemenata u alternativnom i klasinomputu. Alternativni put (A) se aktivira vezivanjem C3b zarazliite površine, kao što je mikrobijalni elijski zid.Klasini put (B) je iniciran vezivanjem C1 zaantigen-antitelo kompleks. C3b nastaje dejtvom C3

konvertaze, vezuje se za elijske površine mikrobaili za antitela i postaje komponenta enzima kojicepaju C5 (C5 konvertaze) i iniciraju kasnije korakeaktivacije komplementa. Kasniji koraci oba puta suisti (nije prikazano na slici), a i aktivacija

komplemenata preko oba puta ima iste funkcije.

C3b se kovalentno vezuje za površinu elije mikroba ili za molekulu antitela, te se tako aktivira a

potom vezuje ostale proteinske kompontente sistema komplementa, aktivira ih i iniciraju se

kasnije faze u aktivaciji sistema komplementa.

Alternativni put

Alternativni put aktivacije komplementa rezultira proteolizom C3 i stabilnim vezivanjem produkta

C3b za površinu elija mikroba (Slika 5 48 i Tabela 5 17 ) Solublilni C3 u plazmi normalno poka-





203

C3b za površinu elija mikroba (Slika 5.48. i Tabela 5.17.). Solublilni C3 u plazmi normalno poka

zuje sporu i spontanu hidrolizu sopstvenih internalnih tioestarskih veza, što vodi formiranju C3b.

Mala koliina nastalog produkta

C3b može kovalentno da se vezuje

za površinu elija mikroba. Na

površini mikroba C3b vezuje FaktorB (plazma protein) koji se cepa

delovanjem serin-proteaze iz plazme

koja se zove Faktor D i generiše se

fragment Bb koji ostaje zakaen za

C3b, a manji fragment, Ba, se

otpušta. Kompleks C3bBb je C3

konvertaza alternativnog puta i

funkcioniše tako da cepa još više

molekula C3. Bez obzira što se

formira u kaskadnom putu, C3b i

dalje može da formira kompleks sa

Bb koji je sposoban da razlaže još

više C3 molekula.

Slika 5.48. Alternativni put aktivacije komplementa.

Solubilni C3 u plazmi pokazuje sporu i spontanu hidrolizusopstvenih internalnih tioestarskih veza, što vodi formacijifluidne-faze C3 konvertaze i formiranju C3b. Kada je C3b

odložen na površinu mikroba, vezuje se za faktor B i obrazujealternativni put C3 konvertaze. Ova konvertaza cepa C3 iprodukuje sve više C3b, koji se vezuje za mikrobijalnepovršine i uestvuje u formiranju C5 konvertaze. C5

konvertaza cepa C5 i nastaje C5b, što predstavlja inicijalni

dogaaj u kasnijim koracima aktivacije komplemenata.

Prema tome C3 konvertaza alternativnog puta amplifikuje aktivaciju komplementa bilo da se

aktivira alternativnim ili klasinim putem. Kada se C3 razgradi, C3b ostaje zakaen za eliju, a

C3a se otpušta i ima specifine biolške aktivnosti.

Tabela 5.17. Proteini Alternativnog puta aktivacije komplementa

PROTEIN STRUKTURAKONCENTRACIJASERUMA (

g/ml) FUNKCIJA





204

C3 185 kD (-subjedinica 110

kD; -subjedinica 75 kD) 1000-1200C3b vezuje se za površinu mikroba, gde

funkcioniše kao opsonin i kao komponenta C3 iC5 konvertaza.

C3a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)

Faktor B 93 kD monomer 200 Bb je serin proteaza i aktivan enzim C3 i C5konvertaza

Faktor D 25 kD monomer 1-2 Serin proteaze iz plazme razdvajaju faktor B,kada je on vezan za C3b

ProperdinI

Gradi ga više od etiri 56 kDsubjedinica

25 Stabili zaci ja C3 konvertaza (C3bBb) na površinimikroba


Stabilna aktivacija alternativnim putem odvija se na površini elija mikroba, ali ne na sisarskim

elijama. Ukoliko se i formira C3bBb na elijama sisara rapidno se degradira i reakcija se završava

delovanjem nekoliko regulatornih proteina. Nedostatak ovih regulatornih proteina na elijamamikroba dozvoljava vezivanje i aktivaciju C3 konvertaze alternativnog puta. Pored navdenih, još

jedan protein alternativnog puta, properdin, može da se veže i stabilizuje C3bBb kompleks.

Takodje, neke molekule C3b generisane u toku alternativne aktivacije mogu da se vezuju za

konvertazu i grade C3bBb3b kompleks koji funkcioniše kao C5 konvertaza alternativnog puta

i cepa C5 inicirajui kasnije faze aktivacije komplementa.

Klasini put

Klasini put aktivacije komplementa se inicira vezivanjem komplementarnog proteina C1 za CH2

domen IgG molekule ili Ch3 domen IgM molekule koje su vezale antigen (Slika 5.49. i Tabela 5.18).

C1 je veliki multimerni proteinski kompleks koji se sastoji od C1q, C1r i C1s subjedinica, pri

emu se C1q vezuje za antitelo, a C1r i C1s su proteaze. C1 subjedinica se sastoji od šest lanaca

radijalno rasporedjenih u obliku koji je slian kišobranu, a svaki lanac ima globularnu glavu

povezanu sa kolegenu-slinim ramenom za centralnu dršku (Slika 5.50.). Ovi heksameri obavljaju

funkciju prepoznavanja i vezuju se specifino za Fc region i nekih teških lanaca. Svaki Fc

region Ig ima jedinstveno C1q-vezujue mesto i svaki C1q molekul mora da veže dva teška lanca

Ig kako bi postao aktivan. Ovaj zahtev objašnjava zašto samo vezana antitela, a ne i slobodna,

cirkulišua, mogu da iniciraju klaian put aktivacije komplmenta (Slika 5.51.). Zbog toga što sva-

ka molekula IgG ima samo

jedan Fc region, vei broj

molekula IgG moraju bitizajedno pre nego što se veže

C1q, a IgG molekule e biti u





205

q, g

grupi jedino ako su vezale

multivalente antigene. Iako je

cirkulišui, slobodni IgM

pentamer, ne vezuje C1q zbog

toga što njegov Fc region nedostupan ukoliko antigen nije

vezan za IgM molekulu.

