הנדסאי סביבהמגמת מעבדהחוברת

במיקרוביולוגיה סניטרית 4711 ט" מהמספר קורס

קדמי-ר מיה נחשון"ד: עריכה ועדכונים,הדפסה

2

17.09.08: עדכון אחרון

:זו מבוססת עלהאינפורמציה הכתובה בחוברת

.חיפה, הטכניון,חוברות מעבדה במיקרוביולוגיה

, מכללת אורט בראודה, טובה כהן' גבר מיכל מעוז ו" ד,חוברות מעבדה במיקרוביולוגיה

.כרמיאל

.עכו, מכללת הגליל המערבי, ר מובדא סמעאן"ד ,במיקרוביולוגיהחוברת מעבדה

, מכללת אורט בראודה, אברהם-ית בןר רונ" ד,חוברת מעבדה במיקרוביולוגיה של מזון

.כרמיאל

.מקורות מידע מדעיים מרשת האינטרנט

3

תוכן עניינים 5...............................................................................הוראות כלליות לעבודה במעבדה

6..........................................................קות בסיסיות במיקרוביולוגיההכרת טכני: פרק א

6.......................................................................................שימוש בפיפטות ופיפטורים

7.................................................................................................שימוש במיקרוסקופ

9.................................................................................טכניקות זריעה במיקרוביולוגיה

11.....................................................................................................זריעת בידוד

14......................................................................................)דריגלסקי(זריעת פיזור

pour plate(..........................................................................14(זריעה בתוך האגר

15.......................................................................................עריכת מיהולים עשרוניים

16..........................................................................................עריכת מיהולים כפולים

17....................................................................................................טכניקות צביעה

17.......................................................................................................צביעת גרם

19.....................................................................................................צביעת נבגים

21..................................................................................................צביעת קפסולה

22.......................................................................................צביעת חומרי תשמורת

23........................................................................................................הכנת מצעים

VRB......................................................................................................23הכנת

23........................................................................................הערות לעבודה במעבדה

24...........................................................................................ניסויים נבחרים: פרק ב

24...................................................................................הכנת מצעי מזון: 1ניסוי מספר

31.........................................................................................מורפולוגיה: 2ניסוי מספר

35...............................................................טכניקות זריעה במיקרוביולוגיה: 3ניסוי מספר

36.......................................................מיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית: 4ניסוי מספר

39............................................................ספירת מיקרואורגניזמים באדמה: 5ניסוי מספר

4

42.....................................השפעת פסטור ועיקור על מיקרואורגניזמים בחלב: 6ניסוי מספר

45......................................................השפעת כלור על תמותה של חיידקים: 7ניסוי מספר

48...............................בדיקת רגישות מיקרואורגניזמים לחומרים אנטיביוטיים: 8ניסוי מספר

51........................................................................................בדיקות מים: 9ניסוי מספר

MPN........................................................51בדיקת קוליפורמים בשיטת : חלק א9ניסוי

Membrane filtration(....................61(י שיטת הסינון "בדיקת איכות מים ע: חלק ב9ניסוי

70..........................................................ספירה מיקרוביאלית במוצרי מזון: 10ניסוי מספר

73..........................................................השפעת חום על תמותת חיידקים: 11ניסוי מספר

76....................................................................השפעת יובש על חיידקים: 12ניסוי מספר

77..................................................................... על חיידקיםpHהשפעת : 13ניסוי מספר

78.........................................................השפעת לחץ אוסמוטי על חיידקים: 14ניסוי מספר

79....................................................................יידקיםעקומת גידול של ח: 15ניסוי מספר

84..................................................... סיסטמטיקה–זיהוי חיידקים נעלמים : 16ניסוי מספר

90...................................................................................ים'בקטריופאג: 17ניסוי מספר

99.................................................................................................................נספחים

112.....................................................................................................מקורות ספרות

5

הוראות כלליות לעבודה במעבדה

. ולאסוף שיערל נעליים סגורותועלנ ,בגדים ארוכים, לוק מעבדה ללבוש חחובה )1

.אסורים בהחלט -במעבדה ושימוש בפלאפון עישון ,שתייה, להאכי )2

! דליק –אין לעבוד בכפפות לטקס במעבדה בקרבת הבונזן )3

.משפשוף עיניים ופה בידיים בעת העבודה במעבדהזהר יהיש ל )4

.ע מיד למדריךיהודיש ל) שפיכת חומר פתוגני(במקרה של תקלה )5

.שנמצא בכניסה למעבדה, הראשיבמקרה של שריפה יש לסגור את ברז הגז )6

.מבלי לעקרה, ניח על השולחן מחט בקטריולוגית שבה עבדתאין לה )7

.עדשות שמן אימרסיה נקה את העדשה בנייראחרי שימוש ב. שמור על ניקיון המיקרוסקופ )8

.הקפד להדגיר את התרביות במקום שנקבע לך באינקובטור )9

:ם לכךכלים המיועדייהקפד לפנות כלים משומשים למ )10

מי סבון לצנצנת המכילה -זכוכיות נושאות

למכלי הפלסטיק שליד הכיור-חרים ארלנמיירים וכלי זכוכית א, מבחנות, פיפטות

)פסולת ביולוגית (bio-hazzardלשקית צלחות פטרי

טיפים לסל האשפה

.נקה וסדר את שולחנך בגמר העבודה )11

.לפני צאתך מהמעבדה טול ידך במים וסבון )12

. בחוברת סיכום התוצאותרשום את התוצאות והמסקנות, רישום מדויק על עבודתךנהל )13

6

טכניקות בסיסיות במיקרוביולוגיההכרת : אפרק בביצוע תשמשנהשיטות אלה . ק זה יתוארו טכניקות שונות המשמשות במיקרוביולוגיהפרב

הרלבנטי הן יש להקפיד לקרוא את הרקע . ב של החוברתבפרקניסויי המעבדה המפורטים

.מעבדהכל לפני , מהחוברת והן מהרצאות הקורס

ופיפטוריםשימוש בפיפטותטווח הנפחים הניתן . ל" מ1 -לשאיבת נוזלים בנפחים קטנים מלרוב פיפטורים משמשים

לצורך שאיבת נוזלים בעזרת פיפטורים יש לחבר אליהם . י הפיפטור רשום על גביו"לשאיבה ע

.)עיקור (ם מסודרים בקופסאות פלסטיק והם עוברים סטריליזציההטיפי. חד פעמייםטיפים

קיימות פיפטות המאפשרות . ל" מ1 -לשאיבת נוזלים בנפחים גדולים מלרוב פיפטות משמשות

. )'ל וכו" מ10, ל" מ5( נפחים שונים שאיבת

רב-פיפטות זכוכית. פעמיות מקבלים כשהן ארוזות באריזת פלסטיק-פיפטות סטריליות חד

.והן עוברות סטריליזציה, עמיות מקבלים בתוך גליל ממתכתפ

.לצורך שאיבת נוזלים בעזרת פיפטה יש לחבר לקצה העליון משאבה

יש , בתום השימוש. נעשית בצורה סטרילית ליד בונזןאו טיפים יפטות פשאיבת נוזלים בעזרת

. או הטיפ לפח החד פעמיתלזרוק את הפיפטה

. לשני תרחיפים הנבדלים זה מזה בריכוז או בסוג החיידק פיפטה אואסור להשתמש באותו טיפ

. בידיים או בחלק המסומן של הפיפטהאסור לגעת בטיפ

משאבה פיפטות

טיפים פיפטורים

7

שימוש במיקרוסקופ תיאור. א

:חלקי המיקרוסקופ העיקריים מסומנים באיור הבא. במעבדה נשתמש במיקרוסקופ אור

המערכת הקרובה . י צינור"עדשות המחוברות זו לזו עשל המיקרוסקופ בנוי משתי מערכות

המערכת השניה ). כמסומן על גביה (מגדילה אותו הגדלה מסוימת) האובייקטיב(לפרפרט

עוצמת (יקטיב יי האוב"מגדילה את התמונה המוגדלת שהתקבלה ע) אוקולר(הקרובה לעין

כך שהדמות הנראית בעין היא בעלת הגדלה השווה , )ההגדלה מסומנת על גבי האוקולר

.למכפלת ההגדלות של שתי מערכות העדשות

השימוש הנכון. ב

ניתן לכוון את עוצמת האור . קופ בעזרת הכפתור המצוי בחלקו התחתוןיש להדליק את המיקרוס

. בעזרת הכפתור המצוי בצידו של המיקרוסקופ

מניחים את . בנתיב האור) x10(קטיב בעל ההגדלה הקטנה ביותר ימתחילים בעבודה כשהאובי

ההכוונה בעזרת ברגיי ) focus(ומכוונים את המוקד , על שולחן המיקרוסקופ)דוגמא (הפרפרט

בהגדלה הגדולה נראה רק אורך קטן במרכזו של שדה . עד קבלת תמונה ברורה, הגסה והעדינה

עינית

זרוע

מקור אור

צמצם

מיקוד עדין

מיקוד גס

עדשה

גלגל העדשות

בסיס

מהדקים שולחן

8

יש להסיט את , לפני העברה להגדלה הבאה, לכן. אשר התקבל בהגדלה הקטנה,הראיה

לאחר . הפרפרט עד אשר האזור המיועד לבדיקה מפורטת נמצא במרכזו של שדה הראיה

בעזרת בורג ההכוונה רקיש לחדד את התמונה ) x100 - וx40(ולה המעבר להגדלה בינונית וגד

. יש לשים טיפה קטנה של שמן אימרסיה על גבי הפרפרטx100 המעבר להגדלה לפני. העדין

כמודגם , כינוס קרני האור לעדשהי "היא לחדד את התמונה עשמן אימרסיה מטרת השימוש ב

:באיור

: X100גדלה שימוש בשמן אימרסיה בה

. קרני האור מתכנסות לתוך העדשה,עם שמן: מימין; קרני האור מתפזרות, ללא שמן:משמאל

הטיפול הנכון. ג

העדשות . ובפרט של העדשות והראי, יש לשמור על ניקיונם המוחלט של חלקי המיקרוסקופ

. יוחדלכן אין לנקותן אלא בעזרת נייר עדשות מ. עשויות מזכוכית אופטית רכה הנשרטת בקלות

אפשר לרחוץ את זכוכית העדשה במים , במקרה וטיפת חומר זר נדבקה לאחת העדשות

. כ לנגבן בנייר עדשות"מזוקקים ואח

למניעת חיכוך (וודא שהאובייקטיב הקצר ביותר נמצא בנתיב האור , עם גמר העבודה

).האובייקטיב בזכוכית המרכז

9

טכניקות זריעה במיקרוביולוגיהיש , כאשר רוצים לגדל מיקרואורגניזמים במעבדהולכן , ם נמצאים בכל מקוםמיקרואורגניזמי

. אוטוקלבהנקרא מכשיר כ משתמשים ב"בד. לפני השימוש בו, עליו הם נזרעיםלעקר את המצע

במשך התהליך נעשה . האוטוקלב הוא דוד מתכת היכול לעמוד בלחצים של מספר אטמוספירות

, כשהמצע מוכן .שר השמדת תאים וגטטיביים וספורות ומאפ1210C דקות בטמפרטורה 15-20

דבר זה . של המיקרואורגניזמים )המיקרואורגניזם הנזרע, מזרע( ניתן לזרוע עליו את האינוקולום

י מיקרואורגניזמים "כלומר שיטות המונעות זיהום של התרבית ע, דורש שימוש בשיטות אספטיות

כאשר .אוויר המכיל מיקרואורגניזמים מרחפיםהמקור הראשון לחדירת זיהומים הוא . מזהמים

יש לעשות זאת בצורה שמזהמים הנמצאים באוויר לא יחדרו , פותחים מבחנות או צלחות פטרי

, כ על ידי לולאה או מחט"העברה אספטית של תרבית ממצע אחד לאחר נעשית בד. לכלי

.וגית כמו בעפרוןיש לאחוז במחט הבקטריול. שעברה סטריליזציה בלהבת אש ממתקן בונזן

אופן האחיזה במחט בקטריולוגית

).עד שהופכת כתומה(יש לעקר את המחט היטב באש

מחט בקטריולוגית בלהבת בונזן עיקור קלות באגר י דקירות"ניתן לקרר ע .חשוב לקרר את המחט במקום סטרילי לפני לקיחת אינוקולום

.סטרילי באזור בו אין צמיחה של חיידקים או טבילה במצע מזון נוזלי סטרילי

לאחוז את המבחנה בעת פתיחת מבחנות יש להחזיק את הפקק בזרת של היד האוחזת במחט ו

.יש לפתוח את המבחנה רק ליד אש .זוויתב, ביד השניה

10

אופן פתיחת מבחנות י "יש לפתוח את הצלחת ע .להניח צלחות פטרי כשהמכסה כלפי מטה ומצע המזון כלפי מעלהיש

.יש לפתוח את הצלחת רק ליד אש .כך שהמכסה נותר על השולחן, אחיזה בתחתית

פתיחת צלחות אופן יש לאחוז בצלחת בצורה , ביצוע זריעה על גבי צלחתבעת לקיחת אינוקולום מצלחת או בעת

.יש לפתוח את הצלחת רק ליד אש .אנכית

אופן לקיחת אנוקולום לזריעה החלק הפנימי של הצלחת כלי הזכוכית או המצע , יש להימנע מלגעת ביד בחלקים הסטריליים

.המוצק או הנוזלי

לפי הצרכים של הניסוי או הבדיקה ,עים שונים בכלים שונים בכל פעםזורעים חיידקים על מצ

, כ לגידול מסה גדולה של מיקרואורגניזמים"זריעה לתוך מצע נוזלי נועדה בד. שרוצים לבצע

11

, יעילות ניצול הסובסטרט, מעקב אחרי פרמטרים שונים בשלבי הגידול של החיידק כמו זמן דור

בידוד או שמירת החיידק , כ לזיהוי אפיון"ת על מצע מוצק נועדו בדזריעו. 'יעילות יצור התוצר וכו

בכדי למנוע , בתנאים אספטיים ליד האש ועם כלים סטרילייםכל הזריעות מתבצעות . הרצוי

. זיהום של התרביות בניסוי

הוא מחט Quadloop. כ על ידי שימוש במחט בקטריולוגית"זריעת חיידקים נעשית בד, כאמור

ניתן ,זריעותביצוע לצורך .ת וסטריליה ארוזה פלסטיק ומגיעיהעשויה, תת חד פעמיבקטריולוגי

הזריעה . דמוי מגב,וזהו מוט זכוכית או מתכת המכופף בקצה. להשתמש גם במקל דריגלסקי

בדומה למחט . י מריחת דוגמה נוזלית בנפח ידוע על פני מצע מוצק בצלחת הפטרי"מתבצעת ע

המגיע , קיים אביזר זהה מפלסטיק, במקרה זה גם .אחרי השימושיש לחטא את המקל לפני ו

.ארוז בסטריליות

זריעת בידוד

על גבי מצע ) מכילה מין אחד של מיקרואורגניזמים(השיטה המרכזית לקבלת תרבית טהורה זו

הזריעה נעשית על ידי . בשיטה זו מפרידים מיקרואורגניזם מסוים מתוך אוכלוסיה מעורבת. מוצק

זריעת בידוד מבצעים ). streak plate technique( פסים על פני מצע המזון בעזרת המחט סימון

). תרביות טהורות(על מנת לקבל מושבות בודדות ) אינוקולום(לחיידקים הנלקחים ממקור מסוים

קבוצה של תאים שמקורה בתא אחד או נבג אחד או,ה של תאיםיהיא אוכלוסימושבה

.התחלקו מספר רב של פעמיםאשר , המחוברים זה לזה

או צמיחה , מוצר מוצק(או מסביבה מוצקה ) תרחיף(מקור החיידקים יכול להיות מסביבה נוזלית

).של חיידקים על אגר

מעקרים את המחט באש בין –המשותף לכולן . קיימות טכניקות שונות לביצוע זריעת בידוד

תתקבלנה , לאחר הדגרה .החיידקיםאת ריכוז ) למהול (להקטיןזריעה אחת לשנייה על מנת

.מושבות בודדות בקווי הזריעה האחרונים

) איורראה( :מהלך הזריעה

.י טבילה באגר" שורפים את המחט בלהבה ומקררים ע.המחט ביד ימין .א

).אינוקולום(לוקחים בעזרת המחט את המיזרע .ב

.)על השולחןהמכסה נותר (ניצבת קצת באלכסון, האגר ביד שמאללוקחים את הצלחת עם .ג

).1שלב ( על כשליש צלחתקווי זריעה אופקייםבעזרת המחט מעבירים .ד

.ל"שורפים את המחט ומקררים אותה כנ .ה

).2שלב (מעבירים קווי זריעה ניצבים .ו

.ל"שורפים את המחט ומקררים אותה כנ .ז

.)3שלב (מעבירים קווי זריעה אופקיים .ח

.ל"ורפים את המחט ומקררים אותה כנש .ט

12

).4שלב (וי זריעה ניצבים מעבירים קו .י

.)על המכסה (מחזירים את הפלטה למקומה .יא

.שורפים את המחט .יב

זריעת בידוד

אנו זורעים מהן למצעים על מנת לקבל , לאחר שהצלחנו לקבל מושבות בודדות בזריעת בידוד

.ולים לבצע בהמשך מבחנים נוספים ולזהות את החיידק סופיתמכאן אנו יכ. צמיחה רבה יותר

לצלחת פטריזריעה פשוטה מתוך מבחנה

.המחטאת יםרפוש .א

.הפקק נלקח בעזרת הזרת של יד ימין .מבחנה ביד שמאלאוחזים ב .ב

.מעבירים את פי המבחנה באש .ג

לאחר (המחטאת הצמיחה מעל פני האגר בעזרת או מגרדים קצת ) ממרק(לוקחים טיפה .ד

).קירורה באגר

13

.מעבירים באש את פי המבחנה .ה

.מחזירים את הפקק ומניחים את המבחנה .ו

חזיקים אותה מ ,)המחט כל הזמן ביד ימין( האגר בעזרת היד השמאלית צלחתלוקחים את .ז

.בצורה אלכסונית כמעט ניצבת

. בזיגזג על האיזור המיועד לזריעהמחטמעבירים את ה .ח

.שורפים את המחט .ט

וטה מתוך מבחנה אחת לשניהזריעה פש

.המחטאת יםרפוש .א

.הפקק נלקח בעזרת הזרת של יד ימין .מבחנה ביד שמאלאוחזים ב .ב

.מעבירים את פי המבחנה באש .ג

לאחר (המחטאו מגרדים קצת את הצמיחה מעל פני האגר בעזרת ) ממרק(לוקחים טיפה .ד

).קירורה באגר

.מעבירים באש את פי המבחנה .ה

.יחים את המבחנהמחזירים את הפקק ומנ .ו

.לוקחים ביד שמאל את המבחנה השניה ומסירים את הפקק בעזרת הזרת של יד ימין .ז

. שורפים את פי המבחנה .ח

.זורעים לתוכה בעזרת הלולאה הבקטריולוגית .ט

.מעבירים באש את פי המבחנה שנזרעה ופוקקים אותה .י

.שורפים את המחט .יא

אופן לקיחת אינוקולום ממבחנה

14

)דריגלסקי(זריעת פיזור

0.1( נפח קטן בזריעה זו מפזרים. כ לצורך ביצוע ספירה חיה של חיידקים"שיטה זו משמשת בד

ף בעזרת מקל מכופ, המכילה מצע מוצקממיהול מתאים של תרחיף חיידקים על פני צלחת) ל"מ

באגר ולא יאפשר ספירה לא ייספגיותר נוזל בנפח גדול ). מקל דריגלסקי(עשוי זכוכית או מתכת

.הנוחות לספירה, היטב את התרחיף על מנת לקבל מושבות מבודדותלפזר חשוב .נכונה

-30 (המושבות הנוח והנכון לספירה כדי לקלוע למספר חזרות ובמספר מיהוליםזורעים ממספר

.) מושבות בצלחת300

)ראה איור (:הזריעהמהלך

מניחים נפח . מתרחיף החיידקים,ל" מ0.1 ,סטרילי נפח קטןשואבים בעזרת פיפטור ובאופן .א

.פעולה זו נעשית כאשר פלטת האגר נשארת על השולחן. זה על פני האגר

י "אין צורך בחימום המקל ע(טובלים מקל דריגלסקי בכוהל ומעבירים במהירות באש .ב

.ממתינים עד דעיכת הלהבה מהמקל). השהייתו בתוך האש

.צלחת האגרמכסה ק הפנימי של מקררים את המקל בחל .ג

י החלקה "בעזרת המקל המחוטא והמקורר מפזרים את החיידקים על כל השטח של האגר ע .ד

.סיבובית ועדינה

.מחטאים את המקל בכוהל ומחזירים למקומו .ה

זריעת דריגלסקי

)pour plate(זריעה בתוך האגר

לכן מכינים את המצע מייד לפני ביצוע הזריעה . ות בתוך האגרזריעה זו מיועדת לקבלת מושב

.48ºCושומרים עליו חם ונוזלי בתוך אמבט מים בטמפרטורה של

:מהלך הזריעה

. מהדוגמא לתוך צלחת ריקהל" מ1מעבירים בעזרת פיפטור .א

15

.שופכים מהמצע החם לתוך הצלחת עד כחצי גובה הצלחת ומערבבים בעדינות .ב

. עד לקרישת המצע ומדגירים באינקובטור מתאיםמחכים מספר דקות .ג

).לעידוד פרמנטציהשופכים שכבה דקה עליונה נוספת , VRB מצעכמו, במקרים מסוימים(

זריעה בתוך האגר

עריכת מיהולים עשרוניים

משמשים לצורך מיהולים. לכל מיהול10להקטין את ריכוז החיידקים פי מיהולים אלה נועדו

על פי העכירות או (מספר המיהולים נקבע לפי התרבית המקורית . ביצוע ספירה של חיידקים

).בהתאם לסוג המוצר והמידע הקיים עבורו

:מהלך העבודה

ל " מ9ל מהתרחיף המקורי למבחנה המכילה " מ1בעזרת פיפטור וטיפ סטרילי מעבירים .א

.10-1 מיהול –זהו המיהול הראשון . vortexזרת מערבבים בע). כמו סליין(תמיסה סטרילית

ל ממבחנת המיהול הראשונה למבחנת " מ1בעזרת פיפטור וטיפ סטרילי חדש מעבירים .ב

. 10-2על מנת לקבל את המיהול העשרוני השני , סליין נוספת

.ממשיכים הלאה עד לקבלת המיהול הדרוש .ג

שלוקחים ממנה אתכל מבחנה לפני יש לערבב . יש להחליף טיפ בין מיהול אחד לאחר: זכור

.הנפח למיהול

16

עשרונייםהדגמת מיהולים

כפוליםעריכת מיהולים . לכל מיהול2 פי החומר / להקטין את ריכוז החיידקיםמיהולים אלה נועדו

