11 高效液相色谱法 (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography

High Perssure Liquid Chromatography

High Speed Liquid Chromatography

自学“薄层色谱法”讨论题

1. 荧光薄层板的组分是什么？它是否用于荧光化合物的检测？2. 荧光薄层的展开动力？展开速度是否发生变化？3. 推导容量因子与比移值的关系？4. 什么是过压薄层色谱法？5. 薄层色谱扫描仪的工作原理。。。。。。。。

HPLC 是在经典液体柱色谱的基础上 ,

在色谱理论指引下，加以改进而发展起来的。特别是 GC 迅速成为一种仪器分析方法和社会需要分离分析难挥发复杂样品促进了 HPLC 的发展。近年来它以6-8% 的增长率发展，目前年发表论文数已超过 GC 。 2000 年仪器销售全球第一。

特性 经典 LC TLC/PC HPLC HPLC优势

进样 人工加样 点样 进样器 准确

溶液流动 重力 表面张力 高压泵 快速分离 ,重现性好

检测和定量 收集馏分检测

显色 连续检测 高灵敏度 ,自动化

实验结果 棒式图 斑点 色谱图 五高一广

表 11.1 三种不同形式液相色谱的这样特征

HPLC 和经典 LC 比较

HPLC 和经典 LC 主要差别在于高效固定相、输液设备和连续检测。从速率理论得到塔板方程：

uDk

qkdu

D

d

k

ku

D

d

u

DdH

s

f

M

P

M

PMP 2

22

2

2

)1()1(

22

涡流扩散、流型效应和停滞流动相慢传质均与 dp

有关，小的 dp 有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是颗粒细小。 固定相的慢传质与 df 有关，减少 df 有利于提高柱效。键合相色谱有效降低 df ，柱效进一步提高。

※ 经典 LC 填料的缺陷 填料通常是粒度大、范围宽、不规则 , 不易填充均匀 , 扩散和传质阻力大 , 谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。

※ HPLC 填料（高效固定相） 颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小 , 分离效率高。早期 HPLC 的固定相用涂渍的方法制备， df 大，这和 GC 一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代 HPLC 填料多用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。 ( 高效固定相带来什么新问题？ )

使用高效填料带来两个新问题：★ 柱流动阻力大大增大，需要采用高压泵输液★ 表面能很大，采用专业的装柱技术 目前经典 LC 主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。

※ HPLC 的特征 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器 , 从而实现了高效、高速和高灵敏度、定量准确 , 达到可与 GC 相媲美的分离分析性能。特别是结合计算机技术， HPLC 已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。

历史上出现不同的 HPLC 名称：★ 高压液相色谱 (High Pressure Liquid Chromatograph

y)

★ 高速液相色谱 (High Speed Liquid Chromatography)

★ 高效液相色谱 (High Performance Liquid

Chromatography)

总之， HPLC 与经典 LC 相比 , 使用时更方便 , 对操作者的依赖性更小。 HPLC 的高重现性和连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具有较高的准确性和精密度。 经典 LC 的特点：简便，填料一次使用。

高效液相色谱仪基本装置

流动相

进样阀

注入样品液

色谱柱检测器

色谱处理机

高压泵 流出液

高效液相色谱仪方框图

流动相→高压泵→进样器→色谱柱→ 检测器→积分仪 ◎ 流速控制 ◎ 阀进样 ◎ 温度效应

旋转式六通阀 a) 取样位（ load ） b) 进样位（ injection ）

一般来说，色谱和电泳仪的仪器流程基本相同。从构成仪器的功能块可分为六大系统：流动相供给和输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录或数据处理系统和辅助控制系统。由于流动相的性质不同，流路系统的仪器结构有所不同。但记录和数据处理系统相同。 ◆ 色谱检测器 ◆ 色谱数据处理