Slika 5.49. Klasini put aktivacije komplemenata.Kompleks antigen-antitelo, koji aktivira klasini put, može biti solubilan, fiksiran za površinu

elija, ili odložen u ekstracelularnom matriksu. Klasini put se inicira vezivanjem C1 zakompleks antigen-antitelo, što vodi produkciji C3 i C5 konvertaze vezane za površinu, gde

je odloženo antitelo. C5 konvertaza cepa C5 i poinju kasniji koraci aktivacijekomplemenata.

Slika 5.50. Struktura C1 subjedinice proteina C1.C1q sastoji se od šest identinih subjedinica organizovanih takoda formiraju centralnu osnovu i simetrino projektovane radijalnegrane. Globularna glava na kraju svake grane (obeleženo sa H)

predstavlja kontakt region za imunoglobuline. Dva C1r i dva C1sormiraju tetramer, locirani su izmeu radijalnih grana C1q. Na

krajevima C1r i C1s nalaze se katalitiki domeni

C1r i C1s su serin-esteraze koje formiraju tetramer koji sadrži po dve molekule od svakog.

Tabela 5.18. Proteini Klasinog puta aktivacije komplementa

PROTEIN STRUKTURAKONCENTRACIJAU SERUMU (

g/ml) FUNKCIJA

C1 (C1qr 2s2) 750 kD Inicijacija klasinog puta

C1q460 kD; heksamer

izgraen iz 3 para

75-150

Vezuje Fc fragment antitela za koji je vezan antigen





206

C1q izgraen iz 3 paralanaca (22, 23, 24 kD)

Vezuje Fc fragment antitela za koji je vezan antigen

C1r 85 kD dimer 50 Serin proteaza, razdvaja C1s i ini je aktivnom

C1s 85 kD dimer 50 Serin proteaza, razdvaja C4 i C2

C4

210 kD, trimer izgraen

od 97- 75- i 33-kDlanaca

300-600

C4b se kovalentno vezuje za površinu mikroba ili elija,

za koje je vezano antitelo i komplement je aktiviranC4b vezuje C2, pri cepanju sa C1s

C4a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)

C2 102 kD monomer 20 C2b je serin proteaza, koja funkcioniše kao aktivanenzim C3 i C5 konvertaza, pri razdvajanju C3 i C5

C3 Videti predhodnu tabelu(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Vezivanje dve ili više globularne glave C1q za Fc region IgG ili IgM vodi enzimskoj aktivaciji

asociranog C1r koji se cepa i aktivra C1s (Slika 5.50.).

Aktivirani C1s cepa naredni protein u kaskadi, C4, i

generiše C4b i C4a (manji fragment koji se otpušta). C4b je

homolog C3b i vezuje u kompleks naredni protein, C2, koji

se cepa delovanjem C1s na C2b fragment koji ostaje

stabilno fiziki asociran u kompleksu sa C4b, kao i

solubilni fragment Ca koji se otpušta. Kompleks C4b2b je

C3 konvertaza klasinog puta i ima sposobnost da

proteolitiki razlaže C3.

Slika 5.51. Vezivanje C1 za Fc fragment IgM i IgG.C1 se mora vezati za za dva ili tri Fc fragmenta da bi postao atkivan i da bi se inicirala kaskadakomplemenata. Fc fragmenti pentamernog IgM nisu dostupni za C1 ( A). Posle vezivanja IgM zapovršinu za koju su vezani antigeni, dolazi do promene oblika što ini dostupnim Fc i omoguavavezivanje i aktivaciju C1. Solubilni IgG ne mogu aktivirati C1 zbog toga što imaju samo jedan Fcregion (C), ali posle vezivanja za površinske elijske antigene Fc fragment IgG može vezati iaktivirati C1 (D).

Vezivanje kompleksa C4b2b za C3 je posredovano C4b komponentom, a proteoliza C3 je

katlizovana C2b komponenetom. Cepanjem C3 se pomera i otpušta manji C3a fragment, a C3b

formira kovalentne veze ili sa površinom elije ili antitelom za koje gde je aktivacija komplementa

inicirana. Kad se C3b »smesti« može da vezuje faktor B (ukljuivanje i alternativnog puta) i da

generiše više molekula C3 konvertaze. Neto efekat multiplih enzimatskih faza i amplifikacije je da jedan jedini molekul C3 konvertaze generiše i »smešta« stotine ili hiljade novih molekula C3b na

površinu elije na kojoj je inicirana aktivacija komplementa. Kljuni korak i alternativnog i





207

p j j j j j p j g

klasnog puta je potpuno isti: C3 molekula alternativnog puta je homolog C4 molekuli u

klasinom putu, a faktor B alternativnog je homolog molekulu C2 klasinog puta aktivacije. Slino

kao i u alternativnom, neke C3b molekule generisane u klasinom putu aktivacije komplementa

mogu da se vežu za konvertazu i formiraju kompleks C4bC2b3b koji funkcioniše kao C5

konvertaza klasinog puta (cepa C5 i inicira kasnije faze aktivacije komplementa).

Lektinski put

Lektinski put aktivacije komplementa se inicira u odsustvu antitela, vezivanjem mikrobijalnih

polisaharida za cirkulišue lektine kao što je manoza-vezujui lektin (engl. Mannose Binding

L ectin – MBL ) koji je pominjan u poglavlju 5.2. MLB se vezuje za ostatke manoze na

polisaharidima, a pošto je po strukturi veoma slian C1q inicira kaskadu sistema komplementa

ili tako što aktivira C1r-C1s enzimski kompleks (kao C1q) ili tako što se asocira sa drugim

serin-poroteazama koje se zovu sa manoznime-vezujuim-proteinom-asocirane serin

esteraze koje cepaju C4. Sem što se aktivira u odsustvu antitela, ostali deo puta je potpuno isti.

