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RESUMEN

Un avance en el desarrollo de un protocolo de micropropagación para plantas de roble (Tabebuia rosea)ha sido logrado con el fin de producir masivamente clones de esta especie. Para determinar el mejortratamiento de desinfección superficial el efecto de tres concentraciones (1%, 2% y 3%) de hipocloritode sodio con tres tiempos (5, 10 y 15 min) de exposición de los explantes consistentes de brotes axilaresde 2-3 cm de longitud fueron evaluadas después de establecidos en medio ½ MS con (en mg L-1) mioinositol (100), sacarosa (30,000), tiamina HCl (0.4) y TC agar (8,000) (Sigma Co.). Cinco tratamientos(0.00, 2.22, 4.44, 8.88, 17.76 µM BAP) fueron utilizados para determinar las mejores condiciones parala multiplicación, mientras que usando el mismo medio de establecimiento, el efecto de seis tratamientos(0.00, 1.35, 2.69, 4.03 y 5.37 µM ANA) fueron analizados para evaluar el enraizamiento in vitro de losbrotes micropropagados. Los tratamientos fueron repetidos 15 veces y se distribuyeron usando un diseñocompletamente al azar. Brotes micropropagados con y sin enraizamiento in vitro fueron transferidos exvitro. Hipoclorito de sodio al 3% durante 10 minutos fue el mejor tratamiento de esterilización superficial.La mejor tasa de multiplicación se obtuvo con 17.76 µM BAP mientras que el mayor enraizamientoocurrió en presencia de 5.37 µM ANA. El enraizamiento in vitro fue necesario para la recuperación deplantas ex vitro donde se debe seguir trabajando para aumentar los porcentajes de recuperaciónmostrados.

Palabras claves: Micropropagación, enraizamiento in vitro, ex vitro, citocinina, auxinas.

ABSTRACT

A significant advance for oak (Tabebuia rosea) micropropagation has been developed in order to massivelypropagate clones. The effect of three sodium hypochlorite concentration (1%, 2% and 3%) at threetimes (5, 10 y 15 min) on surface disinfestations were evaluated using explants consisting of 2-3 cmaxillary shoots established on ½MS with (in mg L-1) mio inositol (100), sucrose (30,000), thiamine HCl(0.4) and TC agar (8,000) (Sigma Co.). Five BAP (0.00, 2.22, 4.44, 8.88, 17.76 µM) concentration were

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA PROPAGACION INVITRO DE ROBLE (Tabebuia rosea Bertol DC)

DEVELOPMENT OF AN IN VITRO PROPAGATION PROTOCOL FORROBLE (Tabebuia rosea Bertol DC)

Isidro E. Suárez1, Alfredo J. Jarma1 y Marledis Avila1

Recibido para evaluación: Septiembre 13 de 2006 - Aceptado para publicación: Noviembre 20 de 2006

1Universidad de Córdoba, Departamento de Ingeniería Agronómica y Desarrollo Rural. Carrera 6 No. 76 – 103,Montería–Colombia. Email: [email protected]. Tel: (4) 790 8023. Fax: (4) 786 0255

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evaluated for shoot multiplication and ANA at 0.00, 1.35, 2.69, 4.03 y 5.37 µM were evaluated forshoot rooting, both experiments had 15 replicates for treatment distributed in a complete randomizeddesign. In vitro multiplied and rooted shoots were transferred to ex vitro for acclimatization. Ten percentsodium hypochlorite at 10 minutes was the best surface disinfecting treatment. BAP at 17.76 µM inducedthe higher multiplication rate while rooting was better with 5.37 µM ANA. Only in vitro rooted shootssurvived to ex vitro conditions at a low rate indicating the need for further investigation to improve exvitro acclimatization.

Key words: Micropropagation, in vitro rooting, ex vitro, citokinins, auxins.

por pol í t icas es ta ta les d i señadas eimplementadas como son los programas decadenas productivas forestales que buscanestablecer una base forestal de 1.5 millonesha, la zonificación de áreas de explotaciónforestal, la conformación y modernización deempresas fo res ta les y e l fomento decondiciones para la exportación de bienes yservicios (Ramírez y Gómez, 1999; DNP,2003).