流 动 相供 给 和输送

进样 分离 检测记录、数据处理

色谱工作站（计算机）：控制显示

温 度 控制

收集

◆    流路系统（分析单元）：高、低压流路

◆    电路系统（控制单元）：信号传输与处理

色谱检测器（对流出物进行连续检测）

检测器实际上是一种换能装置 , 它将流动相中组分含量的变化 , 转变成可测量的电信号 ( 通常是电压 ), 然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能色谱检测器。理想的检测器应该是灵敏度高、线性范围大、对所有待测组分相同响应。一般检测器分为；● 热学、光学、电学、电化学。。。检测器● 总体性质检测器：热导、示差折射、电导 溶质性质检测器：氢焰、紫外、荧光● 通用检测器与选择型检测器●浓度型检测器和质量型检测器

检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。 ◆ 检测器的线性范围 大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性响应。实际上检测器的线性方程可表示为： y = a c , 只有在三个数量级的浓度范围内满足 0.98 1.02 的线性响应的检测器才是线性的。

◆ 灵敏度 色谱分析中有三种不同的灵敏度表示法 , 检测器本身的灵敏度 , 整个色谱体系的浓度灵敏度和质量灵敏度。 对于定量分析来说 , 重要的是色谱体系的灵敏度 , 因为它还包括柱子和仪器的其它部分的影响。

检测器的灵敏度 (CD), 实际上指检测限 , 即通常指相当于两倍噪音信号的溶质浓度。而色谱体系的最小检测限应是柱外效应 >10% 的最大进样体积所对应的二倍于噪音峰高所对应的样品浓度。而色谱分析最重要的是色谱体系的质量灵敏度 , 最小可测量： m = 2CCD , C 是柱内效应的标准偏差。 或 m = 6.25e(1＋ k) , e 是柱外效应的标准偏差。 ◆ 检测器的色区展宽 对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色区展宽是柱外效应的一个主要来源。一般仪器厂商在设计时已把检测器的色区展宽减少到最低程度。

色谱数据处理分离柱

检测器

记录仪

积分仪

色谱工作站

色谱仪信号输出方框图

色谱数据处理通过 A

DC转换器 , 把模拟信号转换成数字信号 ,

然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。

数据处理原理： ◆ 峰的检测

◆ 数据采集

◆ 基线校正和重叠峰的分离

自动处理 人工修正

● 峰的检测 峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：

切线

色谱峰的判断 最小面积

▲ 依照信 号斜率的变化检测信号

▲ 依照积 分 面 积检测峰信号

     保留时间和峰面积的计算

A a t

t n t

i ii

n

r r i

1

● 基线校正和重叠峰的分离 在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂移值参数来解决

色谱仪自动定性和定量分析 定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时 , 一般通过保留值来识别峰。但由于各种因素的影响 , 在重复多次分析中 ,

保留值会有一定的变化 , 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。

◆ “时间窗”法 (Time Window) ： tR±Δt

对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗” ，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。

◆ “时间带”法 (Time Band): tR(1±a%)

对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。

色谱数据处理机和色谱工作站的差别

色谱数据处理系统 / 机，积分仪功能：色谱数据处理

ADC模数转换接口

色谱工作站

功能：色谱数据处理 控制仪器参数ADC 和 DAC模数转换接口

色谱智能化和专家系统简介 色谱智能化是新一代色谱仪的发展方向 , 其特点是代替人的部分智能 , 选择分析方法和确定最佳色谱条件 , 并有条件地进行部分组分定性工作。这项工作不仅要求计算机技术 , 更重要的是 , 要加强色谱的基础理论研究 , 提高色谱操作技术 , 特别是制备出性能稳定的色谱柱 , 这样才能使操作规范化 , 以实现人工智能色谱。 色谱专家系统是色谱智能化的一个重要组成部分 , 它从人工智能和数值计算方法出发开展研究 , 应包括以下几大部分： ⑴分离模式和柱系统的选择； ⑵预处理方法和检测器的选择； ⑶分离条件最优化； ⑷在线色谱峰的定性和定量； ⑸色谱硬件的诊断。

色谱柱（固定相、填料） 色谱柱是色谱仪的心脏（起分离作用），其核心是优质固定相（填料） 。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好的色谱柱，即在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑： 固定相类型的选择 , 主要取决于样品分离模式； 柱填料的结构 , 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等； 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度 色谱柱的牌号 /厂商。

色谱柱的结构

色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接的特性。

柱规格

制备柱 分析柱

微径柱液相色谱 (Microbore HPLC)

