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Inmunidad y profilaxis antiviral Inmunidad del hospedero a las infecciones virales Inmunidad innata Inmunidad adquirida Inmunidad pasiva Mecanismos virales de evasin y escape Vacunas y vacunacin contra las enfermedades virales Vacunas de virus atenuado Vacunas de virus que no se replican (inactivados) Vacunas producidas por ADN recombinante y tecnologas relacionadas Mtodos para aumentar la inmunogenicidad de las vacunas virales Factores que afectan la eficacia y seguridad de la vacunas Polticas y esquemas de vacunacin Vacunacin de aves y peces Otras estrategias de profilaxis y tratamiento antiviral Inmunizacin pasiva Quimioterapia de las enfermedades virales Virus como vectores en la terapia gnica

Al ser parsitos intracelulares obligados, los virus han tenido que co-evolucionar con sus respectivos hospederos, y las clulas eucariticas de los organismos hospederos han desarrollado diversas y sofisticadas defensas para protegerse contra las infecciones virales y sus enfermedades asociadas. A su vez, los virus han desarrollado una gran variedad de estrategias para evitar o subvertir estas defensas del hospedero. La inmunidad antiviral en los animales superiores es compleja y se refleja una combinacin de mecanismos de respuesta inmune innata y adquirida (adaptativa), aunque hay una considerable interaccin entre estas dos grandes categoras. Las citocinas, clulas dendrticas, anticuerpos naturales y ciertos linfocitos T (clulas T ) proporcionan un puente de unin importante entre las respuestas inmunes innata y adquirida. La inmunidad antiviral de los animales est mediada por factores humorales y celulares, y la naturaleza de la respuesta inmune generada por diferentes individuos infectados con el mismo virus pueden ser diversas, dependiendo de la constitucin gentica individual, influencias ambientales y otros factores que pueden determinar el curso y patogenia de la infeccin.

Las defensas inmunes innatas (tambin referidas como inmunidad natural o nativa) estn presentes constantemente para proteger a los organismos multicelulares contra las infecciones virales, y no es requerida una exposicin previa a un virus particular para activar estos mecanismos. En contraste, la inmunidad adquirida se desarrolla solamente despus de la exposicin a un virus, y es especfica a ese virus en particular y, algunas veces, a sus parientes ms cercanos. La inmunidad adquirida incluye mecanismos efectores celulares y anticuerpos (humoral), mediados respectivamente por linfocitos T y B. En contraste a la inmunidad innata, las respuestas inmunes adquiridas poseen memoria, de manera que la respuesta puede ser rpidamente reactivada despus de la re-exposicin al mismo virus. En muchas infecciones virales sistmicas, la memoria inmunolgica despus de una infeccin natural confiere proteccin contra el virus de largo trmino y a veces para toda la vida.

El desarrollo de vacunas eficaces sustancialmente ha reducido el impacto nocivo de las enfermedades virales en humanos y animales. El xito de la vacunacin es estimular las respuestas de inmunidad adquirida para proteger a los animales a una posterior reinfeccin con virus especficos. Una creciente variedad de tipos de vacunas estn ahora disponibles comercialmente para su uso en animales, especialmente para los animales de produccin y compaa, incluyendo ganadera, avicultura y peces; estas incluyen vacunas inactivadas (sinom. Muertas), atenuadas (sinom. Modificadas) y varios tipos de recombinantes y de ingeniera gentica. Las vacunas son usadas extensivamente en programas reguladores para el control de ciertas enfermedades virales del ganado, a menudo en combinacin con procedimientos especficos de manejo. Otras estrategias para el tratamiento antiviral y profilaxis involucran a drogas (medicamentos) que interfieren con la infeccin viral o la replicacin, as como molculas que estimulan o imitan las respuestas protectoras del hospedero.

Inmunidad del Hospedero a las Infecciones Virales Inmunidad InnataLas defensas inmunes innatas no exhiben especificidad antignica, ni memoria, pero proporcionan una primera lnea crtica de defensa contra las infecciones virales debido a que estn constantemente presentes y operan inmediatamente despus de la infeccin viral. La inmunidad innata es a menudo se parada de las respuestas de la inmunidad adquirida, pero ellas estn fuertemente relacionadas, pues las respuestas innatas modulan subsecuentemente a las respue3stas adquiridas en muchas maneras. Diferentes actividades conforman a la defensa inmune innata, incluyendo: (1) barreras epiteliales; (2) protenas sricas antimicrobianas, como el complemento (C); (3) anticuerpos naturales producidos por linfocitos B1; actividades de clulas fagocticas como los neutrfilos, macrfagos y clulas dendrticas; (5) clulas asesinas naturales (Natural Killer cells) que pueden lisar a las clulas infectadas por virus; (6) diversos tipos de clula presentes en los sitios de invasin viral que poseen receptores que genricamente reconocen y rpidamente responden a la invasin viral por activacin de transcriptores que estimulan la produccin de una amplia variedad de molculas protectoras, por ejemplo, el sistema del interfern (IFN) que es un componente especialmente crtico y central de la resistencia antiviral; (7) apoptosis, un proceso de muerte celular programada que puede eliminar clulas infectadas; (8) molculas de ARN pequeas que interfieren con la replicacin viral (ARNi).Los virus que son transmitidos horizontalmente entre individuos primero deben romper las barreras en su puerta de entrada antes de que causen infeccin y su respectivo hospedador. Por ejemplo, la cubierta epitelial de la piel y aparatos respiratorio, gastrointestinal y urogenital proporciona una barrera mecnica contra la infeccin en estos sitios comunes de entrada de virus. Las secreciones y otras actividades de las superficies mucosas son una muy adecuada proteccin contra las infecciones virales. Por ejemplo, los surfactantes y el aparato mucociliar dan una proteccin antimicrobiana no especfica al aparato respiratorio. Similarmente, la proteccin antimicrobiana en el aparato gastrointestinal est mediada por la barrera mucosa, los extremos del pH regional, la accin esterilizante de secreciones (p- ej., del hgado (bilis) y pncreas), y pptidos antimicrobianos especficos como las defensinas que estn presentes en la mucosa y sus secreciones.

Una gran variedad de protenas plasmticas poseen actividad antimicrobiana, incluyendo a las diversas protenas del Complemento, protena C reactiva, protena que se une a manosa y anticuerpos naturales reactivos en trminos generales. Estas protenas pueden ejecutar un efecto antimicrobiano directo, o promover la captura de microorganismos en las clulas fagocticas al cubrir su superficie para facilitar la unin de receptores (opsonizacin).

Las clulas fagocticasmacrfagos y neutrfilosproporcionan una crtica funcin antimicrobiana, as como ellos son atrados a los sitios de inflamacin., en donde eficientemente ingieren y digieren materiales extraos, incluyendo microorganismos. Estas clulas poseen la maquinaria intracelular para destruir a los microbios ingeridos, particularmente bacterias, por las acciones de enzimas lisosomales hidrolticas as como tambin la produccin de oxgeno activado y metabolitos de nitrgeno en las vacuolas fagocticas. Varios mediadores solubles pueden atraer a estas clulas a los sitios de inflamacin, y activarlos para aumentar su actividad antimicrobiana.

Las clulas dendrticas son jugadores clave en las inmunidades innata y adquirida de las infecciones virales. Adems de ser altamente eficientes como clulas presentadoras de antgeno, son una fuente especialmente importante de IFN tipo I y de otras diversas citocinas que inhiben las infecciones virales y la replicacin. Las clulas dendrticas interdigitales son abundantes en las puertas de entrada de virus (como los aparatos respiratorio, urogenital, gastrointestinal y la piel), y estn dotadas con Receptores de Reconocimiento de Patrones que les permite rpidamente iniciar respuestas protectoras innatas a los virus invasores.

Clulas Asesinas Naturales (Natural Killer Cells, NK)Las clulas asesinas naturales son linfocitos especializados que son capaces de rpidamente matar a clulas infectadas, de esa manera proporcionan resistencia temprana y no especfica contra las infecciones virales. Especficamente, las clulas NK reconocen a las clulas del animal que expresan niveles alterados de molculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) tipo I y/o protenas de choque trmico (o similares). La funcin de las clulas NK est fuertemente regulada por el balance de seales de activacin e inhibicin expresadas en la superficie de las clulas blanco. Las clulas infectadas tpicamente expresan reducidos niveles de molculas inhibitorias del CMH tipo I y elevados niveles de ligandos especficos para activar receptores sobre las clulas NK. En resumen, las clulas NK no son especficas de antgeno, ms bien, su activacin requiere de enlaces diferenciales de receptores de superficie celular en combinacin con la estimulacin de citocinas protoinflamatorias (Figura 4.1).

Las clulas NK median la muerte de las clulas infectadas por la va de la apoptosis; esta actividad citocida es central para el control de infecciones virales, debido a que puede eliminar a las clulas infectadas antes de que ellas liberen la progenie de nuevos viriones. Estas clulas (NK) tambin poseen receptores de superficie para la porcin Fc (fraccin cristalizable) de las molculas de anticuerpos, lo que les permite unir y lisar clulas blanco cubiertas de anticuerpos, mediante el proceso de citotoxicidad mediada por anticuerpos. Por ltimo, las clulas NK sintetizan y liberan una variedad de citocinas, incluyendo IFN tipo II y varias interleucinas (IL) que estimulan su proliferacin y actividad citoltica.

Receptores Celulares de Reconocimiento de PatronesLas clulas en las puertas de entrada de los virus poseen receptores de superficie (Receptores de Reconocimiento de Patrones, PRR), que reconocen especficos Patrones Moleculares Asociados a la Patogenicidad (PAPMS), los cuales son macromolculas presentes en los microbios pero no en las clulas somticas. Estos receptores de reconocimiento de patrones son expresados sobre y dentro de diferentes clulas incluyendo macrfagos, clulas dendrticas, neutrfilos, clulas NK, clulas endoteliales y de las mucosas epiteliales. La unin de las macromolculas microbianas (PAMPs) a estos receptores inmediatamente dispara las respuestas innatas que protegen al individuo de la invasin microbiana. La activacin de estas respuestas no requiere exposicin previa del animal a ese virus especfico.