El éxito de las explotaciones forestales radicaen la producción de maderas de excelentecalidad que cumplan con los estándaresex ig idos por e l mercado nac ional einternacional, y al igual que toda actividadagrícola, la siembra de un material genéticode excelente calidad es el factor más decisivoen los resultados finales del proceso. Dentrode este componente, la tendencia de laforesteria moderna está dirigida hacia las iembra y cu l t ivo de c lones de a l torendimiento adaptados a ambientesespecíficos que permitan obtener los mayoresrendimientos expresados en términos decalidad, volumen y uniformidad del productoy el tiempo a cosecha (Murillo, 2004). Laaplicación de técnicas biotecnológicas eneste campo ha favorecido la producciónclonal masiva y e l es tablecimiento deplantaciones clonales de especies forestales(Carrizosa et al., 1994; Nadgauda, 1999;Gamboa y Aldenour, 1999; Chalupa, 2002;Ndoye e t a l . , 2003) ; s in embargo, suaplicación en forestales nativos como el robleha sido poca (Castro et al., 1999). El presentetrabajo ha tenido como objetivo desarrollarun protocolo para establecer, multiplicar y

INTRODUCCION

El roble (Tabebuia rosea Bertol DC) es unaplanta d ico t i ledónea de la fami l iaBignonieaceae con una altura de hasta 30 my diámetro del fuste a la altura del pecho dehasta 1 m, con flores hermafroditas y semillasaladas para favorecer la diseminación por elv iento (CONABIO, 2006; USDA-GRIN,2006). Esta planta es una de las especiesforestales nativas de Colombia con mayorpotencial para la explotación comercial porsu duramen marrón pálido con bandas quevan desde los tonos grises hasta los amarillosdorados, y líneas marrón oscuro con bandasdel mismo color . Adic ionalmente , lascondiciones físicas de densidad y mecánicasde flexión, compresión, cizalladura y durezaentre otras permiten catalogarla como lacuar ta madera de mejor ca l idad en e lmercado después de la caoba (Swieteniamacrophylla), el cedro (Cedrela odorata) y laceiba tolúa (Bombacopsis quinata) (Colorado,2003).

Las s i tuac iones ac tua les como lasrestricciones impuestas por las autoridadesa la explotación de madera prevenientebosques naturales, el incremento de lademanda de madera en e l mercadointernacional y los incentivos ambientales yeconómicos por captura de dióxido decarbono han convertido los cultivos forestalesen una de las actividades agrícolas con mayorfuturo económico, a lo cual nuestro país noha sido ajeno. En Colombia, la inversión encultivos forestales vienen siendo estimulada

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA PROPAGACION IN VITRO DE ROBLE (Tabebuia rosea Bertol DC) . . .

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adaptar p lan tas micropropagadas encondiciones in vitro con miras la producciónclonal mas iva de p lan tas para e lestablecimiento de cultivos comerciales.

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal, desinfección super-ficial y establecimiento in vitroPlantas de 2 a 3 años de edad fueronestablecidas en recipientes con un sustrato(1:1:1, arena:suelo:cascarilla de arroz) ymantenidas en una casa malla cubierta conpolisombra del 50%. Con el fin de inducir elcrecimiento de yemas axilares, las plantasfueron decapitadas a una altura de 1 maprox imadamente y t ra tadas cada dossemanas con una solución 1mM de kinetina.Los explantes iniciales consistieron de brotesor ig inados a par t i r yemas ax i la res deaproximadamente 2 cm que fueron aislados,lavados durante 1 h con agua potabledirectamente de la llave y posteriormentesumergidos en una solución de 3 g L-1 defungicida Dithane® y Rifampicina® en dosisde 300 mg L-1 durante 20 minutos. Paradeterminar el mejor método de desinfecciónsuper f ic ia l , se eva luó e l e fec to de untratamiento control absoluto consistente deenjuague con agua destilada estéril por 10minutos, tres concentraciones de hipocloritode sodio (1%, 2% y 3%) y tres tiempos deexposición (5, 10 y 15 minutos), todos lostratamientos fueron suplementados con 5gotas de Tween 20® L-1 y los tratamientos conhipoclorito fueron finalmente enjuagados contres cambios de agua estéril en condicionesasépticas en el interior de una cámara de flujolaminar.