:מהלך העבודה

ל תמיסה " מ5לה ל מתמיסת המקור למבחנה המכי" מ5בעזרת פיפטה סטרילית מעבירים .א

.1/2 מיהול –זהו המיהול הראשון . vortexמערבבים בעזרת ). כמו סליין(סטרילית

/ ל ממבחנת המיהול הראשונה למבחנת סליין " מ5פיפטה סטרילית חדשה מעבירים בעזרת .ב

. 1/4על מנת לקבל את המיהול הכפול השני , מצע נוספת

.ממשיכים הלאה עד לקבלת המיהול הדרוש .ג

יש לערבב כל מבחנה לפני שלוקחים ממנה את . יש להחליף פיפטה בין מיהול אחד לאחר:זכור

.הנפח למיהול כפוליםהדגמת מיהולים

17

טכניקות צביעה צביעת גרם

הצביעה הדיפרנציאלית . צביעה דיפרנציאלית היא צביעה שלא צובעת את כל התאים באופן שווה

. שפיתח צביעה זוChristian Gramעל שם הבקטריולוג הדני , ותר היא צביעת גרםהחשובה בי

גרם חיוביים וגרם -בהתאם לתגובת החיידקים לצביעת גרם מחלקים אותם לשתי קבוצות

מכיוון שהיא מייצגת הבדלים יסודיים במבנה דופן , לתכונה זו יש חשיבות טקסונומית. שליליים

. הצביעה מאפשרת גם אבחנה בצורת התא ודרך התקבצות התאים.החיידקים ותכונות אחרות

תאור צביעת גרם

צבע בסיסי הנקשר (בחום בקריסטל ויולט ) קיבוע(צובעים את החיידקים שעברו פיקסציה

בשלב זה כל החיידקים הגרם . ושוטפים את עודף הצבע) ביעילות לחומצות גרעין ופוליסכרידים

החומר הפעיל , )KI + I2) lugolמוסיפים תמיסת . ים בכחולחיוביים והגרם שליליים נצבע

היוד חודר לתאים ויוצר . במיםI2 מאפשר מסיסות KI -בעוד שה , I2בתמיסה זו הוא היוד

. הגרם חיוביים והגרם שליליים מגיבים בצורה דומה, גם בשלב זה. קריסטל ויולט- I2קומפלקס

- I2הגורם להמסת הקומפלקס , זרת כוהל או אצטוןבע) הוצאת צבע(כ מבצעים דקולוריזציה "אח

עוברים דקולוריזציה בעוד שהגרם שליליים לאהאורגניזמים הגרם חיוביים . קריסטל ויולט

יציבות . ההבדל העיקרי בין הגרם חיוביים והגרם שליליים הוא ביציבותם לדקולוריזציה. עוברים

יפידים בדופן החיידק הגרם שלילי ומותיר זו היא כנראה הודות לעובדה שהסולבנט ממיס את הל

הדופן העבה מאוד של חיידקים בעוד ש, אחריו דופן פורוזיבית המאפשרת סילוק הצבע מהדופן

דבר זה גורם לסגירת הנקבוביות בדופן ומונע יציאת . י הכוהל"עוברת דהידרציה ע, גרם חיוביים

חיידקים גרם חיוביים , דקולוריזציהלאחר ה. מהתא, קשה התמס, קריסטל ויולט- I2הקומפלקס

כדי לראות חיידקים אלו משתמשים . צבועים עדין כחול אולם הגרם שליליים נותרים חסרי צבע

.כ בצבעים אדומים כמו פוקסין או ספרנין"בד, בצביעה נגדית

שלבי צביעת גרם

18

:מהלך הצביעה

)יוכן בהתאם למקור הדוגמא (:הכנת משטח החיידקים .א

. ו מהנוזל הנבדק במרכז זכוכית נושאאשמים טיפה מתרחיף החיידקים : נוזלי מקור :1א

.מפזרים בעזרת מחט בקטריאלית עד קבלת שכבה דקה

מרחיפים בתוך טיפה זו . במרכז זכוכית נושא שמים טיפה של בופר סטרילי : מקור מוצק:2א

.בעזרת מחט בקטריאלית) כ צמיחת חיידקים"בד(מהמקור המוצק

.קרוב לאש, את הפרפרט באוויריםיבשמ: ייבוש .ב

מעבירים את הזכוכית כמה פעמים בתוך הלהבה, לאחר ייבוש מלא): פיקסציה (קיבוע .ג

פעולה זו גורמת לתמותת . )צידה התחתון ללא החיידקים מופנה כלפי מטה אל האששכ(

.החיידקים והדבקתם לזכוכית

:השלבים הבאים יבוצעו בעמדות המיועדות לצביעה בלבד

.שטוף במים. דקות2כסה את המשטח בתמיסת קריסטל ויולט למשך : צביעה בסיסית .ד

.שטוף במים. דקות2כסה את המשטח בתמיסת לוגול למשך : הוספת יוד .ה

. בצע את הפעולה בזריזות. אצטון עד ליציאת הצבע-שטוף בתמיסת כוהל: שטיפת הצבע .ו

.שטוף במים

שטוף במים וייבש . דקה1רנין למשך כסה את המשטח בפוקסין או ספ: צביעה נגדית .ז

.בעדינות

.המשטח מוכן כעת להסתכלות מיקרוסקופית .ח

)גרם שלילי( E.coliצביעת גרם

)גרם חיובי (Staphylococcus epidermidis צביעת גרם

19

צביעת נבגים

).נבג(חיידקים גרם חיוביים מסויימים יכולים ליצור בעקבות שינויים בתנאי הסביבה ספורה

בזכות שינויים אלה החיידק יכול לשרוד . שונה במבנה ובפיזיולוגיה שלה מתא חי רגילהספורה

בצביעה זו . ובתנאים שבהם תאים וגטטיביים לא יכולים להתקיים) מיליוני שנים(לזמן ארוך מאוד

צביעת הספורות בצבע ירוק מלכיט נעשית תוך . נבליט את הספורות הנמצאות בחלק מהחיידקים

ספורות שאינן בשלות יאבדו את . ום על גבי אדים כדי להחדיר היטב את הצבע לספורהחימ

תא החיידק ייצבע צביעה . הצבע בשטיפה וייראו שקופות בעוד שספורות בשלות ייצבעו בירוק

).ספרנין(נגדית בצבע אדום

: חומרים

Malachite green 0.5%תמיסת

ספרניןתמיסת

:מהלך הצביעה

לאחר מכן ). ג, ב, סעיפים א(ייבוש וקיבוע נעשים כפי שמתואר לצביעת גרם , הכנת המשטח

)ראה איור (:מבצעים את השלבים הבאים

או הבת בונזןל עם מים רותחים מעל כוס פיירקס את הזכוכית מעל מניחים: צביעת הספורות .א

.Malachite green בתמיסה שלבנייר סינון ומציפים את המשטח מכסים. פלטה חשמלית

החימום . דקות תוך הוספת צבע מדי פעם כדי למנוע התייבשות5 לחמם במשך ממשיכים

.מאפשר חדירת הצבע לספורות וצביעתן בירוק

,י פינצטה ולהניח במתקן הצביעה"ת מעל האדים עשלב זה יש להוריד את הזכוכילאחר .ב

. יש לזרוק את נייר הסינון.בעמדות המיועדות לצביעה

. שניות30ם במשך במי בזהירותשוטפים .ג

שניות60מציפים את המשטח בספרנין במשך : צביעת תאי החיידקים .ד

. שניות30שוטפים במים במשך .ה

.המשטח מוכן כעת להסתכלות מיקרוסקופית. מייבשים בעדינות בעזרת נייר .ו

20

צביעת נבגיםשלבי

צביעת נבגים : צילום ממיקרוסקופ

21

פסולהצביעת ק

מקיפה את הדופן שכבה ).Aerobacter aerogenes ,Bacillus spכמו (בחיידקים רבים

מעטפת . חיידקי קפסולה הם פתוגניים. או נרתיק) capsule(לטינית נפרדת המכונה קפסולה 'ג

צביעת קפסולה היא . זו בנויה מפולימרים של סוכרים ולפעמים מפולימרים של חומצות אמינו

אזור . ובה צובעים את הרקע ואת תאי החיידקים אך לא את הקפסולה עצמהצביעה מיוחדת

מתקבלת תמונת נגטיב של הקפסולה ולכן הצביעה נקראת , כלומר, הקפסולה נשאר חסר צבע

. צביעה שלילית

: חומרים

2% Congo red סרום10% עם

1% HCL

כחול מתילן1%

:מהלך הצביעה

החיידקים וכית נושאת והרחף בה את תרביתל גבי זכ עcongo redשים טיפה גדולה של .א

.צביעה זו תיצור רקע כתום סביב לחיידקים. הנבדקת

תן . פזר את תרחיף החיידקים ככל האפשר בעזרת מחט בקטריולוגית ובעזרת זכוכית מכסה .ב

.לטיפה להתייבש וערוך פיקסציה באש

תהליך זה הורס את . יבש באוויר. שניות10-5 למשך HCL תמיסתכסה את המשטח ב .ג

.ממברנת התא ומאפשר חדירת צבע לתא הוגטטיבי

. דקות2למשך כחול תילן תמיסת מבכסה את המשטח היבש .ד

.יבש והסתכל במיקרוסקופ, שטוף במי ברז .ה

.הקפסולה לא נצבעת ותופיע כאזור שקוף על רקע צבוע כתום מסביב לחיידק הצבוע כחול

צביעת קפסולה : צילום ממיקרוסקופ

22

צביעת חומרי תשמורת

אופיים שונה באורגניזמים . לעיתים קרובות ניתן להבחין בנוכחות גרנולות שונות בתוך התאים

מרבית גרנולות . ומרי מוצא מבניים של התאלחאנרגיה או ל כמאגרשונים אולם הם משמשים

הוא אחד מהחומרים הנפוצים ביותר המאוחסן בגרנולות אלה. תאלה עטופות במעטפה שומני

משמשת כחומר הזוהי תרכובת ). poly-β-hydroxybutyric acid) PHBהתרכובת הלא מסיסה

משמש כמאגר . תשמורת פחממני והוא נאגר בתאים בתנאים של חוסר בחנקן ועודף פחמן

Burkholderia cepacia ,Ralstonia solanacearum, Bacillus. למקור פחמן ואנרגיה

thuringiensis יוצרים גרנולות של PHBבעוד ש - Pseudomonas syringaeלא .

PHBמבנה

:חומרים

:PHBתמיסת (0.2gr (NH4)2SO4, 0.2gr KCl, 0.2gr MgCl2.7H2O, 5gr DL-hydroxybutyrate, 1L H2O)

) אתנול70% - צבע בSudan black B) 0.3%תמיסת

ספרנין 0.5%תמיסה מימית של

:מהלך הצביעה

).PHBל מרק " מ10 -יש לגדל את החיידקים ב(

לאחר מכן ). ג, ב, סעיפים א(ייבוש וקיבוע נעשים כפי שמתואר לצביעת גרם , הכנת המשטח

:מבצעים את השלבים הבאים

. דקות15 עד 10 במשך (Sudan black B)ן שחור הצף את הזכוכית בסוד .א

.ייבש היטב באוויר .ב

.מיםי "שטוף את עודף הצבע ע .ג

. שניות10הצף את המשטח בצבע ספרנין למשך .ד

.שטוף במים .ה

. נצבעות בצבע שחורPHB והגרנולות של ורוד-התאים נצבעים באדום

23

PHB של צביעת גרנולות: צילום ממיקרוסקופ

הכנת מצעיםמצעים . י גידול מכילים חומרי מזון הדרושים לאורגניזמים חיים למטרות צמיחה ותפקודמצע

, מכילים בנוסף גם מרכיבים ספציפיים המיועדים להבטיח את הסלקציה) בררניים(סלקטיביים

או מעניקים לחיידקים הרצויים מושבות , כלומר מעכבים את התרבותם של חיידקים מתחרים

.לקוליפורמיםומבחין הינו מצע סלקטיבי , למשל) VRB )violet red bile agarמצע . אופיניות

VRBהכנת

pour(מכיוון שהזריעה נעשית בתוך המצע , מכינים מצע זה מייד לפני ביצוע זריעת החיידקים

plate .( בצורה נוזלית יש להכין את המצע ולשמור עליו) 48באמבט מים בטמפרטורה שלºC.(

:ל" מ100ל מהלך ההכנה לכמות ש

. סטרילייםל מים מזוקקים" מ100ומערבבים עם ) לפי הוראות היצרן( גרם 4.15שוקלים .א

יש .תוך כדי ערבוב עד רתיחה, בזהירות מירביתאו פלטה חשמלית מחממים על בונזן .ב

.חימום עד הצטללות יספיק. יחת יתרלהימנע מרת

.pour plateשית בשיטת הזריעה נע.עד ביצוע הזריעות) 48ºC( באמבט מים מניחים .ג

הערות לעבודה במעבדהלשם כך .םסמן את הכלים והמצעים עימם עובדייש ל, זריעות/ מיהולים / לפני ביצוע ניסוי תמיד

.לא מחיק, יש להשתמש בטוש שחור או כחול

.יש לסמן על המבחנה בסמוך לפקק: מבחנות

בהיקף , ולא על גבי המכסה) ו נמצא המצעאזור בב(יש לסמן בתחתית הצלחת : צלחות

.ובכתב קטן

, זמן, טמפרטורה, מיהול, שם מיקרואורגניזם, שם סטודנט): כתלות בניסוי(פרמטרים לסימון

.'שם מצע וכו, ריכוז חומר

).מכסה למטה( כשהן הפוכות המתאיםיש להדגיר צלחות פטרי באינקובטור

24

ניסויים נבחרים: בפרק הכנת מצעי מזון:1ניסוי מספר

, שמרים ופטריות משתמשים במצעי גידול שונים, בעבודה עם מיקרואורגניזמים כמו חיידקים

תהליך זה חיוני ). סטריליזציה(שלב חשוב בהכנת מצעי הגידול הוא העיקור . נוזליים ומוצקים

כדי להכיר את , בכל המקרים בהם אנו מעוניינים לעבוד עם סוג אחד של מיקרואורגניזמים

. לי שמיקרואורגניזמים זרים יפריעו בבדיקותמב, תכונותיו

סטריליזציה-חלק א

זוהי השמדה כללית או הרחקה מלאה של מיקרואורגניזמים כולל ספורות - )סטריליזציה(עיקור

קרינת , חומרים כימיים, חוםהכוללות שימוש ב התהליך יכול להתבצע בטכניקות שונות. )גיםנב(

U.V .או סינון.

: עומדות לרשותנו כמה שיטות- סטריליזציה בחום. א

משמש לסטריליזציה של כלים שאינם עלולים . שעות3 במשך C180- 160° חום יבש .1

.מתבצע בתנור. להתאדות או להנמס, להשרף

בטמפרטורה מאפשר סטריליזציה . מחום יבשיותר יעיל ) באדים או במים (רטובחום .2

121ºCדקות20 - במשך כ .

חימום חד פעמי .אחת ליום, פעמים3, דקות30 במשך 100ºC - חימום ל- טינדיליזציה .3

נבוטנה הספורות לצורות ת, בין חימום אחד למשנהו, אולם, א הורס ספורותל ,100ºC -ל

רק בתנאי שהסביבה שבה הן הנביטה תתבצע . יהרסו בחימום הבאללו וגטטיביות וה

בטינדיליזציה משתמשים לעיקור .תאפשר צמיחתן) הרכב כימי, רטורהטמפ(מצויות

. חומרים הנהרסים באוטוקלב אולם לא בהרתחה רגילה

ול זהו דוד עשוי מתכת הבנוי כך שיכ. מכשיר בו מבצעים סטריליזציה בחום רטוב- האוטוקלב

עיקרון השיטה מבוסס על העובדה שטמפרטורת הרתיחה של . אטמוספירות2לעמוד בלחץ של

', אטמ1 -ב) ללא אוויר(אם נגדיל את הלחץ בתוך הדוד המכיל קיטור . המים תלויה בלחץ האדים

.121.5ºC -תעלה טמפרטורת הרתיחה ל

משך תהליך העיקור הנו . תכ להרוס את הצורות הוגטטיביות והספורו"טמפרטורה זו מספיקה בד

כדי לבצע סטריליזציה נכונה יש להקפיד על הוצאת כל האוויר מהאוטוקלב וכן יש . דקות20

25

לדאוג לכך שכל חלקי המטען העובר סטריליזציה לא יהיו אטומים למעבר אדים אך יהיו אטומים

.כ"שכבות צמר גפן ונייר ממלאות תפקיד זה בד. בפני מעבר מיקרואורגניזמים

מבנה סכמתי של אוטוקלב

י סינון"סטריליזציה ע. ב

חומרים , כגון חלבונים) רגישים לחום(הסינון משמש לעיקור של תמיסות חומרים תרמולביליים

מקובל להשתמש בפילטרים . בשיטה זו מעבירים תמיסה של החומר דרך מסנן. טיים ועודאנטיביו

סוגים רבים של פילטרים גם סופחים אליהם . בעלי נקבים קטנים המעכבים מעבר של חיידקים

פילטרים . השיטה לא משמידה את החיידקים אלא מאפשרת את הפרדתם מהתמיסה. חיידקים

פילטרים בעלי נקבים בגודל . שמרים ופטריות, עים מעבר חיידקים מונ0.45µבעלי נקבים בגודל

0.22µהפילטרים עשויים מחומרים סינטטיים כמו . מונעים גם מעבר של וירוסים וחיידקים קטנים

זרימת התמיסה . הכלים בעזרתם עושים את הסינון בפילטר עוברים עיקור בחום. צלולוז אסטרים

. בואקוםדרך הפילטר מואצת על ידי שימוש

י סינון"מערכות לסטריליזציה ע

26

סטריליזציה באור אולטרא סגול. גהחדירות של הקרניים האולטרא . הורגת מיקרואורגניזמים באוויר ועל פני השטח. U.Vקרינת

להקרנת משטחים או נוזלים בתמיסות .U.V -משום כך מוגבל השימוש ב, סגולות נמוכה מאוד

.רדודות וכן פלטות אגר ואריזות

אמצעים כימיים. דמתאימים . הורגים או מונעים גדילה של מיקרואורגניזמים–) antiseptics (חומרים אנטיספטיים

.דטרגנטים, כוהל, יוד: למשל. משטחי עבודה וכלים, לשימוש חיצוני בלבד כמו ידיים

. הורגים או מונעים גדילה של מיקרואורגניזמים–) disinfectants (סאינפקטנטייםחומרים די

קירות בבית חולים , שולחנות, כמו חיטוי רצפות, משמשים לחיטוי אובייקטים דוממים בלבד

.אתילן אוקסיד: לדוגמא. ציוד רפואי ועוד, ובמעבדות

קרקעות מזון-חלק ב

הנם חומרים אורגנים ואנאורגנים הדרושים לאורגניזמים חיים למטרות ) נוטריינטים(חומרי מזון

.צמיחה ותפקוד

:ניתן לחלק את החיידקים לשתי קבוצות גדולות, בהתאם לדרישותיהם התזונתיות

אורגניזמים אלו מסוגלים לסנטז בעצמם את כל מרכיבי התא -) Autotrophs(אוטוטרופיים .א

ואילו מקור האנרגיה הנו חמצון 2COמקור הפחמן הוא . ממלחים אנאורגניים פשוטים

הקבוצה הראשונה נקראת . תרכובות אנאורגניות מחוזרות או ניצול אנרגיית האור

.כימוליטוטרופים והשנייה פוטואוטוטרופיים

לא מסוגלים לסנטז את כל חומרי התא בהעדר פחמן -) Hetorotrophs(פיים הטרוטרו .ב

ישנם כאלה הדורשים . מידת ההטרוטרופיה שונה במיקרואורגניזמים שונים. אורגני ואנרגיה

מספר גדול של חומרים לצמיחתם התקינה בעוד שאחרים דורשים רק מספר קטן של

גם בקבוצה . זון וברפואה שייכים לקבוצה זורוב המיקרואורגניזמים בהם נעסוק במ. חומרים

זו מבחינים בין פוטוהטרוטרופיים המשתמשים באור כמקור אנרגיה ובין כימוהטרוטרופיים

.המחמצנים תרכובות אורגניות כמקור אנרגיה

הדרישות התזונתיות של מיקרואורגניזמים נקבעות בחלקן על ידי המבנה הגנטי ובחלקן על ידי

. םגורמים סביבתיי

27

כ בצורת "הנמצאים בטבע בד, C ,H ,O ,N ,S ,P: היסודות העיקריים המרכיבים את התא הם

חשובים בתזונת , Fe ,Co ,Mn ,Mg ,I ,Clאולם גם יסודות אחרים כגון . תרכובות

. מיקרואורגניזמים

הסבר למרכיבי מצע . המים הכרחיים לגדילת תאים- מים

: סיבות עיקריותיש להשתמש במים מזוקקים וזאת משתי

. ולכן לא ניתן להכין קרקע מזון סטנדרטית, מי ברז מראים שינוי ממקור אחד למשנהו •

בתמצית בשר , מי ברז מכילים קלציום ומגנזיום הפועלים עם פוספטים המצויים בפפטונים •

כמו כן מכילים מי הברז יוני . ובחומרים אחרים של המצע ויוצרים מלחי פוספט בלתי מסיסים

.ר העלולים להשפיע על הגדילהכלו

המורכב בעיקר מפפטידים בעלי אורך , זהו שם כללי להידרוליזט אנזימטי של חלבונים- פפטון

תפקידו בקרקע המזון לספק מקור זמין של תרכובות חנקן . חומצות אמינו ויסודות קורט, שונה

קיימים . ם בופר מצויןהפפטון מהווה ג, מכיוון שהחלבונים הם חומרים אמפוטריים. ואנרגיה

.פפטונים ממקורות שונים כמו חלבוני חלב וסויה בדרגות פירוק שונות

, העשירה בחומרים מן החי, זו תמצית מימית מרוכזת של בשר- )Beef extract(תמצית בשר

. החשובים לגדילהB ויטמינים מקומפלקס -בין החומרים . מולקולות אורגניות קטנות ומינרלים

, חומצות אמינו חופשיות, אלנין, גלוטמין, ATP, נוקלאוטידים, הוא מכיל בסיסים פורינייםכמו כן

.חומצות אורגניות ומלחים מינרליים שונים, שמנים, פוספטים, הקסוז

. זו תמצית מימית של שמרים שעברו תהליך של אוטוליזה- )Yeast extract(תמצית שמרים

לרוב משתמשים בה כתחליף . א משמשת מקור לויטמין זה והיBתמצית שמרים עשירה בויטמין

. או כתוספת לתמצית בשר

משמש . זהו פוליסכריד הבנוי מיחידות גלקטוז וחומצה גלוקורונית. חומר המופק מאצות ים- אגר

:יתרונותיו. ל'להפיכת קרקע המזון לג

.י רוב החיידקים"לא מותקף ע .1

.C40-45°' ונקרש בטמפ80-100ºC 'טמפמאחר והוא נמס ב, נוח לעבודה .2

28

וכן דרושים בכמויות זעירות 4SO ,Fe ,K ,Ca ,Mg דרושים חומרים כמו - אורגנייםנחומרים א

חלק מהם . האחרונים מצויים על פי רוב כמזהמים של הראשונים. Zn ,Co ,Mn ,Cuחומרים כמו

פן ספציפי משתתף בסינטזה של מרכיבי התא וחלק קשור לאנזימים שונים האחראים באו

.לפעולות שונות

: מבין החד סוכרים הנפוצים. משמשים כמקור אנרגיה או כיסודות הבונים את דופן התא- סוכרים

.לקטוז וסוכרוז: מבין הדו סוכרים הנפוצים. גלקטוז ופרוקטוז, גלוקוז

סוגי קרקעות מזון :ניתן לחלק את קרקעות המזון לשתי קבוצות

)עים מוגדריםאו מצ(מצעים סינטטים . אחומרים אורגניים , מצעים סינטטים מכילים חומרים בעלי הרכב כימי ידוע כגון מלחים אי אורגניים

-וכן בופר מתאים ל', כהלים וכו, חומצות הידרוקסיליות, חומצות שומן נמוכות, כמו חומצות אמינו

pHבו נערך הגידול .

