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DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOLS IN
HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 :HAEMATOLOGICAL MALIGNANCIES IN 2010 : New New
Tools: SNP arrays,Tools: SNP arrays, mutations, Expression profiles mutations, Expression profiles
S. D. RaynaudS. D. RaynaudDépartement d’Hématologie BiologiqueDépartement d’Hématologie Biologique
CHU de NiceCHU de Nice
2
Trois décennies de recherche en onco-hématologie
GénétiqueGénétique MoléculaireMoléculaire
Protéomique / NGS /Protéomique / NGS / Génomique Génomique
FonctionnelleFonctionnelle
CytogénétiqueCytogénétique
GénomiqueGénomiquetranscriptomiquetranscriptomique
1980 1990 2000 2010
Bases moléculaires des hémopathies=> Amélioration de la prise en charge des patients
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Délétion: caryotype
Régions communes de délétion, double minutes, homogenous staining regions, caractérisation des gènes partenaires de translocations.
Del 16q Normal
Cytogénétique
Délétions, amplifications, double minutes, caractérisation des partenaires d’une translocation.
FISH
Délétion p53
Délétion
Southern blot : délétions et
amplifications
Techniques classiques de détection des déséquilibres Techniques classiques de détection des déséquilibres chromosomiques et géniqueschromosomiques et géniques
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Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des Comparaison des méthodes actuelles de caractérisation des déséquilibres chromosomiquesdéséquilibres chromosomiques
Méthode
Résolution(Sensibilité en % cell
anormales)
Détection des UPD
NécessiteCellules en
division
Distinction entre clones
individuels
Caryotype sur métaphases
Faible (10 à 15%)
Non Oui Oui
FISH Faible (élevée)
Non Non Oui
CGH arrays Elevée (20-30%)
Non Non Non
SNP arrays Très Elevée (20-
30%)
Oui Non Non
FISH: Fluorescent in situ Hybridization CGH: Comparative Genomic HybridizationSNP: Single Nucleotide Polymorphism UPD: Uniparental Disomy
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• Support solide (verre, plastique, métal, silicone)
• Chip = cible miniaturisée composée de clones ADNs (BAC, PAC, P1s, oligonucleotides)
• Taille des clones variable (oligomères à 200 kb
• Nombre de clones par array: < 300 à > 250 k
• Basée sur principe biochimique de l’hybridation complémentaire ADN/ADN
• ADNs test et référence sont marqués par fluorescence : Cy3 (tumeur) / Cy5 (référence)
• Hybridation compétitive des ADNs test et référence sur les séquences cibles
Nouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPENouveaux outils de détection : CGH sur microarray. LE PRINCIPE
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• ADN (0.1 g à 5 g) marqué par random priming avec incorporation de colorants fluorescents (Cy3 & Cy5)
• Dénaturation d’ADN Cot-1 et de l’ADN marqué• Pré-hybridation• ADNs marqués appliqués sur la lame• Hybridation (conditions variables)• Lavages• Puces scannées, puis étapes de quantification du signal,
normalisation, et exploitation des données grâce à des logiciels dédiés
• Plateformes spécifiques (four à hybridation, station de lavage, scanner, logiciels informatiques dédiés)
CGH sur microarray : LA TECHNIQUECGH sur microarray : LA TECHNIQUE
7
Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysNouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysDétection des gains et pertes de matériel génétiqueDétection des gains et pertes de matériel génétique
Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300
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Nouveaux outils en cytogénétique : Nouveaux outils en cytogénétique : CGH arraysCGH arrays
Plateforme Abbott (Genosensor), Microarray 300
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Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14.2-3Détection anomalies cryptiques: LLC stade A avec Del 13q14.2-3
D13S319 / D13S25 D13S319 / D13S25 (Microarray 300 Abbott)(Microarray 300 Abbott)
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LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32Del 1p36 / Del 11p13 / Del14q32
11
LLC stade A avec Del 13q14.2-3 Délétions multiplesDélétions multiples / / Ampli 9q11.2Ampli 9q11.2
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Délétion:
LOH marqueur microsatellite
Etude des LOH par analyse des MicrosatellitesEtude des LOH par analyse des Microsatellites
Paradigme de la progression tumorale: Mutation d’un allèle, perte de l’allèle normal et duplication de l’allèle anormal.