Los explantes tratados fueron establecidos enmedios de cultivos semi sólido de Murashigey Skoog (MS) (1962) diluido a la mitad (1/2MS) suplementado con (en mg L -1) mioinositol (100), sacarosa (30,000), tiamina HCl(0.4) y TC agar (8,000) (Sigma Co.). Unexplante fue establecido en cada recipiente

de v idr io de 125 cc de capacidadconteniendo aproximadamente 30 ml demedio de cultivo; posteriormente, los frascosfueron cubiertos con una capa de papela luminio , se l lados con Para f i lm® yalmacenados a una temperatura de 25°C conuna intensidad lumínica de 40 µmol m-2 s-1

por un per íodo de 12 horas d ia r iassuministrada con lámparas de luz blancafluorescente. Aquellos explantes que no secontaminaron o fallaron fueron transferidosa medios de cultivo fresco cada 3 a 4 semanashasta que mostraron signos de adaptación.

Multiplicación in vitroCon el fin de determinar el mejor tratamientopara la producción de nuevos tallos a partirdel crecimiento repetido de yemas axilares,explantes consistentes de segmentos nodalesde aproximadamente 1.5 cm de longitud conal menos un par de yemas opuestas fuerontransferidos a un medio de cultivo similar alde la e tapa de es tab lec imiento perosuplementado independientemente con unt ra tamiento cont ro l abso lu to y cua t roconcentraciones (2.22, 4.44, 8.88 y 17.76µM) de BAP. Los t ra tamientos , fueronrepetidos 15 veces cada uno y distribuidosutilizando un diseño completamente al azar.Al final de la cuarta semana, se registró elnúmero de nuevos tallos producidos por cadaexplante y la longitud promedio de losnuevos tallos originados, el experimento fuerepetido una vez. Los datos obtenidos seanalizaron por medio de un análisis devarianza con base en el modelo estadísticoYj = µ +ai + ei; donde µ correspondió alpromedio general, i correspondió al efectodel tratamiento para inducir la multiplicacióncaulinar y e correspondió efecto del errorexperimental. Una vez realizado el análisisde varianza, los promedios fueron separadosmediante la prueba de Tukey (0.05).

Enraizamiento in vitroLos ta l los micropropagados fuerontransferidos a condiciones ambientales y unmedio semi sólido similar al del estado de

TEMAS AGRARIOS - Vol. 11:(2), Julio - Diciembre 2006 (52 - 62)

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es tab lec imiento pero suplementadoindependientemente con un tratamientocontrol absoluto y cuatro concentraciones(1.35, 2.69, 4.03 y 5.37 µM) de ácidonaftalenacético (ANA). Los tratamientosfueron distribuidos utilizando un diseñocompletamente al azar y después de cuatrosemanas de cultivo, se registró el número deexplantes que produjeron raíces, se calculóel porcentaje de enraizamiento por cadatratamiento, el número promedio de raícesproducidas por cada explante y la longitudpromedio de las raíces producidas en cadauno de los tratamientos evaluados. El análisisde los datos se realizó con un análisis devarianza con base en el modelo estadísticoYj = µ +ai + ei; donde µ correspondió alpromedio general, i correspondió al efectodel tratamiento de enraizamiento y e fue elefecto del error experimental. Los promediosfueron separados utilizando una prueba deseparación de medias de Tukey (0.05).