毛细管液相色谱 (Capillary HPLC)

快速柱：高效短柱，如 4.6×30mm, 3mODS 柱 整体柱（ Monolithic column)

整体柱 (monolithic column) 是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相 , 具有制备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效分离等优点。 制备技术 :硅胶整体柱，如 Merck 公司的 Chromolith Performance RP - C

18 、 Silica ROD 和 Prep ROD ；有机聚合物整体柱，如 BIA Separations 的 CIM(Convective Int

eraction Medai) 等聚合物整体柱 应用： 高效液相色谱 (HPLC) 、毛细管电色谱 (CEC) 、微柱液相色谱 (μ- HPLC) 、固相萃取等系统上 , 成功地应用于生命科学、药物学、环境科学等领域的分离分析。

何为无死体积柱头连接？

无限直径效应（无限直径柱）？

柱填料

1 ．填料的特性

1 ）基质材料

① 无机基体：硅胶、氧化铝、氧化锆和二氧化钛等

② 交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等

③ 复合材料：无机基体复合一层聚合物

2）形状：球形和不规则

硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无机金属氧化物等。

OHSi ClSiR3+ Si O

(ROSiR3)

SiR3 + HCl

这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在 70℃以下， pH2 ～ 8范围内正常工作，应用广泛 .

硅烷化（≡ Si—O－ Si － C）键合固定相制备反应如下： （最常见类型！）

3 ）粒度及分布范围

4）孔径和耐压性

一般硅胶的孔径在 60-125A, 但大孔硅胶的孔径为 300-1000A 。硅胶填料的产品差异主要取决于：

① 微粒基质的制备过程差异；

② 基质和键合物反应的差异；

③ 柱装填技术专利的差异。

一些键合键新技术：

（ 1） RX 技术 (Tx technology) “ 碱性脱活”

（ 2 ） SB 技术 (Stabilized Bonding) “ 高覆盖量”

（ 3）封端技术 (End-Capping)

1 ）为什么要封端？

2）聚合物柱的特点？

封端 常规 聚合物

固定相类型 (Stationary phase)1 ）按色谱保留原理把填料分为：吸附剂、离子交换剂、涂敷固定液、分级孔径或交联度填料等。2）按特性分类① 硅胶：极性吸附剂② 键合固定相 （为什么要键合？）

采用硅胶表面键合技术 , 对硅胶微粒表面进行修饰 --- 硅烷化 , 使得硅胶表面带有不同的功能团 , 以适应不同的分离需要。目前在色谱填料中 , 键合相约占 78%( 其中 C18 占反相色谱的 72%), 硅胶约占 10%) 。

A. 基质： 200-300m2/g 的硅胶；聚合物 , 如聚苯乙烯和聚乙烯醇胶等。

键合相类型烷基： C1 、 C2 、 C3 、 C4 、 C6 、 C8 、 C12 、 C16 、 C18 、

C22 等反相柱；

苯基： C6H5-, 含有 - 相互作用；

氰基： -(CH2)3-CN, 带有给电子作用、羟基的氢键作用；正相、反相均可。氨基： -(CH2)3-NH2, 弱阴离子型键合相 , 可用于糖分析。 其它极性键合相还有：二醇基 Lichrosorb DIOL；硝基 Nucleosil-NO2 ；二甲胺基 Nucleosil-NMe2 等。

C. 键合层（单层和聚合物）

柱性能测试 : 应指定色谱条件和检测物质

1 ．理论塔板高度2．峰不对称因子：应小于或等于 1.23 ．相对保留值和分配比的重现性：精密度应优于 5%和 10%

4 ．柱阻力因子： = 0.1Pt0dp2÷(109L

2) ，多孔填料 500-10005. 折合塔板高度

流动相 (Mobile phase) 流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的保留值、分离选择性和柱效。 在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。 流动相的选择和优化是大多数液相色谱分析的主要研究工作，在合理的时间内 , 所用的流动相要能使样品各组分达到足够的分离。