)או מצעים מורכבים(מצעים לא סינטטים . בסרום , דם, פפטונים, תמצית שמרים, ומרים שהרכבם הכימי לא ידוע כמו תמצית בשרמכילים ח

.חיידקים רבים גדלים רק בתוספת של חומרים אלה. 'וכו

הניסוימטרותוכלים ) שיפועי אגר(סלנטים , מבחנות מיהול, לימוד הכנת מצעי מזון פשוטים נוזליים ומוצקים .א

.לעבודה מיקרוביאלית

. לים והדגמת חשיבות העיקורעיקור מצעים וכ .ב

חומרים וציוד ל" מ500ארלנמייר של

)nutrient broth(אבקת מרק מזין

אבקת אגר

)nutrient agar(אבקת אגר מזין

מאזניים

נייר שקילה

corningבקבוק

ל" מ250משורה של

ארוכות ופקקיםמבחנות 14 ,מבחנות קטנות 12

29

לא סטריליותצלחות פטרי 2

פטרי סטריליות צלחות20

2 swabs )קיסמי עץ 2) + מטושים

בוחש מגנטי, פלטה לחימום וערבוב

מעמד למבחנות

כוסות להכנסת המבחנות לסטריליזציה

ל לא סטריליות" מ10 פיפטות 2

אופן ההכנה

. שהוא אחד המצעים המקובלים לגידול חיידקים) Nutrient Broth(בניסוי זה נכין מרק מזין

תמצית : האבקה המוכנה מכילה. ה והוא מאפשר גידול סוגים רבים של חיידקיםהכנתו פשוט

גרם אגר 15בתוספת ). NB" (מרק מזין" גרם אבקת 8 ליטר נדרשים 1להכנת . בשר ופפטון

).Nutrient Agar (NAייהפך המרק למוצק וייקרא בשם אגר מזין ) 1.5%(לליטר

. גרם אבקת מרק מזין1.6 ארלנמייר והוסףל מים מזוקקים ל" מ200 העבר: NBהכנת מרק .1

.עד להמסה מלאה, בעזרת מגנט, ערבב היטב

, פקוק את המבחנות. מבחנות12 -לכל אחת מ) עם פיפטה ומשאבה(ל מהמרק " מ5העבר .2

השאר הנותרות ותהמבחנ 2את . מהמבחנות בכוס פלסטיק וכסה בנייר אלומיניום10הנח

. עיקורנהבור לא תעאלה ותמבחנ. לביקורת, בצד

המס את האגר על ידי הרתחה). 1.5%לקבלת ריכוז של ( גרם אגר 2.1ליתרת המרק הוסף .3

ההמסה מסתיימת . כדי למנוע שריפת האגר, עם בוחש מגנטיעל פלטה חשמלית תוך ערבוב

). יש להקפיד שהתמיסה לא תגלוש(כאשר התמיסה מצטללת

2הנח . נות ארוכות וסגור אותן בפקקים מבח12 -מהמצע שהכנת לכל אחת מל " מ8העבר .4

וכסה בנייר (את היתר הכנס לכוס פלסטיק . )ביקורת (בשיפוע ללא עיקורמבחנות

.אל תזיז את המבחנות עד לאחר התמצקות המצע, הנח בשיפועלאחר העיקור). אלומיניום

למצע והנח לא סטריליות ת פטרי וצלחכל אחת משתי ל מהמצע שהכנת ל" מ20 -כגם מזוג .5

.)ביקורת (להיקרששבצלחות

nutrient(" אגר מזין" גרם אבקת Corning 9.5העבר לתוך בקבוק : סטריליNAהכנת מצע .6

agar ( עם הפקק סגור את הבקבוק. ל" מ400לנפח של והוסף מים מזוקקים עד) לא לסגור

). עד הסוף

ות פטרי סטריליות צלח20 -לכל אחת מ, ל מהבקבוק שהכנת" מ20 –שפוך כ: לאחר העיקור .7

יש לעבוד במהירות כדי למנוע התמצקות כבר בתוך הבקבוק . והנח למצע שבצלחות להיקרש

). ניתן להמיסו מחדש על ידי חימום במיקרוגל, אם בכל זאת נקרש המצע(תוך כדי המזיגה

30

פקוק את , וקיסם) swab(הכנס לכל אחת משתי מבחנות ארוכות מטוש : הכנת כלים ועיקורם .8

.נותהמבח

עיקור מצעים באוטוקלב

.הכנס מים מזוקקים לאוטוקלב כך שיכסו את גוף החימום .1

. הכנס את סלי האוטוקלב ובהם המצעים והכלים אשר צריכים לעבור עיקור .2

הקפד שכל הברגים במצב . הפעל את החימום. סגור את המכסה והדק אותו בעזרת הברגים .3

.מאוזן

בתום זמן זה נפסק . דקות20ום למשך לאחר השגת הלחץ הדרוש השאר את החימ .4

.החימום

.שים לב להוראות הרשומות ליד המכשיר. תן למערכת להתקרר וללחץ לרדת .5

פתיחה מהירה מידי של הברז עלולה לגרום . שים לב לא לשחרר את הקיטור מהר מידי .6

. הנוזלים ולגלישת המצעיםלרתיחת

.ם והרטבתםפתח את המכסה כדי למנוע התעבות אדי מים על הפקקי .7

NB ,2 מבחנות 2(הדגר את מצעי הביקורת הלא מעוקרים וכן מדגם מהמצעים המעוקרים

לאחר הדגרה רשום את תצפיותך והסק . 37ºC בטמפרטורה )NA צלחות NA ,2שיפועי

. מסקנות

. 4 - ו3ישמשו לביצוע ניסויים מצעים אלה . במקררמצעים המעוקרים שמור את שאר ה

31

מורפולוגיה: 2ניסוי מספר מורפולוגיה של המושבה-חלק א

לכן תאי הבת נשארים סמוכים זה לזה . במצע מוצק מוגבלת לרוב יכולת התנועה של החיידקים

תאור מאפייני המושבה הוא כלי חשוב לצורך אפיון . ויוצרים מושבה האופיינית לכל חיידק וחיידק

.החיידק מבחינה סיסטמטית

חומרים .ושבותפלטות אגר עם מ

מהלך העבודה :בדוק אותן ותאר את צורתן לפי התכונות הבאות. מושבות בודדות4בחר

).מ"מדוד קוטר במ(גודל המושבה .1

).פילמנטית, אי רגולרית, עגולה(צורת המושבה .2

). יש להביט במושבה מהצד-שטוח , קמור, קעור(צורת התרוממות .3

).עם אונות או סעיפים, חלקות(שוליים .4

).חלק, מחוספס(ח פני השט .5

).פיגמנט, שקופה, אטומה(תכונות אופטיות .6

:היעזר באיור הבא

מורפולוגיה של מושבות

.ך את תוצאותיסכם

32

מורפולוגיה של התא היחיד-חלק ב :המורפולוגיה של התא היחיד מוגדרת לפי התכונות הבאות

תנועה, גודל התא .1

או ספירילום) ויבריו( מתג מכופף ,מתג, קוקוס-צורתו .2

קבוצות מסודרות או לא מסודרות, זוגות, שרשרות, יחידים בודדים: התקבצותצורת .3

קיום פלגלות, קפסולה, )יצירת נפיחות, צורתן ומיקומן בתא( נוכחות ספורות -מבנה פנימי .4

. לצבוע אותםעל מנת להבחין בחיידקים במיקרוסקופ ולקבוע את המורפולוגיה שלהם יש

צביעת גרם

.במעבדה נבצע צביעת גרם לארבעה חיידקים

לזוגחומרים : שעות על צלחות פטרי של18-24תרביות בנות

Escherichia coli (E.coli)

Staphylococcus aureus (S.aureus)

Bacillus subtilis (B.sub)

Serratia sp.

ריאגנטים לצביעת גרם

33

זכוכיות נושאות

יולוגיתמחט בקטר

צביעהלמתקן

מהלך העבודה

. 18-17בעמוד פ פרוטוקול "בצע צביעת גרם לכל אחד מארבעת החיידקים ע .1

.פ הכללים"הסתכל במיקרוסקופ אור ע .2

. ך את תצפיותסכם .3

KOHבדיקת . להבחנה בין חיידקים גרם שליליים לגרם חיוביים שיטה מאקרוסקופית היזו

15 על גבי זכוכית נושאת ומערבבים למשך KOHמרחיפים מושבה של החיידק בטיפה של

חיידקים גרם שליליים ייצרו . לאחר הערבוב מנסים להרים את התערובת בעזרת המחט. שניות

גורם לכך הינו המסתם של הגרם ה. עיסה צמיגה ואילו חיידקים גרם חיובים ייצרו תמיסה מימית

.י תמיסת האלקלי ושחרור חומצות נוקלאיות היוצרות את הצמיגות"שליליים ע

KOHתמיסה צמיגית המתקבלת בבדיקת

.ךתצפיות את סכם החיידקים ו4 -בצע את הבדיקה ל

צביעה חיה בעזרת מתילן כחול .לן כחול על זכוכית נושא מתי1%שים טיפה מתמיסה של .1

.קח בעזרת מחט בקטריולוגית אינוקולום של חיידקים מהפלטה והרחף בתוך תמיסת הצבע .2

. כסה בזכוכית מכסה .3 .פ הכללים"הסתכל במיקרוסקופ אור ע .4 . ך את תצפיותסכם .5

34

קפסולהצביעת

.חיידקיםשני לקפסולהבמעבדה נבצע צביעת

לזוגחומרים : של סוכרוז2%גר המכיל תוספת של תרביות על גבי שיפוע א

Aerobacter aerogenes Bacillus sp.

קפסולהריאגנטים לצביעת

זכוכיות נושאות

זכוכיות מכסות

מחט בקטריולוגית

מתקן לצביעה

מהלך העבודה

. 12בעמוד פ פרוטוקול " עיםדקבצע צביעת קפסולה לחיי .1

.פ הכללים"הסתכל במיקרוסקופ אור ע .2

.סכם את תצפיותך .3

חומרי תשמורתצביעת

.poly-β-hydroxybutyric acidחומר התשמורת במעבדה נבצע צביעת

לזוגחומרים : שלPHBשגדלה במרק ת תרבי

Bacillus subtilis חומרי תשמורתריאגנטים לצביעת

זכוכיות נושאות

מחט בקטריולוגית

מתקן לצביעה

מהלך העבודה

. 22בעמוד פ פרוטוקול " לחיידק עחומרי תשמורתבצע צביעת .1

.פ הכללים"הסתכל במיקרוסקופ אור ע .2

.סכם את תצפיותך .3

35

לוגיה במיקרוביוטכניקות זריעה :3ניסוי מספר זורעים חיידקים על מצעים שונים בכלים שונים בכל פעם לפי הצרכים של הניסוי או הבדיקה

זריעות בסיסיות מכל סוג , במעבדות נלמד ונתרגל עבודה עם כלים סטריליים. שרוצים לבצע

.ונבצע כמה ניסויים עם החיידקים

מטרה

זריעת חיידקים למצע מוצק ולמצע נוזלי תרגול

יםהחומר

: שעות על צלחות פטרי של18-24תרביות בנות

Escherichia coli (E.coli)

Staphylococcus aureus (S.aureus)

Bacillus subtilis (B.sub)

Serratia sp.

NA צלחות 4

סלנטים4

NB מבחנות 4

מחט בקטריולוגית

אופן ביצוע :בצע לכל אחד מהחיידקים הנתונים

NAזריעת בידוד על פלטת .א

זריעה על סלנט .ב

NBזריעה למרק .ג

.כים ובהתאם להנחיות המדרי13-11 םיבעמודפ הפרוטוקולים "הזריעות תבוצענה ע

. 37ºC -הדגר את כל המצעים הזרועים ב

.לאחר ההדגרה בחן וסכם את התוצאות

36

מיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית :4ניסוי מספר

מטרות). גוף האדם, מים, אדמה, אוויר( בסביבתן הטבעית לדגום ולהכיר אוכלוסיות מיקרוביאליות

הרכבן של אוכלוסיות מיקרואורגניזמים אלו הנה פונקציה מורכבת של גורמים כגון ריכוז החומר

.טמפרטורה וכדומה, נוכחות חמצן, ריכוז וסוג המלחים, האורגני

מיקרואורגניזמים באוויר.א

והם מתאפיינים נאי יובש וקרינת שמש חזקהחיידקיי האוויר מצטיינים בתכונתם לשרוד בת

.הם נישאים על גרגירי אבק ומכאן שתנועתם באוויר מושפעת מכוח הכבידה. ביצירת פיגמנטים

לזוגחומרים

.חתיכת פלסטלינה, צלחות אגר מזין2

ביצוע) העזר בפלסטלינה(פתח צלחת אחת של אגר מזין במצב מאוזן ואת השניה במצב מאונך .1

כל זוג ידגיר לזמן אחר בהתאם להנחיות ( דקות60 או 30, 20, 10, 5זמן של פרק ל

. )המדריכים

.37ºC - בהצלחותהדגר את .2

. ו מהצלחות התקבלו יותר מושבותלבאי וציין אר את המושבות שהתקבלות: לאחר הדגרה .3

.הסבר את התוצאות

מיקרואורגניזמים במים. ברגניזמים שונה מבתי גידול אחרים בעיקר בגלל מציאותה המדיום האקווטי כבית גידול למיקרואו

פאזה זו מאפשרת דיפוזיה מהירה של כל המרכיבים הכימיים והגורמים . של פאזת מים רציפה

.מי ברז ומי ביוב: בתי גידול אקווטים טיפוסיים2בניסוי זה נכיר . הפיסיקליים של המערכת

חומרים לזוג NA צלחות אגר מזין 4

ל בופר" מ4.5עם מבחנות 2

מי ביוב, מי ברז

כוס עם כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטריליים, פיפטורים

37

ביצוע ). ל סליין" מ4.5ל לתוך " מ0.5 (1:10מהל את מי הברז ומי הביוב .1

ופזר בעזרת מקל ) דופליקט(ל על כל אחת משתי צלחות " מ0.1מכל מיהול בהתאם זרע .2

. דריגלסקי

. 37ºC -ב) ותהפוכ (הצלחותהדגר את .3

ספור את המושבות שהתפתחו וחשב את מספר המיקרואורגניזמים שהיו : לאחר הדגרה .4

. השווה בין שתי דגימות המים.בדוגמת המים המקורית

מיקרואורגניזמים באדמה. ג

. המשתנות תדיר) נישות(הקרקע הנה בית גידול מורכב הבנוי ממספר רב של סביבות אקולוגיות

כל מין ומין מתפתח בתנאים . פשרויות עשירה מאוד הקרקע במיקרואורגניזמיםמפאת מגוון הא

.האופטימליים לו ויוצר יחד עם מינים אחרים את הפלורה הטבעית של בית גידול נתון

חומרים לזוג NAת וצלח 2

מבחנה עם בופר סטרילית

מחט בקטריולוגית

אדמת גינה

ביצוע .העבר כחצי כפית אדמה למבחנת הבופר .1

. ערבב היטב בוורטקס ותן לגרגירי האדמה לשקוע .2

בעזרת מחט בקטריולוגית אסוף טיפת מים מהנוזל העליון ופזרה בזריעת בידוד על פני .3

. הצלחות

. 37ºC - בהצלחותהדגר את .4

.סכם את תצפיותך: לאחר הדגרה .5

מיקרופלורה של גוף האדם. דמרביתם , חיידקים אלו. ם קבועה ואופייניתהשכבה החיצונית של העור נושאת אוכלוסיית חיידקי

חיידקים אנאירוביים (Staphylococcusבעיקר קוקים השייכים לסוג , גרם חיוביים

, חיידקים אירוביים (-Micrococcusו) המקובצים בדרך כלל בצורת אשכולות, פקולטטיביים

ך הקמטים הקטנים חיידקים אלה חיים בעיקר בתו). המצויים בדרך כלל בצורת קוקים בודדים

על העור מצויים . מסוגים אלה, היבש של העור נמצאים חיידקים מעטים, בחלק החיצוני. שבעור

38

. שהגיעו לשם באופן מקרי, שמקורם בחפצים איתם העור בא במגע, גם חיידקים רבים אחרים

יסודית וממושכתדרושה רחיצה . רחיצת ידיים מסלקת את אלה ומשחררת גם קוקים מהקמטים

שמרביתם גרם חיוביים ניזונים מהפרשות העור , חיידקים אלו. לסילוק והמתה של כל החיידקים

. ומתאים מתים בשכבה החיצונית של האפידרמיס

בחלל . חלקים אחרים של הגוף כמו חלל הפה והמעיים מייצגים סביבות אקולוגיות עשירות יותר

שם מהווים החיידקים , םהפה נמצא בעיקר סטרפטוקוקים המוליטיים ואילו במעיי

. נמצא בעיקר חיידקים גרם שליליים ואנארוביים פקולטטיביים, מתוכן המעי20% -כ

חומרים לזוג

צלחות אגר דם 2

NA צלחות 6

קיסמים ומטושים סטריליים2

ביצוע

עם (כ " ואחNAזרע על מחצית פלטת . סטרילי) swab( משטח גרון בעזרת מטוש ערוך .1

.על מחצית פלטה של אגר דם) ם שנותרו על המטוששארית החיידקי

פזר בעזרת הקיסם בחלק העליון של המחצית השנייה . חטט בין השיניים, קח קיסם סטרילי .2

. כ בחצי השני של פלטת אגר דם" ואחNAשל פלטת

כ גע שוב על פני "שטוף היטב ידיים במים וסבון ואח. NA אגרשלישגע באצבעות ידך על פני .3

וגע ) צמר גפן רווי באתנול(חטא ידיך בכוהל . עם אותן אצבעותהצלחת של שליש אחר

.בשליש האחרון של הצלחת

). אל תירק (NA של צלחתנשוף מאויר ריאותיך על .4

. 370C' בטמפ, הדגר את כל הפלטות באינקובטור .5

. בחן הופעת המוליזה באגר דם. את תצפיותךסכם: לאחר הדגרה .6

39

באדמהמיקרואורגניזמיםת ספיר: 5ניסוי מספר מפאת מגוון . אדמה היא בית גידול מורכב המכיל מספר רב של נישות אקולוגיות המשתנות תדיר

כל מין מתפתח בתנאים האופטימליים לו : האדמה עשירה מאוד במיקרואורגניזמים, האפשרויות

ניתן למצוא , לדוגמא. ומהווה יחד עם מינים אחרים את הפלורה הטבעית של בית גידול נתון

ןקושרי פחמ, ) אטמוספרי כמקור לתרכובות חנקןN2מנצלים (חנקןבאדמה חיידקים קושרי

חיידקים גרם חיוביים האופייניים לאדמות (אקטינומיצטים , )פחמןל כמקור CO2מנצלים (

. ועוד)חלקם יוצר חומרים אנטיביוטיים, העשירות בחומר אורגני

נבגים בקטריאליים מופיעים בחיידקים כגון . בנבגים לסביבה עשירה גםהאדמה נחשבת

Bacillus ,Clostridiumו - Sporosarcina . הם מצטיינים ביציבות לתנאי סביבה קיצוניים

הנבגים עטופים במעטפות בעלות שבירות אור ). קליטת כימיקלים, יובש, קרינה, טמפרטורה(

אין חומצה דיפיקולינית בתאים (ומכילות חומצה דיפיקולינית) בליעת אור גבוהה(גבוהה

הנביטה היא . או גירוי מכניpH, נביטת הנבגים דורשת גירוי מוקדם כמו הלם חום ).וגטטיביים

הוא מהיר ובו הנבג מאבד את התכונות germinationהראשון : הכולל שני שלביםתהליך

, לחים וחומרי מזוןמ, קולט מים, ארוך יותר ובו התא גדלoutgrowthהשלב השני . האופיניות

.והוא מסתיים בחלוקת התא הראשונה

מטרת הניסויריכוז חיידקים , ריכוז נבגים,כלליריכוז חיידקים : באדמה חיידקיםקבוצות שונות של קביעת ריכוז

.קושרי פחמן ואקטינומיצטים, קושרי חנקן, תרמופילים

עקרון הניסוי

הגידול מתבצע בתנאים . ונות של ברירה והעשרהבידוד מיקרואורגניזמים שונים מתבסס על עקר

, סלקטיביים המאפשרים גידול של אוכלוסיה מיקרוביאלית מסוימת בלבד או העשרה שלה

בהשוואה , תודות לניצול יעיל יותר של חומרי המזון,כתוצאה מגידול מהיר יחסית שלה

עות הרכב מצע הגידול תנאי הברירה מופעלים בתהליך הבידוד בעיקר באמצ. לאוכלוסיות אחרות

והכוונה של הפרמטרים הסביבתיים של ) pHערך , חנקן וזרחן, מקורות פחמן, מקור האנרגיה(

). מידת האוורור והערבול, טמפרטורה(תנאי גידול

לפני ואחרי , של חיידקים באדמהקביעת ריכוז נבגים באדמה יתבסס על ביצוע ספירה כללית

לכן מושבות שיגדלו על המצע . ביים וגורם לנביטת הנבגיםהלם חום משמיד תאים וגטטי. הלם

.מקורן בנבגים שנבטו, לאחר הלם חום

.50ºC והדגרתו בטמפרטורה NAי זריעה על מצע "קביעת ריכוז חיידקים תרמופילים תעשה ע

40

לכן . שלא מכיל מקור חנקן) M( תעשה על מצע מניטול קביעת ריכוז חיידקים קושרי חנקן

.דקים שיגדלו על מצע זה מנצלות כמקור חנקן את החנקן הגזי מהאטמוספירהמושבות של חיי

לכן מושבות . אורגנישלא מכיל מקור פחמן T עקביעת ריכוז חיידקים קושרי פחמן תעשה על מצ

.מהאטמוספירה CO2 -ה את פחמןשל חיידקים שיגדלו על מצע זה מנצלות כמקור

.)S(סוקצינט י זריעה על מצע "שה עאקטינומיצטים תיעקביעת ריכוז חיידקים

חומרים לזוג אדמת גינה יבשה

)ל למבחנה" מ4.5( מבחנות סליין 11

)אגר מזין (NA צלחות 14

M צלחות 2

T צלחות 2

S צלחות 2

כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטרילים, פיפטורים

מהלך הניסוי

מערבבים . ל סליין סטרילי"מ 9לתוך מבחנה המכילה ומעבירים גרם אדמה יבשה 1שוקלים .1

.10-1זהו המיהול הראשון . vortexי "היטב ע

אופן ביצוע מיהולים עשרוניים (10-6מבצעים מיהולים עשרוניים נוספים במבחנות סליין עד .2