Kasnije faze u aktivaciji komplementa

C5 konvertaza koja je generisana inicira aktivaciju komponenti koje se nalaze dalje/kasnije u nizu.

Tabela 5.19. Proteini kasnijih faza aktivacije komplementa

PROTEIN STRUKTURA KONCENTRACIJAU SERUMU (g/ml) FUNKCIJA

C5 190 kD, dimer izgraen 80 C5b inicira formiranje MAC; C5a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)

C6 110 kD; monomer 45 Komponenta MAC-a: vezuje se za C5b i prihvata C7

C7 110 kD dimer 90 Komponenta MAC-a: vezuje se za C5b,6 i ugrauje se u lipidne membrane

C8 115 kD trimer 60 Komponenta MAC-a: vezuje se za C5b,6,7 i inicira vezivanje i polimerizaciju C9

C9 79 kD, monomer 60 Kom. MAC-a: vezuje se za C5b,6,7,8 i polim erizuje, te s e formira pora u membrani


C5 konvertaza generisana alternativnim, klasinim i lektinskim putem, inicira proteine u daljem

nizu komponenti sistema komplementa, tako da aktivacija kasnijih faza kuliminira formiranjem tzv.

MAC molekula (engl. Membrane Attack Complex), odnosno citocidalnog kompleksa koji napada

membranu (Tabela 5.19. i Slika 5.52.). Konvertaza C5 cepa C5 u mali C5a fragment koji se otpušta

i C5b fragment (dvolanani) koji ostaje vezan za proteine komplementa smeštene na površinielije. Ostale komponente proteinske kaskade, C6, C7, C8 i C9 su strukturno povezani proteini i

nemaju enzimsku aktivnost. C5 prolazno održava komformaciju koja je sposobna da poveže





208

naredne proteine kaskade, C6 i C7. Tako nastaje C5b, 6, 7 kompleks, a njegova hidrofobna

komponenta, C7, se »ubacuje/umee« u lipidni dvosloj elijske membrane, gde postaje

receptor visokog afiniteta za jedan C8 molekul. C8 protein je trimerni molekul gradjen od tri

lanca, od kojih se jedan vezuje za C5b, 6, 7 kompleks; dok se drugi insertuje u lipidni dvosloj

elijske membrane. Ovako stabilno umetnut C5b, 6, 7, 8 kompleks (C5b-8) ima limitiranu

sposobnost lize elija. Formiranje potpunog aktivnog MAC je omogueno vezivanjem C9,

finalne komponenete kaskade komplementa, za C5b-8 kompleks. C9 komponenta

komplementa je serumski protein homolog perforinima pronadjenim u citolitinim T limfocitima

i NK elijama (videti poglavlje 5.3.), a polimerizuje se na mestu gde je vezan C5b-8 kompleks,

formirajui pore u plazma membrani.

Slika 5.52. Kasnije faze – “koraci” aktivacije komplemenata i formiranje MAC.C5 konvertaza cepa C5 i nastaje C5b, koji se vezuje za konvertazu. C6 i C7 se vezujusekvencijalno, pa se C5b,6,7 kompleks direktno ubacuje u lipidni dvosloj plazmamembrane, što je praeno insercijom C8. Više od 15 molekula C9 može se potompolimerizovati oko kmpleksa i formirati MAC, koji gradi poru u membrani i indukuje lizuelije. C5a osloboen proteolizom C5 stimuliše inflamaciju.

Pore koje se formiraju na membrani elije na kojoj je došlo do aktivacije komplementa su veliine

oko 100 u dijametru (Slika 5.53.) i dozvojavaju slobodan prolazak vode i jona. Ulazak vode

dovodi do osmotskog bubrenja elije i rupture elije na kojoj je MAC smešten. Nukleirane elije su

otporne na rupturu, ali MAC formiran na njihovoj membrani može da uzrokuje apoptozu,

verovatno zbog toga što se poveava koncentracijucitoplazmatinog kalcijuma jer on ulazi kroz MAC

iz spoljašnje sredine gde ga ima mnogo više nego u





209

eliji.

Slika 5.53. Struktura MAC u elijskoj membrani. A - Prikaz elektronskom mikrografijom. Lezije se sastoje od rupa dijametra oko 100 koje formiraju poli-C9 tubularni kompleks.B - Zbog poreenja su prikazane membranske lezije indukovane na ciljnim elijama

preko CTL i polimerizovanog perforina. Lezije (B) su morfološki sline (A), sa neštoveim dijametrom ( oko 160A).C - Model organizacije subjedinica MAC. Transmembranski region se sastoji od 12 do15 molekula C9 organizovanih u tubularnu strukturu, sa dodatkom pojedinanih

molekula C6, C7 i C8 i lanaca. C5b, C5b, C8 formiraju dodatak koji seprojektuje iznad transmembranske pore.

5.4.4.2. Receptori za proteine komplementa Mnoge funkcije sistema komplementa se ostvaruju vezivanjem fragmenata komplementa za

specifine memebranske receptore ekspresovane na razliitim tipovima elija (Tabela 5.20.).

Tabela 5.20. Receptori za fragmente C3

RECEPTOR LIGAND ELIJSKA DISTRIBUCIJA FUNKCIJA

Tip 1 CR (CR1, CD35) C3b > C4b > iC3b

Mononuklearni fagociti,

nutrofili, B i T elije,

eritrociti, eozinifili, FDCs

Fagocitoza; išenje imunih kompleksa;

promocija disocijacije C3 konvertaze delujui kao

kofaktor za cepanje C3b,C4b

Tip 2 CR (CR2, CD21) C3d, C3dg > iC3bB limfociti, FDCs,

nasofaringealni epitelijumKoreceptor za aktivaciju B elija;»Pratilac« antigena u germinativnim centrima

Tip 3 CR (CR3, Mac-1, CD11b/CD18) iC3b, ICAM-1 Mononukearni fagoci ti ,neutrofili, NK elije

Fagocitoza; Adhezija leukocita za endotelijum preko ICAM-1

Tip 4 CR (CR4, p150/95, CD11c/CD18) iC3b Mononukearni fagociti,neutrofili, NK elije

Fagocitoza ???elijska adhezija ???