Los receptores Tipo Toll (TLRs; el nombre refleja el parecido de estas protenas a las protenas Toll de Drosophila) son importantes ejemplos de receptores de reconocimiento de patrones. Estando localizados en la superficie y en vesculas endosmicas, lo cual permite a estos receptores detectar la presencia de disparadores microbianos (PAMPs) en el ambiente extracelular, adems de aquellos internados a la clula despus de la fagocitosis o endocitosis mediada por receptores. Hay al menos 10 TLRs en los mamferos, y diferentes TLRs reconocen diferentes PAMPs. El TLR3 es especialmente importante para la inmunidad antiviral, porque su ligando es el ARN de doble cadena (dsARN), que es producido en diferentes clulas infectadas. Todos los TLRs tienen una porcin extracelular que incluye dominios ricos en leucina y cistena, y una porcin citoplsmica conservada que interacta con protenas de sealizacin celular. Otros sistemas de reconocimiento/deteccin de patgenos tambin son operacionales en el citoplasma celular, y la activacin de los TLRs y/o cualquiera de los otros sensores provoca la activacin de rutas de sealizacin comn que involucran factores de transcripcin celular, notablemente el factor nuclear B (NF-B) que causa dependiendo del tipo celular: (1) Expresin de IFNs y citocinas inflamatorias como el factor de necrosis de tejidos (TNF) e interleucinas 1 y 12 (IL-1, IL-12); (2) activacin de clulas fagocticas y endoteliales con produccin aumentada de mediadores inflamatorios y molculas de adhesin de superficie celular; (3) produccin en los fagocitos de productos microbicidas como el xido ntrico. Colectivamente, estas respuestas celulares que son disparadas por la activacin de receptores de reconocimiento de patrones son potentes estimuladores de la inflamacin e inhibidores de la infeccin y replicacin viral.

CitocinasLas citocinas son mensajeros de aparato inmune que son responsables de la induccin y regulacin de las respuestas inmunes innata y adquirida. Especficamente, las citocinas son mediadores solubles que facilitan la comunicacin entre poblaciones celulares clave, incluyendo varias subpoblaciones de linfocitos, macrfagos, clulas dendrticas, endoteliales y neutrfilos. A modo de propiedades generales, las citocinas son tpicamente glicoprotenas inducibles que son sintetizadas de forma transitoria despus de la estimulacin apropiada de las clulas que las produce. Ciertas citocinas son producidas por ms de un tipo celular y realizan varias actividades, frecuentemente divergentes. Hay mucho empalme (redundancia) en la actividad de diferentes citocinas; as sus interacciones y actividades son altamente complejas. Las citocinas se unen a receptores en la superficie de las clulas blanco, con la subsecuente activacin de transcriptores de esa clula. Estas actividades pueden manifestarse como: Efectos autcrinos sobre el mismo tipo de clulas que las produce Efectos parcrinos sobre clulas adyacentes de diferentes tipos Figura 4.1 Receptores que activan e inhiben a las clulas asesinas naturales (NK). A. Clulas sanas que auto-expresan molculas del CMH I, que son reconocidos por receptores inhibidores, asegurando as que las clulas NK no las atacarn. Note que las clulas sanas pueden expresar ligandos para la activacin de receptores (no mostrado), o no pueden expresar tales ligandos (mostrado), pero no activan a las clulas NK porque estn enganchados a los receptores inhibidores. B. En las clulas infectadas, la expresin del CMH I est reducida para que los receptores inhibidores no se enganchen, y los ligandos para la activacin de receptores sean expresados. El resultado es que las clulas NK son activadas y las clulas infectadas estn muertas. [From Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, J. Aster, 8th ed., p. 188. Copyright Saunders/Elsevier (2010), with permission.]Efectos endcrinos, los cuales son sistmicos en muchos tipos celulares.

Las citocinas clave que estn involucradas con las respuestas inmune innatas son: IFNs tipo I, factor de necrosis de tejidos (TNF), IL-6, y las quimiocinas. Las quimiocinas son una familia de protenas pequeas que son quimiotcticas para los leucocitos, incluyendo entre muchas otras a la IL-8. Otras citocinas como IL-12 e IFN tipo II son crticas para las respuestas inmunes innata y adquirida. Los IFNs son especialmente crticos para la inmunidad antiviral y son discutidos ms adelante.

InterferonesIssacs y Lindenmann en 1957, reportaron que las clulas de la membrana corioalantoidea de los huevos embrionados de gallina infectados con el virus de influenza liberan al medio una protena no viralinterfern (IFN) que protege a clulas susceptibles contra el mismo o virus relacionados. Desde entonces ha sido determinado que hay varios tipos y subtipos de interfern (IFN), y que estas protenas son elementos clave de la resistencia antiviral y son centrales en las respuestas inmunes innata y adquirida a las infecciones virales,

Hay tres tipos de IFN, designados como tipos I, II y III, y que cada uno utiliza diferentes receptores celulares (Figura 4.2).

Interfern Tipo I (IFN tipo I). Los IFNs I incluyen IFN-, del cual hay varios tipos dependiendo de las especies, y un tipo de IFN-; muchas clases de clulas pueden producir estos tipos de IFN I. Otros tipos de de IFNs tipo I con funciones especficas incluyen los IFN-, -, -, -, y . Los IFNs tipo I se unen a receptores IFN-a (IFNAR), un heterodmero de IFNARs 1 y 2, para activar una cascada de seales enzimticas incluyendo las cinasas de tirosina (TYK) y Janus (JAK), transductores de seales y activadores de transcripcin (STATs), y el factor regulador de IFN 9 (IRF9). La activacin de esta cascada de seales finalmente resulta en la induccin de los genes de respuesta de IFN [elementos estimulados de respuesta-IFN (ISRE)] en la clula tratada (Figura 4.2). La importancia del IFN tipo I a la resistencia innata est grficamente confirmada por el hecho de que ratones deficientes del receptor IFN (IFNAR) son altamente susceptibles a las infecciones letales con virus, pero no con patgenos intracelulares como la bacteria Listeria monocytogenes. Similarmente, humanos con deficiencias en las rutas de sealizacin disparadas por IFN (STST, TYK, IFNAR) a menudo mueren de enfermedades virales. Interfern Tipo II (IFN tipo II). Solo hay una forma de IFN tipo II, designado IFN-el cual es un producto de las clulas T y NK. Las clulas T activadas son especialmente fuentes importantes para la produccin de IFN-, el cual es importante para la expresin de la inmunidad mediada por clulas de la inmunidad adquirida. El IFN tipo II se une al receptor IFN-, el cual es un tetrmero compuesto de dos heterodmeros de IFNGRs 1 y 2, para activar las rutas de sealizacin celular (incluyendo JAK y STAT) para inducir sitio activo de IFN- (GAS). Esta activacin transcripcional inducida por IFN- genera una amplia inmunidad antimicrobiana en las clulas tratadas, especialmente macrfagos. El IFN-g es particularmente importante en conferir inmunidad a microorganismos intracelulares, adems de los virus. Interfern tipo III (IFN tipo III). El IFN tipo III representado por el IFN- fue descrito recientemente y parece que representa un IFN tipo I ancestral, quiz con una funcin reguladora.

Adems de las importantes actividades antivirales, particularmente esas del IFN tipo I, los IFNs tambin estimulan las respuestas de la inmunidad adquirida, incluyendo el incremento de la lisis celular mediada por linfocitos T citotxicos mediante la expresin aumentada de CMH tipo I en clulas infectadas. Similarmente, el IFN- promueve la expresin de CMH tipo II en macrfagos, activa macrfagos y clulas NK y modula la sntesis de inmunoglobulinas por los linfocitos B. el IFN tipo II tambin ejerce efectos sistmicos incluyendo pirexia y mialgia.

Figura 4.2 Receptor de activacin o complejo ensamblado de ligando-receptor por interferones (IFNs) tipos I, II o III. Los IFNs tipo I (, y en credos; en rumiantes) interactan con IFN (a, b, ) con el receptor 1 (IFNAR1) e IFNAR2; el IFN- tipo II interacta con el receptor 1 de IFN-(IFNGR1) e IFNGR2; los IFN- interactan con el receptor IFN- 1 (IFNRL1; tambin conocido como IL28RA) y el receptor 2 de IL-10 IL10R2; tambin conocido como IL10RB). El IFN-g tipo II es un homodmero no paralelo que exhibe dos ejes de simetra. Une dos cadenas de receptores IFNGR1, ensamblando un complejo que est estabilizado por dos cadenas de IFNGR2. Estos receptores estn asociados con dos cinasas de la familia JAK: Janus 1 (JAK) y tirosina (TYK2) para los IFNs tipos I y III.; JAK1 y JAK2 para el IFN tipo II. Todos los receptores para cadenas de IFN pertenecen a la clase 2 de la familia de receptores para citocina helicoidal, lo cual es definido por la estructura de los dominios extracelulares de sus miembros: aproximadamente 200 amino cidos distribuidos en dos subdominios de 100 amino cidos (mdulos de fibronectina tipo III), construidos por siete cadenas- arregladas en un sndwich-. Los dominios de 200 amino cidos generalmente contienen el sitio de unin del ligando. Los receptores IFNAR2, IFNLR1, IL10R2, IFNGR1 e IFNGR2 son representantes clsicos de esta familia, mientras que IFNAR1 es atpico, porque su dominio extracelular est duplicado. GAS, sitio activado del IFN-IRF9, factor regulador 9 del IFN; ISGF3, factor 3 estimulador de genes de IFN (se refiere al complejo STAT1STAT2IRF9); ISRE, elemento estimulador de respuesta del IFN; P, fosfato; STAT1/2, transductores de seales y activadores de transcripcin 1/2. [From E. C. Borden, G. C. Sen, G. Uze, R. H. Silverman, R. M. Ransohoff, G. R. Foster, G. R. Stark. Interferons at age 50: past, current and future impact on biomedicine. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 975990 (2007), with permission]

Induccin a la Produccin de IFNLa induccin del interfern tipo I involucra una activacin mediante los receptores de reconocimiento de patrones, los cuales son sensores no especficos de infecciones virales que detectan estructuras virales nicas (PAMPs), conduciendo a la transduccin de numerosos genes que codifican para protenas que se emplean en las respuestas inmunes innata y adquirida, y entre ellas el IFN tipo I. De manera muy importante, estas respuestas pueden ser activadas por varias rutas redundantes, citoplsmicas y extracitoplsmicas (Figura 4.3). Los TLRs son por mucho, los responsables de la deteccin de patgenos en los ambientes extracelulares, y de la subsecuente induccin de produccin de IFN tipo I. Los TLRs detectan PAMPs y seales por la va de los dominios de los receptores citoplsmicos Toll/IL-1 (TIR) para que mediante transcripciones, activar genes crticos, incluyendo a los que codifican para el IFN tipo I. Diferentes TLRs detectan diferentes PAMPs; as TLR7 y TLR8 detectan ARN de cadena sencilla (ssARN) y son importantes en la produccin de IFN tipo I en infecciones de influenza e inmunodeficiencia viral humana, el TLR9 detecta ADN viral, como en la infeccin por herpesvirus, y el TLR3 detecta ARN de doble cadena (dsARN) que es caractersticamente producido durante las infecciones virales pero no est presente en las clulas normales. Estos receptores estn predominantemente ubicados en el endosoma, en donde pueden fcilmente detectar virus que entraron por endocitosis, incluyendo virus o su cido nucleico liberado de clulas adyacentes apoptticas o lisadas. La induccin de la transcripcin del IFN tipo I despus de la activacin de la ruta extracitoplsmica es dependiente del TLR especfico que es activado; as el TLR3 utiliza un adaptador especfico llamado TRIF (dominio TIR-que contiene el adaptador de induccin de IFN-) que media la activacin de: (1) NF-B, (2) IRF3, y (3) activacin de la Protena 1 (AP1), que conduce a la regulacin positiva de la transcripcin del gen IFN-. En contraste, la activacin de los TLRs 7, 8 y 9 es mediada por diferenciacin mieloide de la protena 88 (MyD88) de respuesta primaria asociado al adaptador molecular con el dominio TIR, lo cual provoca la activacin de IRF7, NF-B y AP1, que provoca la activacin transcripcional de los genes de IFN- e IFN- (Figura 4.3). Especialmente altos niveles de expresin de esta ltima ruta sucede en las clulas dendrticas, presumiblemente debido a su papel central y crtico en ambas respuestas inmunes.