Transferencia a ex vitroLas plantas micropropagadas directamente dela etapa de multiplicación y otras enraizadasin vitro fueron transferidas en bandejasconteniendo un sustrato desinfectado conproporciones 1:1:1 de arena, cascarilla dearroz y suelo. Para aquellos brotes s inenraizamiento, se evaluó el efecto de untratamiento control y tres concentraciones(2.69, 5.37 y 10.74 mM) de ANA diluidas enagua destilada para evaluar el efecto en elenraizamiento y la recuperación final deplantas adaptadas, sumergiendo la base delos brotes en la solución de ANA por unminuto. Todas las plantas fueron colocadasen una casa malla con polisombra del 30%de transmisión de luz y riegos intermitentesde 30 segundos cada doce minutos durantelas primeras dos semanas. Posteriormentefueron transferidas a otra área de la mismacasa malla cubierta con polisombra del 70%de transmisión de luz y 4 riegos de 30segundos por día. Al f inal de la octavasemana se registró el porcentaje de plantasque sobrevivieron.

Preparación de medios de cultivo yesterilizaciónEl pH de todos los medios fue ajustado a 5.7– 5.8 con KOH o HCl previo a la adición deagar, posteriormente los medios fueronesterilizados en un autoclave a 121°C y 1.1kg cm-2 por un período de 15 minutos yfinalmente vertidos en los recipientes.

RESULTADOS

Desinfección superf ic ia l yestablecimiento in vitroLos resultados del experimento de esterilizaciónsuperficial permitió confirmar que el uso dehipoclorito de sodio fue necesario para obtenerexplantes libres de contaminantes superficialesal compararse con el tratamiento control dondese observó contaminación en todos losexplantes (Tabla 1). El tratamiento que permitióobtener el mayor porcentaje de explantes libresde contaminación fue el que consistió de unaconcentración de 3% de hipoclorito de sodiocon un tiempo de exposición de 10 minutos(Figura 1A). Dentro de los tipos de agentescontaminantes presentes, los más frecuentesfueron los hongos, que de acuerdo con laidentificación realizada en el laboratorio debiotecnología de la Universidad de Córdobacorrespondieron a especies de los génerosFusarium, Verticillium y Cladosporium. Losdatos registrados con relación a la fitotoxicidadcausada por el tratamiento de desinfección, nomuestran una relación consistente con las dosisde desinfectante ni los tiempos utilizados.

La presencia de contaminantes tanto externoscomo internos afectan el desempeño de losexplantes una vez establecidos en condicionesin vitro haciendo indispensable el uso técnicasque permitan la detección de patógenossistémicos y su desinfección superficial (Leiferty Cassels, 2001; Suárez et al., 2003). Ladesinfección de explantes aislados de plantasleñosas perennes ha sido siempre una de laslimitantes más severas para el establecimientoin vitro de este tipo de especies reportándose


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Control (Agua estéril durante 10 minutos) 100 0

1% durante 5 minutos 96 10









Tabla 1. Efecto de diferentes tratamientos de desinfección superficial sobre la contaminación in vitrode explantes de roble (Tabebuia rosea).

Concentración de hipoclorito de sodio y tiempo Contaminación (%) Fitotoxicidad (%)de exposición de los explantes al tratamiento

Figura 1. Micropropagación de roble (Tabebuia rosea). A = Establecimiento de explantes, B =Contaminación tardía de tejidos, C = Multiplicación de brotes, D = Planta micropropagada y enraizada,E = Formación de raíces adventicia en la base de los brotes micropropagados y F = Plantasmicropropagadas adaptadas a condiciones ex vitro.