CR (engl. Complement Receptor) – receptor komplementa; CCPR (engl. Complement Control Protein Repeat) – protein koji kontroliše ponavljanje proteina komplementa;

FDCs (engl. Follicular Dendritic Cells) – folikularne dendritske elije; ICAM-1 (engl. IntraCellular Adhesion Molecule-1) – intraelijski adhezioni molekul(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

5.4.4.3. Regulacija aktivacije komplementa

Aktivacija kaskade komplementa i stabilizacija aktivnih proteina komplementa je veoma precizno I

regulisana da bi se prevenirala aktivacija komplementa na normalnim elijama organizma domaina,

kao i da bi se limitiralo trajanje aktvacije komplementa na elijama mikroba i antigen-antitelo

kompleksima. Regulacija aktivacije komplementa je posredovana preko nekolikko cirkulišuihproteina, kao i pojedinim proteinima vezanim za elijsku membranu (Tabela 5.21.).





210

Tabela 5.21. Regulatori aktivacije komplementa

RECEPTOR DISTRIBUCIJA INTERAGUJU SA FUNKCIJA

C1 inhibitor (C1 INH)Protein plazme

(konc 200 g/ml) C1r, C1sInhibitor serin-proteaza; vezuje se za C1r i C1s idisocira ih od C1q

Faktor IProtein plazme(konc 35 g/ml) C4b, C3b

Serun-proteaza; razlaže C3b i C4b koristei kaokofaktore: faktor H, MCP, C4BP ili CR1

Faktor HProtein plazme

(konc 480 g/ml) C3bVezuje C3b i izmešta Bb;Kofaktor je za faktorom I–posredovano cepanje C3b

C4-vezujui protein (C4BP)Protein plazme

(konc 300 g/ml) C4bVezuje C4b i izmešta C2b;Kofaktor je za faktorom I–posredovano cepanje C4b

Membranski kofaktorni protein(MCP, CD46)

Leukociti; epitelijalne elije;endotelijalne elije C3b, C4b

Kofaktor je za faktorom I–posredovanocepanje C3b i C4b

Faktor koji ubrzava raspadanje(engl. Decay-Accelerating Factor – DAF)

elije krvne loze; epitelijalneelije; endotelijalne elije

C4b2bC3bBb

Izmešta C2b od C4b, kao i Bb od C3b(ubrzava disocijaciju C3 konvertaza)

CD59elije krvne loze; epitelijalneelije; endotelijalne elije C7, C8 Blokira vezivanje C9 i prevenira formiranje MAC

CR (engl. Complement Receptor) – receptor komplementa; MAC (engl. Membrane Attack Complex) – kompleks koji napada/atakuje membranu;(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Mnogi od ovih proteina, kao i neki proteini klasinog i alternativnog puta aktivacije komplementa

pripadaju familiji koja se zove regulatori aktivnosti komplementa (engl. Regulators of ComplementActivity - RCA) i kodirani su homologim i vezanim genima. Aktivacija komplementa mora biti

regulisana iz dva razloga. Prvi: mali nivo aktivacije komplementa ide spontano, te ako se dozvoli

da ova aktivacija ide dalje do normalnih elija, rezultat e biti ošteenje normalnih elija i tkiva.

Drugo: ak i kada je komplement aktiviran onda kada je neophodan, aktivacija mora biti

kontrolisana zbog toga što degradacioni produkti proteina komplementa mogu da difunduju u

susedne elije i da ih ošteuju. Razliiti regulatorni mehanizmi inhibišu razliite faze u aktivaciji

sistema komplementa (npr. formiranje C3 konvertaze u ranim fazama aktivacije komplementa;cepanje i aktivaciju C3 i C5 konvertaza; formiranje MAC u kasnijim fazama aktivacije itd).

5.4.4.4. Funkcije komplementa

Glavne efektorne funkcije proteina sistema komplementa u urodjenom, kao i u specifinom

humoralnom imunitetu su da promovišu fagocitozu mikroba na kojima je komplement aktiviran, da

stimulišu inflamaciju, te da idukuju lizu ovih mikroba na kojima je komplement aktiviran. Pored

toga, produkti aktivacije komplementa obezbedju drugi signal za aktivaciju B limfocita iprodukciju antitela. Fago-

citoza, inflamacija, kao i





211

stimulacija mehanizama

humoralnog imunog odgo-

vora su posredovane

vezivanjem proteolitikih

fragmenata proteinskih ko-mponenti sistema komple-

menta za razliite tipove

elija, dok je liza elija po-

redovana formiranjem MAC

(Slika 5.54).

Slika 5.54. Funkcije sistema komplemenata.

elijski vezan C3b promiše fagocitozuokolnih elija (A); proteolitiki produktiC5a, C3a i C4a stimulišu regrutacijuleukocita i inflamaciju (B); MAC vrši lizu

elija (C).

Opsonizacija i fagocitoza. Mikrobi na kojima je komplement aktiviran alternativnim ili klasinim

putem postaju obloženi sa C3b ili C4b. Vezivanje ovih proteinskih fragmenata za receptore na

membrani fagocita aktivira fagocite i inicira fagocitozu mikroba na kome je aktiviran komplement.

Stimulacija inflamatornog odgovora. Fragmenti komplementa, C5a, C4a i C3a, sa proteoli-tikom aktivnosti indukuju akutnu inflamaciju preko aktivacije neutrofila i mastocita (Slika 5.54).