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Single nucleotide polymorphism (SNP)
TGCAT GCATGCA : Allele A
TGCAA GCATGCA : Allele B
CHIP ADN
Sonde SNP Oligonucléotide
Analyse des cancers humains par SNP-CHIP
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Data analysis of SNP-CHIP
Heterozygosity (A/B)
Allele A Allele B
Hybridized
signal
Matched Normal
Hybridized
signal
Tumor
Allele B is missing in Tumor Gene dosage reduction Gene dosage reduction
Homozygosity (A/A)
Allele specific gene dosage Total gene dosage Allele A Allele B
Matched Normal
Tumor
Allele specific Total gene dosage
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A gauche, technique utilisée par Affymetrix SNP-A; à droite, bead array plateforme utilisée par Illumina (San Diego, CA), incluant les variants 1 et 2 couleurs utilisés par les arrays Infinium I et II X (Illumina).
Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112:965-974
Analyse bioinformatique:•Mesure les pertes d’hétérozygotie par génotypage (fréquence des calls hétérozygotes) et détermination de l’intensité des signaux d’hybridation. Traitement des données via différents logiciels. Ex. CNAG qui combine l’analyse des CNV et des LOH•Résultats à évaluer en tenant compte de la variabilité normale du génome:•12% du génome contient 1500 régions variables (CNV) type duplications et délétions•taille moyenne de chaque CNV 20Mb•Des centaines de gènes sont en CNV Détection des CNA et UPD
Principes de base des techniques de SNPs appliquées au caryotypage moléculaire (allelo-karyotyping)
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Chromosome 9
Dosage génique
Héterozygotie
Dosage génique spécifique d’allèle
LOH
Délétion homozygote
Délétion hétérozygote
Réduction du Dosage Génique
Barres roses : LOH détectées dans tumeurs
Un allèle est absent, l’autre allèle est intact
420
210
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Chromosome 9 (UPD) Chromosome 10 (Normal)
Dosage génique
Hétérozygotie
Dosage génique spécifique d’allèle
Dosage génique normal
LOH: Loss of Heterozygosity
Un allèle délété (Vert)Un allèle amplifié (Rouge): Uniparental disomie (UPD)
420
420
210
210
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Entraînent LOH sans anomalie du dosage génique.Ce phénomène concerne des fragments de chromosomes ou des
chromosomes entiers. Dispersés sur tout le génome.Conséquences potentielles en oncologie: duplication d’un gène muté,
homozygotie d’un allèle de susceptibilité, duplication d’un gène avec profil
de méthylation atypique, haploinsuffisance...
Attention:Ne pas confondre avec faux LOH ou LOH reliquat d’une étape précoce
de l’embryogénèseLOH détectés chez 8% à 10% individus contrôlesTous sont interstitiels et ont une taille moyenne de 8,7Mb (Maciejewski et
al, Blood 2008)Toute lésion interstitielle <24.8Mb (95% CI) est exclue ou doit être
confirmée par étude du tissu sain du patient (Maciejewski et al, Blood 2008).
