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1 INTRODUÇÃO
Atualmente, a obesidade pode ser classificada como uma pandemia
(NISWENDER, BASKIN & SCHWARTZ, 2004). A Organização Mundial de Saúde estima
que haja no mundo mais de 1 bilhão de adultos com sobrepeso [índice de massa
corporal – IMC (kg/m2) > 27], dos quais 300 milhões são obesos (IMC > 30) (WHO,
2003). A obesidade deixou de ser uma doença presente apenas em países
desenvolvidos. Alguns países de baixa renda possuem níveis de obesidade iguais ou
maiores que aqueles encontrados nos Estados Unidos e em outros países
desenvolvidos (OPAS, 2003). No caso do Brasil, mudanças demográficas, sócio-
econômicas e epidemiológicas ao longo do tempo permitiram que ocorresse a
denominada transição dos padrões nutricionais, com a diminuição progressiva da
desnutrição e o aumento da obesidade (MONTEIRO, MONDINI, SOUZA & POPKIN,
1995).
A obesidade está associada a inúmeras co-morbidades tais como diabete
mellitus, dislipidemias, doenças cardiovasculares e algumas formas de câncer,
representando, portanto, um grande problema à saúde (ALLISON & SAUNDERS, 2000;
OPAS, 2003).
Muitos estudos têm sido realizados a fim de identificar os principais fatores
que contribuem para o desenvolvimento da obesidade. A obesidade não é uma
desordem singular, e sim um grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas. Os
principais fatores ambientais relacionados ao aumento da obesidade no Ocidente têm
sido o moderno suprimento de alimentos e a disponibilidade de alimentos altamente
gordurosos para o consumo dentro e fora de casa (WHO, 1998), aliados às mudanças
nos padrões de atividade física no trabalho e lazer (POPKIN & DOAK, 1998). Os fatores
genéticos são ainda pouco definidos. No entanto, embora o excesso de ingestão
energética e/ou a redução do gasto energético proveniente da atividade física sejam
responsáveis pelo aumento da prevalência da obesidade, fatores genéticos parecem ser
determinantes à sua susceptibilidade. Deste modo, alguns autores enfatizam que a
prevalência da obesidade pode ser atribuída aos fatores ambientais que, interagindo
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com fatores genéticos, poderia explicar o acúmulo de gordura corporal em grandes
proporções na população mundial (HILL, MELANSON & WYATT, 2000).
Por muitos anos, cientistas vêm procurando um possível mensageiro que
sinalizaria ao cérebro e a outros tecidos o estado das reservas energéticas do corpo.
KENNEDY (1953) foi o primeiro a propor a teoria lipostática da regulação do peso
corporal. Segundo esta teoria, quando a massa adiposa se expande, a concentração
circulante da molécula sinal pode aumentar e atuar nos circuitos neurais do cérebro,
controlando o consumo e balanço de energia. Por isso, a identificação do gene ob pelo
grupo de Friedman em 1994 foi extremamente inovadora (FRIEDMAN & HALLAS, 1998)
e muito significativa na medida em que forneceu evidências de que o fator “lipostático”
postulado por KENNEDY (1953) havia sido identificado, provocando grande repercussão
nas pesquisas sobre balanço energético.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Leptina
Um dos produtos do gene ob é a leptina, conhecida como o “hormônio da
saciedade”. A leptina é um peptídeo constituído por 146 aminoácidos, codificado pelo
gene ob (ZHANG, PROENÇA, MAFFEL, BARONE, LEOPOLD & FRIEDMAN, 1994), que
circula como um monômero de 16 kilodaltons. É expressa e secretada de forma pulsátil
pelo tecido adiposo branco e pela placenta (FRIEDMAN & HALLAS, 1998). Circula na
forma livre ou ligada a uma proteína (ZHANG et al., 1994), até o momento em que se
liga ao seu receptor de superfície celular, ou é excretada pelos rins.
A leptina age através de receptores expressos central e perifericamente.
Seus receptores são encontrados em muitos tecidos, incluindo o hipotálamo, plexo
coróide, células β do pâncreas, tecido adiposo, fígado, rins, jejuno, pulmão, medula
adrenal, ovários, testículos, placenta, coração e músculo esquelético (HICKEY &
CALSBEEK, 2001; HOUSEKNECHT, BAILE, MATTERI & SPURLOCK, 1998). Existem
pelo menos seis isosformas de receptores (OBRa, OBRb, OBRc, OBRd e OBRe e
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OBRf) (ZHANG, CHEN, HEIMAN & DIMARCHI, 2005), que podem ser divididos em três
classes: longos, curtos e solúveis (KOERNER, KRATZSCH & KIESS, 2005). Os
receptores OBRa, OBRb, OBRc e OBRd e OBRf contêm uma única região
transmembrana, enquanto o OBRe é truncado próximo a essa região. Este receptor
funciona como proteína solúvel circulante ligada à leptina, sendo o principal componente
ligante da leptina no plasma (LAMMERT, KIESS, BOTTNER, GLASGOW & KRATZSCH,
2001). Potencialmente o OBRe modula as concentrações estáveis (steady-state) de
leptina ao se ligar a ela e impedir sua degradação e clearance (KOERNER, KRATZSCH
& KIESS, 2005). Desta forma, o OBRe aumenta a leptina disponível na circulação,
regulando as concentrações de leptina ativa no plasma (ZHANG et al., 2005).
Somente o receptor OBRb (forma longa) contém domínio intracelular que é
capaz de realizar a transdução total do sinal de ligação da leptina para dentro da célula
(NEGRÃO & LICINIO, 2000; ZHANG et al., 2005). A forma longa do receptor (OBRb) é
prevalente no hipotálamo, sendo então, provavelmente, a responsável pelas ações
centrais da leptina (MEIER & GRESSNER, 2004; TARTAGLIA, DEMBSKI, WENG,
DENG, CULPEPPER, DEVOS, RICHARDS, CAMPFIELD, CLARK, DEEDS, MUIR,
SANKER, MORIARTY, MOORE, SMUTKO, MAYS, WOOLF, MONROE & TEPPER,
1995). Além disso, no hipotálamo, picos de concentração de OBRb são observados em
áreas relacionadas com o controle de ingestão alimentar e gasto energético
(FUNAHASHI, YADA, SUZUKI & SHIODA, 2003), como o núcleo arqueado,
paraventricular, dorsomedial e ventromedial (ZHANG et al., 2005), tendo papel
fundamental na homeostase energética. Desta forma, o cérebro parece ser o alvo
primário para a ação anorexígena da leptina (CONSIDINE, SINHA, HEIMAN,
KRIAUCIUNAS, STEPHENS, NYCE, OHANNESIAN, MARCO, MCKEE, BAUER &
CARO, 1996; HALLAS, GAJIWALA, MAFFEI, COHEN, CHAIT, RABINOWITZ,
LALLONE, BURLEY & FRIEDMAN, 1995; HOUMARD, COX, MACLEAN & BARAKAT,
2000). Já as formas curtas (OBRa, OBRc e OBRd) são encontradas na maioria dos
outros tecidos. Diferentemente dos receptores de forma longa, ainda não é claro o quão
eficientemente e de que modo as formas curtas sinalizam (TARTAGLIA et al., 1995).
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Sua função ainda não é bem delimitada, mas foi sugerido que os receptores de forma
curta atuem no clearance da leptina, na facilitação do seu transporte para os
compartimentos centrais (ZHANG et al., 2005) e permitindo a passagem de leptina do
soro através da barreira sangue-cérebro (HOSSNER, 1998; MUNZBERG,
BJORNHOLM, BATES & MYERS JUNIOR, 2005; ZHANG et al., 2005).
Uma das funções mais evidentes da leptina é ser um sinal aferente para o
sistema nervoso central (SNC), atuando dentro de um feedback negativo, ao inibir a
expressão do gene da leptina (HOUSEKNECHT et al., 1998), consequentemente,
regulando a massa de tecido adiposo (NEGRÃO & LICINIO, 2000), peso corporal e
apetite (KOERNER, KRATZSCH & KIESS, 2005).
Muitos efeitos da leptina no controle do consumo alimentar e no gasto
energético são mediados no sistema nervoso central, mais precisamente nas regiões
hipotalâmicas, em áreas associadas com a regulação do peso corporal. A leptina tem
sua ação nos neurônios produtores de neuropeptídeos e neurotransmissores orexígenos
e anorexígenos (NEGRÃO & LICINIO, 2000). Tais mecanismos serão descritos mais
adiante.
Uma vez que receptores de leptina são também encontrados em diversos
órgãos e tecidos do corpo, há evidências de que a leptina aja em tecidos periféricos.
Tais evidências sugerem que a leptina pode regular a homeostase energética através de
ações periféricas diretas no metabolismo lipídico (ZHANG et al., 2005). Segundo
MINOKOSHI, KIM, PERONI, FRYER, MULLER, CARLING e KAHN (2002), a leptina
aumenta a oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético através da ativação da
AMPK (proteína quinase ativada pelo AMP). A AMPK é uma indicadora intracelular de
energia e tem papel importante na regulação da oxidação de ácidos graxos (AG). A
AMPK é ativada quando a razão celular de AMP:ATP aumenta após diminuição dos
níveis de ATP. Uma vez ativada, a AMPK inicia processos de geração de ATP (ex.:
oxidação de AG) e inibe processos de gasto de ATP (ex.: síntese de AG) (ZHANG et al.,
2005). Isso facilita a capacidade da célula de restabelecer a homeostase energética. A
fosforilação e ativação da AMPK estimuladas pela leptina no músculo esquelético
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podem ocorrer diretamente, mas também indiretamente, através do sistema nervoso
simpático (MINOKOSHI et al., 2002). A leptina, também através da ativação da AMPK,
parece ainda promover o aumento da depleção de triacilgliceróis (TAG) (YILDIZ &
HAZNEDAROGLU, 2006) e estimular a lipólise no músculo esquelético (DYCK,
HEIGENHAUSER & BRUCE, 2006) e tecido adiposo branco (JEQUIER & TAPPY,
1999). Desta forma, a AMPK parece ser a mediadora dos efeitos da leptina no
metabolismo de ácidos graxos no músculo. Estes dados sugerem que a leptina estimula
a oxidação de substratos, promovendo a utilização destes, ao invés de seu
armazenamento (YILDIZ & HAZNEDAROGLU, 2006).
Existe alta correlação entre a expressão e as concentrações plasmáticas
de leptina e a massa de tecido adiposo (CONSIDINE et al., 1996; FRIEDMAN,
FERRARA, AULAK, HATZOGLOU, MELUNE, PARK & SNERMAN, 1997; HALLAS et
al., 1995; KOERNER, KRATZCH & KIESS, 2005; NEGRÃO & LICINIO, 2000;
RACETTE, COPPACK, LANDT & KLEIN, 1997; ROSENBAUM, NICOLSON, HIRSCH,
MURPHY, CHU & LEIBEL, 1997; SPEAKMAN, STUBBS & MERCER, 2002; WADDEN,
CONSIDINE, FOSTER, ANDERSON, SARWER & CARO, 1998) e porcentagem de
gordura corporal (OSTLUND, YANG, KLEIN & GINGERICH, 1996; PERUSSE,
COLLIER, GAGNON, LEON, RAO, SKINNER, WILMORE, NADEAU, ZIMMET &
BOUCHARD, 1997). Desta forma, quanto maior a quantidade de tecido adiposo, mais
leptina é produzida e liberada na circulação (CONSIDINE et al., 1996). Contudo,
diversos mecanismos fisiológicos influenciam a expressão e síntese de leptina,
alterando essa correlação. Jejum, glicocorticóides, atividade simpática, insulina,
exercício físico e alterações no peso corporal e no balanço energético podem alterar
drasticamente as quantidades de leptina intrinsecamente associadas com a massa de
gordura (NEGRÃO & LICINIO, 2000).