Komplementom-posredovana citoliza. Komplementom-posredovana liza stranog organizma se

ostvaruje formiranjem MAC (Slika 5.54C.). izgleda da je ovaj mehanizam veoma važan za odbranu

protiv nekoliko tipova mikroba zbog toga što su genetiki defekti MAC komponenti rezultirali

poveanjem osetljivosti jedino na infektivne bakterije roda Neisseria .

Druge funkcije sistema komplementa. Vezivanjem za komplekse antigen-antitelo, proteini

sistema komplementa promovišu solubilizaciju ovih kompleksa i njihovo uklanjanje fagocitima.





212

C3d protein koji se formira vezivanjem C3 za CR2 receptor na B elijama, aktivira B elije i

obezbedjuje signal za iniciranje mehanizama humoralnih imunih odgovora.

Sumarno, biološke funkcije sistema komplementa ukljuuju opsonizaciju organizama i imunih

kompleksa C3 fragmentima, praenu vezivanjem receptora na fagocitima za fragmente

komplementa i fagocitno “išenje/uklanjanje” ; aktivaciju infalmatornih elija proteolikim

fragmentima komplementa koji se nazivaju anafilatoksini (C3a, C4a, C5a); citolizu posredovano

formiranjem MAC na površini elije; solubilizaciju i “išenje/uklanjanje” imunih komleksa i

pojaavanje humoralnih imunih odgovora.

5.4.5. Funkcija antitela na specijalnim anatomskim mestima u organizmu

Do sada su opisivane efektorne funkcije antitela koje su sistemske i ne pokazuju ni jednu jedinu

specifinu osobinu vezanu za lokaciju. Antitela mogu da obavljaju specifine funkcije u odbrani

organizma, a kao rezultat aktivnog transporta u dva anatomska kompartmenta: lumen mukoznih

organa i u placentu u kojoj se razvija fetus. Osnovni i dominantni mehanizam zaštitnog imuniteta

protiv mikroba na ovim mestima je antitelima-posredovana neutralizacija, zbog toga što

leukociti i druge efektorne elije ne mogu da prodju kroz mukozni epitel ili placentu.

5.4.5.1. Mukozni imunitet

IgA je glavna klasa antitela koja se produkuje u mukoznom imunom sistemu. Poznato je da su

gastrointestinalni i respiratorni sistemi dva naješa portala za ulazak mikroorganizama. Odbrana

od mikroba koji dospevaju u organizam ovim putevima ostvaruje se antitelima, i to uglavnom IgA,

koji se produkuje u mukoznom limfoidnom tkivu i sekretuje kroz mukozni epitelijum u lumen

organa. U mukoznim sekretima se IgA vezuje za mikrobe i njihove toksine prisutne u lumenu

organa i neutrališe ih blokirajui njihov ulazak u elije organizma domaina (Slika 5.55.).

Mukozni imuni sistem je zapravo predstavljen kolekcijom limfocita i akcesornih elija veoma

esto organizovanih u diskretne anatomske strukture koje podseaju na limfoidne folikule, a koje

su lokalizovane u subepitelijalnom prostoru gastrointestinalnog i respiratornog trakta (videti

poglavlje 2.2. elije i tkiva imunog sistema ). IgA se produkuje u enormno velikim koliinama uodnosu na ostale izotipove antitela, najviše zbog veliine površine lumena intestinalnog trakta.

Prema tome, odbrana uperena protiv mikroba i toksina u lumenima mukoznih organa je





213

obezbedjena IgA antitelima produkovanim u mukoznom limfoidnom tkivu i aktivno

transportovanim kroz epitelijalne elije u lumen mukoznih organa. Sekretovani IgA se

transportuje kroz epitelijalne elije u intestinalni lumen zahvaljujui specifinom Fc receptoru za

IgA koji se naziva poly-Ig

receptor.

Slika 5.55. Transport IgA kroz epitelijalneelije.IgA produkovan od strane plazma elija ulamini proprii mukozalnog tkiva se vezuje zapoli-Ig receptor baze epitelijalnih elija.Kompleks se aktivno transportuje kroz elijeepitela, a vezani IgA se oslobaa u lumen

proteolitikim cepanjem. Proces aktivnogtransporta kroz eliju naziva se transcitoza.

5.4.5.2. Neonatalni imunitet

Neonatalni sisari su zaštieni od infekcije antitelima koje produkuje majka, a koja se transportuju

kroz placentu u fetalnu cirkulaciji, kao i antitelima iz majinog mleka koja se transportuju kroz

epitelijum intestinuma novorodjeneta. Neonatalni organizmi nemaju sposobnost da održavaju

efikasne immune odgovore protiv mikroba, te im je nekoliko meseci nakon rodjenja glavna

odbrana protiv infekcija pasivni imunitet obezbedjen antitelima majke. IgG majke se transportuje

kroz placentu, a IgA i IgG iz majinog mleka novordjene dobija dojenjem. Ova antitela se

transportuju kroz placentu, kao i epitel digestivnog trakta preko sepcijalizovanih tzv. neonatalnih

Fc receptora (FcRn).





214

DODATAK D





215

DPripremile: Marija Janji i Nataša Stojkov

D.1. LABORATORIJSKE TEHNIKE KOJE SE KORISTE U IMUNOLOGIJI

Veliki broj laboratorijskih tehnika koje se rutinski koriste u naunom i klinikom radu zasniva se

na imunološkim metodama i to naješe primeni korišenja antitela i/ili njihovih osobina u

pojedinim metodama. Takodje, veliki broj tehnika molekularne biologije doprinele su sakupljanju

neprocenjivo važnih informacija u modernoj imunologiji. U ovom poglavlju dat je kratak pregled

principa na kojima se zasnivaju neke od metoda koje se esto koriste u imunologiji. Detalje o tome

kako se izvodi pojedina metoda ili esej mogu se nai u laboratorijskim prirunicima koji sunavedeni u spisku dodatne literature na kraju skripte (a nalaze se u prostorijama Laboratorije za

Reproduktivnu endokrinologiju i signaling, III sprat, sobe 15, 17, 18).