.)16-15מוד בעמתואר

ספירת ( 37ºC שיודגרו בטמפרטורה NAמבצעים זריעות פיזור על צלחות מכל המיהולים .3

.14בעמוד אופן ביצוע זריעת פיזור מתואר ). תחיידקים כללי

50ºC שיודגרו בטמפרטורה NAמבצעים זריעות פיזור על צלחות 10-2 - ו10-1ממיהולים .4

).תרמופילים(

37ºC שיודגרו בטמפרטורה Mמבצעים זריעות פיזור על צלחות 10-2 - ו10-1ממיהולים .5

).קושרי חנקן(

37ºC שיודגרו בטמפרטורה Tות פיזור על צלחות מבצעים זריע 10-2 - ו10-1ממיהולים .6

).קושרי פחמן(

37ºC שיודגרו בטמפרטורה Sמבצעים זריעות פיזור על צלחות 10-2 - ו10-1ממיהולים .7

).אקטינומיצטים(

). הלם חום( דקות 10 במשך 80ºC באמבט מים בטמפרטורה 10-1מעמידים את המבחנה .8

. ומנות בהתאםסהמ, 10-6נות סליין עד מבצעים מיהולים עשרוניים חדשים במבח .9

41

חדשות מסומנות בהתאםNAמבצעים זריעות פיזור על צלחות מכל המיהולים החדשים .10

.)נבגים( 37ºCשיודגרו בטמפרטורה

סיכום התוצאות

.צלחותכל ה המושבות בספור את .1

י " עהחישוב נעשה. באדמה הנבגיםמהקבוצות השונות ואת ריכוז ריכוז החיידקים את חשב .2

.ל" במנפח שנזרעוחלוקה במיהול הקטור בפבצלחת מספר המושבות הכפלת

ריכוז בסכום של הנבגיםריכוז י חלוקת "החישוב נעשה ע. באדמההנבגיםחשב את אחוז .3

.100 ומוכפל פי ריכוז החיידקים הכלליו הנבגים

צביעות

חומרים לזוג Bacillus cereusל תרחיף נוזלי ש

.Clostridium spתרחיף נוזלי של

ריאגנטים לצביעת נבגים וריאגנטים לצביעת גרם מתקן לצביעה, פלטה חשמלית, כוס פיירקס, נייר סינון, פינצטה, זכוכיות נושאות

מהלך הניסוי : חלק א

:ל, 18-17בעמוד פ פרוטוקול "בצעו צביעת גרם ע

תרחיף אדמה

: חלק ב

:ל ,20-19ד בעמופ פרוטוקול "ע צביעת נבגים בצעו

Bacillus cereusתרבית טהורה של החיידק

.Clostridium spתרבית טהורה של החיידק

תרחיף אדמה

42

השפעת פסטור ועיקור על מיקרואורגניזמים בחלב: 6ניסוי מספר ע מזיהומים מעטין הפרה ומפעולת ב הנו,כ מטען מיקרוביאלי מסויים"החלב הגולמי מכיל בד

החלב הוא מצע . 'שחפת וכו, קים פתוגנים וביניהם חיידקי טיפוסהוא עלול להכיל חייד. החליבה

:לשם שימורם של מוצרי חלב ומניעת קלקולם נוקטים במספר שיטותמזון טוב לחיידקים ולכן

בעיקר גורמי מחלות ואינו משמיד , מהמיקרואורגניזמיםחלקטיפול תרמי מתון המשמיד : פסטור

בתעשייה ( למשך חצי שעה63ºC -י השהיית החלב ב" עניתן לבצע פסטור. נבגים של חיידקים

). שניות2-4 משך ל125-1380Cעל -או פסטור, שניות14 למשך 72ºC -מקובל לפסטר ב

.)קירור(החלב לא סטרילי ולכן יש לשלב אמצעי שימור נוספים , לאחר תהליך פסטור

, ) דקות15 במשך 121ºC -טיפול אפקטיבי ב(כ באוטוקלב "טיפול תרמי חזק הנעשה בד: עיקור

לא נהוג לחמם את החלב .כולל נבגים של חיידקים, משמיד את כל המיקרואורגניזמים

מכיוון שהדבר משנה את טעמו ומפריע בשלבים ) כלומר להרתיחו (100ºCלטמפרטורה של

חלב זה –חלב עמיד נחשב לחלב מעוקר . הליכי הייצור של מוצרי חלב שוניםהבאים של ת

. למשך מספר שניות140ºCייה בטמפרטורה תעשמטופל ב

ת הניסויומטרי מתילן "עבדיקת טריות חלב י ספירת חיידקים ו"ע) מעוקר אומפוסטר, גולמי(בחינת סוג החלב

.כחול

ספירת חיידקים בחלב. א

חומרים לזוג ל חלב גולמי" מ3

בשקיתל חלב מפוסטר" מ3

)עמיד(ל חלב מעוקר " מ3

)ל למבחנה" מ9( מבחנות מיהול 9

)אגר מזין (NA צלחות 11

פטרי סטריליות ריקות צלחות 11

מותך סטרילי MRS agarבקבוק המכיל מצע

כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטרילים, פיפטורים

43

מהלך הניסוי :מבצעים בחלב שני סוגי ספירה של חיידקים

צעים זריעות פיזור על לאחר ביצוע מיהולים עשרוניים מב:)total count(ספירה כללית .1

.סופרים את כל סוגי המושבות, 37ºC -בהדגרה לאחר . )כמפורט בטבלה (NAצלחות

בתוך ל בזריעה " מ1זורעים , לאחר ביצוע מיהולים עשרוניים:ספירה של חיידקים לקטיים .2

לאחר . ) נמוךpH -מאופיין ב, לחיידקים לקטייםסלקטיבי (MRSבמצע ) pour plate( האגר

.סופרים את המושבות הלבנות והריריות, 37ºC - בהדגרה

וזריעותמיהולים טבלת

10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 מקור סוג המצע סוג החלב

NA + + + + + גולמי

MRS + + + + +

NA + + + + + מפוסטר

MRS + + + + +

NA + מעוקר

MRS +

ריעה על צלחתמציין מיהול ממנו מתבצעת ז+ הסימן

סיכום תוצאות . השווה לתקנים.ל"ספור מושבות במצעים השונים וחשב את ריכוז החיידקים למ

.105cells/ml*2.5הספירה הכללית בחלב גולמי תהיה עד , לחלב גולמי55פ תקן "ע

.105cells/ml*1כללית בחלב מפוסטר תהיה עד ההספירה , לחלב מפוסטר284פ תקן "ע

44

)methylene blue(לן כחול בחלב בדיקת מתי. בכאשר מוסיפים אותו . המאפשר לבחון אם יש או אין חיידקים בחלב, מתילן כחול הוא חומר בוחן

ההסבר לכך . הצבע נעלם, אך בחלב שיש בו חיידקים. מתקבל צבע כחול, ידקיםילחלב נקי מח

מצן הוא מאבד את צבעו של חומר הבוחן הוא כחול ובהיעדר ח, בסביבה המכילה חמצן: הוא

ריכוז החמצן בחלב יורד ולכן נעלם , הם צורכים חמצן, כאשר החיידקים מתרבים בחלב. צבעו

קיימת קורלציה מסוימת בין כמות החיידקים החלב לבין מהירות . הצבע הכחול של חומר הבוחן

.היעלמות הצבע הכחול של המתילן הכחול

חומרים לזוג

עד לניסויחלב מפוסטר ששהה בקירור שקית

חלב מפוסטר ששהה כשעה מחוץ למקרר שקית

עם פקק מתברג מבחנות גבוהות סטריליות6

0.01%תמיסת מתילן כחול בריכוז

ותרמומטר100ºC - ו50ºCאמבט

מהלך הניסוי .1-6סמן את ששת המבחנות במספרים .א

פורט ופעל כמששהה בקירור עד לניסויחלב מפוסטר ל " מ10 - ב1-3מלא את מבחנות .ב

:להלן

. השאר בטמפרטורת החדר1' מבחנה מס

.)י תרמומטר" בחלב ע'מדוד טמפ (C50°לטמפרטורה עד הגעה חמם 2' מבחנה מס

.)י תרמומטר" בחלב ע'מדוד טמפ (C100° טמפרטורהעד הגעה ל חמם 3' מבחנה מס

.טבפקוק ונער הי, מתילן כחולמתמיסת ל " מ1הוסף לכל מבחנה .ג

. בכל אחת מהמבחנותקבלשום את צבע החלב שהתר .ד

יש לבדוק את המבחנות מדי (עקוב במהלך המעבדה אחר היעלמות הצבע במבחנות .ה

.יש לציין תוך כמה זמן מתחילת הניסוי נעלם הצבע, במידה והצבע נעלם). רבע שעה

ה אך עם חלב מפוסטר ששהה כשע, 4-6 במבחנות ה-בחזור על הפעולות שבסעיפים .ו

. מחוץ למקרר

.השווה את התוצאות שהתקבלו בשני סוגי החלב ובתנאים השונים

45

השפעת כלור על תמותה של חיידקים: 7ניסוי מספר המהווה את הגורם , )HOCl(כאשר כלור מוסף למים הוא מתרכב עימם ויוצר חומצה היפוכלורית

לכן היא . משקל מולקולרי נמוךהיא ניטרלית ובעלת ) HOCL(חומצה היפוכלורית . המחטא במים

בסיסי pH -הפעילות הביוצידית לרוב נחלשת ב. חודרת בקלות לתא ומכאן פעילותה הביוצידית

המטען השלילי יכול למנוע חדירה של התרכובת לתא ). -OCl(מכיוון שמתקבל יון היפוכלוריט

ם בעלי מטען שלילי ולמנוע מגע קרוב עם חלבונים כתוצאה מכוחות דחייה חשמליים עם חלבוני

. בפני השטח של החיידק

:הכלור גורם להרעלה בלתי הפיכה של התא

אינאקטיבציה בלתי הפיכה של המערכות האנזימתיות בתא –

כלורינציה של מרכיבים בתא ויצירת כלוראמינים טוקסיים –

: כלורינציה של מרכיבי ממברנת התא –

למשל פגיעה ישירה במנגנון , ים הקשורים לממברנההפרעה לתפקודים שונ •

הפוספורילציה האוקסידטיבית

דבר הגורם לדליפת מרכיבי תא חיוניים, פגיעה בברירנות הממברנה •

שהיא בעלת ) HOCl( הכלור מגיב עם המים ויוצר חומצה היפוכלורית -תגובות חימצון –

חומצות , אנזימים, ו חלבוניםפוגעת במרכיבים חיוניים בתא כמ(פעילות ביוצידית חזקה

)גרעין

.המנגנון בפועל יכול לערב שילוב של השפעות אלה

:הכושר הביוצידי של הכלור מושפע ממספר גורמים

גורמת להגדלה בריכוז חומצה היפוכלורית ולכן להגברת הפעילות7 - מתחת ל pH -ירידה ב –

עליית הטמפרטורה מאיצה את תמותת החיידקים –

)עד רמה מסוימת(מצא ביחס ישר לריכוז הכלור שעור התמותה נ –

תרכובות אורגניות ואנאורגניות במים נקשרות לכלור והוא מאבד מתכונת החמצון שלו –

:יתרונות השימוש בכלור

. ואוזוןUVעלות נמוכה בהשוואה לשיטות חיטוי אחרות כמו

.יעיל בריכוזים נמוכים

46

ניתן למדוד אותו על . החיטוי הראשונימאריך את השפעת , הריכוז השאריתי הנותר במים

.ריך את יעילותועמנת לה

.יעיל בחמצון תרכובות אורגניות ואנאורגניות. חומר מחמצן חזק

.יעיל כנגד טווח רחב של מיקרואורגניזמים פתוגנים

.מסלק תרכובות בעלות ריח לא נעים

.י לוואיניתן ליצור בקלות כלוראמינים בעלי כושר חיטוי שאינם יוצרים תוצר

:חסרונות השימוש בכלור

.רעיל לאורגניזמים מימיים, גם במינונים נמוכים, כלור שאריתי

שינוע וטיפול בו מצריכים החמרה של , לכן אחסון. כל צורות הכלור הן קורוזיביות ורעילות

.תקנות בטיחות

ריהלומתאניםט, חמצון תרכובות אורגניות מסוימות גורם ליצירת תרכובות לוואי קרצינוגניות

)THM.( מיקרוגרם לליטר100 נקבע לחומרים אלה תקן מירבי במי השתייה של 1999 -ב .

דרך נוספת . ניתן למנוע את היווצרות הטריהלומתאנים על ידי שימוש בכלור במינונים נמוכים

. להפחתת תוצאי הלוואי של הכלור היא סינון החומר האורגני מהמים לפני הוספת הכלור

.תבצע בעיקר בשימוש במי הכינרת המכילים חומר אורגני רב לעומת מי התהוםדבר זה מ

נוכחות תרכובות המגיבות עם כלור מאלצת שימוש במינונים גבוהים יותר לקבלת אפקט

.חיטוי מספק

- וGiardiaכמו ציסטות של , כמה אורגניזמים מראים עמידות למינונים נמוכים של כלור

Cryptosporidium )ואה הגורמים לפרוטוז- Giardiasisו - Cryptosporidiosis , מחלות

ניתן להשתמש בסינון על מנת לסלק . ואף למוות במקרים קשים, הגורמות לבעיות מעיים

.)בנוסף לכלורינציה, פרוטוזואה מהמים

.לא ידועה השפעה ארוכת טווח של שחרור תרכובות כלור לסביבה

.חה ועלול לגרום לצריבות בעור ובעינייםריכוז כלור גבוה במים גורם לריח דו

שאינו יוצר תרכובות מסרטנות והוא ) ClO2(כיום נוהגים לעבור לחיטוי על ידי כלור דיאוקסיד

.חסר ריח וטעם לוואי

ריכוזים שונים של חשיפה ל על ידי E.coliמטרת הניסוי הנוכחי היא להראות תמותה של חיידקי

וקביעת ריכוז E.coliת ריכוז מסוים של כלור לתרחיף של חיידקי י הוספ"ערך עייהניסוי . כלור

.החיידקים בזמנים שונים לאחר מכן

47

חומרים לזוג 4x105 -כ בריכוז E.coliל תרחיף חיידקי " מ5.5 מבחנות עם 2

.ppm 25ל תמיסת כלור בריכוז " מ0.5

)ל בכל מבחנה" מ4.5( מבחנות סליין סטרילי 20

NA צלחות 22

כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטריליים, יםפיפטור

טיימרשעון

מהלך הניסוי

. 4x105 בריכוז E.coliל תרחיף חיידקי " מ5.5 מבחנות המכילות 2לפניך

). 0זמן (קבע את ריכוז החיידקים בכל מבחנה לפני הוספת כלור .1

)ppm 0.5ריכוז הכלור הסופי במבחנה (ל מתמיסת הכלור" מ0.1, 1הוסף למבחנה .2

. )ppm 1ריכוז הכלור הסופי במבחנה (ל מתמיסת הכלור" מ0.2, 2למבחנה ו

.הנחשב זמן אפס וערבב את המבחנות, רשום את זמן ההוספה .3

י ביצוע מיהולים עשרוניים וזריעות פיזור "בצע ספירות לחיידקים ע, דקות15 - ו10, 5 כעבור .4

:כמתואר בטבלה, NAעל צלחות

מיהולים עשרוניים

10-3 10-2 10-1

מקור

+ + 0

+ + + 5

+ + + 10

+ + + 15

זמן לקיחת

דוגמא

)דקות(

מציין מיהול ממנו מתבצעת זריעה על צלחת+ הסימן

. למשך הלילה37ºC -הדגר את הצלחות ב .5

סיכום תוצאות : לאחר הדגרה

ל השונים ובריכוזי בזמני הטיפול"ספור מושבות במצעים וחשב את ריכוז החיידקים למ .1

.הצג את תוצאותיך בגרף .הכלור השונים

ריכוז חיידקים לאחר טיפול מחולק : פ"החיידקים השורדים בכל זמן וריכוז ע %חשב את .2

.הצג את תוצאותיך בטבלה. 100 ומוכפל פי לפני טיפולבריכוז חיידקים

.הסבר את התוצאות .3

48

חומרים בדיקת רגישות מיקרואורגניזמים ל: 8ניסוי מספר אנטיביוטיים

או בקטריוליטים, קוטל ללא ליזיס= בקטריוצידים(חומרים אנטיביוטיים הם חומרים המשמידים

מחלקים אותם . מיקרואורגניזמים באופן סלקטיבי) בקטריוסטטים(או מעכבים ) י ליזיס"קוטל ע=

. ח ההשפעהאתר ההשפעה וטוו, סוג ההשפעה, מבנה כימי: לקבוצות לפי קריטריונים שונים

מטרת הניסוי .בדיקת רגישות של מיקרואורגניזמים לחומרים אנטיביוטיים .1

).MIC(קביעת הריכוז המינימלי המעכב לאנטיביוטיקה .2

Kirby-Bauerבדיקת רגישות לפי . אהאנטיביוטי הוא מבוסס על כושרו של החומר . נוח לזיהוי השפעת חומרים אנטיביוטייםזהו מבחן

הנבדק שנזרע על המצע המיקרואורגניזםמצע מזון מוצק ולעכב את גידולו של לעבור דיפוזיה ב

לאחר מכן מניחים את . המיקרואורגניזם על פני מצע מזוןףתחילה מפזרים מתרחי). צלחת אגר(

הדיסקיות או לכן שיטה זו נקראת שיטת . צלחת האגר בצורה של דיסקיתעל האנטיביוטיקה

המכסה את פני ) דשא( ויוצר מרבד ה מתרבהמיקרואורגניזם ,בזמן ההדגרה. שיטת הדיפוזיה

אזור צלול סביב יתקבל, והחומר הנבדק מעכב את גדילתו במידה ,אולם. השטח של הצלחת

. כמוצג באיור,סקיותיהד

דוגמא לתוצאות מבחן הדיפוזיה באגר חיידק ( E.coli ,)שמר (Sacharomyces cerevisiae: אם המיקרואורגניזמיםנקבע בניסוי זה

כמה חומרים עמידים או רגישים ל, )חיידק גרם חיובי (Staphylococcus aureus -ו) גרם שלילי

.אנטיביוטיים

חומרים לזוג : מהמיקרואורגניזמים הבאיםאחד תרחיפים עכורים של

E.coli

Staphylococcus aureus

Sacharomyces cerevisiae

)כתלות במיקרואורגניזם (OGY או NA צלחות 2

,penicillin, ampicillin, sulfadiazine, chloramphenicol(דיסקיות של חומרים אנטיביוטיים

streptomycin, nystatin(

פינצטה, כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטריליים, פיפטורים

49

מהלך הניסוי : צלחות מצע מזון2 על ל מתרחיפים עכורים" מ0.1בצע זריעות פיזור של .א

NAחיידקים על

).oxytetracycline בתוספת YEמצע (OGYשמר על

:) דיסקיות לצלחת3 (ל את הדיסקיות של האנטיביוטיקות" על הצלחות הנהנח .ב

1. Penicillin

2. Ampicillin

3. Sulfadiazine

4. Chloramphenicol

5. Streptomycin

6. Nystatin

.30ºC - בOGY ואת צלחות 37ºC - בNA - את צלחות ההדגר .ג

יש להשלים תוצאות ( )מ"במ(לל הדיסקיות ד את קוטר איזור העיכוב כוו מד: ההדגרהלאחר .ד

. את התוצאותהסבר ו)מכל הכיתה

)MIC(קביעת הריכוז המינימלי המעכב . ב

את התרבותו מעכבאשר עדין , מטרת הניסוי היא לקבוע את הריכוז המינימלי של האנטיביוטיקה

ת רבשיטה זו מכינים סד ).minimal inhibitory concentration) MIC –של חיידק ספציפי

לתוך הנבדק מיהולים של החומר תמבחנות המכילות מצע גידול המתאים לחיידקים ועושים סדר

לכל מבחנה מוסיפים . כך שריכוז החומר המעכב ילך וירד ממבחנה אחת לשנייה, מבחנות אלה

פ הופעת " ע,הדגרה קובעים היכן התרחש גידול והיכן לאלאחר . מזרע של החיידקים ומדגירים

הריכוז הנמוך ביותר של החומר האנטיביוטי בו לא היה . עכירות או העדרה מהמבחנות השונות

. MIC -גידול הוא ה

MICדוגמא לקביעת

50

הריכוז המינימלי –) MBC) minimal bactericidal concentration - וMICן בין יש להבחי

מכיוון שיש חומרים , MIC - לא נבדק בניסוי זה ואינו בהכרח זהה לMBC - ה.הקוטל

וישנם חומרים שהם בקטריוצידים רק בריכוזים גבוהים , אנטיביוטיים שהם בקטריוסטטיים בלבד

האם , צריך להמשיך ולבדוק מהמבחנות בהן לא היה גידול, MBC -כדי לבדוק את ה .מאוד

מהמבחנות בהן לא נצפה אינוקולום ניתן לקחת לצורך כך .חיידקים מתים או מעוכבים בלבדה

הנפח הסופי , ם שנזרעו למבחנהימתוך ידיעת ריכוז החיידק. גידול ולזרוע על צלחות עם אגר מזין

ניתן לחשב כמה מושבות חיידקים אמורות להתקבל אם חל , במבחנה והנפח שנלקח לזריעה

99% -היעדר גידול שמעל ל( מהחיידקים שנזרעו 1% -מגידול של פחות . בלבדעיכוב בגידול

.שהחומר בקטריצידי בריכוז שנבדק במבחנהיעיד , )מהחיידקים

- וE.coli: עבור שני חיידקיםpenicillin לאנטיביוטיקה MIC -במעבדה זו נקבע את ה

Staphylococcus aureus.