Las vas citoplsmicas para la deteccin de patgenos y la induccin de IFN tipo I tambin ocurren por la va de la sealizacin independiente del TLR involucrando a protenas de ARN helicasa como el gen inducible del cido retinoico (RIG-1) y el gen 5 asociado a la diferenciacin del melanoma (MDA-5) (Figura 4.3). La ruta citoplsmica incluye la protena de sealizacin antiviral mitocondrial (MAVS; tambin llamada IPS-1) y lleva a la activacin de NF-B, AP-1 e IRF3, teniendo como resultado la activacin transcripcional de los genes de respuesta innata incluyendo el del IFN tipo I. Tambin hay rutas de sealizacin independiente de TLR- y RIG-1 que proporcionan una mayor redundancia en la deteccin de disparadores de los microorganismos (PAMPs), los cuales son crticos para montar una pronta respuesta antiviral y, por supuesto la supervivencia del hospedero.

Figura 4.3 Rutas por endosomas y citoplsmicas para el reconocimiento de los virus y la produccin de IFN. En las clulas dendrticas los TLR7 y TLR8 estn localizados en compartimientos endosmicos reconocen al ssARN viral mediante infeccin directa o captura autofgica de material viral del citoplasma, o fagocitosis de partculas virales o de otras clulas infectadas. La seal de ambos TLRs es por el adaptador MyD88, que hace interaccin con el complejo IRAK4-IRAK1-TRAF6 que conduce a la fosforilacin y activacin del IRF7 y la subsecuente transcripcin del IFN. El TLR3 est localizado en los endosomas de DCs, macrfagos, clulas epiteliales y fibroblastos, se activa al encontrar dsARN. Despus de su activacin, las seales del TLR3 pasan a su adaptador, TRIF, el cual lleva a una activacin de cinasas IKK no reguladas (TBK1/IKK ) y la subsecuente fosforilacin y translocacin nuclear del IFR3. El Factor Nuclear B (NF-B) tambin es activado por medio de seales del TRIF mediante cinasas reguladas IKK (IKK , y ). El RIG-1 y el MDA5 localizados en el citoplasma son expresados en la mayora de las clulas y reconocen al dsARN con 5 ppp o un dsARN largo, respectivamente. Estos dos sensores citoplsmicos una vez activados interactan y marcan mediante el adaptador MAVS, localizado en la mitocondria. Esta ruta de sealizacin, anloga a la del TLR3, lleva a la activacin de cinasas IKK reguladas y no reguladas y consecuente translocacin nuclear del NF-B y del IRF3. La concurrente activacin positiva de IRF3 y NF-B permite la transcripcin de genes de IFN y su sntesis y exportacin. DCs, clulas dendrticas; IKK, IB cinasas; IRAK, receptor de interleucinas asociadas a las cinasas; IRF, factor regulador de IFN; MDA5, gen 5 asociado a la diferenciacin de melanoma; MVAS, protena de seales antivirales mitocondrial; RIG, gen inductor del cido retinoico; TBK, miembro de la familia TRAF asociado a la cinasa que se une al activador NFB; TLR, receptor tipo Toll; TRAF, factor asociado al receptor del factor de necrosis tumoral; TRIF, dominio TIR que contiene al adaptador de induccin de IFN-. [From A. Baum, A. Garcia-Sastre. Amino Acids 38, 12831299 (2010), with permission]

Actividad del IFN Tipo I El IFN tipo I producido y liberado por las clulas infectadas (como se describi antes) ejecuta sus efectos en las clulas adyacentes mediante el receptor (IFNAR) con actividad de unir y sealar para llevar a la induccin de la respuesta elemental del IFN, con la activacin transcripcional de ms de 300 genes de IFN (ISGs). La mayora de estos ISGs codifican receptores de reconocimientos de patrones celulares o protenas que regulan las rutas de sealizacin o a los factores de transcripcin que amplifican la produccin de IFN, mientras otros promueven un estado antiviral por la va de la remodelacin del citoesqueleto, apoptosis, eventos post-transcripcin (edicin, particin y degradado de ARNm), o modificacin post-traduccin (Figura 4.4).

Esas protenas que prueban ser crticas en la induccin de estado antiviral inducido por el IFN, incluyen:

ISG15, la cual es un homlogo de ubiquitina que no est constitutivamente en las clulas. Adems de que la ubiquitina es una protena celular clave para la regulacin de la respuesta innata, y la ISG15 aparentemente puede ejecutar funciones similares con ms de 150 protenas blanco en clulas estimuladas por IFN. Las actividades de ISG15 pueden regular todos los aspectos de la ruta del IFN, incluyendo la induccin, sealizacin y accin. MxGTPasa es una enzima hidrolizante que, como la ISG15, no est constitutivamente expresada. La enzima est localizada en el retculo endoplsmico liso, en donde afecta la formacin de vesculas, especficamente actuando sobre el nucleocpside viral en las clulas infectadas para prevenir la maduracin del virus. La ruta de la proten-cinasa (PKR) est constitutivamente expresada en un nivel muy bajo, pero se eleva rpidamente al estimulas el IFNAR. En la presencia de dsARN, hay fosforilacin de la proten-cinasa, alargando (traduccin) al factor de iniciacin eIF-2 y previene la recirculacin de los nucletidos cclicos (GDP), deteniendo la sntesis proteica. Esta ruta inducida por el IFN es especialmente importante para inhibir la replicacin de reovirus, adenovirus, virus de viruela e influenza entre muchos otros. La ruta de la 2-5 oligoadenilato sintetasa (OAS), como la ruta de la PKR, est constitutivamente expresada en un bajo nivel. Despus de la estimulacin del IFNAR y en la presencia de dsARN, esta enzima produce oligoadenilatos con una unin 2-5 distintiva, en contraste con el linaje normal 3-5. Estos oligoadenilatos 2-5 activan a la RNasa celular (ribonucleasa) que degrada al ARN, escindiendo al ARN viral genmico y mensajero. Los picornavirus son especialmente susceptibles a la inhibicin por esta ruta, como tambin el virus del oeste del Nilo. Han sido identificadas otras rutas en cultivos celulares tratados con IFN, pero su importancia individual parece se inequvocamente probada en ratones knockout.

Figura 4.4 El estado antiviral. (A) El desarrollo del estado antiviral empieza con la accin del interfern sobre una clula no infectada. El resultado de la cascada de seales de transduccin mostrado en la Figura 4.2 es la induccin de la expresin de ms de 300 genes de los cuales tres se muestran aqu: RNasa L, el 2-5 oligo (A) sintetasa (2-5 OS), y la proten-cinasa (PKR) dependiente de ARN de doble cadena (dsARN). Estas protenas estn latentes hasta que son activadas por infeccin viral. PKR y 2-5 OS, son activadas por dsARN que es producido durante la infeccin viral. Una vez activada la PKR, se autofosforila y luego fosforila al factor 2 de iniciacin eucaritico (EIF2). La sintetasa activada produce oligonucletidos trimricos que activan a la RNasa L.(B) El EIF2 fosforilado y la RNasa L activada son caractersticos del estado antiviral con el cual la clula eucaritica es refractaria a la infeccin por una amplia variedad de virus. El EIF2 fosforilado no puede servir para iniciar la traduccin del ARNm por los ribosomas, y la RNasa L activada degrada al los ARNm virales y celulares, de esta manera cesa la produccin de protenas. Sin sntesis proteica, no haber replicacin viral, pero la inhibicin de la sntesis de protenas es pasajera y la clula se puede recuperar. [From Viruses and Human Disease, J. H. Strauss, E. G. Strauss, 2nd ed., p. 401. Copyright Academic Press/Elsevier (2007), with permission]

En resumen, el IFN tipo I es producido despus de la infeccin viral de muchos tipos de clulas, y el IFN que es liberado de estas clulas entonces induce un estado antiviral en las clulas adyacentes (efecto autcrino o parcrino). Las mltiples rutas antivirales que son activadas en las clulas tratadas con IFN son intrnsecamente reguladas por requerimientos para la presencia de cofactores como el dsARN, demostrando que estas rutas solo pueden ser activadas cuando las clulas tratadas con IFN son subsecuentemente infectadas con un virus. Esta fuerte regulacin es necesaria debido a que algunos de estos mecanismos de defensa antiviral tambin comprometen las funciones normales de las clulas.

ApoptosisDesde siempre se ha credo que las clulas muertas por virus los hacan por medios directos como usurpando su maquinaria celular o rompiendo la integridad de su membrana, finalmente, conduciendo a la necrosis de la clula infectada. Sin embargo, est ahora claro que la apoptosis en un evento importante y comn durante muchas infecciones virales. La Apoptosis es el proceso de muerte celular programada, el cual es esencialmente un mecanismo de suicidio celular que activa el hospedero como un ltimo intento de eliminar la fabricacin de virus antes de que la produccin de la progenie viral sea completada. Hay dos rutas celulares diferentes que disparan la apoptosis (Figura 4.5), ambas culminan en la activacin de las enzimas celulares caspasas que median la muerte celular (la llamada fase de ejecucin). Una vez activadas, las caspasas son responsables de la degradacin del ADN y protenas celulares. Las alteraciones de la membrana celular de la clula condenada promueven su rconocimiento y remocin por clulas fagocticas. Las dos rutas de iniciacin son:

1. La Ruta Intrnseca (Mitocondrial). La ruta mitocondrial es activada como resultado de una permeabilidad aumentada de las membranas de las mitocondrias subsecuente al dao celular, que est asociado con la infeccin viral. Los daos severos alteran el delicado balance entre molculas anti-apoptticas (p. ej., Bcl-2) y pre-apoptticas (p. ej., Bax) en la membrana de la mitocondria y en el citosol, resultando en una progresiva licuacin de las protenas mitocondriales (como el citocromo C) en el citosol en donde estas protenas activan a las caspasas celulares.2. La ruta extrnseca (el receptor de la Muerte). La ruta extrnseca es activada por la unin de receptores especficos de membrana, con miembros de la familia de receptores TNF (TNF, Fas, y otros). Esta unin de la citocina TNF a su receptor celular puede disparar la apoptosis. Similarmente, linfocitos T citotxicos que reconocen clulas infectadas por virus en una manera antgeno especfica, pueden unir el receptor Fas, activar el dominio de la muerte, y disparar la ruta de la caspasa ejecutora que luego elimina a la clula antes de que ella se convierta en una fbrica funcional de virus.