ROSENBAUM et al. (1997), CONSIDINE et al. (1996) e OSTLUND et al.
(1996) relataram que a perda ou ganho de peso corporal parecem provocar,
respectivamente, a diminuição e o aumento das concentrações de leptina. A redução em
10% de peso corporal em humanos obesos resultou na redução de 53% da leptina
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sérica (CONSIDINE et al., 1996), e 10% de aumento do peso corporal causaram o
aumento de 300% (KOLACZYNSKI, OHANNESIAN, CONSIDINE, MARCO & CARO,
1996).
Quando o balanço energético está em equilíbrio, a expressão e a secreção
de leptina refletem a massa de tecido adiposo em humanos e ratos (AHIMA & FLIER,
2000; HOUSEKNECHT et al., 1998). A privação de alimentos (12 a 48 h) resulta na
queda expressiva da expressão da leptina (CUSIN, ROHNER-JEANRENAUD,
STRICKER-KRONGRAD & JEANRENAUD, 1996; WADDEN et al., 1998). Alterações
mais sutis no balanço energético também produzem efeitos profundos nessa expressão.
Assim, a leptina não funciona apenas como um “adipostato”, sinalizando ao cérebro
sobre a situação dos depósitos de energia do corpo, mas também como um sensor do
balanço energético (HOUSEKNECHT et al., 1998; NEGRÃO & LICINIO, 2000).
Os depósitos regionais de gordura também parecem contribuir para o
mecanismo de regulação da leptina. Diferenças na expressão de leptina pelos diferentes
depósitos foram observadas em adipócitos de humanos e ratos (HUBE, LIETZ, IGEL,
JENSEN, TORNQVIST, JOOST & HAUNER, 1996; LI, MATHENY, NICOLSON, TUMER
& SCARPACE, 1997; OGAWA, MASUZAKI, ISSE, OKAZAKI, MORI, SHIGEMOTO,
SATOH, TAMURA, HOSODA, YOSHIMASA, JINGAMI, KAWADA, & NAKAO, 1995;
RUSSEL, PETERSEN, RAO, RICCI, PRASAD, ZHANG, BROLIN & FRIED, 1998;
ZHANG, GUO, DIAZ, HEO & LEIBEL, 2002; ZHENG, JONES, STEPHEN & DOHM,
1996). Em ratos, a expressão de leptina parece ser maior no tecido adiposo visceral
(TAV) do que no tecido adiposo subcutâneo (TAS) (LI et al., 1997; OGAWA et al., 1995;
ZHANG et al., 2002; ZHENG et al., 1996). Já em humanos, a expressão e secreção de
leptina são maiores no TAS do que no TAV (HUBE et al., 1996; RUSSEL et al., 1998).
Possivelmente isso ocorre em função do tamanho menor dos adipócitos do TAV em
humanos (BENOIT, CLEGG, SEELEY & WOODS, 2004, HUBE et al., 1996). No
entanto, o jejum provoca redução da expressão do mRNA da leptina sem que haja
alteração do tamanho dos adipócitos em ratos e humanos, sugerindo que o balanço
energético também influencia a expressão da leptina (ZHANG et al., 2002).
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Segundo RAYNER e TRAYHURN (2001), o SNS é um importante
regulador da produção de leptina e a leptina, por sua vez, media algumas de suas ações
através do SNS. A ativação simpática inibe a expressão de leptina e sua secreção no
tecido adiposo. RAYNER (2001) sugere ainda que o SNS tenha ação inibitória tônica na
síntese da leptina, a qual pode ser pulsátil. Desta forma, uma vez que a leptina age
aumentando a atividade do SNS e o SNS age inibindo sua expressão e secreção,
sugere-se que haja um mecanismo de feedback negativo entre o SNS e a síntese e
secreção de leptina pelo tecido adiposo (MARK, RAHMOUNI, CORREIA & HAYNES,
2003).
Assim como outros hormônios, a leptina plasmática exibe um ciclo
cicardiano, tendo suas concentrações variadas ao longo do ciclo, e picos de
concentração próximos à meia-noite em humanos e ratos (FRIEDMAN & HALLAS,
1998). A secreção e dinâmica pulsáteis da insulina e da leptina mostram alta
sincronicidade. Além disso, análises de correlação indicam relação temporal, na qual
alterações nas concentrações de leptina seguem alterações nas concentrações de
insulina, sugerindo que haja influência da insulina no controle da dinâmica de secreção
da leptina (YILDIZ & HAZNEDAROGLU, 2006).
2.2 Leptina e insulina
Embora a leptina seja o protótipo do “sinalizador da adiposidade corporal”,
a insulina pode ser considerada como o segundo sinalizador de adiposidade, a qual se
deu relativamente menos importância na literatura (NISWENDER, BASKIN &
SCHWARTZ, 2004).
A insulina é sintetizada nas ilhotas de langerhans, células do pâncreas
endócrino. Seus efeitos periféricos anabólicos já são muito bem estabelecidos na
literatura. Segundo PEREIRA e LANCHA JUNIOR (2004), o efeito fisiológico mais
importante da insulina é a estimulação do transporte de glicose em diversos tecidos.
Além disso, a insulina promove síntese de glicogênio, triglicérides, aumento do consumo
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de aminoácidos pelas células, enquanto inibe a lipólise (MCARDLE, KATCH & KATCH,
1996).
No entanto, fortes evidências sugerem que a insulina seja também um
hormônio catabólico importantíssimo na regulação central da ingestão energética e
adiposidade corporal. Concentrações de insulina plasmática estão diretamente
correlacionadas ao peso corporal e, principalmente, à adiposidade corporal (BENOIT et
al., 2004). Diferentemente da leptina, as concentrações plasmáticas de insulina refletem
alterações mais agudas do metabolismo energético e gordura corporal do que a leptina.
As concentrações de insulina aumentam logo após refeições e outras condições de
balanço energético positivo, e diminuem durante o jejum e períodos de balanço
energético negativo, sendo sua meia-vida no sangue de 2 a 3 minutos. Sendo assim, a
secreção de insulina segue fielmente às mudanças do balanço energético em questão
de minutos a horas, e essas alterações são sempre diretamente proporcionais ao
tamanho das reservas adiposas (BENOIT et al., 2004). Animais e humanos obesos
possuem maiores concentrações basais de insulina plasmática e secretam mais insulina
em resposta à determinada refeição em relação a indivíduos e animais não obesos
(WOODS, SEELEY, BASKIN & SCHWARTZ, 2003). Já a leptina é secretada pelos
adipócitos em proporção direta ao metabolismo dos adipócitos. As concentrações de
leptina são então estáveis e confiáveis indicadores da gordura corporal. Portanto,
concentrações de insulina refletem a interação dos processos metabólicos e
adiposidade corporal enquanto as concentrações de leptina refletem a atividade dos
adipócitos mais diretamente (BENOIT et al., 2004).
Independentemente das diferenças, leptina e insulina fornecem
importantes informações aferentes ao cérebro. Os neurônios encontrados no núcleo
arqueado do hipotálamo também expressam receptores de insulina, sendo então alvos
de ação deste hormônio (WOODS et al., 2003).
Nas regiões hipotalâmicas, mais precisamente no núcleo arqueado, leptina
e insulina têm suas ações nos neurônios produtores de neuropeptídeos e
neurotransmissores primários (SCHWARTZ, WOODS, PORTE JUNIOR, SEELEY &
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BASKIN, 2000) que aumentam (orexígenos) ou diminuem (anorexígenos) a ingestão
alimentar (NEGRÃO & LICINIO, 2000). Os neuropeptídeos orexígenos não apenas
estimulam a ingestão alimentar, mas também diminuem o gasto energético. Os
neuropeptídeos anorexígenos agem de forma oposta, diminuindo o consumo alimentar e
aumentam o gasto energético (BENOIT et al., 2004). Os neuropeptídeos orexígenos
primários são o neuropeptídeo Y (NPY) e o peptídeo agouti (AgRP); já os
neuropeptídeos anorexígenos são da família das melanocortinas: o precursor POMC
(pró-opiomelanocortina), com seu produto de clivagem α-MSH (hormônio alfa-
melanócito-estimulante) e o transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina (CART)
(HALPERN, RODRIGUES & DA COSTA, 2004). Os neuropeptídeos α-MSH e CART do
núcleo arqueado possuem conexões inibitórias curtas com os neuropeptídeos NPY e
AgRP e conexões inibitórias longas com neurônios localizados no núcleo hipotalâmico
lateral (LH), além de possuírem conexões excitatórias longas com neurônios do núcleo
paraventricular (PVN). Já os neuropeptídeos NPY e AgRP parecem possuir apenas
conexões inibitórias longas com o PVN e excitatórias longas com o LH (VELLOSO,
2006). As conexões de ambos os tipos de neuropeptídeos se fazem com duas sub-
populações distintas de neurônios de secundários, tanto do PVN quanto no LH
(SCHWARTZ et al., 2000). No PVN, existem neurônios que expressam
neurotransmissores CRH (hormônio liberador da corticotrofina) e TRH (hormônio
liberador da tireotrofina), os quais têm funções anorexigênicas e pró-termogênicas,
aumentando o gasto energético (VELLOSO, 2006). Já no LH, há também duas sub-
populações distintas que expressam a orexina e a MCH (hormônio concentrador de
melanina), as quais desempenham funções orexigênicas e anti-termogênicas
(VELLOSO, 2006).
Quando há uma situação de baixas concentrações de leptina e insulina,
como por exemplo, durante o jejum prolongado, a expressão do NPY e da AGRP é
ativada, resultando no aumento da expressão da orexina e MCH no LH, além da
redução da expressão de TRH e CRH no PVN. Por outro lado, após uma refeição
quando as concentrações de insulina se elevam, ou quando há discreto ganho de
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massa adiposa, promovendo elevação nas concentrações de leptina e insulina, ocorre a
ativação dos neuropeptídeos POMC, α-MSH e CART no núcleo arqueado, gerando
redução da expressão de orexina e MCH no LH e aumento da expressão de TRH e
CRH no PVN (SCHWARTZ et al., 2000). O equilíbrio entre os dois sistemas, orexígeno
e anorexígeno, é que determina o comportamento alimentar e a quantidade de gordura
corporal (BENOIT et al., 2004).
Desta forma, leptina e insulina parecem agir, então, estimulando a síntese
de neurônios anorexígenos (POMC, CART) e inibindo a síntese de neurônios
orexígenos (NPY e AgRP) (CUSIN et al., 1996; MEINER & GRESSNER, 2004;
MUNZBERG et al., 2005), encontrados no ARC, os quais parecem funcionar como
neurônios primários em uma série neural de circuitos que inibe o consumo alimentar e
aumenta o gasto energético e a atividade do sistema nervoso simpático (NISWENDER,
BASKIN & SCHWARTZ, 2004; RAYNER, 2001; SEALS & BELL, 2004), mecanismo
melhor estabelecido em ratos.
Insulina e leptina agem então de forma agonista na redução da ingestão
alimentar e aumento do gasto energético via ação nos neurônios hipotalâmicos,
podendo ser chamadas de “sinalizadoras de adiposidade corporal” (STOCKHORST, DE
FRIES, STEINGRUEBER & SCHERBAUM, 2004). Os efeitos centrais semelhantes
desses dois hormônios sugerem que possa haver uma modulação entre eles.
