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BASES TERICAS PARA LAS

TCNICAS DE HIBRIDACIN

MOLECULAR

HEBRAS ANTIPARALELAS

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Puentes de hidrgenoentre las basesA=T (dos)Entre OHs del azcar y el agua

Hidroflicasfosfato y azcar afuera

Hidrofbicaslas bases nitrogenadas aromticas adentro

Fuerzas de apilamientoentre anillos aromticos de las bases

APAREAMIENTO o HIBRIDACIN DE HEBRAS COMPLEMENTARIAS

2,0 nm

5

5

3

3

INTERACCIONES NOINTERACCIONES NO--COVALENTESCOVALENTES

G C (tres)

Na+

Na+

Na+

Cargas negativas de los grupos fosfato de las hebras Cargas negativas de los grupos fosfato de las hebras deben ser neutralizadas para evitar repulsin deben ser neutralizadas para evitar repulsin

electrosttica y electrosttica y desnaturacindesnaturacin

Na+

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DENATURACIN y RENATURACIN DE AC. NUCLEICOS

SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS SE APAREAN o HIBRIDANDEPENDIENDO DE:

- la la secuenciasecuencia

-- temperatura temperatura

-- concentracin de concentracin de sal en el mediosal en el medio

ds (doble hebra)

ss (hebra simple)

Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos absorben a 260 nm, siendoadenina la que ms absorbe a esa longitud de onda y citosina la que absorbemenos.

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Al estar ms expuestas al solvente las bases nitrogenadas en un cido nucleicodesnaturado absorben ms y a 260 nm se observa un efecto hipercrmico

DNA desnaturado

DNA nativo

ds DNA: una solucin de 50 g/ml presenta una absorbancia a 260 nm de1.0ss DNA: una solucin de 33 g/ml presenta una absorbancia a 260 nm de1.0

TmTm = melting temperature o temperaturatemperatura mediamedia dedefusinfusin se define como: la temperatura a la cual aprox. lamitad de las bases de un cido nucleico inicialmente doblehebra se encuentran desapareadas.

Corrimiento hipercrmico

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Efecto Efecto de la de la secuenciasecuencia

Dado que el par GC tiene 3 enlaces puente hidrogeno y el par AT solo tiene 2, esms fcil o requiere menos energa desnaturar un DNA o hbrido rico en AT queuno rico en GCs.

Existen diferentes frmulas para calcular la temperatura de fusin (Tm) deun oligonucletido.Todos los mtodos dan diferentes resultados ya que todos son clculostericos.Los valores ptimos de Tm deben ser determinados experimentalmente.

1.1. (A+T) x 2 + (G+C) x 4 (A+T) x 2 + (G+C) x 4 Tm (C)Tm (C)

Ej: 5'-CTCTGCTTCGTCCAGCCACTT-3'

(9 x 2) + (12 x 4) = 18 + 48 = 66 Tm = 66C

La ms sencilla es la frmula de Wallace:

Sin embargo, esta frmula es vlida para oligos entre 18 - 24 bases yasumeasume queque lala reaccinreaccin eses realizadarealizada enen presenciapresencia dede unauna concentracinconcentracin dedecationescationes monovalentesmonovalentes dede 5050mMmM..

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Partidor Homlogo100% complementario

Partidor HeterlogoNo 100%

complementario

3 5

5 3

3 5

5 3

missmatcho mal apareamiento

Un par de bases desapareadas disminuye significativamente la estabilidad del hbrido

DNA templado

Oligonucletido o partidor

REACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENAREACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENA

PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRPCR

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Partidor directo o sentido

Partidor reverso o antisentido

Producto (amplicn)

35

53

PRIMER CICLO DEL PCRPRIMER CICLO DEL PCR

Mg2+

DNA doble hebra

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3Primer ciclo

Separarhebras

T

Hibridar partidores

Sntesis deDNA

elongacin

+ DNA polimerasa

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La Temperatura de desnaturacin depende del templado

Etapa 1:Etapa 1: DesnaturacinDesnaturacin de la doble hebra (separacin)de la doble hebra (separacin)

94 94 --95 C 95 C 30 a 60 s30 a 60 s

Etapa2:Etapa2: ApareamientoApareamiento de de partidorespartidores

~50 ~50 -- 60 C 30 60 C 30 -- 60 s 60 s

EtapaEtapa 3:3: SntesisSntesis o o extensinextensin de de partidorpartidor

72 72 C (30C (30--90 s)90 s)