D.1.1. Laboratorijske metode koje koriste antitela

Antitela (Ab) su veoma pogodne supstance za detekciju, purifikaciju i kvantifikaciju antigena (Ag),

zahvaljujui svojoj visokoj specifinosti za odgovarajue antigene supstance. Primena antitela se

zasniva na njihovoj sposobnosti da se vežu za specifian antigen i formiraju imuni kompleks, koji

je mogue detektovati razliitim optikim metodama. S obzirom da je sa velikom lakoom mogue

dobiti antitela za razliite molekule, metode koje koriste antitela su našle široku primenu u

njihovom prouavanju.

D.1.1.1. Kvantifikacija antigena imunoesejima

Moderne imunohemijske metode se zasnivaju na formiranju kompleksa Ag-Ab, pri emu se mogu

odrediti koncentracije kako Ag i Ab, tako i kompleksa Ag-Ab. Naješe se primenjuju metode koje

se zasnivaju na kompeticiji izmeu neobeleženih molekula Ag i na neki nain obeleženih molekula

Ag za ista vezna mesta na Ab. Ukoliko je Ag obeležen radioizotopom, re je o radioimunoeseju

(RIA), pri emu se kvantifikacija vrši pomou instrumenata koji detektuju radioaktivnost.

Antigen, takoe, može biti

obeležen enzimom i tada jere o ELISA metodi

(enzyme-linked immun-

b t ) i





216

osorbent assay), pri emu

se kvantifikacija vrši spe-

ktrofotometrijski (enzim

konvertuje odgovarajui

supstrat u obojeni pro-dukt). Postoji nekoliko

varijanti RIA i ELISA me-

toda, ali se naješe

primenjuje tzv. sendvi

esej (Slika D.1.).

Slika D.1. Sendvi esej

D.1.1.2. Purifikacija i identifikacija proteina

Antitela se esto upotrebljavaju za purifikaciju proteina iz rastvora, kao i za njihovu

identifikaciju. Dve naješe koriš

ene metode za purifikaciju su: imunoprecipitacija i afinitetna

hromatografija; dok je Western blotting tehnika koja se naješe koristi za utvrivanje prisustva i

veliine proteina u biološkim uzorcima.

Imunoprecipitacija i afinitetna hromatografija (Slika D.2., A i B) predstavljaju metode koje se

koriste za izolaciju odgovarajueg Ag (proteina) iz smeše, pomou Ab specifinih za dati Ag

(protein).





217

Slika D.2. Izolacija antigena imunoprecipitacijom (A) i afinitetnom hromatografijom (B).A - IMUNOPRECIPITACIJA Odreeni antigen se može izdvojiti iz mešavine razli itih antigena , koji se nalaze u serumu ili nekom drugom rastvoru. Antigen se

može purifikovati (izdvojiti) dodavanjem u rastvor antitela specifinih za taj antigen, koja su vezana za nerastvorna zrnca (beads). Antigeni koji se nisu vezali seisperu, a željeni Ag odvaja se od antitela promenom pH ili neke druge osobine eluenta koje time smanjuju afinitet Ag za vezivanje. Imunoprecipitacija može

omoguiti purifikaciju, kvantifikaciju ili identifikaciju odreenih Ag. Antigeni purifikovani imunoprecipitacijom se naješe analiziraju SDS-PAGE elektroforezom.

B - AFINITETNA HROMATOGRAFIJA Bazira se na istim principima kao i imunoprecipitacija, s tom razlikom što su antitela fik sirana za nerastvorni matriksili gel, obino na koloni. Ova metoda se naješe koristi za izolaciju rastvorljivih antigena ili za izolaciju antitela specifi nih za antigene koji su imobilisani.

Western blotting (Slika D.3.) je metoda koja se koristi za utvrivanje relativne koliine imolekulske težine pojedinanih proteina iz njihove smeše.





218

Slika D. 3. Karakterizacija antigena Western blotting-om.Proteini antigena se razdvoje SDS-PAGE elektroforezom i prenesu na membranu, kao postojaniji nosa . Membrana sa proteinima se

inkubira sa radioaktivno obeleženim antitelima ili enzimom obeleženim antitelima. Ukoliko se koriste radioaktivno obeležena antitelaproteini na membrani vizuelizuju se autoradiografijom; dok se u sluaju enzimom obeleženih antitela vizuelizacija vrši izlaganjem

fotografskom filmu, zahvaljujui osobini enzima da formira hemiluminiscentni signal koji ostavlja trag na filmu.

D.1.1.3. Markiranje i detekcija antigena u elijama i tkivima

Za identifikaciju i separaciju pojedinih elijskih tipova iz tkivne ili elijske suspenzije veoma esto

se koriste Ab specifina za Ag koji se ekspresuju na/u tim elijama. Za metode bazirane na ovom

principu mogu se upotrebiti Ab koja su radioaktivno obeležena, vezana za enzim ili fluorescentno

obeležena.Imunofluorescencija je metoda kojom se utvruje prisustvo, lokalizacija i koliina

specifinog antigena u nekom tkivu ili eliji na osnovi fluorescencije do koje dolazi kada željeni

antigen stupi u reakciju sa specifinim antitelom obeleženim fluorescentnom bojom Vizualizacija





219

antigen stupi u reakciju sa specifinim antitelom obeleženim fluorescentnom bojom. Vizualizacija

se vrši fluorescentnim mikroskopom koji pomou svetlosti ekscitira fluorescentnu boju, koja za

uzvrat emituje svetlost, ali neke druge talasne dužine. Ovom metodom se mogu ispitivati sve

elijske komponente za koje postoje antitela. Ispituju se enzimi, strukturni proteini, prisustvo

virusa. Imunohistohemija kombinuje anatomske, imunološke i biohemijske tehnike za

identifikaciju specifinih tkivnih komponenti na osnovu reakcije antigen/antitelo pri emu je

antitelo obeleženo vidljivim markerom. Najpopularnij imunohistohemijske metode su one kod

kojih je enzim vezan za Ab ili gde je Ab fluorescentno obeleženo. Protein ije se prisustvo želi

ispitati predstavlja antigen, za koji postoji odreeno antitelo koje se može obeležiti enzimom. Posle

reakcije Ag-Ab dolazi do aktivacije enzima koji reaguje sa supstratom i nastaje intenzivno obojen

proizvod reakcije koji se može analizirati obinim svetlosnim mikroskopom.