A interação entre leptina e insulina é um tanto quanto complexa. As
concentrações basais de leptina e insulina estão positivamente correlacionadas em
indivíduos sensíveis à insulina, e ambas diminuem em resposta à perda de peso
(YILDIZ & HAZNEDAROGLU, 2006). DOUCET, ST-PIERRE, ALMÉRAS, MAURIÈGE,
DESPRÉS, RICHARD, BOUCHARD e TREMBLAY (2000) dividiram indivíduos com a
mesma quantidade de gordura corporal total em indivíduos com “alta insulinemia” e
indivíduos com “baixa insulinemia”. O grupo com “alta insulinemia” apresentou
concentrações de leptina de 32% e 22% mais altas do que os indivíduos com “baixa
insulinemia”, em homens e mulheres, respectivamente, enfatizando a correlação positiva
entre as concentrações de insulina e leptina. A diminuição na expressão e concentração
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de leptina é observada após diminuições das concentrações de insulina no jejum
(AHIMA & FLIER, 2000; CAMMISOTTO, GÉLINAS, DESHAIES & BUKOWIECKI, 2005;
MEIER & GRESSNER, 2004). No entanto, enquanto as exposições agudas e crônicas à
insulina resultam na expressão e secreção aumentadas de leptina (AHIMA & FLIER,
2000; MEIER & GRESSNER, 2004; WALKER, BRYSON, BELL-ANDERSON,
HANCOCK, DENYER & CATERSON, 2005; ZHENG et al., 1996), apenas a
hiperinsulinemia sustentada (24 a 72 horas) consegue aumentar as concentrações
plasmáticas de leptina em humanos e ratos (BRYSON, PHUYAL, PROCTOR, BLAIR,
CATERSON & COONEY, 1999; CUSIN et al., 1995; KOLACZYNSKI et al., 1996).
A leptina, por sua vez, aumenta a sensibilidade periférica à insulina,
enquanto inibe sua secreção pelas células B do pâncreas (YILDIZ & HAZNEDAROGLU,
2006). Como já descrito anteriormente, efeitos periféricos da leptina no músculo
esquelético incluem o aumento da incorporação e oxidação de glicose e aumento da
oxidação de ácidos graxos (AG), além da depleção de triacilgliceróis (TAG), o que
promove melhora na sensibilidade à insulina (YILDIZ & HAZNEDAROGLU, 2006).
2.3 Resistência à Leptina
FRIEDMAN e HALLAS (1998) sugerem três caminhos que levam à
obesidade:
• Falha na produção de leptina;
• Secreção inapropriada de leptina para uma dada massa adiposa de um
indivíduo;
• Relativa ou absoluta insensibilidade a leptina no local de ação da mesma,
podendo estar associada ao aumento da leptina circulante.
A descoberta de que mutações da leptina e dos receptores dos genes
causavam obesidade severa em ratos levou à hipótese de que um fenômeno
semelhante fosse válido para humanos (HOUSEKNECHT et al., 1998). No entanto, de
acordo com SPIEGELMAN e FLIER (1996), a maioria dos modelos de obesidade em
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ratos e humanos não era caracterizada pela deficiência na produção de leptina, mas sim
pelas concentrações elevadas de leptina circulante (hiperleptinemia).
Segundo FRIEDMAN e HALLAS (1998), o princípio da resistência à leptina
em obesos é desconhecido. Estudos com animais indicam que essa condição é
heterogênea e que muitos fatores podem influenciar a atividade do circuito neural que
regula o peso corporal.
Existem alguns mecanismos potenciais para a explicação dessa
resistência:
• Defeito não transporte da leptina através da barreira sangue-cérebro
(HOUSEKNECHT et al., 1998; ZHANG et al., 2005);
• Defeito na expressão ou sinalização do receptor no cérebro (ZHANG et al.,
2005);
• “Down-regulation” dos receptores centrais em resposta ao acúmulo
excessivo de leptina a curto prazo e reajuste dos efeitos inibitórios da leptina sobre o
apetite; ou seja, seria necessária concentração supranormal de leptina para o mesmo
efeito inibitório sobre o apetite (NEGRÃO & LICÍNIO, 2000);
• Ineficiência da leptina em responder à alimentação muito excessiva
(ARCH, 2005);
O último mecanismo mostra que, apesar de inicialmente estar relacionada
à prevenção da obesidade, talvez, o principal papel fisiológico da leptina seja permitir a
resposta do organismo a períodos de fome, e não somente refletir a massa do tecido
adiposo (HICKEY & CALSBEEK, 2001).
2.4 Leptina e exercício físico
Os benefícios da atividade física estão bem estabelecidos e pesquisas
continuam confirmando importante papel do exercício habitual na manutenção da saúde
global e do bem-estar (ACSM, 2000). Evidências de estudos epidemiológicos e
experimentais têm demonstrado que o exercício físico regular protege contra o
desenvolvimento e a progressão de inúmeras doenças crônicas (tais como doenças
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coronarianas, hipertensão, obesidade, diabetes tipo 2, entre outras), sendo, portanto,
relevante componente de um estilo de vida saudável.
Estudos foram realizados para a verificação de efeitos do exercício
moderado prolongado (aeróbio) agudo e crônico nas concentrações de leptina,
determinando também a influência, ou não, de outras variáveis. Os resultados são, em
grande maioria, conflitantes.
Observando-se o efeito agudo do exercício moderado prolongado,
segundo alguns estudos, não se nota uma diferença significativa entre as concentrações
de leptina antes e após o exercício (PERUSSE et al., 1997; RACETTE et al., 1997;
TORJMAN, ZAFEIRIDIS, PAOLONE, WILKERSON & CONSIDINE, 1999; WELTMAN,
PRITZLAFF, WIDEMAN, CONSIDINE, FRYBURG, GUTGESELL, HARTMAN &
VELDHUIS, 2000). PERUSSE et al. (1997) mediram a leptina plasmática antes, 10-12
minutos após o início de 50 W de ciclo ergômetro, e imediatamente após o esforço
máximo. Nenhuma diferença foi encontrada quando comparada a concentrações basais.
RACETTE et al. (1997) mediram as concentrações de leptina arteriovenosas no tecido
adiposo durante 60 min de ciclo ergômetro e não encontraram alterações. Segundo
TORJMAN et al. (1999), após 60 min de exercício em esteira, a 50% do VO2máx, não
houve alterações nas concentrações de leptina plasmática em até 4 horas após o
término da sessão. Outros estudos ainda concluíram que a leptina não responde ao
aumento do gasto energético imediatamente após o exercício (RACETTE et al., 1997;
ROSENBAUM et al. 1997, TORJMAN et al., 1999; WELTMAN et al., 2000).
Por outro lado, ESSIG, ALDERSON, FERGUSON, BARTOLI e DURSTINE
(2000) encontraram redução em 30% da leptina 48 h após duas sessões separadas de
exercício, as quais geraram o dispêndio de aproximadamente 800 e 1500 Kcal. No
entanto, logo após e 24 h após as sessões, não houve diferenças nessas
concentrações. LANDT, LAWSON, HELGESON, DAVILA-ROMAN, LADENSON, JAFFE
e HICKNER (1997) encontraram concentrações de leptina reduzidas após uma
maratona. TUOEMINEN, EBELING, LAQUIER, HEIMAN, STEPHENS e KOIVISTO
(1997) também encontraram 34% de redução nas concentrações de leptina plasmática
14
44 horas após duas horas de exercício a 75% do VO2 máx. OLIVE e MILLER (2001)
analisaram as concentrações de leptina plasmática 24 e 48 h após uma hora de
exercício moderado (~900Kcal despendidas) e após exercício intenso de curta duração
(~200Kcal despendidas). Houve diminuição de 18% (24 h) e 40% (48h) após atividade
prolongada e moderada e não houve alteração após atividade curta e intensa. Estes
dados sugerem que a diminuição das concentrações de leptina após uma sessão aguda
de exercício só ocorre se o esforço físico for extremo, como em uma ultramaratona, na
qual há um balanço energético negativo, induzido pela atividade física extenuante. Além
disso, exercícios de longa duração (≥ 60 min) parecem estar associados à diminuição
tardia das concentrações de leptina, aproximadamente, 48hs após a atividade.
Estudos longitudinais também apresentam resultados contraditórios.
KRAEMER, KRAEMER, ACEVEDO, HEBERT, TEMPLE, BATES, ETIE, HALTOM,
QUINN e CASTRACANE (1999) não encontraram alterações na leptina plasmática de
mulheres obesas após nove semanas de treinamento aeróbio (aproximadamente 1256
Kcal despendidas por sessão). Não houve também alteração da massa adiposa e os
sujeitos mantiveram suas dietas normais ao longo do estudo. HOUMARD et al. (2000)
não encontraram alterações nas concentrações de leptina após sete dias consecutivos
de treino aeróbio (1 h/dia a 75% VO2máx). Não houve alteração da porcentagem de
gordura corporal, porém houve melhora na sensibilidade à insulina. Tais estudos
sugerem que o treinamento aeróbio não modula independentemente as concentrações
plasmáticas de leptina de jejum, e que a melhora da sensibilidade à insulina induzida
pelo treinamento pode não estar associada a alterações nas leptina plasmática de jejum.
Já outros estudos mostram a redução das concentrações plasmáticas e/ou
expressão de leptina em resposta ao treinamento aeróbio como efeito crônico (HICKEY
& CALSBEEK, 2001; KOHRT, LANDT & BIRGE, 1996; MIYATAKE, TAKAHASHI,
WADA, NISHIKAWA, MORISHITA, SUZUKI, KUNITOMI, MAKINO, KIRA & FUJII, 2004;
OKAZAKI, HIMENO, MANRI, OGATA & IKEDA, 1999; PASMAN, WESTERTERP-
PLANTENGA & SARIS, 1998; PERUSSE et al., 1997; ZACHWIEJA, HENDRY, SMITH &
HARRIS 1997).
15
Em homens obesos, após 12 meses de treinamento moderado, foi
observada menor concentração de leptina plasmática em relação ao grupo controle.
Após análise do efeito independente do treinamento, corrigido pelas alterações da
insulina e porcentagem de gordura corporal, o número de horas de treino por semana
estava ainda significativamente correlacionado às alterações das concentrações de
leptina. Isso levou os autores a concluírem que o treinamento físico, independente da
massa adiposa e da concentração de insulina, diminuiu as concentrações de leptina
circulante (PASMAN, WESTERTERP-PLANTENGA & SARIS, 1998).
ZACHWIEJA et al. (1997) observaram menores concentrações de leptina
plasmática e expressão do mRNA da leptina no tecido adiposo branco de ratos
Osborne-Mendel (OM) sensíveis e ratos OM resistentes à obesidade induzida pela dieta,
após sete semanas de treinamento com exercício voluntário. Além disso, os animais dos
dois grupos treinados apresentaram ainda menor quantidade de tecido adiposo em
relação aos seus respectivos grupos controle, havendo correlação entre a concentração
de leptina e soma da quantidade de gordura dos diferentes depósitos de gordura.
Apenas os OM obesos apresentaram maior sensibilidade à insulina, sugerindo que os
efeitos do treinamento físico na expressão e secreção de leptina puderam ocorrer
independentemente da sensibilidade à insulina.