El tiempo depende de la longitud del producto (~1min/1 kb)y la procesividad de la enzima

La Temperatura de apareamiento depende de la Tm delos partidores

Etapas de un cicloEtapas de un ciclo

Recin en el tercer ciclo aparece el producto

final el amplicndelimitado entre los 2

partidores

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5 15 20 25 30 Ciclos de amplificacinSt

En teora, ciclos sucesivos de la reaccin de amplificacin doblan la cantidadde DNA sintetizado de manera que debera acumularse exponencialmente elamplicn de inters en 2n, dnde n es igual al nmero de ciclos.

ESTO NONO OCURRE EN LA REALIDAD Y LA EFICIENCIA DE LA REACCION VA DISMINUYENDO EN

EL TRANSCURSO DE ESTA, PRESENTANDO UNA CURVA HIPERBLICA. Porqu?Porqu?

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Vida media de la Taq polimerasa a 95 C es aproximadamente 30 min.Esta es una de las razones por las cuales cae la eficiencia de lareaccin.

Tambin influye fuertemente la disminucin de los sustratos para laenzima (dNTPs, partidores) y el aumento de la concentracin detemplado.

Durante la reaccin de amplificacin tambin se acumula pirofosfato,el cual afecta negativamente la actividad de la enzima.

Diferencias entre PCR convencional y de tiempo realDiferencias entre PCR convencional y de tiempo real

convencional

Tiempo real

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PARMETROS QUE AFECTAN LA ESPECIFICIDAD, FIDELIDAD Y RENDIMIENTO DEL PCR

La reaccin de PCR debe ser optimizada en cada caso particular,especialmente cuando se aplica al diagnstico.

Una reaccin estndar contiene: TempladoTemplado DNADNA(1 g DNA genmico0,1-1ng DNA plasmidial en 10 l dereaccin2020 pmolespmoles dede cadacada unouno dede loslospartidorespartidores5050 MM dede cadacada dNTPdNTP11 unidadunidad dede lala enzimaenzima TaqTaq DNADNA polpolbufferbuffer enzimaenzima pHpH ptimoptimoconcentracinconcentracin dede MgMg++22 ((22 mMmM))

En general, dependiendo del largo y secuencia del segmento a amplificar, loscuatro dNTP deben usarse a baja concentracin (20-200M) para minimizar laextensin de partidores apareados en otras regiones del templado.

Curvas de magnesioCurvas de magnesio

Es importante optimizar la concentracin de Mg+2 pues afecta el apareamiento departidores, desnaturacin de las hebras, actividad de la enzima, fidelidad de copiay formacin de dmeros de partidor. La concentracin ptima debe ser determinadaexperimentalmente y en general flucta entre 00,,55 yy 33 mMmM MgMg++22.

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La Tm de los partidores y por lo tanto la temperatura de

apareamiento de stos depende de:

la longitudlongitud dede loslos partidorespartidores

el %% GG--CC

lala secuenciasecuencia de stos

la concentracinconcentracin salinasalina en el medio

Un criterio simple es partir probando con una temperatura de

apareamiento que est 55ooCC bajobajo lala TmTm de aquel partidor que

tiene la Tm ms baja.

Determinacin de la temperatura de Determinacin de la temperatura de apareamiento de los partidoresapareamiento de los partidores

Las condicionescondiciones inicasinicas yy lala mantencinmantencin deldel pHpH sonfundamentales para el xito de la reaccin deamplificacin.

La Taq ADN polimerasa es sensible a lasconcentraciones de iones magnesio y ionesmonovalentes.

La concentracin de Mg+2 depender de laconcentracin de dNTP ya que estos tienen lacapacidad de unir el in.

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Cul es la temperatura de apareamiento ptimaCul es la temperatura de apareamiento ptima??

Muy alta Muy alta -- muy poco productomuy poco producto

Muy baja Muy baja productos productos inespecficosinespecficos

Conclusin: Es necesario optimizarConclusin: Es necesario optimizar

La Tm de apareamiento a utilizar conun templado purificado (ej.plasmidio)no necesariamente coincide conaquella ptima para el templado enuna muestra biolgica ms compleja(ej. tejido).