Protona citometrija (Flow cytometry) je metod za kvantifikaciju razliitih komponenti i

strukturnih karakteristika elija. Koristi se za odreivanje fizikih i hemijskih karakteristika

(veliina, oblik, granulacija elija), metabolikih i fizioloških karakteristika (aktivnost enzima,

sinteza DNA). U te svrhe se koristi protoni citometar, iji su osnovni elementi: izvor svetlosti -

laser, sabirna optika, elektronika i kompjuter koji prevodi signale u podatke. elije koje se

analiziraju mogu biti žive ili fiksirane, ali je bitno da budu u monodisperziji, zato što se

analiziraju jedna po jedna. elije u suspenziji kontinuirano protiu (flow) kroz laserski zrak i

svaka od njih odbija odreenu koliinu laserskog zraka, a takoe i emituje fluorescentnu svetlostnastalu ekscitacijom pomou lasera (ako je fluorescentno obeležena). Citometar simultano meri

nekoliko parametara: intenzitet svetlosti razliitih uglova odbijanja i intenzitet fluorescencije

razliitih talasnuih dužina. Odbijanje pod malim uglom (0.5° -5°) govori o veliini elije, a veliki

ugao odbijanja 15° -150° o granulaciji. Odbijeni i emitovani zraci dolaze do elektronskog detektora

koji je povezan sa kompjuterom.





220

Slika D.4. Princip protone citometrije.

D.1.1.4. Odredjivanje/merenje interakcije antigen-antitelo

U veini situacija, veoma je važno poznavanje afiniteta antitela za odgovarajui antigen, i za male

antigene, kao što su hapteni, može se meriti direktno, tzv. ekvilibrijum dijaliza metodom (Slika

D.5.).





221

Slika D.5. Analiza Ag-Ab vezivanja ekvilibrijum dijaliza metodom. U prisustvu antitela (B) koliina antigena unutar dijaliza membrane je vea, u odnosu na odsustvo antitela (A). Razlika je posledicavezivanja antitela za antigen (samo slobodan antigen može da difunduje kroz membranu), što se koristi za merenje afiniteta antitela zaantigen. Ova metoda se može primenjivati samo u sluajevima kada su antigeni male molekule, sposobne da prolaze kroz dijalizamembranu koja je semipermeabilna (Semipermeabilna u ovom kontekstu podrazumeva da kroz svoje pore propušta male molekule,

kao što su antigeni, dok antitela, kao vee molekule, ne prolaze)

D.1.2. Analiza genske strukture i ekspresije

U narednom tekstu se daje kratak opis metoda molekularne genetike koje se naješe koriste u

imunologiji.

D.1.2.1. »Southern Blot« hibridizacija

Pod pojmom Southern blotting podrazumeva se prenos DNK fragmenta sa gela na postojani nosa

i predstavlja jedan deo eksperimentalnog procesa DNK-DNK hibridizacije u in vitro uslovima.

Southern blot se koristi za detekciju fragmenta DNK u uzorku. DNK fragment koji se detektuje

može biti jedan jedini gen ili može biti deo veeg molekula DNK, kao što je na primer virusni

genom. Osnova metode je hibridizacija koja predstavlja proces formiranja dvolananog DNK

molekula od jednolanane probe i jednolanane ciljne DNK. Reakcija hibridizacije je strogo

specifina, što znai da e se proba vezati samo za onu ciljnu sekvencu molekula DNK koja ima

komplementaran raspored baza. Proba može da nae odgovarajuu sekvencu DNK izmeu milion

drugih slinih, ali nekomplementarnih molekula. Koraci u hibridizaciji su sledei:

Razdvajanje smeše molekula DNK Imobilizacija molekula na matriksu

Dodavanje probe u cilju vezivanja za odgovarajuu sekvencu DNK

Uklanjanje nevezane probe ispiranjem





222

Uklanjanje nevezane probe ispiranjem

Mesto vezivanja probe odgovara mestu na kome se nalazi sekvenca

Nakon toga sledi DNK preišavanje i fragmentacija DNK pomou enzima restrikcionih

endonukleaza (seku molekul DNK na tano odreenom, specifinom mestu) i elektroforetsko

razdvajanje fragmenata prema veliini na agaroznom gelu. DNK se, zatim, denaturiše inkubacijom

agaroznog gela u puferu za denaturaciju. Kako je poznato da je agaroza nepogodna za

manipulaciju, neophodno je preneti DNK fragmente sa gela na nosa pogodniji za manipulaciju

(celulozna ili najlon

membrana), elektrofore-

zom ili kapilarnom

difuzijom. Mambrana se

izlaže visokoj temperaturi

ili UV zracima da bi se

DNK fiksirala. Nakon

hibridizacije sa radioakti-

vno obeleženom probom,

membrana se ispere i

detekcija se vrši autora-

diografijom.

Slika D.5. »Southern Blot« hibridizacija.

D.1.2.2. »Northern Blot« hibridizacija

Northern blot je tehnika prenosa RNK sa gela. RNK se koristi kao matrica, pri emu nastaju RNK-

RNK ili RNK-DNK hibridni molekuli. Princip metode je isti kao kod Southern blotting-a.