חומרים לזוג : החיידקים הבאיםאחד של במרק מזין)cells/ml 105 - כוזבריכ( לוגריתמיףתרחי

E.coli

Staphylococcus aureus

mg/ml 2תמיסת פניצילין בריכוז ל "מ 6

)ל למבחנה" מ5(גבוהות NB מבחנות 8

ל" מ5 פיפטות סטריליות של 7

משאבה לפיפטות

מהלך העבודה .mg/ml 2של פניצילין בריכוז של מקבלים תמיסת אם .1

.8 עד 1 במספרים NBל מרק מזין " מ5 אחת כלהמכילות , מבחנות8מסמנים .2

אופן ביצוע (7מבחנה עד 1עורכים מיהולים כפולים של האנטיביוטיקה החל ממבחנה .3

מתמיסת האם למבחנה ל " מ5י העברת " עעושים זאת). 16בעמוד מיהולים כפולים מתואר

יש להוציא 7ממבחנה . 7מבחנה מספר וכך הלאה עד 2וממנה למבחנה מספר , 1מספר

יש להחליף פיפטה בין מיהול אחד . יש לערבב כל מבחנה לאחר המיהול. ל" מ5נפח של

. מבחנת ביקורת– ללא אנטיביוטיקה 8משאירים את מבחנה מספר . למשנהו

. החיידקףל מתרחי" מ0.1מוסיפים לכל אחת מהמבחנות .4

.עות ש24 למשך 37ºC -מדגירים את המבחנות ב .5

. MIC וקובעים את בודקים הופעת עכירות בכל אחת מהמבחנות:ההדגרהלאחר

51

בדיקות מים: 9ניסוי מספר MPNבדיקת קוליפורמים בשיטת : חלק א9ניסוי

חייבים לעבור בדיקות על מנת לוודא שלא הזדהמו בזיהום שמקורו , מים המיועדים לשתיה

בדיקות אלה נעשות בשיטות סטנדרטיות בהתאם . )ח"זיהום שמקורו בצואת אדם או בע(פקאלי

כולרה , דיזנטריה, מים מזוהמים בזיהום פקאלי עלולים להעביר מחלות כגון טיפוס הבטן. לתקן

, מאחר וקשה לבדוק את החיידקים מחוללי המחלות הנמצאים במים. ומהווים סכנה לבריאות' וכו

חיפשו אחרי חיידק מזהה , קים הגדולבגלל מספרם הנמוך והקושי בזיהויים מתוך כלל החייד

: שיענה על הדרישות הבאות) אינדיקטור(

.ח"או בע/מקורו בצואת אדם ו .1

.יחסיתריכוזו במים גבוה .2

.קביעת החיידק המזהה תהיה פשוטה וספציפית .3

.ושפכיםמי ים , מי תהום, נהר, מי ברז-צריך להתאים לאנליזה של כל סוגי המים .4

.ידול וזיהוימספרו יהיה רב ונוח לג .5

.הנו עמיד יותר מהחיידקים מחוללי המחלות .6

.לרמת האינדיקטור במים צריך להיות קשר ישיר לרמת הזיהום הפקאלי .7

אחרים יתנו כלומר אסור שחיידקים , ספציפיתעל פרוצדורת המבחן לאינדיקטור להיות .8

ות נמוכות של כמו כן על השיטה להיות רגישה ולגלות רמ). false positive(תוצאה חיובית

.האינדיקטור

.רצוי שהאינדיקטור יהיה בלתי מזיק לאדם .9

נוכחותם במים מהווה . כיום משתמשים בחיידקים קוליפורמים כמיקרואורגניזמים אינדיקטורים

. אינדיקציה לזיהום המים בחומר ממקור צואתי

ם את הסוגים הם כוללי, Enterobacteriaceae -החיידקים הקוליפורמים משתייכים למשפחת ה

)genera (Escherichia ו - Aerobacter וקבוצות ביניים )intermediates.(

הם משמשים . משמשים גם כן כמיקרואורגניזמים אינדיקטורים) צואתיים(אנטרוקוקים פקאלים

במי מלח חיידקים אלו מתים בשיעור נמוך יותר . כאינדיקציה לזיהום צואתי במים מלוחים ומי ים

.ובשל כך הם מהווים אינדיקטור אמין יותר לזיהום אפשרי, קוליפורמים הפקאליםמזה של ה

:המבחן הקלאסי לגילוי קוליפורמים במים מורכב משלושה שלבים

Presumptive testמבחן מוקדם .1

Confirmed test בחן מאשרמ .2

Completed testמבחן שלם .3

52

המבחן המוקדם: חלק ראשון, חסרי ספורות, אנאירובים פקולטטיבים, ללת מתגים גרם שלילייםקבוצת חיידקי הקוליפורם כו

.35ºC שעות בטמפרטורה 48 תוך לקטוז עם יצירת גז להתסיסהמסוגלים

מספר . הבדיקה המוקדמת לנוכחות חיידקי קוליפורם מבוססת על יצירת חומצה וגז מלקטוז

. MPNהקוליפורמים המשוער נקבע בשיטת

בשיטה . סטית המשמשת להערכת ריכוז מיקרואורגניזמים בדוגמאשיטה סטטיהיא MPNשיטת

השיטה מתבססת על מיהול . זו הדוגמא הנבדקת עוברת סדרה של מיהולים עשרוניים

המכילות מצע מזון , מבחנות5האוכלוסיה עד הכחדה וזריעה מכל אחד מהמיהולים לסדרה של

ושליליות התקבלו בכל אחד לאחר הדגרה בודקים כמה מבחנות חיוביות. נוזלי ספציפי

מבחנה חיובית משמעותה . 'יצירת גז וכו, שונים הכוללים עכירותפרמטריםעל בסיס , מהמיהולים

מספר המבחנות החיוביות . שלפחות חיידק אחד נכח במבחנת המיהול ממנה בוצעה הזריעה

בטבלאות י שימוש"ע, בכל מיהול משמש להערכת ריכוז המיקרואורגניזמים בדוגמא המקורית

).standard methods(סטטיסטיות

: השיטהיתרונות

או כשלא ניתן להשתמש בשיטת הספירה החיה/שימושית כשמספר החיידקים בדוגמא קטן ו

פשוטה יחסית

י שימוש במצעים "ניתן להעריך ריכוז קבוצות ספציפיות של מיקרואורגניזמים בדוגמא ע

סלקטיביים

: השיטהחסרונות

ה הסתברותית של מספר החיידקיםמתבסס על הערכ

דורש מבחנות רבות

ת מושבותילא ניתן לראות מורפולוגי

חומרים לזוג ל דוגמת מים" מ100

ל בופר סטרילי" מ90 בקבוקי מיהול המכילים כל אחד 3

ז כפול ובתוכן מבחנת דורהם ל מרק לקטוז בריכו" מ10המכילות כל אחת גבוהות מבחנות 5

הפוכה

ז רגיל ובתוכן מבחנת דורהם הפוכהל מרק לקטו" מ10המכילות כל אחת והות גב מבחנות 20

ל" מ10פיפטות סטריליות של

53

)54בעמוד ראה סכימה (מהלך הניסוימבין המבחנות המכילות . A המבחנות המכילות מרק לקטוז בריכוז כפול באות 5סמן את .1

. בהתאמהE - וB ,C ,D מבחנות באחת האותיות 5סמן כל , מרק לקטוז בריכוז רגיל

ל מדוגמת המים הנבדקת לכל אחת " מ10ל העבר באופן סטרילי " מ10בעזרת פיפטה של .2

. ערבב היטב ובזהירות.Aמהמבחנות המסומנות

ל מדוגמת המים הנבדקת לכל אחת מהמבחנות " מ1בעזרת פיפטור העבר באופן סטרילי .3

. ערבב היטב ובזהירות.Bהמסומנות

.E - וC ,Dי המיהול באותיות בקבוק3סמן את .4

.ערבב היטב. Cל מהדוגמא לבקבוק " מ10בעזרת פיפטה העבר .5

.ערבב היטב. D לבקבוק Cל מבקבוק " מ10בעזרת פיפטה סטרילית נוספת העבר .6

.ערבב היטב. E לבקבוק Dל מבקבוק " מ10בעזרת פיפטה סטרילית נוספת העבר .7

. Cל לכל אחת ממבחנות שורה " מ1 והעבר בעזרת פיפטורCערבב היטב את בקבוק .8

.E - וDחזור על אותה פעולה עבור בקבוקים .9

. שעות48 למשך 35ºCאת המבחנות והדגר באינקובטור ובזהירות ערבב היטב .10

הופעת גז במבחנת דורהם ההפוכה מצביעה על מבחן מוקדם חיובי לחיידקים מקבוצת .11

.הקוליפורמים

פרשנות תוצאות

מספר יש לחשב את . בדוגמת המים שבדקת) MPN(חשב את המספר המסתבר ביותר .12

.55בעמוד MPNת פ טבל" ע,מיםדוגמת ל " מ100 -החיידקים ב

54

MPNסכימה למהלך שיטת

:MPNדוגמא לחישוב ריכוז חיידקים לפי מסתכלים בטבלה במיהול : הסבר לדוגמא

הן בחנות כל חמש המשבו , ביותרהגבוה

ובהמשך בשני חיוביות לתכונה הנבדקת

. )הגבוהים יותר(המיהולים הבאים

) מכונה מספר אופייני(המספר המתקבל

המייצגות את , ספרות משלושמורכב

שהיו בכל , החיוביותמספר המבחנות

על פיו קובעים את מספר .מיהול

וש החיידקים בתרחיף המקורי תוך שימ

המתאיםבגורם המיהול את המספר המתקבל מהטבלה כעת יש לכפול. בטבלה סטטיסטית

-מספר זה מתאים ל, 532 המספר האופייני בדוגמא הוא ). המיהולים הנבחרים3 מבין נמוךה(

MPN כעת יש לכפול בגורם המיהול המתאים שהוא ). לפי הטבלה הסטטיסטית (140 של

.1400ל דוגמת מים הוא " מ100 -ידקים למכאן ריכוז החי. 101במקרה זה

55

56

המבחן המאשר: חלק שנייש , לשם כך. מטרתו לקבוע אם אמנם מתסיסי הלקטוז שהופיעו במבחן המוקדם הם קוליפורמים

חיידקים גרם דילת גםמדכאיהלהעביר מזרע מהמבחנות החיוביות למצעים הכוללים חומרים

.את המבחן המאשר ניתן לבצע עם מצע נוזלי או מוצק. חיוביים

מצע נוזלי. א

מרק זה ). Brilliant green lactose bile broth) BGLBהמרק בו משתמשים לבדיקה נקרא

לצורך המבחן . קוליפורמים הם גרם שליליים. מכיל מלחי מרה המעכבים גדילת גרם חיוביים

.הגבוהים ביותר שהתקבלו במבחן המוקדם) גזעם (משתמשים בשלושת המיהולים החיוביים

חומרים לזוג BGLGמבחנות 3

מחט בקטריאלית

מהלך הניסוי .בהתאם לסימון המקורי במבחן המוקדם BGLG -המבחנות סמן את .1

שרוף מחט בקטריאלית והעבר דוגמא ממבחנת המבחן המוקדם למבחנה מקבילה במבחן .2

.המאשר

. וסכם את התוצאותעות ש48 למשך 35ºCהדגר באינקובטור .3

.יצירת גז בכל כמות שהיא במשך זמן ההדגרה מראה על מבחן חיובי .4

דוגמא לתשובה חיובית

57

מצע מוצק. ב

).Eosin methylene blue agar) EMBמש כמצע מוצק מבחין מאשר מש

חומרים לזוג

EMBצלחות 2

מחט בקטריאלית

מהלך הניסוי

2(קח מחט בקטריאלית והעבר לולאה של תרבית מהמבחנות החיוביות של המבחן המוקדם .1

.יש לבצע זריעת בידוד על הפלטה. EMBטרי של מצע פלצלחות ) מיהולים גבוהים

. וסכם את התוצאות שעות24שך למ35ºCהדגר באינקובטור .2

:את המושבות המתפתחות ניתן להגדיר כ .3

מבחן מאשר חיובי לקוליפורמים, בעלות מרכז כהה עם או בלי ברק מתכתי: טיפוסיות

)E.coli(.

. )Enterobacter (ריריות או ורודות, אטומות ללא מרכז כהה: בלתי טיפוסיות

.ימבחן מאשר שליל. כל יתר המושבות: שליליות

המבחן השלם: חלק שלישי 2מבחן זה כולל . נועד לאמת את הבדיקות הקודמות ולהוכיח כי כל התכונות שייכות לאותו חיידק

: בדיקות

והדגרת המבחנה EMB מרק לקטוז מאחת המושבות האופייניות על זריעה חוזרת במבחנות .1

הופעת גז תאשר כי המושבה האופיינית שייכת לחיידק . שעות24 למשך 35ºCבאינקובטור

.מתסיס לקטוז

הקוליפורמים נראים במיקרוסקופ כמתגים . ביצוע צביעת גרם לאותה מושבה אופיינית .2

).גרם שליליים(ארוכים ורודים

58

שלם המבחן ה

fecal coliform test –מבחן לקוליפורמים ממקור צואתי או בשיטת , או מצע לקטוז בתוספת חומצה בוריתECמבחן זה ניתן לבצע במבחנות עם מצע

.הבדיקה נערכת עם חיידקים שעברו את המבחן המוקדם. הסינון הממברנלי

והעבר טיפה ) וביים גבוהים מיהולים חי3(נער בעדינות מבחנות חיוביות של המבחן המוקדם .1

.ECבעזרת מחט בקטריאלית למבחנה המכילה מצע

עכירות וגז מצביעים על נוכחות חיידקי קולי . שעות24 למשך 44.5ºCהדגר באינקובטור .2

.ממוצא צואתי

דוגמא לתשובה חיובית

59

בין קוליפורמים לאבחנה IMViCמבחן לבין קוליפורמים שאינם , E.coli, ההבדלה בתוך קבוצת הקוליפורמים בין חיידקים ממקור צואתי

מבוססת על הבדלים גנטיים , C.freundii או חיידקי ביניים כמו E.aerogenes, ממקור צואתי

אבחנה ה. זיולוגיות מסוימות כמו למשל פירוק טריפטופן לאינדוליהמתבטאים בתכונות פ

- וI (Indole ,)M (Methyl red ,)P-V (Voges-Proskauer: (מבוססת על ארבע בדיקות והן

)C (Citrate.

מהלך העבודה

מי , I ות המזון המסומנותלתוך קרקע, תנת לך למטרה זויל מתרבית החיידקים הנ" מ0.5זרע

.C -פפטון ו

. Voges - Proskauer - וMethyl red : מצע מי פפטון משמש לשתי בדיקות- הערה*

לאחר מכן הוסף . שעות24 למשך C°37 הדגר את המבחנות בטמפרטורה - Indoleנוכחות .1

amyl - מומס ב Kovac )Paradimethylaminobenzaldehyde טיפות ריאגנט 2-3

alcohol + HClתוצר הפירוק , דומה מעידה על נוכחות אינדולהופעת טבעת צבע א). מרוכז

.של טריפטופן

2. Voges Proskauer - הדגר את המבחנות הזרועות בטמפרטורה C°37 ימים5 למשך .

ל " מ0.2 - ו Naphtolל תמיסת " מ0.6והוסף ל למבחנה נפרדת" מ1העבר , לאחר ההדגרה

2-4התוצאות יש לקרוא את . אדום פירושה תוצאה חיובית-הופעת צבע ורוד. KOHתמיסת

.שעות לאחר הוספת הריאגנט

3. Methyl Red - טיפות של תמיסת אינדיקטור 5 הוסף לשארית הנוזל במבחנות Methyl

red .הופעת צבע צהוב פירושו תוצאה שלילית. הופעת צבע אדום פירושו תוצאה חיובית.

.5 - לpHהמבחן מבוסס על התססת גלוקוז תוך יצירת חומצה והורדת

4. Citrate) Kosser Citrate medium-Difco ( - הדגר את המבחנות הזרועות בטמפרטורה

והופעת צבע כחול פירושה ) עכירות(צמיחה הנראית לעין . שעות96 עד 72 למשך 37°Cשל

י החיידקים "ניצול הציטרט ע. תוצאה שלילית- וצבע ירוק הקרקע מזון צלול. תוצאה חיובית

. ועל כן מתקבל צבע כחולpH –הגורמים לעליית ה, מותיר יוני נתרן במצע

- וE. Coliשל טהורה לתרבית IMViCערוך בדיקות , מהביובבמקביל לבדיקות החיידקים .5

E.aerogenes.

60

Indoleבדיקת

Methyl redבדיקת

Voges Proskauerבדיקת

Citrateבדיקת

לחיידקים ידועיםIMViCתוצאות בדיקת

Citrate Voges Proskauer Methyl red Indole

E.aerogenes + + - -

E. coli - - + +

61

)embrane filtrationM(י שיטת הסינון "ע מים ת איכותיקבד: חלק ב9ניסוי הינה גורם בעל חשיבות עליונה מבחינה , בעיקר מי שתייה, איכות מיקרוביאלית של מים

וכן לשם קביעת רמת טיפולי החיטוי במים , חלהבריאותית לשם מניעת העברת גורמי מ

מטרת הבדיקות המיקרוביאליות למים הינה להצביע על זיהום מי שתייה שמקורו ). כלורינציה(

ולא םישיטות הבדיקה עושות שימוש במיקרואורגניזמים אינדיקטור. על פי רוב במי שפכים

ניזמים האינדיקטורים מעיד על זיהום מי השתייה במיקרואורג. במיקרואורגניזמים פתוגניים

.אפשרות סבירה של זיהום בפתוגנים

שהינה שיטת הסינון הממברנלי ורגניזמיםאמיקרובמעבדה זו נכיר שיטת ספירה נוספת של

membrane filtration) MF .( מיקרואורגניזמים ישירות על ממברנה הבשיטה זו נזרעים

0.45µmמיקרואורגניזם הנדרש לבידודלבהתאם , והממברנה מונחת על מצעי מזון שונים.

MFשיטת עקרון השיטה

מיקרון תוך שימוש 0.45מסננים דגימת מים בנפח מוגדר דרך ממברנה בעלת חורים בקוטר .1

.החיידקים נשארים על הממברנה. בואקום

בהתאם למיקרואורגניזם (סלקטיבי או לא , מניחים את הממברנה על מצע גידול מוצק .2

).הנדרש לבידוד

.הממברנה עשויה מצלולוז ניטראט המאפשר מעבר חומרי מזון מהאגר לחיידקים .3

.לאחר אינקובציה בתנאים מוגדרים סופרים את המושבות .4

.מבטאים את התוצאה כמספר מושבות לנפח המסונן .5

62

יתרונות השיטה

MPN -שיטה מהירה וזולה יחסית ל

החיידקים בדוגמאריכוזמאפשרת קביעה ישירה של

ל החיידקים בצורת מושבות בודדות מאפשר בידוד למטרות זיהוי ואיפיוןגידו

קיימת אפשרות לסינון נפחים גדולים של מים על מנת להעלות את רגישות השיטה

חסרונות השיטה

ריכוז גבוה של ותעכירות גבוהה או כאלה המכיל ותמים בעללא ניתן לבדוק דוגמאות

חומרים רעילים

למיקרואורגאניזמיםstressלא מתאימה למצבי

. מעוגנת בתקנות לבריאות הציבור של משרד הבריאותממקורות שונים איכות מים

.96בעמוד דרישות התקנות מפורטות

קבוצות מיקרוביאליות הנבדקות בשיטת הסינון קבוצת הקוליפורמים

הניתנים לבידוד , גרם שליליים לא יוצרי ספורות תוססי לקטוז, אנאירוביים פקולטטיביים,מתגים

מושבות הקוליפורמים על מצע . m-Endoבמעבדה נשתמש במצע .על מספר מצעים סלקטיביים

. שעות24 למשך 35°C- הצלחות עוברות אינקובציה ב. זה הינן אדומות בעלות גוון מתכתי

י קוליפורמים נוצר אצטאלדהיד המגיב עם אלכוהול ויוצר "במהלך תסיסת לקטוז ע: עקרון המצע

.גוון מתכתי

לזיהוי וספירת קוליפורמיםm-Endoמצע Fecal coliforms - קוליפורמים צואתיים

). מערכת עיכול של בעלי דם חם(חיידקים מקבוצת הקוליפורמים שהינם ממקור צואתי אלה

24זמן הדגרה (ם על אחד המצעים המומלצי44.5±0.2°C- החיידקים הללו גדלים בהדגרה ב

63

מושבות הקוליפורמים הפקאליים הינן כחולות ומושבות . m-FCבמעבדה נשתמש במצע ). שעות

.של חיידקים אחרים הינן אפורות או בצבע קרם

המצע מכיל אינדיקטור ההופך כחול . ויצירת חומצה לקטיתpHמתבסס על שינוי :עקרון המצע

.םצ לפקאליי" מע44.5הדגרה ב . בתנאי חומצה

לזיהוי וספירת קוליפורמים צואתייםm-FCמצע קבוצות הסטרפטוקוקים הצואתיים

,S.fecalis, S. faecium כמו Streptococcus מספר סוגים מהמין כוללתקבוצת חיידקים זו

S. avium, S. bovis, S. equinus, S.gallinarum בעלי דם חםח"כולם בודדו מצואת בעו .

קבוצת האנטרוקוקים

S. faecium ,S.fecalisהינה תת קבוצה השייכת לסטרפטוקוקים הצואתיים וכוללת את

S.gallinarumו -S. avium . האנטרוקוקים נבדלים מיתר הסטרפטוקוקים הצואתיים ביכולתם

ם על מצעים חיידקים אלה מבודדי. 42°C - וב10°C - וכן בpH-9.6- בNaCl 6.5%לגדול על

מושבות . m-Enterococcus agarבמעבדה זו נשתמש במצע . סלקטיביים שונים

.הסטרפטוקוקים הפקאליים הינן בעלות גוון בורדו אדום על מצע זה

לזיהוי וספירת סטרפטוקוקים צואתייםm-Entroמצע

64

Pseudomonas aeruginosa

בשל , הגורם למספר רב של מחלות דלקתיות קשות לטיפול,ה ומיםזהו חיידק המצוי באדמ

של רטורה היכול לגדול בטמפ,אירובי, החיידק הינו מתג גרם שלילי. לאנטיביוטיקותועמידות

41.5°C. קשור לזיהום צואתילאהחיידק . קיים כפלורה טבעית של מים ומסוגל להתרבות במים .

צמדות מצוינת למשטחים וכן עמידות מרשימה יכולת ההחיידק מייצר מספר טוקסינים ובעל י

עלול . משמש כאינדיקטור לזיהומים הנגרמים כתוצאה מרחצה במים מזוהמים. לאנטיביוטיקה

יתכן כי במספרים גבוהים . דלקות מערכת הנשימה והלוע ומערכת השתן, לגרום לדלקות עור

Aק קשורה לייצור טוקסין חוץ תאי פתוגניות החייד . גם לתקיפה של מערכת העיכולםמאוד יגרו

י עיכוב העברת חומצת "הטוקסין מתערב בסינתזת חלבונים בריבוזומים ע. הגורם להרג תאים

. לחלבון הגדלtRNA -אמינו מ

72התקן דורש ( שעות 48 למשך 41.5±0.5°C- בM-PA-Cבמעבדה נגדל את החיידק על מצע

. ירוק-שטוחות ובעלות צבע חום, מ" מ0.8-2.2המושבות האופייניות הן בקוטר של ). שעות

החיידק מבצע הידרוליזה לקזאין והינו בעל פיגמנט . מבחני אישור אפשריים על מצע המכיל חלב

. למי שתיה נדרשת בתקנות של משרד הבריאותלאבדיקת חיידק זה . צהוב- ירוק

לזיהוי וספירת פסאודומונס אירוגינוזהM-PACמצע taphylococcus aureusS

. הם קוקים גרם חיוביים אנאירובים פקולטטיביים המופיעים באשכולותS. aureusחיידקי

חיידק מזופילי אך מסוגל לגדול גם בטמפרטורות נמוכות .Staphylococcusהחיידק שייך למין

ובערכי פעילות מים של עד , 10%אוסמוטולרנטי ומסוגל לגדול בריכוז מלח של הוא . 7°Cכמו

, polymyxin: לתרכובות בקטריוצידיות שונות כמוגבוהההחיידק מגלה עמידות . 0.86

neomycin ,telluriteו - sodium azide. S.aureus הוא הזן הידוע ביותר במעורבותו ביצירת

וב לתכונות יצירת אנטרוטוקסינים מקושרת על פי ר. טוקסינים חוץ תאיים שהינם אנטרוטוקסינים

עמיד ) DNAמפרק (ונוכחות נוקלאז ) מקריש פלסמת דם(נוכחות קואגולז : נוספות של החיידק

.אולם נמצא כי קיימים זנים מסוימים היוצרים אנטרוטוקסינים אך לא קואגולז ונוקלאז. לחום

65

מהמבוגרים ואף יותר בקרב ילדים הם 50%כ . נפוץ בבני אדם בחלל האףS.aureusהחיידק

בנוסף לכך החיידק יכול . ממקור זה מגיע החיידק לעור ובעיקר לפצעים בעור. נשאים של החיידק

החיידק יכול . גם חיות בית הן נשאיות של חיידק זה. בגרון ובמערכת העיכול, להימצא גם בעיניים

שעות לאחר צריכת 4 מתקבלת S.aureusהרעלת מזון על ידי . להימצא גם במזון ומים מזוהמים

, שלשול, כאבי בטן, הקאות, בחילות: הסימפטומים כוללים). שעות1-6התחום הוא (זון מזוהם מ

. שעות ואחוזי התמותה הם מזעריים12-24הסימפטומים אורכים . כאבי ראש ועוד, הזעה

דרישות התקנות הן כי במים רדודים לא . מבוצעת במי בריכות שחיה החיידקבדיקת נוכחות

.ל בשתי בדיקות רצופות" מ100 -ב staph. aureusמקבוצת חיידקים 2 -יימצאו יותר מ

על מצע זה הן שחורות S.aureusמושבות ). Baird parker) BPבמעבדה נשתמש במצע

.מבריקות מוקפות איזור בהיר ולפעמים גם בעלות הילה שקופה

עכבים גידול המlithium -גליצין ו , potassium telluriteמצע זה מכיל : עקרון המצע

כמו כן המצע מכיל פירובט המעודד גידול . Staphylococcusמין שייכים לאל שיקרואורגניזמיםמ

S.aureusרוב זני החיידק . המצע מכיל חלמון ביצה הנותן למצע גוון צהוב ועכור. S.aureusשל

ק מחיידקים חל. הם בעלי פרוטאז הגורם לפירוק חלבון הביצה ויצירת איזור בהיר סביב המושבה

, אלו יוצרים גם הילה שקופה וטבעת עכורה סביב המושבה שלהם והיא תוצאה של נוכחות ליפאז

יש לציין כי . המפרק שומנים ליצירת מלחי מגנזיום וסידן של חומצות השומן שעברו הידרוליזה

- מחזר את ה S.aureusהחיידק . הם בעלי שני אנזימים אלוS.aureusלא כל הזנים של

potassium tellurite לקבלת מלח telluriumבעל צבע שחור מבריק .