PERUSSE et al. (1997) observaram a redução das concentrações de
leptina após um programa de treinamento aeróbio de 20 semanas, mas essa redução foi
atribuída à perda de massa gorda, não tendo havido ainda melhora na sensibilidade à
insulina. THONG, HUDSON, ROSS, JANSSEN e GRAHAM (2000) analisaram os efeitos
independentes do exercício e da perda de peso nas concentrações de leptina. Os
sujeitos treinaram por 12 semanas. As alterações encontradas foram correlacionadas
com as alterações do tecido adiposo total e subcutâneo. Os autores constataram que,
independente do efeito no balanço energético, o exercício não promoveu alterações nas
concentrações de leptina. FRIEDMAN et al. (1997) observaram que após 8-12 semanas
de treinamento aeróbio (5 dias/semana; 1,5h por dia a 70% do VO2máx) a expressão do
mRNA da leptina no tecido adiposo subcutâneo foi 85% menor em ratos treinados. O
16
grupo treinado também apresentou menor porcentagem de gordura corporal, indicando
associação entre a expressão da leptina e quantidade de gordura corporal. Não houve
diferença na insulinemia de jejum entre grupos. LEVIN e DUNN-MEYNELL (2004)
observaram concentrações de leptina 35% menores em ratos treinados em esteira por 6
semanas do que em ratos sedentários. No entanto, os ratos treinados apresentaram
gordura corporal menor em 36% em relação aos ratos sedentários, além de não ter
havido diferença na insulinemia de jejum. Ocorre que, como o treinamento provoca
mudanças na composição corporal, principalmente perda de massa gorda, quando esta
variável é controlada, alguns estudos não observam variações significativas das
concentrações de leptina.
Após um programa de 12 semanas de treinamento aeróbio (4
sessões/semana; 30-45 min/sessão) (HICKEY, HOUMARD, CONSIDINE, TYNDALL,
MIDGETTE, GAVIGAN, WEIDNER, MCCAMMON, ISRAEL & CARO, 1997), as
concentrações de leptina plasmática diminuíram significativamente 17,5% em mulheres,
mas não houve redução significativa em homens. Não houve alteração da massa gorda
em ambos os grupos, porém houve melhora significativa na sensibilidade à insulina
(35% em homens e 82% em mulheres). HAYASE, NOMURA, ABE e IZAWA (2002)
encontraram ainda diminuições significativas nas concentrações de leptina plasmática
em mulheres, mas não na insulinemia, após 10 semanas de natação. Houve altíssima
correlação entre a queda da leptina e da redução da gordura corporal, sugerindo que a
queda das concentrações de leptina após o treinamento dependeu fortemente da perda
de gordura corporal, principalmente do tecido adiposo subcutâneo. No entanto, ao
corrigir as concentrações de leptina pela quantidade de gordura, os autores observaram
ainda queda significativa. Desta forma, sugeriu-se que haja outro fator que não o tecido
adiposo modulando as concentrações de leptina após o treinamento. MIYATAKE et al.
(2004) observaram diminuição das concentrações de leptina plasmática em homens
sobrepeso, após um ano de treinamento aeróbio a 65% do VO2máx, 50 minutos de
exercício por sessão, três vezes por semana, independentemente das diminuições da
porcentagem de gordura corporal, perda de peso e diminuição do IMC. Os autores
17
sugeriram que a insulina poderia ser responsável por esses efeitos, uma vez que houve
melhora na sensibilidade à insulina. Após um ano de treinamento aeróbio (3
sessões/semana, 60 minutos por sessão), homens com síndrome metabólica (altas
concentrações de lipídios no sangue, pressão alta, etc.) apresentaram concentrações
plasmáticas de leptina significativamente reduzidas, mesmo após o ajuste dessas
concentrações pela perda de massa gorda e perda de peso. Os autores sugeriram ainda
que a melhora da sensibilidade à insulina pode ter promovido as alterações nas
concentrações de leptina encontradas (RACETTE et al., 1997).
Enfim, sabe-se que o exercício representa uma grande fração do gasto
energético em humanos, estimula a perda da massa gorda e auxilia na preservação da
massa magra (PERUSSE et al., 1997), além de promover alterações em hormônios
como a insulina e sua ação fisiológica (PASMAN, WESTERTERP-PLANTENGA &
SARIS, 1998). Desta forma, considerando-se o papel da leptina no gasto energético, a
resposta da leptina a alterações da composição corporal, gasto energético e insulina
(FRIEDMAN et al., 1997; TORJMAN et al., 1999), o exercício aeróbio poderia ser um
importante determinante das concentrações de leptina, implicando em possíveis efeitos
crônicos do treinamento físico.
3 JUSTIFICATIVA
Sabe-se que a obesidade é um grande fator de risco à saúde e que muitas
pessoas que perdem peso normalmente recuperam parte do peso perdido, quando não
todo. Em modelos experimentais a leptina tem ação no comportamento alimentar e
gasto energético. Além disso, os estudos são um tanto quanto contraditórios sobre os
possíveis moduladores da expressão e concentração plasmática de leptina em função
do treinamento físico aeróbio.
Em função disso e da importância do conhecimento da leptina, suas
funções e modulações, para que possíveis soluções para o crescente problema da
obesidade possam ser encontradas, o presente estudo vem verificar possíveis efeitos do
18
treinamento aeróbio na expressão e nas concentrações plasmáticas de leptina e suas
implicações.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
• Verificar como o treinamento aeróbio influencia as concentrações
plasmáticas de leptina em ratos, após oito semanas de treinamento
aeróbio.
4.2 Objetivos específicos
• Verificar a expressão do mRNA da leptina nos diferentes depósitos de
gordura [tecido adiposo visceral (TAV) e tecido adiposo subcutâneo (TAS)]
após o treinamento aeróbio.
• Identificar as correlações entre as concentrações plasmáticas de leptina,
insulina, composição corporal, gasto energético e consumo alimentar.
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Animais experimentais
A amostra dos experimentos foi composta de ratos machos Wistar. Os
animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Nutrição e Metabolismo Aplicados
à Atividade Motora da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São
Paulo. Os animais tiveram ciclo claro escuro invertido, com administração de água e
ração comercial (Nuvilab, Ralston Purina do Brasil, São Paulo/SP). Os experimentos
tiveram início quando os animais se tornaram adultos (peso entre 200 e 300 g).
Ao atingirem o peso determinado, os animais foram mantidos nas mesmas
condições citadas anteriormente, porém em gaiolas individuais e divididos
19
aleatoriamente em dois grupos experimentais que diferenciaram quanto ao tipo de
treinamento, conforme descrito no QUADRO 1.
QUADRO 1 - Treinamento segundo grupo experimental
Grupos
T Treinado
C Sedentário (controle)
5.2 Protocolo de treinamento dos an imais
O treinamento dos animais foi feito segundo descrito por LANCHA
JUNIOR, RECCO, ABDALLA e CURI (1995). A primeira fase do treinamento consistiu
na adaptação dos animais ao sistema de natação, sem carga, por 20 minutos (1ª
semana). A segunda fase consistiu em exercício aeróbio sublimiar contínuo, cinco dias
por semana, na qual o tempo de exercício foi gradativamente aumentado até alcançar
60 minutos, durante oito semanas, com carga de 5% do peso corporal. Experimentos
anteriores do nosso laboratório mostram que cargas aeróbias de 5% do peso corporal
garantem melhora do condicionamento aeróbio dos animais e que o treinamento seja
sublimiar, próximo a 70% da capacidade aeróbica máxima (LANCHA JUNIOR et al,
1995).
5.3 Desenho experimental
Cada experimento teve duração de nove semanas. O EXPERIMENTO1
contou com 10 animais, totalizando cinco animais no grupo T e cinco animais no grupo
C, e teve como objetivo apenas a mensuração do consumo alimentar. Os animais
tiveram livre acesso à alimentação 24 horas por dia durante as nove semanas do
experimento. As quantidades de ração consumidas foram medidas três vezes por
semana, a fim de obter o consumo alimentar médio diário de cada grupo. Se houvesse
diferença no consumo de ração entre os dois grupos, haveria a limitação da quantidade
ofertada de alimento nos experimentos seguintes, de maneira que os dois grupos
20
consumissem quantidades equivalentes de energia (pair feeding), tendo como base o
menor consumo observado. Após o EXPERIMENTO 1, foi constatado que não houve
diferença no consumo de ração entre os grupos treinado e controle (0,074 ± 0,003 e
0,070 ± 0,003 g ração/g peso corporal), descartando a necessidade de se fazer o pair
feeding (FIGURA 1).
0,0740,070
0,060
0,065
0,070
0,075
0,080
1
grupo experimental
g ra
ção/
g pe
so
corp
oral
Grupo T Grupo C
FIGURA 1 - Consumo médio de ração expresso em g ração/g peso corporal segundo
grupo experimental (média ± desvio padrão). Grupo T (n=5); Grupo C
(n=5).
Após o EXPERIMENTO 1, foram realizados outros dois experimentos. O
EXPERIMENTO 2 contou com 18 animais e o EXPERIMENTO 3 com 20 animais,
totalizando 18 animais no grupo T (treinado) e 20 animais no grupo C (controle). Os
cronogramas e análises realizadas em cada experimento estão descritos no QUADRO
2.
21
QUADRO 2 - Cronograma dos experimentos realizados.
semanas EXPERIMENTO 2 EXPERIMENTO 3
0
• Aquisição dos animais
• Pesagem dos animais e separação
em grupos homogêneos segundo o peso
• teste oral de tolerância à glicose
(OGTT) ao final da semana
• Aquisição dos animais
• Pesagem dos animais e separação em
grupos homogêneos segundo o peso
1
• adaptação ao meio líquido (exercício
de natação para os animais do grupo
treinado): 20 minutos diários, sem carga
adicional
• adaptação ao meio líquido (exercício
de natação para os animais do grupo
treinado): 20 minutos diários, sem carga
adicional
2
• início dos treinos dos animais do
grupo T (exercitados)
• controle do consumo dos animais
• pesagem semanal dos animais
• início dos treinos dos animais do
grupo T (exercitados)
• controle do consumo dos animais
• pesagem semanal dos animais
3 a 8
• pesagem semanal dos animais
• ajuste das cargas de treinamento dos
animais
• treino dos animais do grupo T
• controle do consumo
• pesagem semanal dos animais
• ajuste das cargas de treinamento dos
animais
• treino dos animais do grupo T
• controle do consumo
9
• última semana de exercícios
• teste oral de tolerância à glicose
(OGTT) ao final da semana
• final do experimento
• sacrifício por decapitação
• coleta de sangue para dosagem de
leptinemia e insulinemia
• armazenamento dos animais para
dosagem do conteúdo de gordura da
carcaça
• última semana de exercícios
• espirometria de repouso
• final do experimento
• sacrifício por decapitação
• coleta do tecido adiposo visceral e
subcutâneo para análise da expressão do
gene da leptina
22
Houve acompanhamento semanal do crescimento ponderal dos animais,
pelo peso corporal medido uma vez por semana. Decorridas as nove semanas de
treinamento, os animais foram sacrificados após 12 horas de restrição alimentar, com
apenas água à disposição e tiveram seu sangue coletado e alguns tecidos separados
para análises, conforme descrito a seguir. O sacrifício dos animais foi feito respeitando
um intervalo mínimo de 48 horas após a última sessão de exercício, uma vez que se
procurou avaliar os efeitos do exercício crônico e não do exercício agudo.