D.1.2.3. Lan ana reakcija polimeraze

Lanana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction, PCR) je tehnika kojom se mala koliina

specifine sekvence DNK umnožava (amplifikuje),





223

p ( p j ),

kako bi se mogla koristiti za dalja istraživanja i

testiranja (Slika D.6.). U suštini, PCR predstavlja

reakciju replikacije DNK in vitro . Stoga je za PCR

neophodno prisustvo:

DNK matrice koja sadrži informaciju

koja se želi umnožiti,

Jednolananih prajmera koje

predstavljaju sekvence komplementa-

rne krajevima DNK matrice,

Smeše slobodnih deoksinukleotida

koji e se ugraivati u novosinte-

tisane DNK lance,

Enzima DNK polimeraze,

Mg2+ jona neophodnih za aktivnost

DNK polimeraze.

PCR se izvodi ponavljanjem veeg broja ciklusa

(20-30).

Slika D.6. Lanana reakcija polimeraze (PCR)

D.1.3. Transgeni miševi i »knock-out« ciljnih gena

Dve veoma važne metode za ispitivanje funkcionalnih efekata specifinih genskih produkata in

vivo su: stvaranje transgenih miševa koji overekspresuju pojedine gene u odreenom tkivu i

stvaranje »gene knockout« miševa u ijim genomima se prekidi ili mutacije pojedinanih gena

koriste za ustanovljavanje obligatorne funkcije tih gena in vivo . Obe metode imaju široku primenu

u izuavanju velikog broja bioloških fenomena, meu kojima su i maturacija, aktivacija i

tolerancija limfocita.





224

»Gene knockout« tehnika bazirana je na fenomenu homologih rekombinacija. Ubacivanjem

stranog gena u eliju može doi do njegove sluajne inkorporacije u elijski genom. Ukoliko strani

gen sadrži sekvence koje su homologe genima domaina prvenstveno e se rekombinovati i

zamenjivati sa datim sekvencama. Fragment homologe DNK koji treba da se ubaci u eliju (Slika

D.7A.), prethodno se smešta u vektor koji sadrži gen za rezistenciju na neomicin (neo ) i gen zatiamidin kinazu (tk ). Ovaj vektor je tako konstruisan da se pri homologim rekombinacijama neo

gen uvek inkorporira u hromozomalnu DNK, dok se tk gen gubi.

Slika D.7A. Formiranje »gene knockout« ciljnih genaES-Embrionalne stem elije; neo-gen rezistencije na neomicin; tk -gen za tiamidin kinazu.

Nakon ubacivanja vektora u embrionalne stem elije (ES ) one rastu u prisustvu neomicina i

ganciklovira (supstance koja se dejstvom tiamidin kinaze transformiše u letalni produkt). elije u

kojima je došlo do sluajne integracije

vektora u genom rezistentne su na

neomicin, ali ih ubija prisustvoganciklovira; dok su elije u kojima je

došlo do homologih rekombinacija

rezistentne na obe supstance, jer se u





225

p j

njima tk gen ne inkorporira u genom.

Ovakva pozitivno-negativna selekcija

omoguava odabir samo preživelih

elija koje nose homologe

rekombinacije, što se dodatno može

proveriti i PCR i Southern blot

metodama. Embrionalne stem elije

dalje se mogu ubaciti u blastociste

(Slika D-7B) i implantirati u uteruse

ženki miševa, koje se nalaze u stanju

»lažne trudnoe«. Nakon razvoja

embriona miševi ovako dobijene

generacije bie himerni za hete-

rozigotne prekide ili mutacije, pri

emu e neka tkiva biti poreklom od

ES elija, a druga od preostalih

normalnih elija blastociste. Germina-

tivne elije ovih miševa, takoe, su

naješe himerne, ali kako pripadajuhaploidnioj garnituri samo neke od

njih nosie izmenjene (mutirane ili

prekinute gene).

Slika D.7B. Formiranje »gene knockout« ciljnih genaES-Embrionalne stem elije; neo-gen rezistencije na neomicin; tk -

gen za tiamidin





226

LITERATURNI IZVORI

L





227

LAbbas AK & Lichtman AH (2002): Basic Immunology . WB Saunders Company.

Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology . WB Saunders Company

Abbas AK & Lichtman AH (2006-2007): Osnovna imunologija: funkcionisanje i poreme aji imunskog sistema. Drugo obnovljeno izdanje . Data Status, Beograd.

ConnMP & Means AR (2000): Principles of Molecular Regulation . Humana Press.

Edgar JDM (2006): Master Medicine: Immunology . Elsevier Churchill Livingstone.

Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ (2005): Immunobiology 6ed: The Immune

System in Health and Disease with CD-ROM . Churchill Livingstone.

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky LS & Darnell J (2004):Molecular Cell Biology . WH Freeman and Company.

Mahon RC & Tice D (2006): Clinical Laboratory Immunology . Pearson Prentice Hall.

Niehoff D (2005): Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease. JosephHenry Press.

Paul EW (2003): Fundamental Immunology. Lipincott Williams & Wilkins

Rott IM & Delves PJ (2001): Essential Immunology. Blackwell Publishing.

Sompayrac L (2003): How the Immune System Works . Blackwell Publishing.

Sperelakis N (1998): Cell Physiology . Academic Press.

Wood P (2006): Understanding Immunology 2ed . Pearson Prentice Hall.





228

Autori:Tatjana Kosti i Silvana Andri

Izdaje:WUS AustriaUniverzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematiki fakultet

Naslovnu stranu osmislili:NINI i TEJ

Grafiko oblikovanje:Predrag Nikoli

Štampa:Daniel Print

CIP -

,

612.017(075.8)





Molekularna i elijska imunologijaTatjana Kosti i Silvana Andri – Novi Sad :WUS Austria, Daniel Print, Prirodno-matematiki fakultetNovi Sad, 2007- 229 str. : ilustr. ; 21 cm

Tiraž: 100.

ISBN 978-86-7031-081-01. Kosti, Tatjanaa) Imunologija – elijska

COBISS.SR-ID 220121607

Documents

0. Molekularna i Celijska Imunologija