Identification de UPD somatiquesIdentification de UPD somatiques
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ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR L’IDENTIFICATION D’UNE ALGORITHME DIAGNOSTIQUE POUR L’IDENTIFICATION D’UNE ANOMALIE CHROMOSOMIQUE D’ORIGINE SOMATIQUEANOMALIE CHROMOSOMIQUE D’ORIGINE SOMATIQUE
Exclure une CNV par :Exclure une CNV par : la taille de l’anomaliela taille de l’anomaliesa localisationsa localisationle % de recouvrement avec une CNV connuele % de recouvrement avec une CNV connue
SNP-aSNP-a
Confirmé par MC ou FISHConfirmé par MC ou FISH Ne pas pousser plus loin l’investigation
Détection d’une lésionDétection d’une lésion
Micro délétionMicroduplication
UPDUPD
télomérique
Interstitiel ≥ 25Mb
Interstitiel ≤ 25Mb
Interroger CNV database
CNV connu Pas de CNV
Germline Probablement somatique
Somatique
Somatique
Probablement non somatique
Confirmer sur CD3+Confirmer sur CD3+
D’après Maciejewski, Patras 2009D’après Maciejewski, Patras 2009
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Place des SNP- et CGH-arrays dans l’analyse des SMD/AML
Objectifs principaux :
•Démembrement des anomalies cryptiques
•Impact sur le pronostic (révision potentielle des scores pronostiques)
•Corrélation avec réponse aux nouvelles molécules thérapeutiques
Quelques cibles des investigations pangénomiques :
•SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array-SMD/AML avec caryotype normal : SNP array, oligonucleotide array-
CGHCGH
•SMD avec del(5q)SMD avec del(5q)
•SMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevéSMD de faible risque, progression risque intermédiaire / élevé
•Formes frontières SMD/SMPFormes frontières SMD/SMP
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Cohorte de 175 patientsFig. 5 Type, frequency, and number of lesions detected by MC and SNP-A. (A) The frequency of chromosomal aberrations and noninformative results as detected by both MC and SNP-A. The insert in the SNP-A pie chart shows the portion of acquired UPD, either as the sole change or in addition to other abnormalities. (B) The percentage of patients with 0, 1, 2-3, and more than 3 lesions, respectively, as detected by MC (■) and SNP-A (□). Pie charts demonstrate distribution of low versus advanced stage of MDS within noninformative and normal karyotypes detected by MC and SNP-A.
Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS,
MDS/MPD, and MDS-derived AML. Gondek LP et al., Blood. 2008 Feb
1;111(3):1534-42.
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Impact sur la survie du SNP-A caryotypage(Maciejewski, Patras 2009)
Grouping by lesions SurvivalLow risk – No additional SNP lesions NR
Low risk – with additional SNP lesions 157 months
Advanced risk – No additional SNP lesions 21 months
Advanced risk – with additional SNP lesions 9 months
1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS1 - Post-SNP-A analysis risk stratification according to IPSS
2 - Survival outcome for new recurrent lesions2 - Survival outcome for new recurrent lesions
Anomalies des Chromosomes 7, 11, 17 et 6, détectées par SNPs: valeurs de p très significatives (Log rank p=<0.0001)
26
UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes
Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357
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UPD somatiques indicateurs de mutations homozygotes
Région de UPD Gène Maladie
UPD9q JAK2 MPD
UPD13q FLT3-ITD AML
UPD17q NF-1 JMML
UPD17p TP53 sAML
UPD21q RUNX1 AML
UPD19q CEBP AML
UPD4q TET2 MDS, AML, MPD
UPD1p C-MPL MDS/MPD, MPD
UPD11p WT1 AML
UPD11q C-CBL CMML, sAML
Ces régions de UPD sont aussi celles de mutations mono/bialléliques connues de nombreux gènes (JAK2, FLT3, c6MPL W515L, NRAS, p53, RUNX1…)
Profil Génomique des LMMC :43% UPD 4q24 (TET2)37% UPD 11p (WT)12% UPD 11q23.3 (CBL)8% UPD 1p13.2 (NRAS)
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Copyright ©2009 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Grimwade, D. et al. Hematology 2009;2009:385-395
Frequency of prognostically relevant molecular and cytogenetic subgroups of AML arising in younger adults
29
Copyright ©2010 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Dohner, H. et al. Blood 2010;115:453-474
Figure 1 Pie chart illustrating the molecular heterogeneity of cytogenetically normal AML based on mutations in the NPM1, CEBPA, MLL, FLT3 (ITD and TKD mutations at codons
D835 and I836), NRAS, and WT1 genes
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Depuis 2005 de nouvelles méthodes de séquençage massifnouvelles méthodes de séquençage massif ayant en commun le clonageclonage et l'amplification moléculaireamplification moléculaire ont été développées. Ces méthodes permettent d’amplifier spécifiquement un fragment d’ADN isolé soit dans des microgouttes d’huiles (GS-FLX, Roche) soit par fixation sur lame (Solexa). Les étapes de clonage bactérien particulièrement longues sont ainsi évitées. Trois Trois méthodesméthodes utilisent actuellement ce nouveau système :
1. le GS FlexGS Flex basé sur l'amplification de l'ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et le pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate)
2. le SolexaSolexa basé sur l'amplification, l’accrochage-liaison sur puce et l'utilisation de terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes,
3. le SOLIDSOLID basé sur l'amplification par émulsion et l'hybridation-ligature chimique.