לזיהוי וספירת סטפילוקוקוס אאוראוס BPמצע מאחר ונמצא כי רוב , קואגולז צריכות להיבחן לנוכחות האנזים S.aureusמושבות אופייניות של

מייצר קואגולז הקשור לתא S.aureusהחיידק . ז הפתוגניים הם בעלי קואגולS.aureusחיידקי

תפקידו של האנזים . הגורמים להקרשת פלסמת הדם, ונקרא גם פקטור צימות וקואגולז חוץ תאי

השוקע על תא החיידק ובכך מגן עליו בפני , בפתוגניות החיידק הוא לגרום לצימות של הפיברין

תבצעת באמצעות בדיקת צימות פלסמה הבדיקה לנוכחות קואגולז מ. התקפה של תאי הפונדקאי

66

מועברת לדוגמא של פלסמת ארנבת נוזלית S.aureusתרבית מועשרת של . של דם ארנבת

התקרשות הפלסמה תוך פרק זמן זה מעידה על . 35°C - שעות ב2-6ומודגרת בנוכחותה למשך

. חיוביS.aureus נוכחות האנזים קואגולז ועל

אשר תבוצע , staphylaseבדיקת : נוכחות האנזים קואגולזלבדיקת קיימות בדיקות מהירות

.במעבדה ומפורטת בהמשך

ספירה כללית של חיידקים הטרוטרופיים

MF -או בשיטת ה) דריגלסקי (pour plate ,spread plateספירה זו ניתן לבצע בשיטות של

ונותנת מידע של מספר החיידקים החיים במים הספירה נותנת הערכה). פילטרציה ממברנלית(

. התומך בתוצאות הבדיקות האחרות,חיוני על איכות המים

ניתן ).PCA) plate count agar על מצע pour plate- במעבדה נבצע ספירה כללית בשיטת ה

.לבצע את הזריעה גם בשיטת הפיזור על מצע זה

לספירה כללית PCAמצע

חומרים לזוג ) או מי בריכת שחיה או מי ביוב מים מינרליים אומסוגים שוניםאו שתייה מי ברז (ם מיבקבוק

מערכת סינון שעברה סטריליזציה

0.45µ סטרילייםיםפילטר

כוהל95%כלי עם , פינצטה

פ המים "ע( m-endo ,m-FC ,M-enterococcus ,M-PA-C ,BP: אחת מכל סוגצלחת

)הנבדקים

מותךPCAבקבוקון עם מצע

)במקרה של מי ביוב או מים לא מטופלים(ל בופר סטרילי " מ90 בקבוקים המכילים 5

)ל למבחנה" מ9 ( מבחנות סליין סטרילי2

סטריליות צלחות פטרי ריקות3

)ל במקרה של מים מינרלים" מ250(ל " מ100משורה סטרילית בנפח

67

הניסוימהלך

MFבדיקות בשיטת יש לבצע : בריכה או או ביוב, מי ברז או שתייה: דוגמאות מים ממקור •

.מצעסוג לכל ל מים" מ100עבור

לכל , ל מים" מ250עבור MFיש לבצע בדיקות בשיטת : מים מינרליים: דוגמת מים ממקור •

.סוג מצע

.ל" מ1: נפח נזרע, ) סוג של מיםלכל (pour plate תבוצע בשיטת ,ספירה כללית •

מקור המים ושם , רשום את שם החיידק .בדיקההכן את הצלחות השונות הדרושות עבור כל .1

.הסטודנט

.הכן את מערכת הסינון והדלק אש .2

.0.45µמקם על המסנן בצורה סטרילית פילטר .3

תוך שימוש , אותהסנן מדוד את כמות המים הדרושה לבדיקה בעזרת משורה סטרילית ו .4

.אקוםבו

פטרי המכילה את הסר באמצעות פינצטה סטרילית את הפילטר ומקם אותו על צלחת ה .5

: הדרושהמצע

לבדיקת ,מהמקור בלבדל " מ100 סנן ומי שתיה אחריםעבור דוגמאות מי ברז

. סטרפטוקוקים צואתייםווליפורמים צואתיים ק, קוליפורמים

קוליפורמים , לבדיקת קוליפורמים,מהמקור בלבדל " מ250עבור מים מינרליים סנן

. אירוגינוזהומונספסאודו סטרפטוקוקים צואתיים, צואתיים

סטפילוקוקוס , לבדיקת קוליפורמים, ל מהמקור בלבד" מ100עבור דוגמת מי בריכה סנן

.אאוראוס ופסאודומונס אירוגינוזה

, לבדיקת חיידקים קוליפורמים10-1מיהול מ ל" מ100עבור דוגמת מים לא מטופלים סנן

אירוגינוזה וסטפילוקוקוס פסאודומונס, סטרפטוקוקים צואתיים, קוליפורמים צואתיים

.)ל תמיסת מיהול" מ90- ל דוגמאת מים ל" מ10י העברת "המיהול יוכן ע(אאוראוס

ל מים מזוקקים " מ50 -י העברת כ"יש לשטוף את המערכת בין סינון אחד למשנהו ע

.סטריליים

לב שים (במבחנות עשרוניים מהל שני מיהולים - )נעשית לכל דוגמאות המים (ספירה כללית .6

ל " מ1 וזרע משני המיהולים ומהמקור) ל" מ100 התקן יש למהול בבקבוקי מיהול של פ"עכי

pourבהתאם לשיטת (בעדינות וערבב PCAכסה בשכבת. סטריליות ריקותלצלחות פטרי

plate 15-14בעמוד המתוארת .(הנח לצלחות להיקרש והדגר ב -C°30) שעות72רצוי .(

). מוכן בצלחות פטריPCAל במידה ויש מצע " מ0.1ר של ניתן לבצע זריעת פיזו(

השלם תוצאות משאר הכיתה וקבע את .ו בכל מצעספור את מושבות החיידקים שהתקבל .7

.עמידת דוגמאות המים השונות בתקנות

68

: ומבחנים משלימים שיש לבצעלהלן סיכום המצעים השונים

מושבות תנאי הדגרה סוג המצע שם החיידק אופייניות

מבחנים משלימים

אדומות עם ברק שעותm-Endo 350C ,24 קוליפורמים

מתכתי

קוליפורמים צואתיים

m-FC 44.50C ,24כחולות כהות שעות

סטרפטוקוקים צואתיים

m-Entro 420C ,48קטנות אדומות שעות

כהות

צביעת גרם

קטלאז

Bile Esculinזריעה על

agar

Staphylococcus aureus

BP 370C ,48שחורות שעות

מבריקות

staphylase

Pseudomonas aeroginosa

M-PAC 41.50C ,48בקוטר ירקרקות שעות

מ" מ0.8-2.2

P-milk agarזריעה על

סופרים את כל שעות PCA 300C ,72 ספירה כללית

המושבות

:הערות למבחנים המשלימים

: סטרפטוקוקים צואתיים .1

. מאשרים בצביעת גרם-ביים גרם חיוקוקים חיידקים אלה

מי חמצן על המושבות 3%י טפטוף תמיסת " מבצעים בדיקת קטלאז ע–חסרי קטלאז

.)לא יופיעו בועות(

- לesculinהחיידקים מפרקים (350C - בBile Esculin agarמשחירים את המצע

esculetinבנוכחות מלח ברזל. ודקסטרוז ,esculetinיוצר קומפלקס שצבעו שחור .(

2. Staphylococcus aureus : מאשרים את נוכחות החיידק על ידי בדיקתstaphylase .

.72בעמוד מהלך הבדיקה מפורט

3. Pseudomonas aeroginosa :י זריעה במצע "מאשרים את נוכחות החיידק עP-milk

agar .370 -לאחר הדגרה בCשעות מתקבלות מושבות ירקרקות עם הילה מסביב24 - ל ,

.שבמצע) הקזאין( חלבון החלב עקב פירוק

69

המתייחסות לאיכות מים ממקורות שוניםדרישות התקנות מי שתיה

2000 שנת – איכותם התברואתית של מי שתיה –בהתאם לתקנות בריאות העם

- מי שתיה דרישות ל" מ100 ל 3 עד –קוליפורמים

ל" מ100 ל 0 –קוליפורמים צואתיים

ל" מ100 ל 0 – םסטרפטוקוקים צואתיי

– )שטח או תהום מתקבלים לטיפול(מי מקור ל" למ1000 עד –ספירה כללית

ל" מ100 ל 3 עד –קוליפורמים

ל" מ100 ל 0 –קוליפורמים צואתיים

ל" מ100 ל 0 –סטרפטוקוקים צואתיים

י למים במיכליםקן ישראל וכן ת– בהתאם לתקנות בריאות העם - מים מינרלים

-דרישות

ל" מ250 ל 0 – קוליפורמים

ל" מ250 ל 0 –קוליפורמים צואתיים

ל" מ250 ל 0 –סטרפטוקוקים צואתיים

ל" מ250 ל 0 –פסאודומונס אירוגינוזה

ל" מ50 ל 0 –קלוסטרידיה מחזרי סולפיט

מי רחצה 1994בהתאם לתקנות רישוי עסקים -בריכות

1992 –בהתאם לתקן איכות מי ים בחופי רחצה מוכרזים -מי ים

-דרישות בריכות ל" מ100 ל 10 עד –קוליפורמים

ל" מ100 ל 2 עד –וס אראוסטפילוקוקוס א

ל" מ100 ל 0 –פסאודומונס אירוגינוזה

-דרישות מי ים ל" מ100 ל 400 עד –קוליפורמים צואתיים

- מי נחל ומאגרי קולחין–מים ללא מגע גוף 1993בהתאם לחוזר מהנדס ראשי לבריאות הסביבה משנת

–דרישות

ל" מ100 ל 1000 עד –קוליפורמים צואתיים

70

ספירה מיקרוביאלית במוצרי מזון: 10ניסוי מספר מוצרי מזון מזוהמים . טריות ויציבות מוצרי מזון תלויה במידה רבה במטען המיקרוביאלי שלהם

התקן . תלכן הם חייבים לעמוד בתנאי התקן של משרד הבריאו, עלולים להיות מסוכנים לצרכן

. מגדיר עבור כל מוצר את הבדיקות הנדרשות ואת ריכוז החיידקים המותר בכל מוצר

בדיקה מיקרוביאלית לגבינה . נבדוק גבינה צהובה מגורדת כדוגמא לבדיקת מוצר מזון לפי התקן

:הנדרשות למוצר זה הןהמיקרוביאליות הבדיקות

קוליפורמים •

• Staphylococcus aureus

שמרים ועובשים •

חומרים לזוג גבינה צהובה מגורדת

ל סליין סטרילי" מ90ארלנמייר המכיל

כלים סטריליים לשקילה, מאזניים

VRBאבקת

ל מים מזוקקים סטרילייים" מ100ארלנמייר המכיל

48ºCאמבט מים

פלטת חימום

מבחנת סליין סטרילי1

כוהל, מקל דריגלסקי, טיפים סטריליים, פיפטורים

סטריליות ריקות צלחות פטרי 2

OGY צלחות 2

BP צלחות 2

מהלך הניסוי

באמבט מים לאחר מכן מניחים ו23בעמוד פ פרוטוקול " עVRBל מצע " מ100מכינים .1

. עד לשימוש48ºCבטמפרטורה

ל סליין " מ90 גרם מהגבינה באופן סטרילי ומעבירים לתוך ארלנמייר המכיל 10שוקלים .2

.10-1התרחיף המתקבל הינו מיהול . דקות2 -בובית כמערבבים היטב בתנועה סי. סטרילי

. 10-2זהו מיהול . עורכים מיהול עשרוני נוסף במבחנת סליין .3

71

מערבבים , )מהאמבט( מותך VRBל מכל מיהול לצלחת פטרי ומוסיפים מצע " מ1מעבירים .4

לאחר היקרשות שופכים שכבה ). pour plateשיטת (בעדינות וממתינים להיקרשות המצע

.לעידוד תהליכי תסיסה, VRBיה דקה של שנ

.OGYמכל מיהול על צלחות ) ל" מ0.1(מבצעים זריעת פיזור .5

.BPמהמיהול הראשון על צלחות ) ל" מ0.2 -ל ו" מ0.1(מבצעים שתי זריעות פיזור .6

.37ºC - בBP - ו30ºC - ב37ºC,OGY - בVRB: מדגירים את הצלחות .7

:לאחר הדגרה

: יזמים השונים בגבינהקבע את ריכוז המיקרואורגנ

.VRBסופרים את המושבות האדומות האופייניות בצלחות : קוליפורמים •

.OGYיש לעשות ספירה נפרדת למושבות האופייניות לכל סוג בצלחות : שמרים ועובשים •

• Staphylococcus : סופרים את המושבות השחורות בצלחותBP.

:בדוק התאמת התוצאות לתקן כמפורט להלן

. גרם1 - ב1000 -ליפורמים לא תהיה גדולה מספירת קו •

. גרם1 - ב100 -ספירת עובשים לא תהיה גדולה מ •

. גרם1 - ב1000 -ספירת שמרים לא תהיה גדולה מ •

. גרם1 - ב100 -תהיה קטנה מ) קואגולז חיובי (Staphylococcus aureusספירת •

ישה מיוחדת והיא חייבת בדיקת חיידקי סלמונלה תיערך במקרה של חשד או לפי דר: הערה

. גרם מוצר20 -להיות שלילית ב

:תנאי ההדגרה והמושבות האופייניות, הטבלה הבאה מסכמת את מצעי המזון

הערות מושבות אופייניות תנאי הדגרה סוג המצע המיקרואורגניזמים

זריעה בתוך מושבות אדומות שעותVRB 37ºC ,24 קוליפורמים

המצע

Staphylococcus

aureus

BP 37ºC ,48נדרש מבחן מושבות שחורות שעות

קואגולז

+ OGY שמרים ועובשים

oxytetracycline

30ºC ,48לשמרים מושבות שעות

, עגולות בצבע קרם

לעובשים מושבות

קורים אופייניות

72

:Staphylococcus aureus נוכחות אישור ל מבחן- Staphylaseבדיקת

הבדיקה . י ביצוע מבחן קואגולז" עStaphylococcus aureusצריך לאמת את הזיהוי של

.Oxoidשל חברת לזיהוי סטפילוקוקוס staphylaseערכת תתבצע באמצעות

לזיהוי חיידקי סטפילוקוקוס המייצרים קואגולז חופשי ) הצמתה( זהו מבחן אגלוטינציה – עקרון

). פקטור צימות(וקואגולז הקשור לתא

לוקוקים שהם קואגולז חיוביים ישנו גם גורם צימות של כדוריות דם מהסטפי95% -מצאו כי ל

לבין הקרשת כדוריות דם ) המקריש פלסמה(כלומר נמצאה קורלציה בין קואגולז חיובי . אדומות

. אדומות

י צימות של פיברינוגן בתאי דם אדומים מרוגשים "הערכה מאפשרת זיהוי נוכחות הקואגולז ע

)sensitized (של כבש.

י בדיקה סימולטנית עם ריאגנט ביקורת המכיל תאי דם לא "פציפיות התגובה מובטחת עס

.בביקורת לא תתרחש תגובת צימות. מרוגשים

חומרים Staphylococcus aureus לזיהוי staphylaseערכת

BPמצע שגדלה בStaphylococcus aureusתרבית טהורה של

אופן ביצוע .קה וריאגנט הביקורת לקבלת תמיסות הומוגניותיש לנער היטב את ריאגנט הבדי .1

ולמרוח על עיגול הביקורת BPבעזרת מחט סטרילית יש להרים מושבה חשודה מפלטת .2

.ועיגול הבדיקה שעל גבי הכרטיס

יש להוסיף טיפה של ריאגנט הבדיקה לעיגול הבדיקה וטיפה של ריאגנט הביקורת לעיגול .3

.הביקורת

.עיגול בעזרת מחט סטריליתיש לערבב את המרכיבים בכל .4

.יש לבחון הצמתה במהלך הערבוב .5

.הופעת הצמתה בעיגול הבדיקה: תוצאה חיובית .6

. לא ניתן להתייחס לתוצאות–במקרה של הצמתה בעיגול הביקורת .7

.BPמצע שגדלה בStaphylococcus aureusל לתרבית טהורה של "ערוך בדיקה כנ .8

דוגמא לתוצאות הבדיקה

73

השפעת חום על תמותת חיידקים: 11ניסוי מספר םזמן ומספר, הוא פונקציה של טמפרטורהיםשל חום על חיידק) קטלני(האפקט הלתאלי

קצב התמותה של מיקרואורגניזמים על ידי חום הוא לוגריתמי והמשמעות היא כ"בד. התחלתיה

ללא קשר לגודל , ייה יושמד בפרק זמן נתוןאוכלוסהאותו אחוז של , שבתנאי חימום קבועים

:עיקרון זה מודגם בעקומת תמותה תרמית. האוכלוסייה השורדת

מוגדר כזמן הנדרש D value) decimal reduction time .(D valueהמכונה מגדירים פרמטר

הוא Dכלומר הערך של . יה מהאורגניזמים באוכלוסי90%בטמפרטורה מסוימת להשמדה של

. אחדlog את האוכלוסייה השורדת בסדר גודל של הזמן הדרוש להקטין

כלומר , קטן יותרD, ככל שהטמפרטורה גבוהה יותר. Dהטמפרטורה משפיעה על ערכו של

. אחד במספר החיידקיםlogעל מנת לקבל ירידה של קצר יותר דרוש זמן

74

Dהשפעת הטמפרטורה על הוא הזמן הנדרש להשמדת TDT) thermal death time .(TDTמגדירים פרמטר נוסף המכונה

.תרחיף חיידקים או ספורות בטמפרטורה מסוימת

מטרה

.לבחון תמותה של חיידקים בחום

חומרים לזוג

)ל"חיידקים למE.coli) 107ל תרבית " מ3

סלייןל" מ4.5 מבחנות מיהול המכילות 20

פתוחה עם תרמומטרת סלייןמבחנ

NA צלחות 14

טיפים סטריליים, פיפטורים

כוהל, מקל דריגלסקי

NAצלחות

אמבט מים

כוס לקרח

75

מהלך הניסוי : באופן הבא,65ºC או55ºCטמפרטורות אחת הב E. coliתרבית לערוך טיפול בחום

. על כל שולחן עבודה מונח אמבט המחומם לאחת הטמפרטורות

. מבחנות סליין בהתאם לזמני הטיפול הנדרשים4סמן .1

ספת כשהיא פתוחה ובתוכה תרמומטרמבחנה נוכן וכשהן פקוקות מבחנות ה 4העבר את .2

.לתוך האמבט

עקוב אחר עליית הטמפרטורה במבחנה הפתוחה עד להשגת הטמפרטורה הרצויה לטיפול .3

. בחום

שים לב כי . מבחנות הסליין שבאמבט4 -ל מהתרבית המקורית לכל אחת מ" מ0.5העבר .4

.10-1זהו מיהול ראשון

הוצא את , ) בהמשךם למפורט בטבלהאבהת(מתחילת הניסוי פרקי הזמן הנדרשים כעבור .5

. המבחנה המתאימה והעבר מיד לקרח

ל על " מ0.1ל סליין וזרע " מ4.5ערוך להן מיהולים עשרוניים בתוך , לאחר קירור הדוגמאות .6

. ין בטבלה כמצוNAצלחות

. שעות24 למשך 37ºC - בהצלחותהדגר את .7

. זמן אפס-) שלא עברה טיפול חום(ערוך סדרת מיהולים לתרבית המקורית , בנוסף .8

זמן טיפול טמפרטורה

)בדקות(בחום

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

+ + 0 ביקורת

2 + + +

3 + + +

4 + +

65ºC

5 + +

5 + + +

10 + + + +

20 + + +

55ºC

30 + +

מציין מיהול ממנו מתבצעת זריעה על צלחת+ הסימן

סיכום תוצאותשרטט את עקומת התמותה התרמית . ל"ספור מושבות במצעים וחשב את ריכוז החיידקים למ

.הסבר את התוצאות . בכל טמפרטורהD-valueשל החיידק בטמפרטורות השונות וחשב את

76

השפעת יובש על חיידקים: 12יסוי מספר נ

מטרה לבחון את עמידות החיידקים לתנאי יובש

לזוגחומרים

ל" תאים למE. coli 106ל תרבית " מ10

מבחנות סליין 11

מבחנה סטרילית עם פקק מתכת ומבחנה סטרילית עם פקק מתברג

NAצלחות 11

מקל דריגלסקי, כוהל, טיפים סטריליים, פיפטורים

לך הניסוימה

מיהולים עשרוניים וזרע 4מהל את התרבית : קביעת ריכוז החיידקים בתרבית בזמן אפס .1

. שעות24למשך 37ºC - והדגר בNAעל פלטות כל מיהול בזריעת פיזור ל מ" מ0.1

לא (ל למבחנה סטרילית ופקוק בפקק מתכת " מ0.1העבר מהתרחיף : תנאי יובש: מבחנה א .2

). אטום

. ל למבחנת הברגה סטרילית ופקוק בפקק מתברג" מ3העבר מהתרחיף : תביקור: מבחנה ב .3

.לשבוע 37ºC -המבחנות באת הדגר .4

הרחף היטב את המשקע , )1:10מיהול (ל סליין " מ1הוסף למבחנה א , לאחר שבוע הדגרה .5

. מיהולים עשרוניים נוספים3היבש וערוך

. מיהולים עשרוניים4למבחנה ב ערוך .6

. NAצלחות על זריעת פיזורל ב" מ0.1 זרע מכל מיהול .7

. למשך שבוע37ºC -הדגר ב .8

. והסבר את התוצאות בכל מבחנהספור המושבות וחשב את אחוז החיידקים השורדים .9

77

על חיידקיםpHהשפעת : 13ניסוי מספר חיידקים גדלים בסביבה מימית ולכן הם חשופים באופן קבוע ליוני מימן שיכולים להשפיע על