Adems de la citlisis mediada por el receptor de la muerte, los linfocitos T citotxicos y las clulas NK pueden iniciar la apoptosis de clulas blanco infectadas por virus, utilizando mediadores preformados tales como perforinas y granzimas que directamente activan las caspasas en la clula blanco

Figura 4.5 Mecanismos de apoptosis. Las dos rutas de la apoptosis difieren en su induccin y regulacin y ambas culminan en la activacin de las caspasas ejecutadoras. [From Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, J. Aster, 8th ed., p. 28. Copyright Saunders/Elsevier (2010), with permission.]

Genes Silenciadores (ARN de Interferencia)Las clulas utilizan molculas de ARN pequeas que causan interferencia (ARNi) para silenciar genes a modo de regular el desarrollo normal y los procesos fisiolgicos, y potencialmente interfiere con la replicacin viral. Los ARNi son producidos de segmentos largos de ssARN o dsARN, posterior a su escisin por una endoribonucleasa (DICER). La produccin de ARNi inicia la formacin del complejo ARN-silenciador que incluye una endonucleasa (argonauta) que degrada a los ARNm con una secuencia que es complementaria a la del ARNi (Figura 4.6). Las clulas que utilizan este mecanismo para interrumpir la replicacin viral por la produccin de ARNi que son complementarios a genes virales especficos; sin embargo, los ARNi tambin pueden ser producidos durante las infecciones virales que especficamente inhiben las rutas de proteccin celular antiviral

Inmunidad AdquiridaLa inmunidad adquirida incluye componentes humorales y celulares. La inmunidad humoral es principalmente mediada por anticuerpos (Abs) que son liberados por los linfocitos B, mientras que la inmunidad celular es mediada por linfocitos T (Figura 4.7). Adems hay, clulas dendrticas, macrfagos, clulas NK y citocinas siendo todos ellos crticos en las respuestas inmunes adquiridas. La inmunidad adquirida es especfica de antgeno, as que estas respuestas toman tiempo (por lo menos algunos das) para desarrollarse, y este tipo de inmunidad es mediada por linfocitos que poseen receptores de superficie que son especficos para cada patgeno. La inmunidad adquirida estimula memoria para mucho tiempo despus de la infeccin, significando esto que las respuestas inmunes protectoras pueden rpidamente ser reactivadas con una re-exposicin del individuo al mismo patgeno.

Figura 4.6 Mecanismos de interferencia de ARN. Molculas de dsARN largas (dsARN) son escindidas por la RNasa III y subsecuentemente procesadas por DICER en pequeos ARNs de interferencia (ARNi), los cuales son dsARNs de 21-22 nucletidos (nt) con 2-nt sobrantes en el extremo 3. Entonces los ARNi introducen el complejo silenciador ARN inducido (RISC), en donde la polaridad de la cadena de cido nucleico es selectivamente degradada. Los ARNmi son codificados como horquillas auto-complementarios no totalmente en genomas virales y celulares. Ellos son escindidos por Drosha en el ncleo y los pre-micro ARN (pre-miARN) son exportados al citoplasma por la Exportina 5.en donde luego son tambin procesados por DICER. Los ARNsi silencian (bloquean) genes por unirse en el contexto del RISC a los ARNm que son exactamente complementarios, y causan degradacin del ARNm. Los ASRNmi a menudo contienen algunos errors y generalmente ejecutan su efecto en inhibir la traduccin. Los ARNsi tambin pueden entrar al complejo silenciador transcripcional de ARNinducido (RITS), con el cual recluta una enzima para metilar al ADN en cromatina, cambindola a cromatina inactiva. Los RITS y RISC contienen protenas argonautas (Agos). miRNP, micro ribonucleoprotena. [From Viruses and Human Disease, J. H. Strauss, E. G. Strauss, 2nd ed., p. 403. Copyright Academic Press/Elsevier (2007), with permission]

Las Citocinas fueron descritas en la seccin de inmunidad innata, pero ellas tambin son importantes en las respuestas de la inmunidad adquirida, enfatizando la manera de cmo las respuestas inmunes adquiridas e innatas estn interrelacionadas. Las citocinas que son especialmente importantes en la inmunidad adquirida son producidas principalmente por clulas T CD+ despus de la estimulacin antignica, y promueven la proliferacin, diferenciacin y activacin de linfocitos. Entra las citocinas importantes de la inmunidad adquirida, tenemos a las siguientes interleucinas: IL-2, IL-4, IL-5, e IL-17 y el IFN- (IFN tipo II)

Los linfocitos B producen anticuerpos (Abs, inmunoglobulinas, gamaglobulinas) que son responsables de neutralizacin y eliminacin de virus libres. Los Abs tambin median una proteccin de mucho tiempo contra la reinfeccin para muchos virus. Los linfocitos B expresan receptores de superficie que especficos para antgenos particulares: despus de la exposicin al antgeno como una infeccin viral, los linfocitos B evolucionan hacia clulas plasmticas que secretan anticuerpos con la misma especificidad antignica como la que hay en los receptores de superficie de las clulas B, de los cuales ellas se originaron. La diversidad de receptores es generada por rearreglos de los genes que codifican porciones de molculas de inmunoglobulinas individuales. La respuesta adquirida de las clulas B a la infeccin involucra conexiones de clases de inmunoglobulinas y una especificidad progresiva, conocida como maduracin de afinidad.

Una subclase de linfocitos B, llamada clulas B1, secreta inmunoglobulinas ampliamente reactivas, conocidas como anticuerpos naturales, que se produjeron sin un estmulo antignico especfico. De esta manera, estos Abs naturales proporcionan una unin entre las respuestas humorales innata y adquirida y proporcionan una primera lnea de defensa humoral.

Los linfocitos T tambin poseen receptores de superficie antgeno-especficos. Como el reconocimiento antignico de las clulas B, la especificidad y diversidad del receptor es generada por rearreglo somtico de los genes que codifican para el receptor de clulas T. hay dos clases importantes de clulas T: unas en las que los receptores constan de un heterodmero de cadenas y /llamadas clulas T ), y otras con el receptor compuesto por el heterodmero y (denominadas clulas T ). Las clulas T reconocen pequeos pptidos expresados en la superficie de las clulas en asociacin con antgenos CMH, los cuales confieren exquisita especificidad a los mecanismos inmunes celulares mediado por estas clulas. En contraste, aunque las clulas T tambin reconocen pequeos pptidos en las superficies celulares, ellos lo hacen sin la restriccin del CMH. Esta carencia de restriccin de CMH, acoplada con el hecho de que las clulas T son especialmente abundantes en las superficies mucosas que sirven de puerta de entrada de los virus (como la cubierta mucosa del aparato gastrointestinal), sugiere que estas clulas pueden servir como centinelas para remover clulas infectadas. As, probablemente las clulas T constituyen un puente entre la inmunidad antiviral adquirida e innata.

Figura 4.7 Las principales clases de linfocitos y sus funciones en la inmunidad adquirida. [From Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, V.Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, J. Aster, 8th ed., p. 185. Copyright Saunders/Elsevier (2010), with permission]

La inmunidad celular (inmunidad mediada por clulas), es realizada por linfocitos y macrfagos que especficamente eliminan clulas infectadas por virus. Los linfocitos que median la lisis celular son los linfocitos T citotxicos (CTLs) que tpicamente expresan (CD8) en su superficie (CTLs CD8+), que lisan clulas que expresan antgenos virales en el contexto de molculas apropiadas del CMH clase I. Porciones de protenas virales inmunognicas producidas en el citosol de la clula infectada son transportados al retculo endoplsmico, en donde se asocia con las molculas del CMH tipo I. Este complejo es dirigido a la superficie celular, en donde los pptidos virales puedan ser reconocidos por linfocitos T citotxicos antgeno-especficos que entonces lisan a la clula infectada induciendo apoptosis.

Las Clulas Dendrticas (DCs) tambin son jugadores importantes en la inmunidad innata y adquirida, derivan sus nombres por filamentos citoplsmicos abundantes, finos (dendritas). Hay dos grupos importantes de ellas:

Clulas Dendrticas Interdigitales son muy importantes clulas presentadoras de antgeno que estn localizadas en las puertas de entrada de los virus, como la piel en/debajo de las superficies epiteliales mucosas que cubren los aparatos gastrointestinal, respiratorio y urogenital. Tambin estn presentes en el intersticio de virtualmente todos los tejidos. Estas DCs expresan receptores de superficie de reconocimiento de patrones que pueden rpida y genricamente responder a la presencia de estructuras virales (PAMPs) por la produccin y liberacin de citocinas antivirales como el IFN. Adems, estas clulas migran a las regiones de las clulas T en los tejidos linfoides, en donde pueden presentar el antgeno a las clulas T y, debido a que expresan altos niveles de molculas estimulatorias como los antgenos CMH, son potentes inductoras de la activacin de las clulas T. Clulas dendrticas Foliculares aparecen en los centros germinales de los tejidos linfoides, como los linfonodos y el bazo. Estas clulas capturan eficientemente (fagocitan) antgenos circulantes, los cuales luego son presentados a los linfocitos B que expresan receptores de superficie con una especificidad relevante, produciendo la activacin de las clulas B y el desarrollo de la inmunidad humoral (mediada por anticuerpos)

Los Macrfagos son clulas importantes derivadas de la mdula sea que son responsables de fagocitar microbios y matarlos. Ellas pueden ser activadas por citocinas como clulas efectoras que median la inmunidad celular mediante su capacidad antimicrobiana aumentada. La activacin de los macrfagos es mediada por IFN- que es liberado por clulas T especficas de antgeno y clulas NK.