5.4 Análises Plasmáticas
Os 18 animais utilizados no segundo experimento foram sacrificados e o
sangue coletado foi centrifugado a 4000 rpm para a extração do plasma e congelado
para posteriores dosagens de insulinemia e leptinemia.
5.4.1 Insulinemia
Foi realizada dosagem da insulinemia de jejum, através de
radioimunoensaio com kits laboratoriais da marca Amersham Buckinghamshire,
England.
5.4.2 Tolerância à Glicose
Para a estimativa da captação sistêmica de glicose, o Teste Oral de
Tolerância à Glicose (OGTT) foi realizado antes e após o treinamento (dois dias antes
do sacrifício). Os animais permaneceram 14 horas em privação alimentar, após as quais
receberam, via gavagem, solução de glicose a 10%, num total de 2 g/kg de peso. A
glicemia foi dosada numa gota de sangue coletada da veia caudal, sem anestesia, em
glicosímetro da marca ACCU-CHECK ACTIVE, da ROCHE. As dosagens foram
realizadas imediatamente antes da administração da sobrecarga de glicose e aos 30,
60, 90 e 120 minutos após, possibilitando o traçado da curva glicêmica (ISHIDA,
MIZUNO, MURAMAKI & SHIMA, 1996). Para a interpretação desse parâmetro, houve o
23
cálculo da área sob a curva conforme demonstrado por MATTHEWS, ALTMAN,
CAMPBELL e ROYSTON (1990).
5.4.3 Leptinemia
A dosagem de leptina plasmática foi determinada pelo método de
radioimunoensaio, utilizando o “kit” comercial específico para dosagem de leptina de
ratos (Linco Research Inc, St. Louis, MO - EUA). O teste é considerado completamente
homólogo, pois o anticorpo, o antígeno marcado com 125I e os padrões são preparados
com leptina de rato altamente purificada.
5.5 Conteúdo de gordura corporal
Como já citado, houve acompanhamento semanal do crescimento
ponderal dos animais. Para a determinação da composição corporal, os 18 animais
utilizados no segundo experimento foram sacrificados e tiveram suas carcaças
congeladas para posterior homogeneização, conforme descrito a seguir. As carcaças
foram acrescidas de água destilada (em quantidade equivalente ao peso da carcaça) e
autoclavadas por 30 minutos. Em seguida, as carcaças foram homogeneizadas com
auxílio de liquidificador e uma amostra do homogenato foi utilizada para determinação
do conteúdo total de lipídios.
As amostras de homogenato das carcaças sofreram a determinação do
conteúdo lipídico total segundo a metodologia descrita por STANSBIE, BROWNSEY,
CRETTAZ, e DENTON (1976). As amostras foram incubadas com 3,0 ml de KOH (30%)
por 15 minutos a 70°C, sendo acrescidas de 3 ml de álcool etílico absoluto e incubadas
por mais duas horas a esta temperatura. Os ácidos graxos livres da fração lipídica foram
extraídos três vezes, sendo que inicialmente foram 2,5ml de ácido sulfúrico em gelo e,
em seguida, adicionados 8 ml de éter de petróleo e colocados em banho à temperatura
ambiente com agitação horizontal por 10 minutos, seguidos de centrifugação por um
minuto a 1500 rpm. O sobrenadante foi separado e reservado com auxílio de pipeta
Pasteur. Os mesmos procedimentos foram repetidos com 6,0 ml e 4,0 ml de éter de
24
petróleo. Os sobrenadantes foram acrescidos de água destilada, separados com bomba
a vácuo, e a mistura de gordura e éter permaneceu 24 horas em capela à temperatura
ambiente para evaporação do éter. O total de gordura foi, então, pesado e calculado.
5.6 Expressão gênica da leptina
A análise da expressão do gene da leptina foi realizada no tecido adiposo
visceral (TAV) e no tecido adiposo subcutâneo (TAS), nos 20 animais utilizados no
terceiro experimento, após a intervenção. Como TAV foi utilizado o tecido adiposo
epididimal e como TAS foi utilizado o tecido adiposo inguinal. A análise foi realizada
segundo o protocolo descrito a seguir:
Extração de RNA
O RNA total (RNA tot) do TAV e TAS dos ratos foi extraído com o reagente
Trizol® (100mg de tecido/ ml Trizol®), homogeneizados em aparelho Politron e
incubados por 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram precipitadas com
cerca de 200µL de clorofórmio e centrifugadas por 15 minutos a 12000g (4°C) para a
obtenção do RNAtot (a fase superior) que foi precipitada com 500µL de álcool
isopropílico e incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Os pellets, agora
visíveis, foram serão lavados com etanol 75% e as amostras centrifugadas por 5 minutos
a 7500g, a 4°C. O álcool foi removido e os pellets secos à temperatura ambiente por 15
minutos. As amostras foram solubilizadas em água-DEPC. Para avaliação da
concentração e pureza do RNAtot, foram realizados ensaios espectrofotométricos sob
comprimento de onda de 260 a 280 nm. A razão A260/280 é proporcional à concentração
de RNAtot na amostra (SAMBROOK & GETHING, 1989).
Análise da expressão gênica
Remoção do DNA genômico: O RNAtot extraído do TAV e do TAS dos
diferentes grupos experimentais foram colocados em presença de Deoxiribonuclease I,
DNAse altamente purificada, para a remoção de DNA genômico. O RNAtot foi incubado
por 15 minutos à temperatura ambiente, em tubo de polipropileno juntamente com 2µL
de DNAse I, e 2µL de solução tampão Dnase 10X, completando com água-DEPC para
25
20 mL de volume total de reação. Em seguida, foi feito o bloqueio da reação com EDTA
25mM e incubado por 10 minutos a 65° C. Então o RNA tot foi seco em centrífuga à
vácuo.
Geração de cDNA por transcrição reversa: O cDNA foi gerado pela
incubação de 2µg de OligoDTs (0,05 µg/µL) e 2µL de transcriptase reversa (M-ML
Reverse Transcriptase 20U, Gibco), completando com Água-DEPC para 20µL de
volume total da reação, por 10 minutos, em termociclador (Gene Amp®, PCR system
9700).
O cDNA foi fracionado sob voltagem (85V) em gel de agarose a 1% e
corado com brometo de etídio para visualização de imagem no transiluminador. Correu
marcador para número de pares de base no mesmo gel (DNA ladder, Gibco).
PCR
PCR do cDNA: O cDNA foi amplificado utilizando-se 0,5µL de enzima Taq
DNA polimerase (2,5U), MgCl2 (1,25mM), dNTPs Mix (0,2mM), e oligosondas
específicas para dos tecidos adiposos, baseado na sequência dos primers descrita
abaixo:
Leptina
Tecido adiposo
S:GTTCAAGCTGTGCCTATCC
AS: AAGAATGTCCTGCAGAGAGCCC
O ciclo para amplificação da leptina do TAV e TAS foi padronizado, e o
número de ciclos considerado ótimo foi aquele que resultou em maior amplificação sem
que houvesse saturação. Cada ciclo consistiu na incubação das amostras por 35
segundos a 94° C (abertura), uma segunda incubação por 45 segundos a temperaturas
variadas (anelamento) para cada primer. Houve então uma terceira incubação durante
60 segundos a 72° C (alongamento). O gene da RPL 19 foi co-amplificado, como
controle interno da reação.
O produto obtido pela amplificação do PCR foi fracionado em gel de
agarose a 1%, sempre utilizando um marcador de peso molecular, para confirmação de
tamanho dos amplificados obtidos. O gel de agarose foi corado com corante brometo de
26
etídio, para a visualização da imagem em aparelho Typhoon (Molecular Dynamics). Para
cada amostra foi calculada a relação de fluorescência da banda Leptina.
5.7 Gasto energético de repouso
A taxa de metabolismo de repouso dos 20 ratos utilizados no terceiro
experimento foi medida um dia antes do sacrifício, 48 horas após a última sessão de
treinamento. Monitoramos, por 20 minutos, em repouso, as concentrações de oxigênio
(O2) e dióxido de carbono (CO2) de cada animal, permitindo que, através da diferença
das concentrações de O2 e CO2, fosse possível o cálculo do consumo de O2 em repouso
de cada animal, obtendo-se a média da taxa de metabolismo de repouso de cada grupo.
6 ANÁLISES DOS DADOS
Primeiramente, foi realizada a análise da qualidade dos dados, em que se
verificou se a amostra possuía distribuição normal para todas as variáveis, o que
constitui um pré-requisito para a execução de testes paramétricos. Para verificar a
normalidade da distribuição da amostra, foi utilizado o teste de Shapiro-Wilk. Para
verificar a homogeneidade da variância, foi utilizado o teste de Levene. Após esta
análise inicial da qualidade dos dados, foram executadas análises de teste t para
amostras independentes. Para as variáveis que não apresentaram distribuição normal
ou variância homogênea, foi utilizado o teste de Mann-Whitney.
Análises de regressão linear múltipla e simples e correlação pelo método
Pearson (para variáveis paramétricas) e Spearman (para variáveis não paramétricas)
foram realizadas entre dois parâmetros com nível de significância p<0,05.
Os dados são apresentados como média ± desvio-padrão e o nível de
significância adotado foi de p ≤ 0,05. As análises foram feitas com o auxílio do software
SPSS for Windows, versão 10.0.
27
7 RESULTADOS
A amostra dos EXPERIMENTOS 2 e 3 foi composta por um total de 38
animais. O grupo treinado (T) contou com 18 animais e o grupo controle (C) contou com
20 animais.
Todas as variáveis apresentaram distribuição normal e variância
homogênea, com exceção das seguintes variáveis: peso inicial e insulina.
7.1 Peso corporal
A FIGURA 2 mostra a evolução de peso dos animais ao longo da
intervenção.
250,0
300,0
350,0
400,0
450,0
Semanas
Pes
o (g
)
Grupo T 281,5 292,9 313,0 332,1 343,6 353,6 366,4 374,2 384,9
Grupo C 293,6 311,95 332,4 360,05 374,05 390,25 405,45 413,95 425,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9
*
*
**
*
FIGURA 2 - Evolução do peso corporal (média) ao longo do experimento segundo grupo
experimental; Grupo T (n=18); Grupo C (n=20); *: p<0,05 entre grupos na
mesma semana de avaliação.
28
Não houve diferença significativa no peso inicial entre os dois grupos. Já a
partir da quinta semana de intervenção, os animais sedentários (controle) apresentaram
maior peso corporal (p<0,05), sendo que, na nona e última semana, foi observada a
maior diferença entre o grupo treinado e controle (384,9 ± 32,6 e 425,35 ± 41,57 g peso
corporal; p=0,003).
7.2 Consumo energético
A FIGURA 3 mostra o consumo médio de ração de acordo com o peso do
animal, segundo grupo experimental. O consumo alimentar dos animais foi medido em
gramas e o consumo médio semanal de cada animal foi divido pelo seu peso em
gramas (aferido na mesma semana). Foi então obtida uma média do consumo alimentar
de cada animal (em gramas por grama de peso) por semana e, depois, uma média de
consumo de ração para cada grupo (em gramas por grama de peso). Não houve
diferença entre o grupo treinado e controle (0,075 ± 0,014 e 0,072 ± 0,013 g ração/g
peso corporal; p = 0,528).
0,075 0,072
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
cons
umo
(g ra
ção/
g pe
so)
Grupo T Grupo C
FIGURA 3 -Consumo médio de ração (média ± desvio padrão) segundo grupo
experimental; Grupo T (n=18); Grupo C (n=20).