A B C

D E F

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contaminaciones mayores del 90% en explantesde guayaba dulce (Psidium guajaba - Mirtaceae)(Viloria et al., 1993), caoba y cedro (Abdelnoury Muñoz, 1997). Los resultados del presenteestudio muestran que las contaminaciones deexplantes de roble establecidos en condicionesin vitro tuvieron comportamientos similares alos reportes citados. Adicionalmente, los datoscolectados indican claramente que losenjuagues previos con fungicidas y bactericidascomplementados con la desinfección superficialcon hipoclorito de sodio no son suficientes paraeliminar completamente los contaminantespresentes en la superficie de los explantes;incluso, observaciones posteriores (Figura 1B)permitieron detectar la presencia decontaminaciones en explantes sanos después devarios subcultivos debiéndose probablementea infecciones de expresión tardía. No obstante,nuevos reportes consignan avances en elmanejo de la desinfección superficial deexplantes de especies leñosas perennes; Avila(2004) reporta una disminución significativa delnúmero de explantes contaminados de abarco(Cariniana pyriformis – Lecythidacea) y cedrotratados con el desinfectante GARHOX 30®

comparados con tratamientos conconcentraciones de hipoclorito de sodiosimilares a las usadas en el presente estudio.

Multiplicación in vitroEl desarrollo de los nuevos brotes se produjo apartir de las yemas axilares presentes en losexplantes (Figura 1B). El análisis de varianzapermitió concluir que se presentaron diferenciasestadísticamente significativas (Pr< 0.0001)como efecto de los diferentes tratamientos conrespecto a la variable número de nuevos brotesproducidos por explante, observándose que elmayor número promedio de nuevos brotesocurrió cuando el medio de cultivo fuesuplementado con las dosis más altas de BAP(4.44, 8.88 y 17.76 µM), mientras que losvalores más bajos para la misma variable seregistraron cuando los explantes fueroncultivados en presencia de la dosis mínima deBAP (2.22 µM) y el tratamiento control (Figura2). Al analizar los datos correspondientes a lavariable longitud promedio de los nuevos brotes

producidos, se concluyó que se presentarondiferencias estadísticamente significativas (Pr=0.0317), donde los tallos producidos a partir delos explantes cult ivados en los mediossuplementados con BAP desarrollaron unamayor longitud que aquellos que crecieron apartir de los explantes cultivados en presenciadel tratamiento control (Figura 2).

La producción repetida de nuevos tallos apartir de yemas axilares, es uno de los efectosmás espec taculares de la ad ic ión deci toc in inas en e l medio de cul t ivo deexplantes con meris temos axi lares pre-ex i s ten tes y una de las es t ra teg iasbiotecnológicas que más ha contribuido a lapropagación clonal de especies forestales(Ahuja, 1992; Kane, 1996; Castro, 1999). Enel presente estudio, los resultados obtenidospermiten af irmar que el suplemento decitocininas en el medio tuvo un efectofavorable a l incrementar de fo rmasignificativa el número de nuevos brotesdesarrollados, resultados que se presentaronen proporciones comparables a otras especiesforestales y leñosas perennes. Por ejemplo,Daquinta et al. (2001) utilizando explantesconsistentes de yemas obtenidas a partir debrotes enraizados, reportaron que el efectocombinado de kinetina (1.83 µM) con BAP(4.44 o 6.66 µM) indujo una tasa de 2.4 a2.6 nuevos brotes por explante en un períodode 6 semanas. Posteriormente, Castro et al.(2002) reportaron que la mayor tasa demultiplicación en teca (Tectona grandis) seobtuvo cuando los explantes consistentes demeristemos apicales obtenidos de brotesepicórmicos fueron cultivados en un medioMS suplementado con 2.22 µM de BAP.Biroscikova et al. (2004) experimentando conexplantes de árboles adultos de olmo (Ulmusglabra), aumentaron de 3.05 nuevos brotespor explante con suplemento de BAP a 5.08nuevos brotes por explante con BAP encombinación con tidiazuron (TDZ). Otrosresultados indican que no solamente elsuplemento combinado de citocininas sino lacombinación de citocininas y auxinas tieneefectos favorables en la multiplicación de