Los Antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) son expresados en la superficie de clulas importantes de la inmunidad adquirida. Los antgenos del CMH son protenas polimrficas y su funcin ms importante es mostrar porciones de protenas inmunognicas a los linfocitos T antgeno-especficos (Figura 4.8). Las molculas CMH tipo I son expresadas en la superficie de todas las clulas nucleadas, y cuando estn en la superficie de las clulas infectadas tpicamente muestran protenas inmunognicas de los virus infectantes que son reconocidas por linfocitos T citotxicos antgeno-especficos. Normalmente, las protenas virales producidas en el citoplasma de las clulas infectadas son degradadas en los proteosomas, y los fragmentos de estas protenas son entonces transportados al retculo endoplsmico en donde son unidos a molculas de CMH tipo I recin sintetizadas. La asociacin de la microglobulina 2con el complejo del CMH tipo I y el pptido viral forman un heterodmero estable que es transportado a la superficie celular, en donde los antgenos virales pueden ser reconocidos por linfocitos T citotxicos antgeno-especficos. La muerte mediada por esta clula T est restringida a las clulas blanco que expresan el mismo haplotipo de CMH clase I. Las molculas del CMH tipo II, en contraste, son expresadas principalmente en clulas presentadoras de antgeno, denominadas linfocitos B, macrfagos y clulas dendrticas. Estas molculas exponen protenas virales en la superficie celular que son reconocidas por linfocitos T CD4+ antgeno-especficosesto es, esas con receptores de superficie que especficamente reconocen y se unen al pptido mostrado. En este escenario, las protenas virales son degradadas hasta pptidos en las vesculas endocticas y luego son asociados con molculas del CMH II que son sintetizadas en esas mismas vesculas. El complejo molecular del CMH II y pptido viral es luego transportado a la superficie celular para mostrarlo y que sea reconocido por linfocitos T CD4+ antgeno-especficos.

Inmunidad Pasiva Los Abs especficos solos son altamente efectivos para prevenir muchas infecciones virales. Por ejemplo, la inmunizacin pasiva (inyeccin de Abs) temporalmente protege a los animales contra infecciones con los virus que causan distemper canino, panleucopenia y sndrome reproductivo y respiratorio de los porcinos (PRRS), entre otros. Es ms, la inmunizacin natural pasivaesto es, la transferencia de Abs de la madre al feto o recin nacidolo protege durante los primeros meses de vida contra la mayora de las infecciones que la madre ha experimentado.

La inmunidad natural pasiva es importante por dos significativas razones: (1) es esencial para la proteccin del animal joven, durante las primeras semanas o meses de vida, de la mirada de microorganismos y virus que estn presentes en el ambiente en el cual nacen los animales; (2) los Abs derivados de la madre, interfieren con la inmunizacin activa del recin nacido y debe por lo tanto, ser tomada en cuenta cuando se disean esquemas de vacunacin. Los Abs maternos pueden ser transmitidos en la yema del huevo en las aves, cruzar la placenta en primates y roedores, o por la va del calostro y/o leche en ungulados y otros mamferos.

Figura 4.8 Procesamiento de antgenos y exposicin por molculas del Complejo mayor de Histocompatibilidad (CMH). A. En la ruta de CMH I, los pptidos son producidos de las protenas en el citosol y son transportadas al retculo endoplsmico (RE), en donde se unen a molculas CMH I. Los complejos CMH-pptidos son transportados a la superficie celular y exhibidos para el reconocimiento por las clulas TCD8+. B. En la ruta del CMH II, las protenas son digeridas en vesculas y degradadas a pptidos, que se unen a las molculas de CMH II para ser transportados en las mismas vesculas. Estos complejos CMH II-pptido son expresados en la superficie celular y reconocidos por clulas T CD+. [From Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, J. Aster, 8th ed., p. 192. Copyright Saunders/Elsevier (2010), with permission.]Los mamferos difieren sorprendentemente en la ruta predominante de transferencia de Abs maternos, dependiendo de la estructura de la placenta de cada especie. En especies como los primates en las cuales la circulacin sangunea materna y fetal est en relativa fuerte aposicin, Abs de la inmunoglobulina (Ig) G (pero no de la IgM) son capaces de cruzar la placenta, de esa manera la inmunidad materna es transmitida principalmente por esa ruta. Algunas especies con una placenta ms compleja, como los ratones, los anticuerpos maternos son adquiridos por los receptores de inmunoglobulinas que estn en el saco de la yema. En contraste, la placenta compleja de la mayora de los animales domsticos sirve como una barrera a las inmunoglobulinas maternas; en estas especies, esta inmunidad es transmitida al recin nacido por la va del calostro y, a veces un poco por la leche. Algunas especies difieren en lo que se refiere en particular a las clases u subclases de inmunoglobulinas que son transferidas principalmente al recin nacido en el calostro, pero en la mayora de las especies domsticas es principalmente IgG. En los bovinos y ovinos hay una transferencia selectiva de IgG1 desde el suero cruzando el epitelio alveolar de la glndula mamaria durante las ltimas semanas de preez. Los Abs de la clase IgG1 son una proteccin importante contra las infecciones entricas durante la lactacin.

Las grandes cantidades de IgG presentes en el calostro son ingeridas y translocadas a vesculas intracitoplsmicas por clulas especializadas presentes en la prima parte del intestino delgado para poder alcanzar la circulacin del recin nacido. Pequeas cantidades de otros Abs (IgM, IgA) presentes en el calostro o leche pueden en algunas especies, tambin ser translocados por el intestino, pero desaparecen pronto de la circulacin del animal joven. El periodo despus de nacer durante el cual los Abs ingeridos en el calostro, son translocados, est perfectamente definido y es muy breve (alrededor de 48 horas) en la mayora de los animales domsticos, pero puede ser muy prolongado en roedores; los ratones continan adquiriendo IgG materna por ms de tres semanas.

En las aves hay una transferencia selectiva de IgG desde la circulacin materna, de manera que la IgG es concentrada en el saco de la yema. La IgG entra a la circulacin vitelina (yema), y de ah al pollo, desde el da 12 de incubacin. Alguna IgG tambin es transferida al lquido amnitico y es deglutida por el pollo. Cerca del momento de la eclosin, el saco de la yema con el resto de inmunoglobulinas es completamente capturado en la cavidad abdominal y absorbido por el pollo.

Los Abs maternos en la circulacin sangunea del mamfero recin nacido o ave recin eclosionada son destruidos rpidamente, con una cintica primordial. La vida media, la cual es de alguna manera larga en los adultos, tiene un rango de 21 das en la vaca y el caballo, 8-9 das en el perro y gato, a solamente dos das en el ratn. Por supuesto, el recin nacido estar protegido contra la infeccin de cualquier virus en particular, solamente si la madre contiene Abs IgG especficos, y la proteccin ser mucho ms duradera que la de la vida media de una IgG si el ttulo inicial contra ese virus es alto.

Aunque las concentraciones de IgA transferidas por el calostro al intestino del recin nacido son considerablemente bajas contra las de la IgG, Abs de este isotipo son importante en la proteccin del neonato contra los virus entricos contra los cuales la madre ha desarrollado inmunidad. Es ms, hay evidencia de que aunque la translocacin intestinal haya cesado, las inmunoglobulinas presentes en la lecheprincipalmente IgA, pero tambin IgG e IgMpueden continuar proporcionando alguna inmunidad protectora contra las infecciones intestinales. A menudo el recin nacido encuentra virus mientras est parcialmente protegido. Bajo estas circunstancias los virus pueden alcanzar la replicacin, pero solo en pequeas reas, estimulando una respuesta inmune sin causar una significativa enfermedad, y el neonato infectado as adquiere inmunidad activa, parcialmente protegido por la inmunidad materna.

Falla de la Transferencia Materna de AnticuerposLa falla (completa o parcial) de la transferencia de anticuerpos por la madre es la causa ms comn de enfermedad por inmunodeficiencia en el ganado, y predispone a los animales afectados a las enfermedades infecciosas, particularmente entricas y respiratorias. La inmunizacin materna asegura proteccin pasiva a los neonatos por lo que es una estrategia importante en la prctica de la medicina veterinaria, en conjuncin con adecuadas prcticas de manejo para asegurar que los recin nacidos rpidamente reciban adecuadas cantidades de calostro.

Mecanismos Virales de Evasin y Escape En la guerra declarada entre el hospedero y los agentes infecciosos, los virus han desarrollado mecanismos muy sofisticados para evitar diversas respuestas protectoras del hospedero. Adems de las diferentes estrategias utilizadas por los virus para facilitar la infeccin persistente [incluyendo el crecimiento en clulas inmunes y/o en sitios inmunolgicamente privilegiados, integracin o deriva antignica], los virus han desarrollado mecanismos diversos y complejos para evadir las respuestas protectoras inmunes innata y adquirida del hospedero. Entre los ejemplos de estos mecanismos se incluyen los siguientes:

Inhibicin de sntesis de macromolculas del hospedero Evasin de la muerte por CTL de clulas infectadas Prevencin de la lisis por clulas NK de clulas infectadas Interferencia con la apoptosis Contra-defensa a las citocinas Evasin del estado antiviral Rutas de silenciamiento de genes virus especficos

Inhibicin de Sntesis de Macromolculas del HospederoMuchos virus, en seguida despus de la infeccin, inhiben la transcripcin y/o traduccin de protenas celulares normales, y rpidamente quebrantan la maquinaria de la clula infectada para la produccin de virus progenie. Este sbito apagado de la clula hospedera rpidamente modifica la respuesta innata hacia el virus infectante, incluyendo la produccin de protenas crticas como las del CMH I, citocinas antivirales como el IFN tipo I. El resultado es que sin respuestas inmunes innatas, el virus infectante puede replicarse y diseminarse antes de que el animal pueda desarrollar una respuesta inmune adquirida. Esta estrategia es ampliamente utilizada por los virus con ARN, muchos de los cuales tienen ciclos de replicacin muy rpidos.

Evasin de la Muerte por CTL (linfocitos Tcitotxicos) de las Clulas InfectadasLa muerte de las clulas infectadas mediante los linfocitos T citotxicos (CTL) requiere de la presentacin de antgenos virales en la superficie de la clula infectada en el contexto de una molcula de CMH I apropiada; de esa manera los virus han desarrollado estrategias para suprimir la expresin normal de molculas CMH I para inhibir la lisis mediante los CTL. Estas estrategias incluyen: (1) supresin de produccin de molculas CMH I, mediante el apagado de sntesis proteica del hospedero; (2) produccin de protenas codificadas por el virus que interrumpan la produccin de protenas del CMH I, o su transporte desde el retculo endoplsmico al aparato de Golgi o a la superficie celular; (3) produccin de protenas codificadas por el virus que interrumpan la funcin o la viabilidad de las molculas CMH I; produccin de homlogos del las molculas del CMH I codificados por el virus, que puedan unirse a la microglobulina 2 y pptidos virales, pero son disfuncionales desde el punto de vista de la actividad de los CTL.

Prevencin de la Lisis Mediada por Clulas NK de las Clulas InfectadasEn contraste a la lisis mediada por los CTL que requieren la presencia de concentraciones apropiadas de de antgeno CMH I en la superficie de las clulas infectadas, la citlisis mediada por las clulas NK es promovida por reducidos niveles de antgeno CMH I en la superficie celular. Es tambin importante para la actividad de las clulas NK, es el balance de molculas inhibitorias (como el antgeno CMH I) y molculas estimuladoras (como las protenas de choque trmico) en la superficie celular, as algunos virus selectivamente inhiben la produccin celular y la expresin de molculas que proporcionan seales estimuladoras para la actividad de las clulas NK. Otros virus inhiben la produccin de la clula hospedera por molculas inhibidoras y estimuladoras, de tal manera que la clula infectada est de alguna manera protegida contra la lisis del CTL y de la clula NK.