1 ）什么溶剂适合于液相色谱？

2）流动相如何影响色谱分离？问题：

高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分）

合适选择性溶剂液 相色 谱溶剂选择范围

液相色谱流动相溶剂的选择步骤：● 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等● 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品， 2 ≤ k’≤ 5 ；复杂样品， 0.5 ≤ k’≤ 20● 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的 α值

所有溶剂

合适物理性质溶剂

合适保留值溶剂

流动相溶剂的选择 考虑溶剂的实用要求：在实际操作中所选用的流动相能保证色谱系统的分离过程可重复进行：溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求；溶剂应当不干扰检测器的工作；在制备分离中 , 溶剂应当易于除去 , 不干扰对分离组分的回收。1．与色谱系统的适应性：溶剂要有一定的化学稳定性 , 不与固定相和样品组分起反应。2．溶剂的纯度（包括毒性和价格） HPLC 级：色谱淋洗剂，波长—透光率 A.R. 级：主成分及杂质含量

3 ．溶剂的粘度要小： 一般 约为 (0.4-0.5) mPa·s , 最大也不超过 2mPa·s。粘度大 , 流动相传质慢 , 柱效下降；同时柱压增大。 4 ．与检测器匹配： UV 检测要求 mp 的背景吸收要低 , 所用溶剂的截止波长 (T<10% 对应的波长 )要与之相匹配。而 RI 检测则要求溶剂的折光指数与溶质的差别要大 , 以利于检测。5 ．沸点低：对制备色谱 , 采用低沸点溶剂时的固体残留物少 , 有利于提高纯度。6 ．其他要求：溶剂对样品要有一定的溶解度。 mp用前要脱气处理。便于更换和清洗。

液相色谱中的溶剂强度1. 溶剂强度是描述色谱性能的主要指标，表示溶剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间分子的作用力。目前还没有一个统一标准描述不同类型液相色谱体系中的溶剂强度，而是采用相对极性和溶解度参数等作为溶剂强度指标。1) 溶解度参数（参见溶剂选择性）2) 极性参数 P’ 根据固定相和流动相的极性大小 , 人们把液相色谱分成：

◆ 正相色谱：固定相极性大于流动相 (包括硅胶吸附色谱 )

◆ 反相色谱：固定相极性小于流动相

正相色谱：增加溶剂极性，保留时间增大或变小？

反相色谱：增加溶剂极性，保留时间又如何变化？

洗脱强度与溶剂极性分子之间相互作用有色散力、偶极作用、氢键和介电作用。某一溶质与其它分子相互作用大小的程度可以用极性大小表示。极性越大 , 它与其它分子的作用力越大。 “极性”溶剂容易吸收和溶解“极性”物质。

溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力 , 它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中 , “溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大 , 洗脱能力越小。

溶剂强度图

反相色谱

THF/H2O

ACN/H2O

MeOH/H2O

0 20 40 60 80 100

正相色谱

0 20 40 60 80 100

甲醇

戊烷

异丙基氯二氯甲烷

乙醚

乙腈

0 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75

混合溶剂的极性 在液相色谱中 , 一般溶剂的极性变化二个单位 , 溶质的分配比差不多能有十倍的变化。通过溶剂强度参数的计算 , 可以较好地较快地选择合适溶剂或调整流动相的极性范围。如：

① 正相色谱： k2’ / k1’ = exp [(P1’ －

P2’)/2]

② 反相色谱： k2’ / k1’ = exp [(P2’ －

P1’)/2] 在液相色谱常用混合溶剂作流动相。混合溶剂的P’具有加和性： P’ab = aP’a ＋ bP’b , 为某一溶剂的体积分数。

溶剂选择性分类 一般地说 , 改变溶剂比例可调节流动相的极性 , 从而使得组分的容量因子落在合适的范围内。但由于分子间相互作用的类型相同 , 分离因子变化不大。因此专门研究了各种溶剂的选择性 , 并将常用溶剂进行分类。

质子给予体 偶极相互作用

质子接受体

溶剂选择性分类三角形图

Xe

Xd

Xn

12

3

4

56

7

8

纯质子接受体

强偶极中性化合物

纯质子给予体

1 组：脂肪醚（纯质子接受体）2 组：脂肪醇（质子接受 -给予体）3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7 组：芳烃、芳醚、硝基甲烷8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）