-יש תלות בין פעילות אנזימים בתא ובין ה. של התמיסהpH -ריכוז יוני המימן מבוטא כ. לםגידו

pHולכן ה - pHערך . התוך תאי חייב להיות מווסת בצורה מאוד קפדניתpH חומצי או ( קיצוני

. יכול לגרום לשקיעה של תרכובות ועיוות המבנה המרחבי של מקרומולקולות) בסיסי

מטרה חיידקים על גדילת pH -שפעת ההלבחון את

לזוגחומרים

ל" תאים למE. coli 106ל תרבית " מ3

)10 - ו7, 3( שונים pH בעלות ערכי NAצלחות פטרי המכילות מצע

מהלך הניסוי

. NA צלחות 3 -ל מתרבית החיידקים על כל אחת מ" מ0.1זרע בזריעת פיזור .1

.37ºC - בצלחותהאת הדגר .2

.סבר את התוצאותסכם וה, לאחר הדגרה .3

78

השפעת לחץ אוסמוטי על חיידקים: 14ניסוי מספר לחץ אוסמוטי נמוך מזה של מוהל התא עשוי לגרום פיצוץ ומוות עקב כניסת מים מהסביבה לתוך

לחץ אוסמוטי גבוה מזה של מוהל התא עלול לגרום לכיווץ התא ומוות עקב יציאת מים . התא

Π=Iהאוסמוטי בתמיסה בעזרת הנוסחה ניתן לחשב את הלחץ . מהתא החוצה C R T , כאשר

Π = אטמוספירות(לחץ אוסמוטי(

I = עבור גלוקוז (ערכיותI=1 , עבורNaCl I=2(

C = מול לליטר(ריכוז מולרי(

R = ליטר אטמוספירה למול למעלות קלווין(קבוע הגזים(

T = מעלות קלווין(טמפרטורה(

.Atm 22.4 – גלוקוז שווה ערך ל M1הלחץ האוסמוטי של

מטרה מיקרואורגניזמים שונים ללחץ אוסמוטילבחון את עמידות

חומרים

S. cerevisiae - ו E. coli ,Staph aureusל " מ5

) סטים מכל ריכוז3 ( מבחנות גלוקוז בריכוזים שונים6 - ו NaCl מבחנות 6

טיפים סטריליים, פיפטורים

מהלך הניסוי

לכל זוג ( בתוך סלייןS. cerevisiae - ושמר E. coli ,Staph aureus תרביות נתונות

. )מיקרואורגניזם אחד

תמצית 0.3%, גלוקוז0.2%(ל מכל תרבית לשורת מבחנות של מצע מזין " מ0.1הוסף .1

: המכילים ) פפטון0.5%, שמרים

%0.85,%1,%3,%5,%10,20% - שוניםNaClריכוזי

%0.2, %2,%5,%10,%30,50% -ם ריכוזי גלוקוז שוני

. למשך שבוע ימים37ºC -הדגר את כל המבחנות ב .2

קבע את הריכוז הגבוה ביותר של המלח בדוק את המבחנות להופעת עכירות ו: לאחר הדגרה .3

. והסבר השלם תוצאות משאר הכיתה. כל מיקרואורגניזםאו הסוכר בו גדל

79

עקומת גידול של חיידקים: 15ניסוי מספר רקע

העלייה . או עלייה במסתם, יהיגדילה של חיידקים באה לידי ביטוי בעליית מספר התאים באוכלוס

כלומר , החלוקה בחיידקים היא חלוקה בינארית. במספר החיידקים נעשית עקב תהליכי חלוקה

. חלוקה של תא ההורה לשני תאי בת שגודלם שווה וקיומם עצמאי

: שלבי גידול4 -הבחין בכאשר שמים חיידקים במצע מזון ניתן ל

)lag(שלב ההמתנה

במהלכו מתרחשים בתא החיידק תהליכים . בשלב זה אין שינוי במספר החיידקים באוכלוסייה

יצירת אנזימים חדשים וצבירת מטבוליטים החיוניים הכולליםהמכשירים אותו לקראת החלוקה

יצול מגוון רב של החיידקים מצוידים במספר רב של גנים המאפשרים נ. לחלוקת התא

הוא חייב לנצל מערכת מינימלית , אולם מאחר והחיידק צריך להתחרות עם אחרים. סובסטרטים

:ישנם מספר גורמים המשפיעים על אורכו של שלב זה. שתתאים למצב הנתון

.בתנאים אופטימלים שלב זה קצר יותר. מלחים, pH, טמפרטורה–תנאים כימופיסיקלים .א

סוג החיידק .ב

שלב ארוך יותר שכן המצע מכיל רק מרכיבים החיוניים לגידול ועל – במצע דל –צע סוג המ .ג

יש גם מלחים –במצע עשיר . כן החיידקים חייבים לסנתז לעצמם את גורמי הגידול החיוניים

. וחומרי הזנה מוכנים ועל כן השלב מתקצר

עברים למצע זהה חיידקים הנמצאים בשלב של חלוקות ומו–מצב פיזיולוגי של החיידקים .ד

חיידקים המועברים מהשלב הסטציונרי . ימשיכו להתחלק ללא שלב המתנה, ולאותם תנאים

. יזדקקו לשלב המתנה על מנת לחזור ולהתחלק בקצב מרבי

שלב הגידול הלוגריתמיעם כל . ביחס לתנאי הגידולוקבוע בשלב זה כל החיידקים באוכלוסייה מתחלקים בקצב מרבי

. ישנה הכפלה במספר החיידקים, םחלוקה של התאי

. )generation time( זמן דורהזמן בו חלה הכפלה במספר החיידקים באוכלוסייה נקרא

80

: בשלב זה השינוי במספר החיידקים עם הזמן בא לידי ביטוי בנוסחה הבאה

log(N2/N1)=n.log2 N1ו - N2 הם מספר החיידקים בזמן t1ו - t2בהתאמה .

n בזמן מסוים )חלוקות(ורות דמספר ה הוא.

nיכול להתבטא גם על ידי המשוואה :

n=(t2-t1)/T

:מכאן

log(N2/N1) =(t2-t1).log2/T

והוא מחושב ) k( )growth rate constant(קבוע קצב הגידול מגדירים פרמטר נוסף הנקרא

:לפי

k=0.693/T

: של החיידקיםזמן הדורגורמים המשפיעים על

. של החיידקתכונות תורשתיות .א

ויטמינים , נוקלאוטידים, המכיל את כל חומצות האמינו החיוניות( במצע עשיר –מצע הגידול .ב

זמן הדור יהיה קצר יותר מאשר במצע מזון דל שמכיל רק מקור חנקן ) וחומרי הזנה אחרים

במצע עשיר החיידק לא צריך להשקיע זמן . גלוקוז כמקור פחמן ואנרגיה ומלחים, בודד

במצע דל החיידק צריך לסנתז את האנזימים הדרושים . אבני הבניין הדרושות לוביצירת

.נוקלאוטידים ושאר מרכיבי התא, ליצירת חומצות אמינו

קצב . החיידקים לא גדלים בלי גבול שכן בשלב מסוים נוצרים תנאים המגבילים את גידולם

.הגידול מואט עד שהתרבית נכנסת לשלב הסטציונרי

)סטציונרי(שלב העמידה

הסיבות לכך . בשלב זה קצב החלוקה מואט ולא מבחינים בשינוי במספר החיידקים באוכלוסייה

, אוורור לא מספק, או הצטברות חומרים טוקסיים, נובעות מחוסר במרכיבי מזון מסוימים

אך יש גם , החלוקה עדיין נמשכת אם כי בקצב איטי. pH -הצטברות חומצות הגורמות להורדת ה

מכיוון שהחלוקה נמשכת במידה מסוימת גם (קטנים הם התאים בשלב זה ). אוטוליזיס (תמותה

.קרינה וכימיקלים, קור, ומתאפיינים בעמידות לחום) אם יש הפסקה בגדילה במסה

שלב התמותה

מוות של חיידקים מוגדר כמצב שבו נפסקת . בשלב זה חלה ירידה במספר החיידקים החיים

מוות של חיידקים מתחיל עוד בשלב . י הוא חיידק המסוגל להתחלקחיידק ח. יכולת החלוקה

קצב התמותה , בשלב התמותה. הסטציונרי אך אז מספר המתים מתאזן עם מספר המתחלקים

81

אצל רוב סוגי החיידקים שהפסיקו להתחלק מופעלות במשך הזמן . עולה על קצב החלוקה

).ליזיס(הגורמות לפירוק התא ) ליפאזות, פרוטאזותכמו (מערכות תוך תאיות של אנזימי פירוק

שיטות למעקב אחר גדילת חיידקיםעכירות למשל מדידת , בשיטות שונות כפונקציה של הזמןניתן לעקוב אחר גדילת חיידקים

ספירה חיה , )מודדת חיים ומתיםהספירה כללית זו ( בספקטרופוטומטר) אופטיתצפיפות(

יראו את שלבי העקומים שיתקבלו בשיטות השונות . ד ועו)מודדת רק חיידקים חיים (בצלחות

. העזרתהנובעים מאופי השיטה ומה שנמדד ב, אך צפויים להיות הבדלים ביניהם, הגידול

לעומת מדידת עכירות(מעקב אחר השפעת גורמים שונים על גדילת חיידקים בשיטות שונות

מעכבת , עודדת גדילהמאפשר לקבוע האם הגורם הנבדק הוא בעל השפעה מ) ספירה חיה

תיראה עלייה בריכוז החיידקים כפונקציה של , גדילהמעודדבנוכחות גורם . או קוטלת, גדילה

לא יחול , )שאינו הורג את החיידקים( גדילה מעכבבנוכחות גורם . הזמן בשתי שיטות המדידה

פ " החיידקים עתיראה ירידה בריכוז, קוטלבנוכחות גורם . שינוי בריכוז החיידקים בשתי השיטות

לא יחול , )פירוק התאים (במידה והגורם הנבדק קוטל אך לא גורם לליזיס. שיטת הספירה החיה

אולם במידה והגורם הנבדק קוטל את , הנמדד בשיטת העכירותשינוי בריכוז החיידקים

.מדידת העכירותתיראה ירידה בריכוז החיידקים גם בשיטת , י ליזיס"החיידקים ע

ימטרות הניסויידקי על גדילת ח) גיל תרבית, מצע, טמפרטורה(מעקב אחר השפעת פרמטרים שונים .א

E.coli.

.השוואה בין שיטת העכירות לשיטת הספירה החיה בהכנת עקום גידול של חיידקים .ב

י זריעת " המעקב ייערך ע.E.coli של חיידקי הגידולעקומת על פרמטרים שוניםנבחן השפעת

ון בארלנמייר עם זרוע ומעקב אחר עכירות התרבית בעזרת למצע מזתרבית החיידקים

. בזמנים שונים תילקח דוגמא גם לספירה חיה.ספקטרופוטומטר

ארלנמייר עם זרוע

חומרים -סולפט ו אמוניום 0.04% , גלוקוז0.1% -שגדלו ב) ימים6(צעירה וזקנה E. coliתרביות

.צית שמרים במצע דייוויס תמ0.01%

מקל דריגלסקי, כוהל, סטריליים טיפים,פיפטורים

60ºC - ו37ºC ,25ºCים בטמפרטורות אמבט

82

מינימלי או מצע מזון עשיר מצע מזוןים עם זרוע המכיליםארלנמייר

ל סליין" מ4.5מבחנות מיהול המכילות

NAצלחות

סל קרח

מהלך העבודה :לרנמייר אחדא לכל זוג – )ל"במ( הבאים םאת המרכיבי המכילארלנמיירך לפניי

) מכיל מצע מינימלי5ארלנמייר , מכילים מצע עשיר1-4אלרנמיירים (

5 4 3 2 1 ארלנמייר' מס

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 גלוקוז2%

1.2 - - - - אמוניום סולפט 2%

10.8 - - - - מצע דייוויס

- LB 12 12 12 12מצע

.רשום על הארלנמייר שם .1

.המשךפ טבלת המיהולים והזריעות ב"מיהול עזמן ו: סמן מבחנות מיהול ב .2

.המשךפ טבלת המיהולים והזריעות ב"זמן ומיהול ע, ארלנמייר' מס, שם: בNAסמן צלחות .3

בעזרת מבחנה אפס את המכשיר . 660nmהספקטרופוטומטר לאורך גל מכשיר כוון את .4

ו הבלנק אותו זה. חיידקיםהללא ומדוד את עכירות המצע בארלנמייר המכילה מים מזוקקים

.יש להחסיר מכל תוצאות הניסוי

התאים נמצאים בשלב ( צעירהE. coliל של תרבית " מ1.5 הוסף 5 - ו3, 2, 1לארלנמיירים .5

התאים נמצאים בשלב הסטציונרי (ל מתרבית זקנה" מ1.5 הוסף 4 ולארלנמייר )לוגריתמי

. )ותמותה

. 660nmקטרופוטומטר באורך גל בספקרא את העכירות , דקות30מיד לאחר הזריעה וכל .6

. וסכם את התוצאות בטבלה דקות180בצע את המדידות עד

.ספקטרופוטומטרקרא תמיד באותו מכשיר

. את המכשיר לפני כל קריאה בעזרת מבחנה המכילה מים מזוקקיםאפס

. 37ºC -ב 5 - ו4, 1 את ארלנמייריםהדגר .7

.25ºC - ב2הדגר את ארלנמייר .8

.60ºC - ב3ר את ארלנמייהדגר .9

בכל אחד מזמנים אלה יש , לשם כך. קח דוגמא לספירה חיה, 180 - ו120, 60, 0בזמנים .10

זהו (ל " מ4.5 למבחנת מיהול המכילה )לאחר ערבובו(ארלנמייר ל מכל " מ0.5להעביר

83

המשך בסדרת מיהולים עשרוניים ובצע . ל בקרחושמור את מבחנת המיה). 10-1מיהול

:טבלה הבאהפ ה"זריעות פיזור ע

מיהולים עשרוניים

10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1

)דקות(זמן לקיחת דוגמא

+ + + 0

+ + 60

+ + 120

+ + 180

37ºC

תרבית צעירה

)1אלרנמייר (

+ + + 0

+ + + 60

+ + + 120

+ + + 180

25ºC

תרבית צעירה

)2אלרנמייר (

+ + + 0

+ + 60

+ + 120

+ + 180

60ºC

תרבית צעירה

)3אלרנמייר (

+ + + 0

+ + + 60

+ + + 120

+ + + 180

37ºC

תרבית זקנה

)4אלרנמייר (

+ + + 0

+ + + 60

+ + + 120

+ + + 180

37ºC

מינימלימצע

תרבית צעירה

)5אלרנמייר (

מציין מיהול ממנו מתבצעת זריעה על צלחת+ הסימן

וחשב את ספור את המושבות–לאחר הדגרה . 370C - שעות ב24 -הדגר את הצלחות ל .11

.ל"ריכוז החיידקים למ

.אותהתוצאות בטבלכל את סכם .12

.פ שתי שיטות המדידה"ד מהארלנמיירים עשרטט את עקומת הגידול של כל אח .13

.פ שיטת מדידת העכירות" לכל אחד מהאלרנמיירים עT - וKחשב את .14

פרמטרים השונים שהתקבלו בהשפעת הT - וK הגידול וכן של ערוך השוואה של עקומות .15

. והסבר את התוצאות

84

סיסטמטיקה– נעלמיםזיהוי חיידקים: 16ניסוי מספר

מבוססת על שורה הגדרת החיידק . טקסונומיה של חיידקים הינו מדע העוסק בהגדרת חיידקים

פיזיולוגיות ביוכימיות וכן על מבחנים סרולוגים והסתכלות , ארוכה של תכונות מורפולוגיות

.במיקרוסקופ אלקטרוני

במעבדה זו נכיר כמה מהמבחנים הביוכימיים המקובלים ונערוך הסתכלויות מורפולוגיות של

. המשמשות להגדרת חיידקים,היחיד והמושבההתא

כריםכושר התססת סו

בסוגי פרמנטציות . י מיקרואורגניזמים"הנה חמצון לא שלם של סוכרים ע) תסיסה(פרמנטציה

המיקרואורגניזמים . 'מימן וכו, כהלים, חומצות אורגניות: נוצרים חומרים שונים כגון, שונים

הרבה לנצלאחדים מסוגלים . נבדלים ביניהם בכושר ההתססה שלהם לגבי סוכרים שונים

בין ). כ גלוקוז"בד( סוכר אחד לנצלד שאחרים הם בעלי יכולת מצומצמת ומסוגלים סוכרים בעו

חלק מהאורגניזמים מתסיסים סוכרים תוך . נמצאים כל דרגות הביניים, שתי דרגות קיצוניות אלו

אינפורמציה על . יוצרים חומצהלא או יוצרים גזלאבעוד שאחרים , יצירת חומצה או חומצות וגז

יצירת חומצה תוך יכולת התססת הסוכר . וכרים חשובה מאוד בהגדרת חיידקיםכושר התססת ס

.מתבטאת בהפיכת צבע המדיום מאדום לצהוב

ITSמצע

1%סוכרוז ולקטוז מהווים . לקטוז וסוכרוז בריכוזים שונים, גלוקוז: מצע זה מכיל מספר סוכרים

המחמיצה את המצע תסיסת כמות כזו של סוכר גורמת ליצירת חומצה רבה . מהמדיום

חיידקים . השיפוע של האגר וגם בתחתית המבחנהבאזורוהאינדיקטור הופך צהוב גם

מעט חומצה הגורמת גורמים ליצירת , מהמדיום0.1%המהווה , המתסיסים את הגלוקוז בלבד

מטבוליזם מתקיים שיפוע המבחנה באזור. להצהבה רק של תחתית המבחנה ולעיתים גם זה לא

לעיתים עקב דאמינציה על ידי חיידקים שונים . יכך אין יצירת חומצה והמצע נשאר ורודאירובי ולפ

המצע מכיל בנוסף תיוסולפט וברזל ציטרט לבדיקת . נוצרים תנאים בסיסיים והמצע הופך ארגמן

.המתבטאת בשבירת האגר, ויצירת גז, המתבטאת בהשחרהH2Sיצירת

MacConkeyמצע

. מתסיסים לקטוזשלאאבחנה בין חיידקים המתסיסים לקטוז לכאלו זהו מצע מבחין המאפשר

.מצע מכיל לקטוזה. גידול של גרם חיובייםהמעכבים , וקריסטל ויולטהמצע מכיל מלחי מרה

pHחיידקים המסוגלים לנצל לקטוז ולהתסיס את הסוכרים המתקבלים מפירוקו יגרמו להורדת

.קים שלא מתסיסים לקטוז נשארות ללא צבעמושבות של חייד. ולצבע אדום של המושבות

85

יצירת אינדול מטריפטופןי חיידקים בדרכים "טריפטופן מתפרק ע. טריפטופן הוא חומצה אמינית המכילה טבעת אינדול

אינדול אתיל - β, אינדול חומצה פרופיונית- β, אינדול חומצה פירובית- βשונות תוך יצירת

י הוספת ריאגנט "ע, בו גודלו החיידקיםבמצע מי טריפטון בדקת נוכחות אינדול נ. 'אלכוהול וכו

Kovacוהופעת טבעת אדומה .

לטין'המסת ג

, חוץ תאיזהו אנזים . לטינז'א תוצאה של פעילות האנזים גוי חיידקים ה"לטין ע'פירוק ג

ור י כך גורם האנזים לשחר"וע, לטין לפרקציות קטנות יותר'פרוטאוליטי המפרק את מולקולת הג

לטין בטמפרטורת החדר הוא נוזלי 'ג. לטין ולהפיכת המצע מקריש לנוזל'המים הקשורים בג

יישאר המצע נוזלי גם לאחר , חיידקים בעלי האנזיםמקרה של ב. ובטמפרטורה נמוכה מוצק

.קירורו

אוראז

אוראה משמש מצע. י האנזים אוראז לקבלת שתי מולקולות אמוניה"פירוק אוראה נעשה ע

, ת בהפיכת צבע המדיום מצהוב לורודפעילות אוראז חיובית מתבטא. ת פעילות אוראזלקביע

.האמוניה שנוצרתי "בגלל הבססה ע

עמילאז

עמילאז מפרק עמילן α. אנזים הידרוליטי המפרק עמילן ליחידות המסוגלות לחדור לתוך התאים

מתקבל צבע (י יוד "עת ע נוכחות עמילן נקב. עמילאז מפרק למלטוז בלבדβ. לדקסטרין ומלטוז

. עקב פירוק העמילן,המצע לא ייצבע לאחר הוספת יוד, במידה והחיידק מכיל עמילאז). כהה

קטלאזH2O2וחמצן האוויר מחוזר , נוצר בראקציות חמצון בהן הפלבופרוטאינים משמשים כדהידרוגנזות

קשור , חיזור- כמו כל מערכות האנזימים של תהליכי חמצון, האנזים קטלאז. H2O2 -ל

נוכחות האנזים . לממברנה הציטופלסמטית ועל כן פעילותו ניתנת להדגמה גם בתאים שלמים

.מתבטאת בהופעת בועות לאחר טפטוף מי חמצן על פני המושבות הנבדקות

מטרת הניסוי

.קביעת התכונות העיקריות של חיידקים שונים וקביעת זהות חיידק נעלם

86

לזוגחומריםזהותו של האחד נתונה וזהותו של האחר נעלמת אך . של חיידקים נוזליותתרביות 2נתונות

: החיידקים הבאים 6משתייכת לאחד מבין

Escherichia coli

Bacillus subtilis

Micrococcus lutea

Proteus vulgaris

Staphylococcus aureus

Serratia marcescens

) יחידות מכל סוג2 (:נתונים המצעים הבאים

אינדיקטור+ מרק גלוקוז .1

אינדיקטור +מרק לקטוז .2

אינדיקטור+ מרק סוכרוז .3

אינדיקטור+ מרק מניטול .4

מי טריפטון .5

לטין'מצע ג .6

אוראה- פפטוןצעמ .7

TSIשיפוע .8

עמילן2%+ אגר מזין .9

NAצלחת .10

MacConkeyצלחת .11

: חלק א11ניסוי

מהלך העבודה, על צלחת אגר מזין מתרחיף החיידק) 11בעמוד פרוטוקול המתואר פ "ע(בצע זריעת בידוד .1

.לקביעת מורפולוגיה של המושבה

ועל פלטת עמילן 2%+ על פלטת אגר מזיןידקי החףמתרחיבידוד בזריעת זרע .2

MacConkey.