Interferencia con la ApoptosisAdems de la apoptosis inducida por las clulas NK o la lisis por los CTL, la sola infeccin viral puede iniciar la apoptosis por la va extrnseca (receptor de la muerte) o intrnseca (mitocondrial). La apoptosis es especialmente deletrea a los virus de ADN con relativo lento crecimiento, incluyendo los poxvirus, herpesvirus y adenovirus, debido a que la apoptosis puede provocar la muerte de las clulas infectadas con esos virus antes de que los niveles mximos de replicacin viral hayan sido completados. As estos virus de ADN, en particular, han desarrollado una gran variedad de estrategias para optimizar su replicacin por la inhibicin de varias rutas que normalmente conducen a la apoptosis. La necesidad de estos virus para prevenir la apoptosis para promover su propia supervivencia es reflejada en el hecho de que virus individuales pueden usar una combinacin de estrategias, incluyendo: (1) inhibicin de la actividad ejecutora de las caspasas que median el dao celularnotablemente por serpinas, las cuales son inhibidores de proteasas producidas por los poxvirus que se unen y bloquean la actividad proteoltica de las caspasas; (2) inhibicin de la expresin, activacin y sealizacin de los receptores de la muerte, como la produccin de receptores homlogos que unen al TNF para que no inicie la ruta extrnseca, o molculas que especficamente bloquean la estimulacin de la cascada que iniciara la activacin del receptor de la muerte; (3) la produccin de protenas antiapoptticas homlogas codificadas por el virus como la Bcl-2; (4) produccin de protenas que secuestran p53, la cual es una molcula pre-apopttica que se acumula en las clulas infectadas con ciertos virus; (5) otros mecanismos todava poco entendido de inhibicin de apoptosis, aparentemente usados por una mirada de protenas virales.

Contra Defensas a las CitocinasLas citocinas son muy importantes en las respuestas inmunes de los animales a las infecciones virales, de esta manera los virus tambin han desarrollado estrategias efectivas para combatir las funciones de estos mediadores de la inmunidad antiviral. Ciertos virus han adquirido o modificado genes celulares, creando genes virales que codifican para protenas que son homlogas a las citocinas o sus receptores. Las citocinas homlogas codificadas por el virus pueden ser funcionales (llamadas virocinas) e imitan los efectos biolgicos de la molcula autntica, o pueden ser no funcionales y simplemente unirse y bloquear al receptor especfico de citocina para neutralizar su actividad. Similarmente, los receptores homlogos de protenas codificados por virus tpicamente se unen y neutralizan a la citocina respectiva. Otras protenas codificadas por virus interfieren con las rutas de activacin del receptor de reconocimiento de patrones del dsARN activado 8como el TLR3 o RIG-1)que disparan la produccin de IFN tipo I y otras citocinas virales, o con las rutas de sealizacin activadas por la unin del IFN a su receptor (IFNAR)). Colectivamente, estas protenas codificadas por virus pueden modular las actividades de una amplia variedad de citocinas importantes como IL-1, IL-6, IL-8, IFN tipos I y II, y TNF para el beneficio replicativo del virus, por inhibir o promover las funciones mediadas por citocinas especficas.

Evasin del Estado AntiviralComo era de esperar, los virus tambin han evolucionado para elaborar estrategias que eviten la actividad de los mecanismos efectores antivirales inducidos por el IFN, como los de las rutas de la proten cinasa (PKR) y oligoadenilato sintetasa 2-5 (OAS). Estas incluyen la produccin de protenas codificas por virus o molculas de ARN (ARNi) que se unen pero no activan a enzimas importantes (o genes que las codifican) involucrados en estas rutas, la produccin de enzimas homlogas no funcionales y la estimulacin de vas que desregulan la actividad y funcin de estas rutas protectoras antivirales. Otras protenas codificadas por virus secuestran al dsARN, el cual es un co-factor crucial para la PKR y la OAS. Los virus de diferentes familias de virus con ARN y ADN han incorporado estrategias para evadir las rutas antivirales del hospedero, y sin duda en el futuro sern identificados ms ejemplos de ello.

Rutas de Silenciamiento de Genes Virus EspecficosLos virus tambin han desarrollado contra defensas a las rutas de interferencia de ARN antiviral celular, por la produccin de protenas codificadas por el virus o por molculas de ARNm pequeo de interferencia (ARNsi) que inhiben pasos clave de la ruta celular, como se puede ver en la Figura 4.4. Otros virus por si mismo producen molculas de ARNi para silenciar genes celulares clave involucrados en la inmunidad antiviral.

Vacunas y vacunacin contra enfermedades viralesLa vacunacin es la manera ms efectiva de prevenir las enfermedades virales. Aunque la deliberada exposicin a virus virulentos tales como viruela humana (sinom. Variolizacin) fue reconocida como un mtodo de profilaxis muy efectivo, aunque peligroso, el concepto de vacunacin es conocido que fue ampliamente utilizado por Edward Jenner en 1798 para proteger a los humanos contra la viruela. Cerca de un siglo despus, el concepto fue retomado por Louis Pasteur porque tena muchas aplicaciones y, ms notablemente, podra ser usado para prevenir la rabia. Con la llegada de las tcnicas de cultivo celular en los aos de 1950, una segunda era de vacunacin fue introducida y muchas vacunas de virus atenuados (modificados) e inactivados fueron desarrolladas. Ms recientemente, el campo de la vacunologa ha testificado la introduccin de muchas vacunas de nueva generacin producidas mediante varias formas de ADN recombinante y tecnologas relacionadas. Mientras que las vacunas de virus atenuados e inactivados de la segunda era continan siendo caballos de trabajo en la prctica veterinaria, la nueva generacin de vacunas estn ahora complementndolas y crecientemente reemplazndolas.

Hay algunas diferencias importantes entre las prcticas de vacunacin de animales y humanos. Las restricciones econmicas son generalmente de menor importancia en la medicina humana que en la medicina veterinaria. Tambin hay un mayor acuerdo en relacin a la seguridad y eficacia de las vacunas para uso en medicina humana que la que hay en las vacunas para los animales y mejores mecanismos para reportar las potenciales consecuencias adversas asociadas con el uso de productos especficos. A nivel internacional, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ejecuta un liderazgo persuasivo en el uso de vacunas humanas, y mantiene varios programas que no tienen equivalente en el uso de vacunas de uso animal por sus agencias hermanas, la Organizacin para la Agricultura y la Alimentacin (FAO, siglas en ingls) y la oficina Internacional de Epizootias (OIE, sinom. Organizacin Mundial de la Salud Animal). Es ms, en algunos pases, se ha permitido que en la manufactura y uso de vacunas para enfermedades de los animales se empleen los patrones de manufactura de las vacunas de uso humano.

Antes de la reciente llegada de la nueva generacin de vacunas basadas en tecnologa de ADN recombinante, hubo dos grandes estrategias para la produccin de vacunas virales: una empleando cepas virales atenuadas (sinom. Modificadas) y la otra empleando preparaciones virales inactivadas qumicamente. Las vacunas de virus atenuado se replican en animal receptor y, por lo tanto, amplifican la cantidad de antgeno (virus) presentado al aparato inmune del hospedero. Hay muy importantes beneficios en este planteamiento, porque la replicacin del virus vacunal imita a la infeccin en la medida que la respuesta inmune es ms similar a la que ocurre despus de la infeccin natural que en el caso de la vacunas inactivadas o las de subunidades. Cuando son producidas las vacunas de virus inactivado, el tratamiento fsico o qumico usado para eliminar la infectividad, puede daarlas lo suficiente como para disminuir la antigenicidad de esas vacunas, especialmente en la induccin de respuestas inmunes mediadas por clulas especficas del virus. Teniendo como resultado que las vacunas inactivadas a menudo inducen una respuesta inmune que es de muy corta duracin, reducida en su espectro inmunognico, ms dbil sus respuestas inmunes celulares y de anticuerpos de las mucosas y posiblemente menos efectiva en inducir inmunidad esterilizante. Sin embargo, vacunas inactivadas muy tiles y seguras estn disponibles y son de ampliamente usadas.

La mayora de las vacunas de larga escala de produccin para el uso en animales continan incluyendo virus atenuado o inactivado, sin embargo, la nueva generacin de vacunas desarrolladas mediante las tecnologas de ADN recombinante ofrecen significativas mejoras y ventajas potenciales en trminos de su seguridad y eficacia. Una gran variedad de tales vacunas han sido recientemente desarrolladas, y muchas de ellas estn ahora en produccin comercial (MEEUSEN et AL. July 2007, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, p. 489510 Vol. 20, No. 3; doi:10.1128/CMR.00005-07).

Vacunas de Virus AtenuadosLas vacunas de virus atenuados, cuando han sido probadas para ser seguras, histricamente han sido las mejores de todas las vacunas. Varias de ellas han sido dramticamente exitosas en reducir la incidencia de importantes enfermedades de animales y humanos. La mayora de las vacunas de virus atenuado son inyectadas intradrmica, subcutnea o intramuscularmente, pero algunas pueden ser aplicadas oralmente, y unas pocas por la va del aerosol o en las aves en el agua de bebida. Para que estas vacunas sean exitosas, el virus vacunal debe replicarse en el animal receptor, provocando con ello una respuesta inmune de larga duracin causando poco o ningn efecto secundario. En efecto, una vacuna de virus atenuado imita una infeccin subclnica. Las cepas individuales de virus, incorporadas en una vacuna de virus atenuado puede ser derivada de cualquiera de diversas fuentes.

Vacunas Producidas de Virus Atenuados NaturalmenteLa vacuna original (vacca = vaca), introducida por Jenner en 1798 para el control de la viruela humana, utiliz virus de viruela bovina, un patgeno natural de la vaca. Este virus solamente produjo infeccin y lesiones leves en humanos, pero, por ser antignicamente relacionado al virus de la viruela humana, confiere proteccin contra la enfermedad humana. El mismo principio ha sido aplicado a otras enfermedadespor ejemplo, la proteccin del pollo contra la enfermedad de Marek empleando una vacuna derivada de u rotavirus bovino. Similarmente, los conejos pueden ser efectivamente protegidos contra la mixomatosis, con el virus de fibroma de Shope naturalmente avirulento.

Vacunas Producidas por Atenuacin del Virus por Pases Seriados en Cultivos CelularesLa mayora de las vacunas de virus atenuados actualmente en uso fueron obtenidas empricamente por series de pases de virus de campo (calle) (sinom. Virus silvestre) en cultivos celulares. Las clulas pueden ser de origen homlogo o, ms comnmente heterlogo. Tpicamente, la adaptacin de un virus a un crecimiento vigorosa en un cultivo celular es acompaada por una progresiva prdida de la virulencia para el hospedero natural. La prdida de virulencia puede ser demostrada inicialmente en un modelo de laboratorio adecuado, antes de ser confirmada por ensayos clnicos en las especies de inters. Debido a requerimientos prcticos del virus vacunal no debe estar tan atenuado que falle en replicarse satisfactoriamente en el hospedador natural, algunas veces es necesario comprometerse con el uso de cepas virales que repliquen suficientemente bien y puedan producir signos clnicos leves en unos cuantos animales receptores (vacunados).