Ces méthodes offrent de nouvelles perspectivesnouvelles perspectives dans de nombreux domaines tels que la génomique médicale (impact majeur dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques).
Ley et al.,Ley et al., Nature, 2008Nature, 2008 : Séquençage du génome entier d’un patient LAM Séquençage du génome entier d’un patient LAM (Illumina/Solexa)(Illumina/Solexa)
Cependant, ces avancées posent de nouveaux problèmes dans la compilation, nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultatsl'étude et la fiabilité des résultats.
Next Generation Sequencing (NGS)Next Generation Sequencing (NGS)
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IRON: The IRON: The IInterlaboratory nterlaboratory RORObustness of bustness of NNGS GS StudyStudy
Aims:Aims:
• To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep-To establish 454 technology as a robust methodology to perform deep-
sequencing analysis of hematological tumorssequencing analysis of hematological tumors
• To evaluate 454 technology in terms of interlaboratory precision and accuracyinterlaboratory precision and accuracy
• Testing of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratoriesTesting of patients, centrally collected and shipped to 10 laboratories
• Sample processing including MIDs using the MLL-designed Assay-on-demand
plates (96-well) and Titanium Amplicon chemistry
• Establish a “454 Hematology Focus” group
• Publish consensus guidelines on QC and assay robustnessPublish consensus guidelines on QC and assay robustness
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IRON Study: Participants and laboratories
Austria
GB
Belgium
Germany
Germany
Italy
Austria
USA
SpainNether-lands
Italy
Dr. Gabriel, Blood Bank, Linz
Dr. Garicochea, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre
Dr. Simen, 454 Life Sciences, Branford
Prof. Vandenberghe, UZ Leuven, Belgium
Prof. Martinelli, University of Bologna
Dr. JH Jansen, Radboud University Medical Centre, Nijmegen
Switzer-land
Brazil Italy
Prof. Haferlach, Münchner Leukämie Labor, München
Dr. Timmermann, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin
Dr. te Kronnie, Università degli studi di Padova, Padova
Prof. Young, St. Bartholomews, London
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Classification morphologique des hémopathies(FAB, WHO, WF)
Classification cytogénétique des hémopathies(LAL, LAM, LNH)
Classification moléculaire des hémopathies(LAL, LAM, DLBCL)
TranscriptomiqueTranscriptomique
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Classification moléculaire des LymphomesClassification moléculaire des Lymphomes
Alizadeh et al., Nature 2000;403:503
DLBCL de l’adultepuce cDNA
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Classification moléculaire des LymphomesClassification moléculaire des Lymphomes
Wright et al., PNAS 2003;100:9991.
274 DLBCLpuce cDNA
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- Clustering à partir des 40 top gènesidentifiant chaque catégorie.- Pas d’identification des ss-classes B.- 20% des LAL restent inclassables.- 70% des gènes identifiant les HD sontsur l’X ou le 21 (indépdt de +X ou non).- 4 cas classés dans TEL-AML1, sans t(12;21) Tous anormaux pour TEL.
Yeoh et al., Cancer Cell 2002;1:133.
360 LAL pédiatriquespuce Affymetrix
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Comparaison LAL / LAM
38Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41Armstrong et al., Nat Genet 2002;30:41.
Nouvelles cibles thérapeutiquesNouvelles cibles thérapeutiques
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COST:European COST:European COCOoperation in the field of operation in the field of SScientific and cientific and TTechnical researchechnical research
Kick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ansKick-off meeting : Novembre 2008 / Durée 4 ans
40
Chair: K. MillsChair: K. Mills
Chair: L. Bullinger
Chair: S. Raynaud
Chair: S. Lehman
Chair: RA Padua
Chair: M. Dugas
17 pays européens17 pays européens