29
7.3 Conteúdo de gordura corporal to tal
A FIGURA 4 mostra o conteúdo lipídico total extraído da carcaça. Os
maiores depósitos foram observados nos animais sedentários (controle), havendo
diferença significativa entre o grupo treinado e controle (51,05 ± 15,2 e 80,33 ± 22,3;
p=0,009).
51,05
80,33
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
mg
gord
ura/
g ca
rcaç
a
Grupo T Grupo C
*
FIGURA 4 - Conteúdo (média ± desvio padrão) de gorduras extraídas das carcaças dos
animais segundo grupo experimental; Grupo T (n=8); Grupo C (n=10); *:
p<0,05 entre grupos.
7.4 Curvas glicêmicas
A FIGURA 5 mostra as curvas glicemias obtidas a partir do OGTT antes e
após a intervenção. As curvas são resultados das médias de glicemia para cada ponto.
As áreas sob a curva glicêmica na semana 0 foram idênticas entre os dois grupos. Ao
final do treinamento, notou-se que a área do grupo treinado diminuiu significativamente,
enquanto que a área do grupo controle se manteve semelhante em relação à semana 0.
Esta área se manteve semelhante em função de uma diminuição significativa dos
valores de glicemia do teste oral de tolerância à glicose (OGTT) nos minutos 0 e 30 e
aumento significativo nos minutos 90 e 120. Já a diminuição da área sob a curva
30
glicêmica no grupo treinado se deu devido à diminuição dos valores glicêmicos nos
minutos 0, 30 e 60. Comparando os animais treinados com os animais do grupo
controle, ao final da intervenção, notaram-se aumentos significativos tanto na área sob a
curva, como nos valores glicêmicos nos minutos 30, 60 e 90 (maiores no grupo
controle). Sendo assim, podemos observar que há significativa melhora na tolerância à
glicose em função do treinamento (p<0,05).
TABELA 1 -Glicemia (mg/dL) a cada 30 minutos do teste oral de tolerância à glicose
(OGTT) e área sob a curva obtida neste teste ao início (semana 0) e ao
final (semana 9) do experimento segundo grupo experimental (média ±
desvio padrão); Grupo T (n=8); Grupo C (n=10); *: p<0,05 em relação ao
Grupo C para o mesmo intervalo de tempo; #: p<0,05 em relação à
Semana 0 dentro do mesmo grupo experimental.
Grupos
0
30
Minutos
60
90
120
Área sob a
curva glicêmica
Semana 0
Grupo T 71,0 ± 8,6 94,2 ± 5,9 75,4 ± 3,3 71,8 ± 3,3 69,3 ± 4,4 9348,3 ± 276,9
Grupo C 70,3 ± 6,0 97,3 ± 6,6 78,2 ± 4,9 73,1 ± 3,0 70,8 ± 3,9 9574,5 ± 313,1
Semana 9
Grupo T 63,3 ± 6,4# 77,6 ± 4,4*# 70,3 ± 4,7*# 72,1 ± 6,2* 73,7 ± 5,8 8656,7 ± 510,1*#
Grupo C 65,8 ± 3,3# 83,5 ± 5,5# 82,0 ± 7,3 79,7 ± 3,7# 76,4 ± 5,0# 9489,0 ± 449,0
31
Inicial (Semana 0)
50
75
100
0´ 30´ 60´ 90´ 120´
Minutos
Glic
emia
(m
g/dl
)
Grupo T Grupo C
Final (Semana 9)
50,0
75,0
100,0
0´ 30´ 60´ 90´ 120´
Minutos
Glic
emia
(m
g/dl
)
Grupo T Grupo C
* * *
FIGURA 5 - Glicemia (média) ao longo dos 120 minutos do teste oral de tolerância ao
início (semana 0) e ao final do experimento (semana 9) segundo grupo
experimental; Grupo T (n=8); Grupo C (n=10); *: p<0,05 entre grupos para
o mesmo intervalo de tempo.
7.5 Leptina
As concentrações de leptina plasmática, segundo grupo experimental,
estão apresentadas na FIGURA 6. Houve diferença significativa entre o grupo treinado e
sedentário (2,58 ± 1,05 e 5,89 ± 2,89 ng/mL; p=0,01), sendo observadas concentrações
maiores nos animais sedentários (controle).
32
2,58
5,89
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00Le
ptin
a (n
g/m
l)
Grupo T Grupo C
*
FIGURA 6 - Concentração de leptina plasmática (média ± desvio padrão) segundo grupo
experimental; Grupo T (n=8); Grupo C (n=10); *: p<0,05 entre grupos.
7.6 Insulina
As concentrações de insulina plasmática, segundo grupo experimental,
estão apresentadas na FIGURA 7. Também houve diferença significativa entre o grupo
treinado e sedentário (5,80 ± 1,42 e 12,82 ± 4,23 uUI/mL; p=0,002), sendo observadas
concentrações maiores nos animais sedentários (controle).
33
5,80
12,82
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
14,00
15,00
16,00
17,00
18,00
Insu
lina
(uU
I/mL)
Grupo T Grupo C
*
FIGURA 7 - Concentração de insulina plasmática (média ± desvio padrão) segundo
grupo experimental; Grupo T (n=8); Grupo C (n=10); *: p<0,05 ente grupos.
7.7 Gasto energético de repouso
A FIGURA 8 mostra o consumo médio de oxigênio em repouso, segundo
grupo experimental. Não houve diferença significativa entre o grupo treinado e controle
(46,38 ± 5,93 e 41,10 ± 5,99 mL/g.min; p = 0,081).
34
46,441,1
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0C
onsu
mo
de O
2 (m
l/g.m
in)
Grupo T Grupo C
FIGURA 8 - Consumo de oxigênio em repouso (média ± desvio padrão) segundo grupo
experimental; Grupo T (n=10); Grupo C (n=10).
7.8 Expressão gênica da leptina
A FIGURA 9 mostra a expressão gênica da leptina corrigido pela
expressão gênica da RPL (marcador) no tecido adiposo visceral (TAV) e tecido adiposo
subcutâneo (TAS), segundo grupo experimental. Não houve diferença significativa na
expressão de leptina no TAV (1,17 ± 0,45 e 1,25 ± 0,28 unidade relativa; p=0,82) e no
TAS (0,59 ± 0,10 e 0,70 ± 0,13 unidade relativa; p=0,22) entre o grupo treinado e
controle. Houve, no entanto, diferença significativa intra grupos, sendo observada menor
expressão no TAS em relação ao TAV, tanto no grupo treinado (p=0,047), quanto no
grupo controle (p=0,017).
35
1,17
0,58
1,24
0,7
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
TAV TAS
mR
NA
Lep
tina/
mR
NA
RP
L
Grupo T Grupo C
* *
FIGURA 9 – Expressão da leptina no TAV e TAS (média ± desvio padrão) segundo
grupo experimental; Grupo T (n=4); Grupo C (n=4); *: p<0,05 em relação
ao TAS do mesmo grupo.
FIGURA 10 – Análise representativa da expressão gênica no tecido adiposo visceral
(TAV) e tecido adiposo subcutâneo (TAS) segundo grupo experimental.
7.9 Cálculos de correlação e regres são
Ao realizarmos o cálculo de correlação, constatamos que a leptina está
positivamente correlacionada às variáveis: peso (Semana 9), conteúdo de gordura da
36
carcaça e insulina (TABELA 2). A maior correlação encontrada foi a da leptina com o
conteúdo de gordura da carcaça.
TABELA 2 -Análise de correlação entre leptina, peso (Semana 9), conteúdo de gordura
da carcaça e insulina.
r p
Peso (Semana 9) 0,557 <0,05
Conteúdo de gordura 0,927 <0,01
Insulina 0,820 <0,01
Através dos resultados obtidos na análise de correlação, partimos para a
análise de regressão linear, pelo método enter, entre a concentração de leptina, peso
(Semana 9), conteúdo de gordura da carcaça e concentração de insulina, encontrando o
R(quad)= 0,924, ou seja, 92,4% da variação das concentrações de leptina podem ser
explicadas pelas variações do peso (Semana 9), conteúdo de gordura da carcaça e
concentrações de insulina. Quando incluímos o fator treinamento na análise, ainda pelo
método enter, o valor de R aumentou para 93,7%. Ainda, ao fazermos a adequação das
variáveis, encontramos que os fatores peso final, insulina e treinamento não se
adequam ao modelo (p=0,929, p=0,613 e p = 0,199, respectivamente). Ao realizarmos a
regressão linear pelo método stepwise, pudemos confirmar o favoritismo da variável
conteúdo de gordura da carcaça para explicar as alterações das concentrações de
leptina. Em função disso, realizamos a análise de regressão linear simples entre as
variáveis concentração de leptina e conteúdo de gordura da carcaça, obtendo R(quad) =
0,860 com significância p = 0,000 (FIGURA 11).
37
y = 0,1079x - 2,8386
R2 = 0,86
0
2
4
6
8
10
12
14
0 50 100 150Gordura da carcaça (mg/g)
Lept
ina
(ng/
mL)
FIGURA 11-Relação entre o conteúdo de gordura da carcaça e concentração de leptina.
7.10 Leptina/Conteúdo de gordura corp oral
Realizamos ainda o cálculo de correção da concentração de leptina pela
quantidade de gordura corporal total dos animais (FIGURA 12), e constatamos que
ainda assim houve diferença significativa entre os grupos (0,05 ± 0,01 e 0,07 ± 0,02
ng/mL.mg; p = 0,008).
38
0,05
0,07
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10Le
ptin
a/G
ordu
ra (
ng/m
l.mg)
Grupo T Grupo C
*
FIGURA 12- Concentração de leptina plasmática / conteúdo lipídico total (média ±
desvio padrão) segundo grupo experimental; Grupo T (n=8); Grupo C
(n=10); *: p<0,05 ente grupos.
8 DISCUSSÃO
De acordo com os resultados do EXPERIMENTO 1, os animais não
apresentaram diferença significativa no consumo alimentar de acordo com o peso
(FIGURA 1), o que nos permitiu descartar a necessidade de se fazer pair feeding nos
experimentos seguintes. A média de consumo de ração de acordo com o peso dos
animais em todos os experimentos também foi igual para os dois grupos (FIGURA 3), o
que indica que o fato de serem exercitados ou sedentários não resultou em maior ou
menor consumo alimentar. Este resultado foi muito importante, na medida em que
diferenças na composição corporal e curva glicêmica pós-treinamento puderam ser
atribuídas somente ao nível de atividade física dos animais, e não a uma diferença de
consumo energético.
Não houve diferença de peso inicial dos animais entre os grupos
experimentais em todos os experimentos, o que indica que houve sucesso na separação
39
homogênea dos animais nos grupos experimentais, de acordo com o peso. Esta
condição é importante, para que a diferença de peso final entre os animais de diferentes
grupos experimentais possa ser atribuída à intervenção aplicada, e não a uma diferença
inicial, pré-intervenção.