Durante los repetidos pases en cultivos celulares, los virus normalmente acumulan sustituciones de nucletidos en su genoma, los cuales entonces llevan a la atenuacin. Con el reciente advenimiento de cultivos de alto rendimiento, la secuenciacin del genoma, las bases genticas de la virulencia y la atenuacin han sido establecidas en muchos virus, lo que permite mejores predicciones para la eficacia y seguridad de la vacuna. Adems, es cada vez ms claro que varios genes pueden contribuir a la virulencia y tropismo de los virus, y esto se realiza de diferentes maneras. Por ejemplo, en contraste con los virus de campo o silvestres asociados con infecciones sistmicas severas, las cepas vacunales de virus atenuado de esos mismos virus aplicados por la va respiratoria pueden ser replicadas, solamente en el aparato respiratorio superior, o sufrir solo una limitada replicacin en el epitelio intestinal despus de la administracin oral.

A pesar del gran xito de las vacunas de virus atenuado por mtodos empricos, hay una fuerte necesidad sentida para reemplazar lo que algunos veterinarios e investigadores consideran que es una ruleta gentica con vacunas racional especficamente diseadas. En estas vacunas de virus atenuados bajo diseo, las mutaciones asociadas con la atenuacin del virus paterno son definidas y pronosticadas, as como tambin la potencial reversin a la virulencia.

Vacunas Producidas por Atenuacin Viral por Pases Seriados en Hospederos HeterlogosLa seriacin de pases en hospederos heterlogos fue un medio importante histricamente para la atenuacin emprica de los virus para su uso en vacunas. Por ejemplo, los virus de peste bovina y fiebre porcina clsica cada uno fue adaptado a crecer en conejos, y luego de muchos pases quedar suficientemente atenuado para ser empleado como vacuna. Otros virus fueron pasados en huevos embrionados de gallina de manera similar, aunque algunos de esos virus (pasados) adquirieron nuevas y muy indeseables propiedades. Por ejemplo, las vacunas atenuadas del virus de la lengua azul propagado en huevos embrionados pueden cruzar la placenta de los rumiantes vacunados durante la preez, provocando infeccin fetal y desarrollo de defectos o prdida. Similarmente, el virus de la peste equina africana propagado en huevos embrionados caus devastadoras consecuencias en humanos infectados por exposicin en aerosol al virus vacunal.

Vacunas Producidas por Atenuacin Viral por Seleccin de Mutantes Termosensibles y RearreglosLa observacin de que los mutantes termosensibles (virus que son incapaces de replicar satisfactoriamente en temperaturas mayores a la corporal) generalmente muestran una virulencia reducida lo que sugiri de que podran hacerse con ellos vacunas atenuadas satisfactoriamente, aunque algunos virus con mutaciones termosensibles han presentado una tendencia perturbadora a revertir a la virulencia durante la replicacin en los animales vacunados. La atencin se est dirigiendo hacia mutantes que se han desarrollado a temperaturas fras, derivadas de la adaptacin del virus de crecer a temperaturas subptimas. Lo racional es que tales virus mutados seran vacunas ms seguras para la administracin intranasal, porque se replicaran en las temperaturas bajas de la cavidad nasal (alrededor de 33 C en la mayora de los mamferos), pero no en temperaturas ms vulnerables del aparato respiratorio inferior o en los alveolos. Las vacunas de influenza termosensibles que contienen mutaciones en la mayora de los genes virales, no revierten a la virulencia, y las vacunas de influenza basadas en tales mutaciones estn siendo permitidas ahora para uso humano; las vacunas contra la influenza equina han sido desarrolladas utilizando el mismo principio.

Vacunas con Virus no ReplicantesVacunas Producidas con virus InactivadosLas vacunas con virus inactivados generalmente son producidas con virus virulentos; agentes qumicos o fsicos son usados para destruir su infectividad pero manteniendo su inmunogenicidad. Cuando se elaboran adecuadamente, tales vacunas son muy seguras, pero necesitan contener relativamente grandes cantidades de antgeno (virus) para obtener una buena respuesta de Abs como la que inducira con una dosis mucho ms pequea de la vacuna con virus atenuado. Normalmente, el primer esquema de vacunacin comprende dos o tres inyecciones y posteriormente ms dosis (refuerzo) pueden ser requeridas a intervalos regulares para mantener la inmunidad.

Las vacunas inactivadas generalmente deben preparadas con adyuvantes qumicos para aumentar la respuesta inmune, pero esto puede provocar reacciones adversas a la vacunacin. Los agentes inactivadores ms usados son formol, -propiolactona y etilenimina. Una de las ventajas de la b-propiolactona, la cual es usada en la manufactura de las vacunas de rabia, y la etilenimina, la cual es usada en la manufactura de las vacunas de fiebre aftosa, es que son completamente hidrolizadas a productos no txicos, en horas. Debido a que los viriones en el centro de agregados pueden ser protegidos de la inactivacin, es importante que los agregados sean rotos antes de inactivarlos. En el pasado, la falla en esto ocasionalmente provocaba brotes de enfermedad asociados a la vacunacinpor ejemplo, varios brotes de fiebre aftosa han sido rastreados en relacin a este problema.

Vacunas Producidas de Protenas Virales Nativas Naturales Los solventes de lpidos como el deoxicolato de sodio son empleados en caso de virus envueltos, para solubilizar al virion y liberar sus componentes, incluyendo las espculas de glicoprotena de la envoltura viral. La centrifugacin diferencial es empleada para semipurificar estas glicoprotenas, las cuales son luego preparadas para usarlas como vacunas fraccionadas. Ejemplos de estas vacunas con agentes como herpesvirus, influenzavirus y coronavirus.

Vacunas Producidas por ADN Recombinante y Tecnologas Relacionadas El relativo reciente advenimiento de la biologa molecular y sus tecnologas asociadas han facilitado el desarrollo de nuevas estrategias de vacunacin, cada una con inherentes ventajas potenciales y, en algunos casos, desventajas cuando se comparan con las de las vacunas tradicionales. Estas nuevas tecnologas han sido usadas para la creacin de nuevas vacunas que ya estn en uso y, teniendo substanciales ventajas potenciales, y se prev que la disponibilidad y tipos de tales productos solamente aumentarn en el futuro.

Vacunas producidas por Atenuacin Viral Mediante la Delecin (Supresin) de Genes o Mutagnesis Dirigida El problema de la reversin a la virulencia de las vacunas atenuadas (p. ej., una mutacin por la cual el virus vacunal recupera la virulencia) puede ser evita de mejor manera por la deliberada insercin de varias mutaciones atenuantes en genes virales clave, o por la delecin completa de genes no esenciales que contribuyan a la virulencia. La delecin de genes es especialmente factible con los virus de ADN grandes que portan muchos genes que no son esenciales para la replicacin, al menos para la replicacin en cultivos celulares. La ciruga gentica es usada para elaborar mutantes por delecin que son estables an despus de muchos pases. Varias vacunas de herpesvirus han sido construidas usando esta estrategia; incluyendo una delecin de timidina cinasa (TK) en la vacuna de pseudorabia (enfermedad de Aujeszky) para cerdos que tambin incluye una delecin de un gen de una glicoprotena (gE). La glicoprotena suprimida puede ser usada como antgeno de captura en una prueba inmuno absorbente de enzima ligada (ELISA), as que los cerdos vacunados, no infectados provocaran una prueba negativa, pudiendo ser distinguidos de los cerdos naturalmente infectados [la estrategia de diferenciacin/discriminacin de animales infectados de los vacunados (DIVA)], facilitando que los programas de erradicacin puedan ser llevados en paralelo con la vacunacin. Una vacuna marcadora carente del gen gE tambin est disponible para el virus de rinotraquetis infecciosa bovina (herpesvirus bovino-1).

La mutagnesis dirigida facilita la introduccin de sustituciones definidas de nucletidos en genes virales a voluntad. Conforme se han continuamente definiendo los genes particulares que influencian la virulencia y patogenicidad de virus individuales, se ha anticipado que existen vacunas de virus atenuados realizadas empricamente que sern reemplazadas por las que se han atenuado mediante ingeniera gentica mediante la alteracin de genes importantes al gusto del cliente. La produccin de vacunas de virus atenuados de clones moleculares facilita la deliberada introduccin de nucletidos que provocan atenuacin definida en los virus vacunales, y la consistente produccin vacunas de semillas virales genticamente definidas. Esta estrategia tambin potencialmente permite el uso de pruebas serolgicas diferenciales para distinguir a los animales infectados naturalmente de los vacunados (DIVA).

Vacunas de Subunidades Producidas por Expresin de Protenas Virales en Eucariotes (Levaduras, Mamferos e Insectos) Bacterias y Clulas Vegetales La expresin de protenas en vectores eucariotes ofrece el potencial de la produccin en gran escala de protenas virales que pueden ser purificadas fcilmente y elaborar vacunas. Una vez que ha sido identificada la protena importante para conferir proteccin, su gen [o en el caso de virus de ARN, un ADN complementario (cADN) de una copia del gen] puede ser clonada en una gran gama de plsmidos de expresin y producida en diversos sistemas celulares. Las clulas de mamferos ofrecen la ventaja sobre las clulas de eucariotes inferiores en que es ms probable que posean la maquinaria adecuada para el proceso correcto de post-traduccin y una autntica maduracin del complejo de protenas virales.

Entre los sistemas de expresin eucaritica ms empleados incluyen clulas de plantas y levaduras (Saccharomyces cerevisiae), clulas de insectos (Spodoptera frugiperda) y diversas clulas de mamferos. Las levaduras ofrecen la ventaja de que hay mucha experiencia en la produccin industrial a escala de ellas; la primera vacuna producida por expresin de un gen clonado, la vacuna de la hepatitis B humana, fue producida en levaduras. Las clulas de insectos ofrecen la ventaja de la simple tecnologa derivada de la industria de la seda: los cultivos celulares de mariposas (o gusanos) pueden ser preparados para expresar grandes cantidades de protenas virales mediante la infeccin con baculovirus recombinantes portando el gen (genes) del virus de inters. El promotor del gen que codifica para la protena polihedrina del baculovirus, es tan fuerte que el producto de un gen viral de inters insertado en el gen polihedrn del baculovirus puede incluir ms de la mitad de la protena que producen las clulas infectadas. Por ejemplo, la inmunizacin de cerdos con la protena del capside del circovirus porcino 2 expresado en clulas de insectos de un vector de baculovirus recombinante confiere inmunidad protectora contra las enfermedades asociadas al circovirus porcino como la enfermedad multisistmica desgastante. Similarmente, la protena E2 expresada en baculovirus solamente da una vacuna de subunidades recombinante efectiva contra la fiebre porcina clsica. La expresin de antgenos virales protectores en clulas de plantas puede tericamente proporcionar un mtodo eficiente y costo-efectivo (barato) de vacunar animales de produccin. Por ejemplo, han sido desarrolladas lneas celulares de plantas que expresan las protenas hemaglutinina y neuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle para una inmunizacin protectora de aves.