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algunas de estas especies, como lo reportadopor Tiwari et al. (2002) quienes observaron lamayor tasa de multiplicación en teca (Tectonagrandis) cultivando los explantes en medio MSsuplementado con 2.22 µM de BAP y 0.57 µMde ácido indolacético (AIA). Bunn et al. (2005)utilizaron una dosis de 0.57 µM de AIA encombinación con 0.5 µM de zeatina paramultiplicar meristemos axilares obtenidos deplantas de Eucalyptus phylacis regeneradas encondiciones in vitro. Los anteriores resultadosindican que las tasas de multiplicaciónobtenidas en el presente trabajo están enconcordancia con aquellas reportadas para lamayoría de especies forestales, las cuales porsu misma naturaleza recalcitrante alcrecimiento en condiciones in vitro, sonmenores a otras plantas especialmente aquellasde consistencia herbácea (Amutha et al., 2006);sin embargo, los trabajos citados en especiescon mayor número de investigaciones en el

campo del cultivo de tejidos podrían ser unindicativo de que las combinaciones decitocininas o los suplementos simultáneos deauxinas y citocininas podría aumentar las tasasde multiplicación de roble, lo cual necesita servalidado experimentalmente para esta especie.

Enraizamiento in vitro y transferenciaa condiciones ex vitroLos datos registrados en la tabla 2 muestranque la presencia de ANA en el medio decul t ivo incrementa e l porcenta je deenra izamiento a l compararse con e lt ra tamiento cont ro l ; mient ras que lost ra tamientos donde se ad ic ionó ANApermitieron a todos los explantes cultivadosdesarrollar raíces (Figura 1C y 1D), sólo el52% de aquellos cultivados en ausencia dees te regulador desar ro l la ron ra ícesadventicias. El análisis de varianza aplicadoa los datos colectados para la variable


Figura 2. Efecto de diferentes tratamientos (1= Control absoluto, 2= 2.22 µM BAP, 3= 4.44 µM BAP, 4=8.88 µM BAP y 5= 17.76 µM BAP) sobre el número y la longitud de nuevos brotes producidos a partir deexplantes con meristemos pre-existentes de roble (Tabebuia rosea).

B

C

BC

A A A A

AB AB A

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número de raíces producidas por explante,permitió concluir que existieron diferenciassignificativas (Pr< 0.0001) como resultado delos tratamientos aplicados, mostrándose queel mayor número de raíces adventicias fueinducida cuando los brotes micropropagadosfueron cultivados en la concentración másalta (5.37 µM) de ANA, mientras que el menornúmero de raíces fue registrado para elt ra tamiento control . Con respecto a lavariable longitud promedio de las raícesproducidas en cada tratamiento, el análisisde varianza permitió encontrar diferenciasestadísticamente significativas (Pr= 0.039),mostrándose igualmente que las raícesinducidas a partir de los explantes cultivadosen presencia de ANA tuvieron una mayorlongitud que aquellas desarrolladas a partirde los brotes cultivados en el tratamientocontrol (Tabla 2). Sólo los brotes enraizadoslograron sobrevivir a las condiciones ex vitro;el porcentaje de supervivencia de las plantasmicropropagadas transferidas a condicionesex vitro fue del 12% al final de la cuartasemana y aquel las que sobrev iv ie ronmostraron hasta la semana 8 una apariencianormal en términos morfológicos (Figura 1E).

El estado III del proceso de micropropagacióntiene como función desarrollar en la plantamicropropagada los mecanismos necesariospara subsistir sin suplementos externos decarbohidratos mediante el desarrol lo yfuncionamiento de un s i s tema rad ica l

eficiente. Aunque en la mayoría de los casosse busca pasar d i rec tamente de lamultiplicación a la transferencia ex vitrocomo una forma de ganar eficiencia, laproducción de ra íces a fec tas igni f icat ivamente las posibi l idades derecuperación de especies leñosas perennesen el estado IV de la micropropagación (Laraet al., 2003; Kane, 1996). Los análisis de losresultados del presente estudio mostraron lanecesidad y suficiencia del suplementoauxínico para inducir buenos porcentajes deenraizamiento, adecuado número de raícespor explante y la proporcionalidad entre elnúmero de ra íces producidas y laconcentración de ANA, aunque aumentó eltamaño de las mismas lo cual podría causarestrés por daños de raíces al momento deltransplante a condiciones ex vitro. Efectossimilares de ANA en el enraizamiento in vitrode varias especies leñosas y herbáceas talescomo Prunus fruticosa y Prunus tormentosa(Pruski et al., 2003), Decalepis arayalpatra(Sudha et al . , 2005), Stevia rebaudiana(Suárez e t a l . , 2005) , Viburnumodoratassimum (Schoene y Yeager, 2005) yElaeagnus angustifolia (Iriondo et al., 1995)entre otros ha sido observado.