质子给予体 偶极相互作用

质子接受体

反相色谱中的溶剂选择性

1甲醇 2

TFH3

4

5

乙腈 6

7

水8

质子给予体 偶极相互作用

质子接受体

正相色谱中的溶剂选择性

醚 1

2

3

4

二氯乙烷 5

乙腈 6

7

8

CHCl3 8

主溶剂：己烷

按溶剂分子的特殊作用类型分类 , 采用三个不同的常数表示：① Xe( 接受质子参数 )~ 易与含羟基的分子作用 ( 如酸类、酚类 )；② Xd(给质子参数 )~ 易与碱性化合物作用 (如胺、亚砜等 )；③ Xn( 强偶极参数 )~ 易与偶极距较大的溶质分子作用 ( 如硝基化合物、腈、亚砜和胺类等 )。 通常把常用溶剂分成八组。同一组溶剂的三个选择性参数相近，其选择性相似。当某一溶剂不能提供足够的分离选择性时 , 那么更换同组的其它溶剂亦不能提高选择性。改变溶剂时 , 只有从距离较远的溶剂组挑选 , 才可能使选择性有较大变化。因为当溶剂和样品分子的各种相互作用的相对重要性发生明显变化时 , 流动相的选择性才会发生最大程度的改变。

流动相的优化 流动相的优化主要是考察流动相组成对保留时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离选择性；保持流动相的低粘度 , 从而保证高的柱效。

在吸附色谱中混合溶剂选择规则：混合溶剂中极性强的组分含量大或小时 , 有最大的值；能与溶质发生氢键作用的溶剂 , 有较好的分离选择性。

梯度洗脱技术

●梯度洗脱的特点●梯度洗脱的主要条件●梯度洗脱的基本原理

梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成来调整组分的 k’值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。

为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？ 在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。

1 ．梯度洗脱的特点

（ 1 ）改善分离 , 加快分析速度；（ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于痕量组分的检测；（ 3）增加峰容量；（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留在柱上 , 保持柱性能长期良好；（ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的 UV 吸收程度稍有差异 , 可能会引起基线漂移。

2．梯度洗脱的主要条件

① A 流动相 /弱溶剂组成；② B 流动相 /强溶剂组成；③ 梯度时间；④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。

强溶剂 A%

time

12

5

3 ．梯度洗脱的基本原理 L.R.Snyder 建立了线性梯度洗脱方程： ln k’ = lnk’0 － b(t/t0)这里 , k’为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子； t 为梯度时间； b 为斜率 ----梯度连续变化的斜率； t0 为死时间。而洗脱时 k’和 k’0 与溶液组成间的关系为：

ln k’ = lnk’0 － S式中为强溶剂在洗脱液所占的体积分数； S 是与强溶剂和试样有关的参数。对 RPLC 分离小分子， S一般为 3-5 。 k’0 为 = 0 时的 P’值。结合上面二式 , 得

b = (St0) / t t0 = V0/t 在梯度完成时 , t = tG 。此时 , 为 A 和 B 两溶液中强洗脱剂组成的差 , 即 = , 这时： b = V0/(tGF) / tG 为梯度变化速率 , S值可由前式求得。可见 , b 值是可以求出的。求出 b 值后 , 可以初步确定一下各种物质的 k’ 值 , 为更好地选择分离条件提供依据。 确定最佳化的梯度分离条件的实现步骤：① 在全浓度范围内进行梯度洗脱 , 要确信欲分离物质在梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；② 确定梯度使用范围 , 的大小；

③ 选择几个梯度洗脱时间 tG, 确定 S值；

④ 确定 tG 下的最佳值 ( 小的 tG, 大的流速 )；⑤可以进行非线性梯度洗脱 , 使欲分离物与其它物质尽可能分开；⑥ 若分离效果不好 , 可以调整 pH 值、盐类型、有机溶剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。

梯度操作注意事项： ○两个流动相溶剂要能互溶，即极性不要相差太大 ○吸附色谱只能是在小范围内变化，因此在吸附色谱中很少用梯度洗脱（为什么？） ○折射检测器不适应于梯度洗脱（为什么？）

高效液相色谱柱的装填（资料）