Vacunas Producidas por Expresin de Protenas Virales que se Autoensamblan en Partculas Parecidas a VirusLa expresin de genes que codifican para protenas de capside de virus de ciertas familias que son icosaedros, desnudos conducen al autoensamblaje de protenas de capside en partculas parecidas a virus (VLPs) que pueden usarse como una vacuna. Esta estrategia ha sido desarrollada para varios picornavirus, calicivirus, rotavirus y orbivirus, y una vacuna-VLP efectiva ha sido fabricada recientemente contra los papilomavirus genitales humanos. La ventaja de la VLP-recombinantes sobre las vacunas tradicionales inactivadas es que ellas estn desprovistas del cido nucleico viral, y por lo tanto son completamente seguras. Ellas equivalen a una vacuna inactivada de virus completo, pero sin el potencial dao de la prdida de la inmunogenicidad que es acompaada con la inactivacin qumica. Sin embargo, la limitacin potencial de la estrategia incluye los costos de produccin y los bajos rendimientos, as como la estabilidad del VLP despus de la produccin, y la inmunidad menos efectiva comparada a las vacunas existentes.

Vacunas que Usan Virus como Vectores para la Expresin de otros Antgenos Virales (Heterlogos)Las tcnicas de AND recombinante permite que genes extraos puedan ser introducidos a regiones especficas en el genoma de virus de ADN o ARN, y el producto del gen extrao es entonces portado y expresado en la clula blanco. Especficamente, el gen (genes) que codifican para antgenos protectores clave (antgenos importantes contra los cuales el hospedero genera inmunidad) de los virus que causan enfermedades de inters son insertados en el genoma de un virus avirulento (el vector recombinante, vacuna vectoreada). Este virus avirulento modificado es luego aplicado como un vector de virus atenuado o un vector no replicante de expresin (suicida). Las clulas infectadas en el hospedero inmunizado expresan la protena extraa, contra la cual entonces el animal montar una repuesta inmune adquirida (humoral y/o celular). El mtodo es seguro, porque solo uno o dos genes del virus causal son insertados en el vector de expresin, y porque solamente virus bien caracterizados pueden ser empleados como vectores de expresin (como los que existen en las vacunas atenuadas). Es ms, los animales inmunizados con esas vacunas recombinantes pueden ser distinguidos fcilmente de los animales infectados (o de los vacunados con virus modificados) usando pruebas serolgicas que detectan Abs a las protenas virales que no fueron incluidas en la vacuna fabricada (la as llamada estrategia DIVA).

Virus de ADN como VectoresGenes individuales que codifican para antgenos de una variedad de virus han sido incorporados el genoma de viriones de ADN, especialmente viruela bovina y otros poxvirus, adenovirus, herpesvirus y virus adeno-asociados (como los parvovirus).

La inmunizacin de animales con una gran cantidad de diferentes vacunas construidas con vectores recombinantes de poxvirus efectivamente ha generado respuestas inmunes mediadas por Abs y/o clulas que confieren fuerte inmunidad protectora en los animales receptores contra el reto con cepas virulentas de virus heterlogos de los cuales los genes fueron derivados. Por ejemplo, vacunas de rabia con vectores recombinantes de viruela bovina incorporada a cebos administrados oralmente para proteger zorros y mapaches contra esta enfermedad zoontica; esta vacuna contiene solamente el gen que codifica para la glicoprotena (G) del virus de la rabia. Similarmente, los poxvirus aviarios han sido usados cada vez ms como vectores de expresin de genes heterlogos en vacunas recombinantes. El virus de viruela aviar es una eleccin lgica como un vector para las vacunas de las aves pero, quiz sorprendentemente, los virus de viruela aviar tambin han sido muy tiles como vectores de expresin en mamferos: aunque este virus, y un pariente cercano el poxvirus de canarios, no completan su ciclo de replicacin en las clulas de mamferos, los genes insertados son expresados e inducen fuertes respuestas inmunes humorales y celulares en los animales inoculados. Debido a que los poxvirus tienen un gran genoma ah se pueden acomodar una docena de genes extraos y ser empacados satisfactoriamente en el virin, de esta manera, es tericamente posible construir, como un vector, a virus recombinante sencillo capaz de proteger contra diferentes enfermedades virales.

Las vacunas de vectores con poxvirus recombinantes han sido ampliamente usadas para inmunizar mamferos incluyen a la combinacin rabia-viruela bovina empleada para la inmunizacin de zorros en Europa y mapaches y coyotes en los Estados Unidos de Amrica, el virus de la viruela del canario ha servido como vector de los virus de influenza y de la encefalitis equina del oeste del Nilo en caballos, distemper en perros, hurones y ciertos animales de zoolgico/animales silvestres, y leucemia felina y rabia en gatos. Entre muchos otros, vacunas experimentales de vectores con el virus de la viruela del canario recombinante se han desarrollado exitosamente para prevenir la fiebre equina africana, lengua azul, encefalitis japonesa y Nipah, tambin se han realizado interesantes ensayos en humanos con una vacuna experimental con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Los poxvirus de mapache, cabra y otros poxvirus se han desarrollado como vectores de expresin recombinantes para uso potencial como vacunas de mamferos. Los conejos pueden ser efectivamente inmunizados contra mixomatosis (un poxvirus) y la enfermedad hemorrgica viral (calicivirus) con una vacuna atenuada con el virus de mixoma que expresa en gen VP60 del virus de la enfermedad hemorrgica del conejo. Esta estrategia de vacunacin combinada tiene la considerable ventaja de que el virus de la enfermedad hemorrgica del conejo no puede crecer en cultivos celulares, as que la vacunacin contra esta enfermedad solamente requiere la inactivacin del virus colectado de hgado de conejos infectados.

Una gran cantidad de vacunas de vectores con virus de ADN han sido desarrollados para su uso en avicultura, incluyendo vacunas de vectores con herpesvirus de pavo recombinante con el virus de Newcastle, virus de laringotraquetis infecciosa y virus de bursitis infecciosa (enfermedad de Gumboro); estas vacunas solamente incluyen genes que codifican para antgenos protectores de los virus heterlogos, de esa manera ellas generan inmunidad protectora en los pollos contra enfermedad de Marek y otra enfermedad (enfermedad de Newcastle, laringotraquetis infecciosa, bursitis infecciosa). Las vacunas de vectores con el virus de la viruela aviar y enfermedad de Newcastle y virus de influenza H5 tambin han sido desarrollado, y han sido ampliamente en Mxico y Amrica Central.

Virus quimricos de AND tambin se han usado como vacunas en los cuales los genes de un virus virulento son insertados en el soporte gentico de un virus relacionado pero avirulento. Por ejemplo, una vacuna de circovirus quimrico usada en cerdos incluye un soporte gentico de circovirus porcino 1, el cual es avirulento (no patognico) en cerdos, con el gen que codifica protenas de capside del circovirus 2 que si es patognico. Los anticuerpos contra las protenas de capside del circovirus porcino 2 confieren inmunidad a los cerdos vacunados. Debido a que el circovirus porcino 1, el virus quimrico replica con alto ttulo en cultivos celulares, es posible producir una vacuna ms eficiente y barata.

Se ha vaticinado que vacunas veterinarias disponibles comercialmente que utilizan vectores de expresin de virus con ADN sern aplicadas cada da ms, debido a sus ventajas inherentes en trminos de seguridad y eficacia, y la habilidad de que en los programas de control de enfermedades poder distinguir a los animales vacunados de los expuestos al virus infeccioso (DIVA).

Virus de ARN como Vectores As como con las vacunas de vectores de virus con ADN, los virus con ARN, especialmente las cepas virales que se3 han probado como seguras, tambin pueden usarse como soportes genticos, por la insercin de genes importantes inmunolgicamente de otros virus (heterlogos). Los virus quimricos de ARN utilizan la maqui8naria replicativa de un virus para la expresin de antgenos protectores de los virus heterlogos. Por ejemplo, se han elaborado vacunas en las cuales los genes codifican para protenas de envoltura de las cepas vacunales de virus atenuados tradicionales del virus de la fiebre amarilla, han sido reemplazados con los genes correspondientes de otros flavivirus como el de la encefalitis japonesa, virus del oeste del Nilo o del virus del dengue, o con genes que codifican para protenas muy inmunognicas de otros virus como el de la influenza. Una vacuna quimrica basada en el virus de la fiebre amarilla que incluye protenas de premembrana (preM) y envoltura (E)del virus del oeste del Nilo, fue empleado para inmunizacin de equinos.

Los virus de ARN de polaridad positiva son especialmente convenientes para su uso como clones moleculares para la insercin de genes extraos porque el genoma de esos virus es por s mismo infeccioso. No obstante, los clones infecciosos tambin se han elaborado a partir de virus de ARN con polaridad negativa, con la inclusin de protenas de replicasa en la transfeccin. En avicultura, una vacuna de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante que expresa el gen H5 del virus de influenza se ha desarrollado y usado ampliamente en China para la inmunizacin de las aves contra la enfermedad de Newcastle e influenza aviar H5. Otros virus de ARN de polaridad negativa como los rhabdovirus tambin han sido evaluados como potenciales vectores de genes, junto con virus de ARN de polaridad positiva como los Nidovirus (coronavirus, arterivirus).

Las partculas de replicn recombinante ofrecen una estrategia similar pero algo diferente de la que se ha desarrollado para ciertos virus de ARN, incluyendo flavivirus y alfavirus como encefalitis equina venezolana, Semliki Forest y Sindbis. Las partculas de replicn recombinante de los alfavirus son creadas exclusivamente de protenas naturales de alfavirus donadores, pero el genoma de ARN contenido en estas partculas es quimrico, esto es que los genes que codifican para las protenas estructurales del replicn de alfavirus son reemplazadas por algunas de virus heterlogos. Como un ejemplo, partculas de replicn derivadas de la cepa vacunal de virus de la encefalitis equina venezolana que co-expresan las protenas de envoltura GP5 y M del virus de la arteritis equina, inducen Abs neutralizantes y protectores en los equinos inmunizados; ni el virus de la encefalitis equina venezolana, ni el virus de la arteritis equina son producidos en los equinos inmunizados, porque el genoma del replicn incluye solamente genes de protenas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana y genes de protenas estructurales del virus de la arteritis equina.

Para los virus de influenza y otros con genomas segmentados, el prin