高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography

Modern Modern Instrumental Instrumental

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@ Tarim University 2010

高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatogHigh Performance Liquid Chromatog

raphyraphy


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高效液相色谱法（ HPLC ）概述

高效液相色谱法

■ 高效液相色谱 (HPLC) 是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱 ( 液固色谱 ) ；离子交换色谱；尺寸排阻色谱 ( 凝胶渗透色谱 ) 。此外，还有亲和色谱、平板色谱 ( 薄层色谱 ) 等。

■ 早期液相色谱，包括 Tswett 的工作，都是在直径 1~5cm, 长 50~500cm 的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在 150~200μm 范围内。即使这样，流速仍然很低 (<1mL/min) ，分析时间仍然很长！


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高效液相色谱法（ HPLC ）概述

■ 当加压增加流速 ( 真空或空气泵 ) 时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度 Hmin 也相应增加了！或者说柱效下降了。

■ 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（ 3~10 μm ）！

■ 直到 60 年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。

H = A + B/u + c·u


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■ 高速： HPLC 采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。

■ 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。

■ 高灵敏度：检测器灵敏度极高： UV——10-9g, 荧光检测器—— 10-11g 。

高效液相色谱的特点


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■ 分析对象及范围： GC 分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的 20% ； HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的 80% 。

■ 流动相的选择： GC 采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小； HPLC 采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。

■ 操作温度： GC 需高温； HPLC 通常在室温下进行。

结论：从色谱分析的发展来看， HPLC 比 GC 更为有用、更具发展前途！

HPLC 与 GC 的比较


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HPLC 的应用

应用领域分析对象举例

环境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。

农业土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。石油烃类族组成、石油中微量成分。

化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。

材料液晶材料、合成高分子材料。

食品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃、农兽药残留。

生物氨基酸、肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子。

医药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。


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HPLC仪器包括：

■ 1. 高压输液装置 ;

■ 2. 进样系统 ;

■ 3. 分离系统 ;

■ 4. 检测系统 ;

此外还配有梯度洗脱、自动进样、自动收集和数据处理装置等。

HPLC 仪器


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HPLC 仪器


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高压输液系统 150 ～ 350×105Pa

■ 贮液器： 1-2L 的玻璃瓶，配有溶剂过滤器 (Ni 合金 ) ，其孔径约 2 μm ，可防止颗粒物进入泵内。

脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。


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高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。

■ 输液泵种类：恒压型和恒流型。

■恒压泵 ( 类似于风箱 ) 可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。

■ 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是往复式恒流泵。

高压输液泵


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往复式恒流泵


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在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

梯度洗脱

■ 线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。　　■ 阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。

梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。


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■ 高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送 A 和 B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。

高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。

高压梯度


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低压梯度

■ 低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。多元梯度泵的流路可以部分空置。


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与 GC 相比， HPLC 柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC 的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。

■1 ）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。

■2 ）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。

进样系统


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色谱柱

色谱柱的构成　　　　色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。　　色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是 5-10 粒径的球形颗粒。　　色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径 4.6mm ，长 250mm 。　　色谱柱：是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的 ,其结构如图所示。


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■ 紫外 - 可见光（ UV-VIS ）检测器原理：基于 Lambert-Beer 定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。

　　很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此 UV-VIS 检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于 UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有 UV-VIS 检测器。

　　用 UV-VIS 检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。

检测器


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检测器

■ 二极管阵列检测器（ diode-array detector, DAD ）：以光电二极管阵列作为检测元件的 UV-VIS 检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。


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■ 荧光检测器

许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比 UV 检测器高 2~3个数量级。

检测器


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HPLC 组成介绍


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分配色谱

■1. 原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。

■2. 流动相 :HPLC 分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。

高效液相色谱方法


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■3 固定相

原则上，用于 GC 的固定相也可用于 HPLC 作固定相。但 HPLC 固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：β,β’-氧二丙腈 (ODPN) 、聚乙二醇 (PEM) 、三甲撑二醇 (TMG) 、十八烷 (C18) 、角鲨烷 (SQ) 。

根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。

1 ）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型 (0.5-1.5% 涂布量 ) 或全多孔型载体 (5-10% 涂布量 )上形成的液液色谱固定相。


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2 ）化学键合固定相

化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。

对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：


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C18 填料的合成


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C18 填料的合成


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正相和反相键合色谱法


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正相和反相键合色谱法


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注意：“失浸润”现象


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液相色谱分离模式的选择


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分析方法


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分析条件的选择


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实例


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实例改变 K’


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实例改变选择性 α


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实例离子抑制： PH 值的影响


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梯度


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其它方面


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作业


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Thank Thank You!You!

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