En a lgunas espec ies fo res ta les , e lenraizamiento in vitro es reemplazado por laapl icac ión de impulsos f i s io lóg icosconsistentes en la inmersión temporal de laparte basal de los brotes micropropagados en

*Promedios con las mismas letras no son diferentes de acuerdo con Tukey (0.05%)

Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de ácido naftalenacético (ANA) sobre el enraizamientode brotes micropropagados de roble (Tabebuia rosea).

Tratamiento Enraizamiento (%) Raíces por brote Longitud raíces (cm)

Control 52 1.8 C 0.62 B*

1.35 µM ANA 100 7.5 BC 1.55 A

2.69 µM ANA 100 10.5 ABC 1.60 A

4.03 µM ANA 100 15.7 AB 1.55 A

5.37 µM ANA 100 19.8 A 1.65 A

Pr - < 0.0001 0.039


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una solución de auxinas seguido por elinmediato transplante de los brotes a unsus t ra to en condic iones ex v i t ro . Es tametodología ha sido utilizada para enraizarex vitro plantas micropropagadas de tecasumergiendo la base de los tallos en unasolución con 9.8 mM de ácido indolbutírico(IBA) logrando un 80% de recuperación delas plantas transplantadas (Tiwari et al. ,2002). Castro et al. (2000) experimentandola misma técnica con brotes micropropagadosde teca usando una solución con 19.6 mMde IBA o la ap l icac ión de productoscomerciales en presentaciones de polvo endosis de combinadas de 4.9 mM de IBA y10.74 mM de ANA reportaron resultadossimilares. Sin embargo es necesario realizarmás estudios para validar o ajustar la utilidadde esta metodología a la adaptación ex vitrode plantas micropropagadas de roble. Lasba jas tasas de recuperac ión en lamicropropagación de especies leñosas hasido una de las grandes limitantes en laaplicación del cultivo de tejidos vegetales enforestales llegando en algunos casos a serinferior al 10% de recuperación (Castro et al.,1999); resultados que sugieren la necesidadde segui r inves t igando con e l f in deincrementar la eficiencia en la recuperaciónfinal de las plantas micropropagadas.

CONCLUSIONES YRECOMENDACIONES

● Los menores niveles de contaminación de

explantes de roble t rans fe r idos acondiciones in vitro se observaron cuandolos explantes fueron tratados con unasolución al 3% de hipoclorito de sodiodurante 10 minutos y luego enjuagadoscon agua destilada estéril.

● Las mayores tasas de multiplicación debrotes se presentaron cuando los explantesfueron cultivados en medio suplementadocon las concentraciones más altas de BAPpor lo que se recomienda evaluar dosismayores de este regulador.

● La presencia de ANA en el medio de cultivoes necesaria para aumentar el porcentaje deenraizamiento mientras que el mayornúmero de raíces por explante se observócuando los brotes fueron enraizados enpresencia de 5.37 µM de ANA.

● El bajo porcentaje de recuperación ex vitrode las plantas micropropagadas hacenecesario continuar investigando paraaumentar la eficiencia en la adaptación dea las condiciones ambientales normales.

AGRADECIMIENTOS

Los autores del presente trabajo deseanexpresar sus agradecimientos a la Oficina deInvestigación y Extensión de la Universidadde Córdoba por el soporte económico; elapoyo técnico de Irma Quintero, M.Sc.,Carmen Polo Tordecilla e Ivan Javier PastranaVargas es altamente apreciado.

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112-6. Desarrollo de Un Protocolo Para Propagacion In