A partir da quinta semana de intervenção, os animais sedentários
(controle) apresentaram maior peso corporal do que os animais treinados. Na última
semana, foi ainda observada a maior diferença entre o grupo treinado e controle,
indicando maior ganho de peso corporal dos animais sedentários ao longo da
intervenção (FIGURA 2). ZACHWIEJA et al. (1997) não observaram diferença
significativa no peso corporal de ratos treinados e sedentários, após sete semanas de
treinamento com exercício voluntário e, no entanto, os animais treinados apresentaram
maior consumo alimentar. Após 31 dias de treinamento com exercício voluntário,
COUTINHO, FEDIUC, CAMPBELL e RIDDELL (2006) também não encontraram
diferença no peso corporal final dos animais treinados em relação aos animais
sedentários, embora tenha havido aumento no consumo energético dos animais
treinados. Uma vez que os animais treinados apresentaram maior consumo alimentar
em gramas, acredita-se que esses animais tenham compensado o aumento do gasto
energético induzido pelo treinamento ao aumentarem a ingestão alimentar, resultando
em ganho de peso semelhante ao dos animais sedentários. Tais resultados não estão
de acordo com nosso estudo, uma vez que os ratos treinados apresentaram menor
ganho de peso e menor peso corporal final e nenhuma diferença no consumo alimentar
entre os grupos. LEVIN e DUNN-MEYNELL (2004) também observaram que ratos
treinados apresentaram menor ganho de peso corporal (24%) após seis semanas de
treinamento com exercício voluntário em relação a ratos sedentários. Os autores não
encontraram ainda diferença no consumo alimentar entre estes grupos. Após 10
semanas de treinamento com natação (1h/sessão, 5 sessões/semana, 5% do peso
corporal de carga), GOBATTO, MELLO, SOUZA e RIBEIRO (2002) não observaram
diferença no consumo alimentar dos ratos treinados em comparação aos ratos
sedentários, embora tenham apresentado menor ganho de peso do que os animais do
40
grupo controle. Isso indica que estes animais não aumentaram seu consumo energético
a fim de compensar o aumento do gasto energético induzido pelo treinamento físico
aeróbio.
COUTINHO et al. (2006) observaram menor adiposidade em ratos
treinados em relação aos sedentários, após um mês de treinamento com exercício
voluntário. FRIEDMAN et al. (1997) também observaram menor conteúdo de gordura
corporal e menor porcentagem de gordura corporal em ratos treinados, quando
comparados a ratos sedentários, após 8-12 semanas de treinamento em esteira, a 70%
do VO2máx. ZACHWIEJA et al. (1997), apesar de não encontrarem diferença no peso
corporal, observaram menor quantidade de gordura corporal em ratos treinados, após
sete semanas de treinamento com exercício voluntário. GOBATTO et al. (2002) também
observaram que animais treinados (10 semanas de treinamento com natação)
apresentaram menor conteúdo de gordura da carcaça quando comparados aos animais
controle. Nossos resultados estão de acordo com estes estudos e com estudos
anteriores conduzidos com humanos (HAYASE et al., 2002; KIMURA, TATEISHI,
SHIOTA, YOSHIE, YAMAUCHI, SUZUKI & SHIBASAKI, 2004; LEVIN & DUNN-
MEYNELL, 2004; MIYATAKI et al., 2004; PERUSSE et al., 1997). De acordo com o
conteúdo de gordura da carcaça medido (FIGURA 4), os animais sedentários
apresentaram maior quantidade de gordura corporal, indicando ainda que o maior ganho
de peso ao final do experimento do grupo controle pode ser atribuído ao aumento do
conteúdo de gordura corporal. Assim sendo, os ratos que se mantiveram sedentários,
tornaram-se mais obesos.
O consumo de oxigênio de repouso não foi diferente entre os dois grupos
(FIGURA 8). Foi sugerido que o treinamento aeróbio pudesse aumentar a taxa de
metabolismo de repouso através dos seus possíveis efeitos, tais como: aumento da
atividade dos hormônios da tireóide e do sistema nervoso simpático, aumento do fluxo
de substratos e aumento da síntese de proteínas (POEHLMAN, 1989). No entanto,
apesar de existirem estudos que comprovam aumento da taxa de metabolismo de
repouso após treinamento aeróbio (POEHLMAN, MELBY & BADYLAK, 1991; SJODIN,
41
FORSLUND, WESTERTEP, ANDERSON, FORSLUND & HAMBRAEUS, 1996), outros
estudos não observam essa alteração (BROEDER, BURRHUS, SVANEVIK &
WILMORE, 1992; WILMORE, STANFORTH, HUDSPEPH, GAGNON, DAW, LEON,
RAO, SKINNER & BOUCHARD, 1998). Essa discrepância provavelmente ocorre em
função do tempo da mensuração em relação à última sessão de exercício realizada,
uma vez que muitos estudos comprovam que a taxa de metabolismo de repouso
aumentada logo após a sessão de treinamento retorna a valores pré-treinamento 48
horas após a última sessão (WILMORE et al., 1998). Isso sugere que qualquer aumento
encontrado na taxa de metabolismo de repouso como conseqüência do treinamento
aeróbio é transitório (WILMORE et al., 1998). Nossos resultados estão de acordo com
essas afirmações, uma vez que não encontramos diferença estatística entre o consumo
de oxigênio de repouso entre os grupos 48 horas após a última sessão de treinamento.
Não houve ainda qualquer correlação entre o consumo de oxigênio de
repouso e as concentrações de leptina plasmática. Este resultado está de acordo com
os resultados demonstrados por ROSENBAUM et al. (1997), que realizaram análises de
correlação entre a taxa de metabolismo de repouso em homens e mulheres com peso
usual estável, após perda de 10% do peso corporal e após ganho de 10% do peso
corporal. Não houve correlação significativa entre a taxa de metabolismo de repouso e
as concentrações de leptina plasmática nos três grupos.
Observamos diferença significativa na área sob a curva glicêmica (AUC)
pós-treinamento entre os grupos (FIGURA 5). Os animais treinados apresentaram AUC
pós-treinamento menor que o grupo controle, indicando melhora da tolerância à glicose
em função do treinamento (TABELA 1). Uma vez que não houve diferença significativa
na AUC pré-intervenção, e que o consumo energético quanti e qualitativo foi igual para
ambos os grupos, podemos conferir ao treinamento tal efeito sobre a curva glicêmica.
Tais achados são coerentes com o encontrado na literatura. Segundo ZACHWIEJA et al
(1997), após sete semanas de treinamento com exercício voluntário, os animais obesos
e não-obesos treinados apresentaram AUC significativamente menor que seus
respectivos animais controle. CHIU, CHOU, CHO, HO, IVY, HUNT, WANG e KUO
42
(2004) observaram que, após três semanas de treinamento de natação (3h/sessão), os
ratos apresentaram menor AUC do que os animais controle com aumento da expressão
do GLUT-4 nos músculos gastrocnêmio e plantar.
Sabe-se que o treinamento físico por si só promove a melhora da captação
da glicose via contração muscular por mecanismos ainda não totalmente esclarecidos:
hipóxia local, aumento das concentrações de cálcio e o próprio processo mecânico da
contração muscular resultando na translocação do pool de vesículas de GLUT 4 para a
membrana da célula sem a necessidade de insulina (HENRIKSEN, 2002; PEREIRA &
LANCHA JUNIOR, 2004). Além disso, já são bem estabelecidos os efeitos crônicos do
treinamento aeróbio na melhora da captação de glicose pelo músculo esquelético por
mecanismos mediados pela insulina em indivíduos saudáveis e ratos normais. O
treinamento aeróbio moderado parece melhorar a tolerância à glicose, sensibilidade à
insulina e ação da insulina no transporte da glicose no músculo esquelético em modelos
de ratos normais. A ação aumentada da insulina no transporte de glicose no músculo
esquelético após o treinamento físico está associada ao aumento da expressão de
GLUT-4 (CHIU et al., 2004), às respostas adaptativas de enzimas envolvidas na
oxidação de fosforilação da glicose (PEREIRA & LANCHA JUNIOR, 2004) e ao aumento
da atividade da AMPK, a qual aumenta a oxidação de gordura, promovendo assim o
aumento da sensibilidade à insulina (GREENBERG & OBIN, 2006). Desta forma, os
resultados referentes à concentração de insulina plasmática de jejum também estão
coerentes com a literatura. Os animais treinados apresentaram menor insulinemia de
jejum do que os animais controle (FIGURA 7). Este resultado aliado à melhora na
tolerância à glicose indica os animais treinados apresentaram melhor sensibilidade à
insulina do que os animais sedentários.
Em relação à expressão gênica de leptina no tecido adiposo, observamos
que, em ambos os grupos, a expressão da leptina no tecido adiposo visceral (TAV) foi
maior que no tecido adiposo subcutâneo (TAS) (FIGURA 9). Tais resultados estão de
acordo com o encontrado na literatura. Segundo LI et al. (1997), OGAWA et al. (1995),
ZHANG et al. (2002) e ZHENG et al. (1996), em ratos, a expressão de leptina parece ser
43
maior TAV do que no TAS, embora em humanos pareça acontecer o oposto (HUBE et
al., 1996; RUSSEL et al., 1998). ZHANG et al. (2002) afirmaram que, em ratos normais,
as taxas de secreção de expressão gênica da leptina pelo tecido adiposo se dão,
principalmente, em função do volume do adipócito. Tal fato pode justificar a maior
expressão de leptina no TAV em ratos, uma vez que os adipócitos do TAS parecem ter
menor volume que os do TAV. A insulina parece também afetar a expressão gênica nos
diferentes depósitos de gordura. Diferentes níveis de expressão do receptor de insulina
(que pode ser utilizado como medida indireta da sensibilidade à insulina) em diferentes
tecidos adiposos podem ter efeitos diferentes na expressão da leptina nesses diferentes
depósitos no estado de jejum. Isso porque em ratos normais, o jejum provoca queda na
expressão de leptina no TAV (epididimal), porém tem pouco efeito no TAS (inguinal) (LI
et al., 1997; ZHENG et al., 1996), consistente com o fato da expressão do receptor de
insulina ser maior no TAV do que no TAS nesses animais (ZHANG et al., 2002).
Curiosamente, não observamos diferença na expressão do gene da leptina
entre o grupo treinado e o grupo controle tanto em relação ao TAV como ao TAS
(FIGURA 9), embora o grupo treinado tenha apresentado menor conteúdo de gordura
corporal total e menor insulinemia. Tal fato indica que ambos os grupos tinham a mesma
capacidade de síntese de mRNA após a intervenção. Isto quer dizer que o treinamento
aeróbio não promoveu uma alteração biomolecular nos animais treinados. FRIEDMAN
et al. (1997) constataram que após 8-12 semanas de treinamento aeróbio, além do peso
dos diferentes depósitos de gordura (TAS e TAV) ter sido menor, a expressão do mRNA
da leptina no tecido adiposo subcutâneo foi 85% menor em ratos treinados em relação
ao grupo controle. Os autores não avaliaram a expressão do mRNA no TAV. Já
ZACHWIEJA et al (1997) observaram significativa menor expressão do mRNA da leptina
no TAV e tendência à menor expressão no TAS, após sete semanas de treinamento
com exercício voluntário, além de menor volume dos adipócitos e menor conteúdo de
gordura corporal em função do treinamento. Uma vez que o aumento do volume da
célula adiposa parece estar associado à maior expressão da leptina, seria lógico dizer
que as diminuições da massa adiposa e do tamanho do adipócito levariam à queda da
44
expressão de leptina. No entanto, os animais tiveram atividade física restringida apenas
12 horas antes do sacrifício aproximadamente, o que poderia levar a alterações agudas
induzidas pelo exercício, justificando, talvez, tais diferenças encontradas.
Finalmente, pudemos encontrar diferença significativa das concentrações
de leptina plasmática entre os grupos após o treinamento (p = 0,009) (FIGURA 6). Uma
vez que não houve diferença significativa entre os grupos para consumo energético,
consumo de oxigênio em repouso e expressão do gene da leptina, descartamos
possíveis explicações para as alterações das concentrações de leptina através de
possíveis alterações destas variáveis.