צעמ, מי טריפטון, סוכריםמרקי תוך מבחנות המכילות ל מתרחיף החיידק ל" מ0.1זרע .3

.לטין'חנת הג ולמבאוראה-פפטון

.TSIזרע בזריעה פשוטה מתרחיף החיידקים לשיפוע .4

. כ למקרר" ותועברנה אח37ºC ימים בטמפרטורה 2-3התרביות תודגרנה למשך .5

Durhamעם מבחנות

87

: חלק ב11ניסוי

העבודהךמהל ).צורה וצבע, גודל (NA במצע מורפולוגיה של המושבותאת האר ת .1

קח . על גבי זכוכית נושאת H2O2 3%שים טיפת : ערוך בדיקת קטלאז מהמושבות שבודדת .2

קצת מן הצמיחה של החיידק הנבדק וערבב בתוך סטרילית בעזרת לולאה בקטריולוגית

).2O(י פליטת גז "ת קטלאז חיובית תתבטא עיריאקצי. הטיפה

בדוק מיקרוסקופית , )18-17בעמוד פ פרוטוקול "ע (החיידקיםאת שני צביעת גרם בצבע .3

:היעזר באיור הבא .)'מתג וכו, קוק ( ומורפולוגיית התא)יובי או שליליח (וקבע את סוג הגרם

מורפולוגיה של התא

קבלת צבע שחור מעידה על . עמילןהמכילה צלחת השפוך יוד על : בדוק נוכחות עמילאז .4

.נוכחות עמילן ולכן היעדר עמילאז

בדיקת נוכחות עמילאז

שליליעמילאז עמילאז חיובי

88

ובדיקת שחרור גז במבחנות phenol red בדיקת הצהבת האינדיקטור :סוכריםסכם התססת .5

durham.

ים סוכרהתססת באפשריותתוצאות לטין על מנת לבחון אם המצע נשאר נוזלי 'מבחנות הגאת בקרח קרר : לטינאז'בדוק נוכחות ג .6

. )לטינאז שלילי'ג( או קרוש )לטינאז חיובי'ג(

לטינז 'בדיקת ג

. הופעת טבעת אדומהן ובחהטריפטון למי Kovac יצירת אינדול על ידי הוספת ריאגנטבדוק .7

בדיקת יצירת אינדול

89

.פ צבע המצע"בדוק נוכחות אוראז ע .8

אוראזבדיקת נוכחות

. MacConkey גדילה במצעבחן את תוצאות ה .9 MacConkeyגדילה במצע

. ושבירת האגרTSIבדוק צבע השיפוע וצבע התחתית של שיפוע .10

TSI -תוצאות אפשריות ב

יש להשלים את הטורים המתאימים לחיידקים הידועים .יש למלא את כל התוצאות בטבלה .11

.פ התוצאות"ת עקבע את זהות החיידק הנעלם שקיבל. משאר הכיתה

90

ים'בקטריופאג: 17ניסוי מספר הם מתרבים בתוך תאי החיידקים . באופן ספציפיים הם וירוסים שמדביקים חיידקים'בקטריופאג

):lysogenic cycle (או ליזוגני) lytic cycle(י מסלול ליטי "ע

הנגיפים המבצעים מסלול ליטי נקראים נגיפים אלימים ואלו המבצעים את שני המסלולים

.נחשבים לנגיפים מתונים

מתבטא בעיקר בשלבים התוך ביניהם ההבדל . ים זהים'שלבי ההדבקה של שני סוגי הפאג

. תאיים של מחזור החיים שלהם

)הוירוס אלים(מסלול ליטי

רוס נספח לתאהוי

החומר התורשתי של הוירוס חודר לתא

וירוסשל ההחומר התורשתי משוכפל וגורם לתא המאכסן לייצר חלבונים

וירוסים שלמיםיצירת החומר התורשתי והחלבונים מתחברים ל

התא המאכסן מומס והוירוסים פורצים מתוכו

תא המאכסן נהרס

)הוירוס מתון(מסלול ליזוגני

לתאהוירוס נספח

החומר התורשתי של הוירוס חודר לתא

החומר הגנטי משתלב בגנום התא

נהרסלאהתא

הוירוס המתון מסוגל להפוך לאלים

91

המאכלס , ים ממי ביוב'ולכן קל לבודד פאג' מרבית החיידקים רגישים ליותר מטיפוס אחד של פאג

.זנים רבים של חיידקי מעיים

ים'מעקב אחר התרבות הפאג

התרבית , ים בודדים מסוג אלים לתרבית חיידקים רגישים הגדלים במצע נוזלי'גכשמוסיפים פא

הנגיפים התרבו בהם והשתחררו מהם , חלק מהתאים הודבקו בנגיפים. מצטללת תוך כמה שעות

. התהליך חוזר על עצמו עד שכל החיידקים יהיו מומסים. תוך כדי המסתם והדביקו תאים נוספים

ים בתמיסה נקבע על פי מספר הפלאקים הנוצרים על 'וז בקטריופאגריכ ?ים'כיצד סופרים פאג

ים המדביקים את החיידקים הסמוכים 'החיידק המודבק משחרר מספר פאג. מרבד חיידקיםפני

: מהלך השיטה מתואר באיור הבא. הניתן להבחנה ולספירה)פלאק (ויוצרים מוקד ליזיס

נפח מעבירים . ים'פאגחיידקים שהודבק ב מיהולים עשרוניים של תרחיף מבצעים סדרה של

-בניגוד ל, אגר0.5-1%(גר רך המכילה אמבחנה המהול למהתרחיף) ל" מ0.1כ "בד(מסוים

לא דגימה נוספת של חיידקים מוסיפיםאגר ל. 450C בטמפרטורה) במצעים מוצקים2%

מכיוון שהחיידקים , יצירת דשא של חיידקיםבמטרה להבטיח, )חיידקי אינדיקטור (מודבקים

מערבבים ויוצקים את התערובת על צלחת פטרי . כבר לא יתרבוהנבדקת המודבקים שבדגימה

ים 'פאג, התערובת של האגר הרך. )over-layהטכניקה נקראת (המכילה מצע מזון מוצק

במהלך ההדגרה .מדגירים באינקובטור. וחיידקים מתפזרת על הצלחת ומתמצקת בשכבה דקה

מדביקים חיידקים שכנים וכך ' החיידקים המודבקים מתמוססים ומאות הצאצאים של כל פאג

ממשיכים החיידקים שניצלו מהנגיפים להתחלק ולהתרבות , במקביל לתהליך ההדבקה. הלאה

שעות של הדגרה אפשר להבחין 24אחר ל. עד שהם מכסים את כל פני הצלחת ויוצרים דשא

עיגולים אלה נקראים מוקדי . ולים הבולטים על רקע המרבד הצפוף של החיידקיםבעיגולים צל

. ים'והם נוצרו כתוצאה מהמסת תאי החיידקים שבאיזור המוקד על ידי הפאג) פלאקים( ליזיס

האגר מאפשר הדבקת תאים שכנים בלבד כך שהמוקדים ממוקמים רק באיזורים שבהם הודבקו

.החיידקים הראשונים

92

over-layטת זריעה בשי

פלאקים

93

גידול חד שלבי

אלים לתוך תא החיידק מתחילה שרשרת של תהליכים ' עם חדירת חומצת הגרעין של פאג

מכונה ' הניסוי שבמהלכו עוקבים אחר קינטיקת ההתרבות של הפאג. המתרחשים ברצף קבוע

. ה על ידי החוקרים דלברוק ואליסוהוא נערך לראשונ, ניסוי של גידול חד שלבי

ים תרבית מרוכזת של חיידקים שנמצאים בשלב הגידול הלוגריתמי 'בניסוי זה מדביקים בפאג

ים 'המאפשרות ספיחה של הפאג) דקות15(לאחר כמה דקות של הדגרה ). חלק א באיור(

). חלק ג באיור (103פי עם מצע גידול טרי מוהלים את התרחיף , )חלק ב באיור(לחיידקים

בצורה זו . המיהול הגדול מאפשר להרחיק חיידקים לא מודבקים ונגיפים שלא נספחו לחיידקים

תהליך ההדבקה נמשך : ים'אנו עוקבים אחר תרבית חיידקים שבה כל החיידקים מודבקים בפאג

נגיפים שהשתחררו בתרחיף צאצאי ה. רק בחיידקים שאליהם נספחו נגיפים עד לזמן המיהול

בגלל ההסתברות הקטנה מאוד , לא מדביקים חיידקים חדשים,המהול מחיידקים מומסים

כך שמספר המוקדים משקף את מספר היחידות יוצרות המוקדים .ים לחיידקים'למפגש בין פאג

מרבד החיידקים הרגישים שבו נספרים . שהתפתחו בחיידקים שהודבקו בתחילת הניסוי

מדגירים את התרבית המהולה ובזמנים .ם משמש רק כאינדיקטור המאפשר את הספירההמוקדי

חלק ד ( אותה מפזרים על מצע גידול מוצק עם חיידקים רגישים , דגימה ממנהקצובים נוטלים

ים שהשתחררו 'בצלחות אלה סופרים את מספר הפלאקים הנוצרים כתוצאה מהפאג). באיור

.גימותבתרבית המהולה שממנה נלקחו הד

94

:חד שלבי מתוארות בגרף הבאשל גידול תוצאות הספירה של המוקדים שמתקבלים בניסוי

: בגרף מבחינים בכמה שלבים

בשלב זה יש מספר נמוך של מוקדי הדבקה : )latent period, שלב החביון(ית תקופה לטנט .א

מספר המוקדים שנוצרו במהלך . הנובעים מחיידקים שהודבקו בנגיפים בתחילת הניסוי

.תקופה זו משקף את מספר החיידקים שהכילו נגיפים בתחילת הניסוי

מהירה במספר המוקדים במשך בשלב זה יש עלייה : )rise period, הפיצוץ(תקופת העלייה .ב

. כתוצאה ממחזור חיים אחד של הנגיפים, זמן קצר ובמהלכו מומסים יותר ויותר חיידקים

בשלב זה אין שינוי במספר המוקדים מאחר וכל החיידקים שבהם התרבו : תקופת הרגיעה .ג

.ואין שחרור של נגיפים חדשים למצע, הנגיפים הומסו

תקופת העלייה ובין מספר המוקדים בתקופה הלטנטית משקף היחס שבין מספר המוקדים בתום

יחס זה נקרא יבול . את המספר הממוצע של צאצאי הנגיף המשתחררים מחיידק מודבק אחד

ים שונים והוא תלוי בתנאי הסביבה 'ערך זה משתנה בזני חיידקים ופאג). Burst size(ההדבקה

.בה מגדלים את תרבית החיידקים

95

מטרת הניסוי

.λ' י פאג"מודבקת עה E.coli Bקב אחר עכירות של תרבית מע .א

.סדר גודל של יבול ההדבקהוחישוב י ספירת פלאקים"ים ע'הריכוז של תרחיף פאגקביעת .ב

)י זוג אחד"יבוצע ע (אלים על חיידקים' הדגמת השפעת פאג: חלק אחר התרבות החיידקים ניתן לעקוב א. נראית עכורה cells/ml 107*5בריכוז מעל תרבית חיידקים

נראה ירידה , ים במסלול הליטי'י פאג"במידה והחיידקים עוברים ליזיס ע .על פי מדידת העכירות

, ים'אחר העכירות בתרבית חיידקים מודבקת בפאג, לאורך זמן, בניסוי זה נעקוב. בעכירות

.ים'תרבית חיידקים נקייה מפאגבהשוואה ל

חומרים . cells/ml 108*5 - בריכוז כE.coli Bתרבית לוגריתמית של

pfu/ml 108*5 - בריכוז כλ' תרחיף פאג

ארלנמיירים סטריליים עם זרוע2

מהלך העבודה

.ביקורת וניסוי: המסומנים ארלנמיירים עם זרוע2 -ל מתרבית החיידקים ל" מ10העבר .1

.'ל מתרחיף הפאג" מ0.4הוסף לארלנמייר הניסוי .2

עד ורבע שעה מדי ו0בזמן ) nm 660(בספקטרופוטומטר יירים הארלנמ2מדוד את העכירות של .3

).כשעה וחצי(הצטללות תרבית הניסוי

. והסברהצג את התוצאות בגרף .4

96

י ספירת פלאקים"ע' מעקב אחר ריבוי פאג: חלק ב לזוגחומרים

. cells/ml 108*4 -בריכוז כבמרק טריפטון E.coli Bתרבית לוגריתמית של

pfu/ml 108*2 -בריכוז כ λ' תרחיף פאג

ל מרק טריפטון" מ4.5 מבחנות מיהול המכילות 11

מבחנות אלו צריכות (45°Cהנמצאות באמבט , ל אגר רך מותך" מ5 מבחנות המכילות 14

.)להישאר במצב נוזלי עד לשימוש

צלחות אגר טריפטון14

ל מרק טריפטון" מ10מבחנה גבוהה המכילה

מרק טריפטוןל " מ9בקבוק סטרילי המכיל

מהלך הניסוי

בצלחות פטרי נזרע , פ שיטה זו" ע.over-layת נשתמש בשיט, ים 'די לעקוב אחר מספר הפאגכ

ביחד עם דגימות ) חיידקי אינדיקטור (תערובת של חיידקים במצב לוגריתמי, מצע מזיןהמכילות

חיידקים ודגימות ה. ים'בפאגשהודבקה חיידקים של תרבית הם ומיהולים שוניזמנים מיילקחו ש

ותוכן המבחנות יישפך , במבחנות המכיל אגר רך מותך, יעורבבו במצע) ים'עם הפאג(התרבית

"חורים"על גביו יובחנו כך תיווצר שכבה המכילה חיידקים כרקע עכור . מעל מצע האגר בצלחות

רקע החיידקים אלו מוקדים בהם ייראה ליזיס על.ים'שקופים הנוצרים מפעילות הפאג

)plaques .( מהלך הזריעה מודגם באיור.ים'חיידקים המודבקים בפאגממקור המוקדים הוא :

97

:סימון מבחנות וצלחות .1

10-2סמן את המבחנה הגבוהה המכילה מרק טריפטון במיהול

ל מרק טריפטון" מ10רשום שם על הבקבוק המכיל

).פ הטבלה בהמשך"ע(זמן ומיהול : טריפטון בל מרק " מ4.5סמן מבחנות המכילות

).פ הטבלה בהמשך"ע(זמן ומיהול , שם: אגר טריפטון בצלחות המכילות סמן

.ביקורת, שם: צלחות המכילות אגר טריפטון ב2סמן

:י כל סטודנט" יבוצע ע–) ביקורת(ניסוי מקדים .2

.ל חיידקי אינדיקטור למבחנה עם אגר רך" מ0.1הוסף

.רטקס ושפוך את תוכן המבחנה על אגר טריפטון המסומן ביקורתערבב בוו

.פזר בעדינות ובתנועה סיבובית

.הנח למצע להיקרש

.לבורנטי ה"תהליך הספיחה נעשה במרוכז ע: ספיחה .3

. E.coli Bרבית תל " מ1 -ל λ' של פאג מיקרוליטר 20מוסיפים

. ללא טלטול370Cאמבט ות ב דק10מדגירים

:103ית המודבקת פי התרבמיהול .4

) 10-2הול מי(ל מרק טריפטון " מ10למבחנה המכילה ממבחנת הספיחה ל " מ0.1העבר

.וערבב

כ "סה (ל מרק טריפטון" מ9לבקבוק המכיל ) 10-2(ל מהמבחנה הגדולה " מ1 העבר

".מרוכז"בקבוק זה יסומן . )10-3מיהול

: דקות0בזמן ) פלאקים(קביעת מוקדי הדבקה .5

מהבקבוק המכיל את התרבית המודבקת ל " מ0.1במהירות הוצא , ות דק0בזמן

.)ל" מ0.1( אינדיקטור חיידקיואגר רך מבחנה המכילה לתוך , המהולה

.זרע על צלחת עם מצע טריפטוןערבב ו

:גידול חד שלבי .6

. 370C את הבקבוק בטלטול בטמפרטורההדגר

ערוך מיהולים ,פירת הפלאקים דגימות לסקח) 90 - ו60, 40, 20, 10(בזמנים שונים

:שתוארה לעיל, over-layוזרע בשיטת עשרוניים כמפורט בטבלה

98

מיהול סופי לבדיקה

מרוכז 10-1 10-2 10-3 10-4

)דקות(זמן

+ 0

+ + 10

+ + 20

+ + 40

+ + 60

+ + + 90

מציין מיהול ממנו מתבצעת זריעה על צלחת+ הסימן

. שעות24 - ל370C -גר את כל הצלחות בהד .7

:לאחר הדגרה .8

. בזמני ההדגרה שוניםל"ים למ'ספור פלאקים וחשב ריכוז פאג

.ל בתרחיף המקורי"ים למ'חשב גם את ריכוז הפאג

.'שרטט את עקומת הגידול החד שלבי של הפאג

.)burst size (חשב את יבול ההדבקה

99

נספחים

ריאגנטים לצביעת גרםGentian violet - 0.5 gr/100 ml H2O

Lugol - Iodine 1gr; KI 2 gr; H2O 300 ml

Fuchsin - basic fuchsin 1 gr; ethanol 10 ml; phenol 5 gr; H2O 1600 ml

ריאגנטים לצביעת נבגים5% malachite green solution

safaranin

ריאגנטים לצביעת קפסולה2% Congo red סרום10% עם

1% HCL

מתילן כחול1%

ריאגנטים לצביעת חומרי תשמורת :PHBתמיסת

(0.2gr (NH4)2SO4, 0.2gr KCl, 0.2gr MgCl2.7H2O, 5gr DL-hydroxybutyrate, 1L H2O)

) אתנול70% - צבע בSudan black B) 0.3%תמיסת

ספרנין0.5%תמיסה מימית של

NAמצע

מבחנות סליין למיהול0.85% Nacl in H2O (Dist.)

100

לבידוד קושרי חנקןMמצע Manitol 10 gr

K2HPO4 1 gr

MgSO4. 7H2O 0.5 gr

CaCO3 3 gr

Agar 20 gr

H2O (Dist.) 1000ml

לבידוד קושרי פחמןTמצע K2HPO4 1 gr

MgSO4. 7H2O 0.2 gr

FeSO4. 7H2O 0.05 gr

CaCl2 0.02 gr

MnCL2. 4H2O 0.002 gr

NaMoO4. 2H2O 0.001 gr

NH4Cl 1 gr

Na2S2O3. 5H2O 7 gr

Agar 20 gr

H2O (Dist.) 1000ml

לבידוד אקטינומיצטיםSמצע (NH4)2SO4 1 gr

K2HPO4 1 gr

MgSO4. 7H2O 0.5 gr

Na – succinate 2 gr

Agar 20 gr

H2O (Dist.) 1000ml

pH 7

101

VRB(e Agar Violet Red Bil(מצע לקוליפורמים

הבא כמעט לרתיחה רצוי . ל מים מזוקקים סטריליים" מ100 - גרם ל4.15שקול מהתערובת

.אין לעקר. להכין לפני השימוש

MRSמצע

102

OGYמצע

103

לקוליפורמים) Brilliant green lactose bile broth) BGLBמצע Peptone 10 gr

Lactose 10 gr

Bile 20 gr

Brillant green 0.0133 gr

H2O (Dist.) 1000ml

pH 7.4

לקוליפורמים) Eosin methylene blue agar) EMBמצע Peptone 10 gr

Lactose 10 gr

K2HPO4 2 gr

Eosin 0.4 gr

Methylene blue 0.065 gr

Agar 15 gr

H2O (Dist.) 1000ml

pH 6.8

104

רמים צואתיים לקוליפוIMViC מצעים לבדיקת מי טריפטון לקביעת אינדול

Tryptone 10 gr

NaCl 5 gr

H2O (Dist.) 1000 ml

MR-VP broth מצע גידול

Peptone 5 gr

K2HPO4 5 gr

Glucose 5 gr

H2O (Dist.) 1000ml

pH 7.6

קביעה

for M.R.

Methyl red 0.2 gr

Ethanol 600 ml

H2O to 1000 ml

for V.P.

5 gr Napthol in 100 ml Ethanol

40% KOH

מצע לקביעת ניצול ציטרט

105

MFמצעים לבדיקות מים בשיטת לקוליפורמיםm-Endoמצע

לקוליפורמים צואתייםm-FCמצע

106

לאנטרוקוקיםm-Enterococcus agarמצע

107

לפסאודומונסM-PA-Cמצע

108

Staphylococcus aureus -ל) Baird parker) BPמצע

109

לספירה כללית PCAמצע

Staphylococcus aureusטסט אישור לנוכחות Oxoidשל חברת staphylase ערכת

LBמצע 0.5% NaCl

1% Tryptone

0.5% YE

מצע מינימלי לפי דייוויס0.7% K2HPO4

0.3% KH2PO4

0.05% Na3citrate

0.01% MgSO47H2O

pH 7

)מניטול, סוכרוז, לקטוז, גלוקוז(י סוכרים מרק

Beef extract 1 gr

Peptone 10 gr

NaCl 5 gr

Phenol red 0.018 gr

Sugar 10 gr

H2O (Dist.) 1000ml

110

TSIמצע

MacConkeyמצע

לקביעת אינדולKovacריאגנט Amyl alcohol 150 ml

p-dimethylaminobenzaldehyde 10 gr

HCl (conc.) 50 ml

לטין'מצע גGelatin 15

Nutrient broth 100 ml

111

מצע לקביעת אוראזPeptone 1 gr

NaCl 5 gr

KH2PO4 2 gr

Agar 20 gr

Glucose 1 gr

H2O (Dist.) 1000 ml

pH 7.1

. אוראה20%של ) מסינון(אחרי אוטוקלב מוסיפים תמיסה סטרילית

.ניתן להכין את המצע ללא אגר, צע נוזלי לקבלת מ

מצע לקביעת עמילאזNA + 2%עמילן

ים'אגר טריפטון לפאג

Tryptone 10 gr

NaCl 5 gr

Agar 10 gr

H2O (Dist.) 1000 ml

אגר טריפטון רךTryptone 10 gr

NaCl 5 gr

Agar 9 gr

H2O (Dist.) 1000 ml

מרק טריפטון

Tryptone 10 gr

NaCl 5 gr

H2O (Dist.) 1000 ml

112

מקורות ספרות

.תל אביב, הוצאת האוניברסיטה הפתוחה. 1-12יחידות , עולם החיידקים. 1986. קלמס י

Clesceri L.S., Greenberg A.E. and Eaton A.D. 1998. Standard methods for

the examination of water and waste water. American Public Health

Association, American Water Works Association and Water Environmnet

Fereration, Washington, DC.

Harley J.P. and Prescott L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5th

Edition, The McGraw-Hill Companies.

Madigan M.T., Martinko J.M. and Parker J. 2003. Brock Biology of

Microorganisms, 10th edition. Pearson Education Inc.

Tortora G.J., Funke B.R. and Case C. 1998. Microbiology – An Introduction,

6th edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc.

http://www.health.gov.il/ אתר הבית של משרד הבריאות

":עולם החיידקים"מתוך , מהנושאיםחלקהפנייה לקריאת רקע תיאורטי על

מספר יחידה נושא

1יחידה מבוא למיקרוביולוגיה

2.3 פרק 2יחידה דופן תא החיידק

2.4, 2.3 פרק 2יחידה הממברנה הציטופלסמית

3.10רק פ3יחידה חיידקים יוצרי ספורות

4.2 פרק 4יחידה שיטות לספירת חיידקים

4.5, 4.4, 4.3 פרק 4יחידה עקומת גידול של חיידקים

5.3 פרק 5יחידה מצעי גידול

5.4 פרק 5יחידה השפעת גורמי סביבה על קצב הגידול

נספח5יחידה השפעת חום קרינה וכימיקלים על חיידקים

9יחידה נגיפים

12.11, 12.10 פרק 12יחידה טייםחומרים אנטיביו

.רקע על שאר הנושאים ניתן למצוא במקורות הספרות באנגלית ובאינטרנט