Observamos, no entanto, diferenças significativas no peso final,
concentração de insulina e porcentagem de gordura corporal entre os grupos. Ao
realizarmos análises de correlação entre leptina, peso final, insulinemia e conteúdo de
gordura corporal, encontramos coeficientes de correlação significativos ao nível de 0,5%
(0,579; 0,820 e 0,922, respectivamente) (TABELA 2). Isso indica que a leptina está
fortemente e positivamente correlacionada a essas variáveis.
Além disso, ao fazermos a análise de regressão linear entre a
concentração de leptina, insulinemia, peso final e conteúdo de gordura corporal,
encontramos um R2 = 0,924, ou seja, 92,4% da variação da concentração de leptina é
explicada pela variação das variáveis insulinemia, peso final e porcentagem de gordura
corporal. Quando incluímos o fator treinamento na análise pelo método enter, o valor de
R2 aumentou apenas para 0,937. Ao fazermos a adequação das variáveis, encontramos
que os fatores peso final, insulinemia e treinamento não se adequavam ao modelo (p =
0,929, p = 0,613 e p=0,199, respectivamente). A análise de regressão linear feita para
concentração de leptina e treinamento possui R2 = 0,181, ou seja, apenas 18,1% das
alterações encontradas para a concentração de leptina puderam ser explicadas pelo
treinamento. Ao realizarmos a regressão linear pelo método stepwise, pudemos
confirmar o favoritismo da variável conteúdo de gordura corporal para explicar as
alterações das concentrações de leptina (R2 = 0,851 com significância p = 0,000).
45
De acordo com estas análises estatísticas, podemos afirmar que a menor
concentração de leptina plasmática em ratos treinados ocorreu, principalmente, devido
ao menor conteúdo de gordura corporal deste grupo em relação ao grupo controle.
Nossos resultados estão de acordo com muitos outros estudos encontrados na
literatura. THONG et al. (2000) analisaram os efeitos independentes do treinamento (12
semanas de corrida) e perda de peso em homens sedentários. As alterações das
concentrações de leptina estavam correlacionadas com alterações do tecido adiposo,
logo, os autores não encontraram efeitos significativos do exercício nas concentrações
de leptina. Após 20 semanas de treinamento em ciclo ergômetro, PERUSSE et al.
(1997) não encontraram alterações nas concentrações de leptina após correção pela
perda de massa gorda. LEVIN e DUNN-MEYNELL (2004) observaram concentrações de
leptina 35% menores em ratos treinados em esteira por seis semanas do que em ratos
sedentários. No entanto, os ratos treinados apresentaram gordura corporal menor em
36% em relação aos ratos sedentários. HAYASE et al. (2002) encontraram ainda
diminuições significativas nas concentrações de leptina plasmática em mulheres, após
10 semanas de natação, mas houve altíssima correlação entre a queda da leptina e da
redução da gordura corporal, sugerindo que a queda das concentrações de leptina após
o treinamento depende fortemente da perda de gordura corporal. Entretanto, ao
corrigirem a variação da concentração de leptina pela variação do conteúdo de gordura
corporal ([leptina] / conteúdo de gordura), observaram que ainda assim a concentração
de leptina estava significativamente reduzida.
Outros estudos, entretanto, demonstraram diminuições das concentrações
de leptina plasmática após treinamento físico crônico, independente da perda da massa
gorda (HICKEY et al., 1997; MIYATAKI et al., 2004; OKAZAKI et al., 1999; PASMAN,
WESTERTERP-PLANTENGA & SARIS, 1998). Tal qual HAYASE et al. (2002),
MIYATAKE et al. (2004) e RESELAND, ANDERSEN, SOLVOLL, HJERMANN, URDAL,
HOLME e DREVON (2001) corrigiram a variação da concentração de leptina pela
variação do conteúdo de gordura corporal após o treinamento aeróbio, e observaram
que a mesma continuava significativamente reduzida. Tais resultados indicam que outro,
46
ou outros, fatores, além do conteúdo de gordura corporal, modulam a diminuição
significativa das concentrações plasmáticas de leptina após o treinamento aeróbio. Os
autores sugerem ainda que a insulina seja a principal candidata a tal modulação.
PERUSSE et al. (1997) sugeriram que uma vez que não houve melhora da
sensibilidade à insulina após o treinamento, isso seria responsável pela ausência de
alterações nas concentrações de leptina após correção pela perda de massa gorda. Já
MIYATAKE et al. (2004), após o programa de treinamento, encontraram menores
concentrações de insulina e de leptina plasmática após correção pela perda de massa
gorda. Após um ano de treinamento aeróbio (3 sessões/semana, 60 minutos por
sessão), homens com síndrome metabólica (altas concentrações de lipídios no sangue,
pressão alta, etc.) apresentaram concentrações plasmáticas de leptina
significativamente reduzidas, mesmo após o ajuste dessas concentrações pela perda de
massa gorda e perda de peso (RESELAND et al., 2001). Os autores sugeriram ainda
que a melhora da sensibilidade à insulina possa ter promovido as alterações nas
concentrações de leptina encontradas. Nossos dados estão de acordo com estes
estudos. Após corrigirmos as concentrações de leptina pelo conteúdo de gordura
corporal, observamos concentrações significativamente menores do grupo treinado em
relação ao grupo controle (FIGURA 12).
Desta forma, observamos que, após treinamento aeróbio de oito semanas,
os animais apresentaram concentração de leptina plasmática significativamente menor
que os animais sedentários. Em função das análises de regressão realizadas, podemos
afirmar que esta menor concentração ocorreu, principalmente, devido ao menor
conteúdo de gordura corporal do grupo treinado em relação ao grupo controle.
Entretanto, embora tenhamos observado menores concentrações de leptina plasmática
nos animais treinados, não observamos diferença entre grupos na expressão do mRNA
da leptina tanto no TAV, como no TAS. Assim, pode-se dizer que o treinamento aeróbio
não alterou a capacidade da célula dos animais de expressar o mRNA para a síntese de
leptina, pois animais treinados e sedentários produziram mRNA da mesma forma. Por
alguma razão, então, podemos dizer que não houve estímulo suficiente para que os
47
animais treinados pudessem concluir a síntese protéica, ou, ainda, liberar a proteína
sintetizada, caso os animais dos dois grupos estivessem sintetizando leptina na mesma
quantidade, o que pode ter então resultado na menor quantidade de leptina circulante no
grupo treinado. Após a correção da concentração de leptina pelo conteúdo de gordura
corporal, ainda foi observada diferença significativa nas concentrações de leptina entre o
grupo treinado e o grupo controle. Assim, talvez, a maior concentração de insulina no
grupo sedentário tenha funcionado como estímulo suficiente para que houvesse a
conclusão da síntese protéica ou liberação da proteína sintetizada por este grupo, o que
pode não ter ocorrido no grupo treinado, uma vez que estes animais apresentaram
menores concentrações de insulina. De fato, segundo WALKER et al. (2005) e
BRADLEY e CHEATHAM (1999), a insulina parece estimular a secreção de leptina sem
necessariamente ocorrer o aumento correspondente da sua expressão gênica no tecido
adiposo.
Além de menor insulinemia, observamos ainda melhora da sensibilidade à
insulina após o treinamento e, bem como em outros estudos (DOUCET et al., 2000;
MIYATAKE et al., 2004; PASMAN, WESTERTERP-PLANTENGA & SARIS, 1998;
RESELAND et al., 2001), encontramos significativa correlação entre as concentrações
de leptina e insulina de jejum (r=0,820; p<0,001). Sabe-se que após diminuições das
concentrações de insulina no jejum ocorre diminuição na concentração de leptina
(AHIMA & FLIER, 2000; CAMMISOTTO et al., 2005; MEIER & GRESSNER, 2004). Tais
resultados indicam que, muito provavelmente, as diferentes concentrações de insulina
observadas devem ter tido forte influência na diferença das concentrações de leptina
plasmática observada entre os grupos treinado e sedentário. CONSIDINE (1997)
sugeriu que alterações no consumo ou gasto energético podem ser detectadas pelos
adipócitos e, assim, influenciar a síntese de leptina via insulina. Logo, um programa de
treinamento aeróbio que melhorasse a sensibilidade à insulina poderia alterar as
concentrações de leptina independente da massa adiposa. Entretanto, os mecanismos
para tal regulação ainda não estão bem estabelecidos.
48
Outra explicação seria a do aumento da sensibilidade à leptina induzido
pelo treinamento aeróbio. Sabe-se que leptina e insulina agem de forma agonista na
redução da ingestão alimentar e aumento do gasto energético via ação nos neurônios
hipotalâmicos (STOCKHORST et al., 2004). Menores concentrações de leptina e
insulina plasmática deveriam resultar então em maior apetite e, por conseqüência, maior
consumo energético no grupo treinado. Entretanto, os animais treinados, mesmo
apresentando menores concentrações de leptina e insulina, não aumentaram seu
consumo energético, embora tivessem maior gasto energético induzido pelo treinamento
físico aeróbio. MIYATAKE et al (2004) também observaram diminuição das
concentrações de leptina e insulina, e nenhuma alteração no consumo alimentar dos
sujeitos antes e após um ano de treinamento aeróbio, indicando que eles também não
compensaram o aumento do gasto energético induzido pelo treinamento aeróbio em
função de menores concentrações de leptina insulina. Os autores sugeriram então que o
treinamento físico poderia promover um “resetting” das concentrações de leptina, ou
seja, uma maior sensibilidade à ação da leptina, para que menores concentrações de
leptina pudessem ser mantidas em resposta a uma mesma quantidade de gordura
corporal.
9 CONCLUSÕES
Ratos treinados apresentaram menor peso corporal final e menor conteúdo
de gordura corporal. Não houve diferença na ingestão energética e no gasto energético
de repouso, sugerindo que estes animais não aumentaram seu consumo energético a
fim de compensar o aumento do gasto energético induzido pelo treinamento físico
aeróbio.
O treinamento aeróbio promoveu melhora na resposta glicêmica a uma
carga de glicose (menor AUC pós-treinamento no grupo treinado), e menor insulinemia
de jejum, o que indica que os animais treinados apresentaram melhor sensibilidade à
insulina.
49
Animais treinados e sedentários apresentaram maior expressão do mRNA
da leptina no tecido adiposo visceral (TAV) do que no subcutâneo (TAS). Entretanto,
não houve diferença na expressão do mRNA da leptina entre os grupos em ambos os
depósitos.
Em função das análises de regressão realizadas, pudemos afirmar que a
menor concentração de leptina plasmática ocorreu, principalmente, devido ao menor
conteúdo de gordura corporal do grupo treinado em relação ao grupo controle. No
entanto, após a correção da concentração de leptina pelo conteúdo de gordura corporal,
ainda foi observada diferença significativa entre o grupo treinado e o grupo controle,
sugerindo a presença de outros fatores moduladores das concentrações de leptina após
o treinamento aeróbio, sendo a principal candidata a tal regulação a insulina. Além
disso, outra possível explicação seria o aumento da sensibilidade à leptina induzida pelo
treinamento aeróbio.
Desta forma, pode-se dizer que a regulação da expressão e das
concentrações plasmáticas de leptina é complexa, uma vez que o treinamento físico
aeróbio não apenas tem efeitos na composição corporal, mas também na regulação
hormonal, mais especificamente na sensibilidade à insulina, os quais são fatores que
influenciam diretamente a expressão e concentração deste hormônio.
50
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