173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM(Dành cho hệ CĐNKN)

Biên soạn : Nguyễn Thúy Hương

Tp.HCM 09/ 2011

1

MỤC LỤC

Chương 1: Đối tượng vi sinh vật và các chỉ tiêu trong thực phẩm………….3

Chương 2: Kỹ thuật cơ bản trong phân tích vi sinh vật……………………..17

Chương 3: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống...39

Chương 4: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại……...85

Chương 5:Đánh giá vệ sinh công nghiệp…………………………………….95

2

Chương I

ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT VÀ CÁC CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM

1.1GIỚI THIỆU

Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguôn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm.

Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng, yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinh vật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến thực phẩm nội địa quan tâm thực hiện. Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thực phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụ thực phẩm được thuyên giảm.

Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hoá học hoặc chứa các vi sinh vật gây bệnh. Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu là các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm bệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mức độ rất thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức độ gây ngộ độc.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sốt, đau đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tuỳ thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vâtk tạo ra và tiết vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tế bào vi sinh vật (nội độc tố).

Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gây ngộ độc hay gây bệnh ở

3

người khi bị đào thải khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị nhiễm phân này. Nước trở thành môi trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho người khi sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách. Nước là môi trường sống, môi trường nuôi trồng của các loài thuỷ sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh vật gây bệnh có thể nhiễm vào các loài thuỷ hải sản, làm nhiễm nguồn nguyên liệu của các thực phẩm thuỷ hải sản chế biến. Đó là một trong những con đường nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thực phẩm. Mặt khác, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, vi sinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt thiết bi, công nhân. Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh vật hiện diện hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Do vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong đa số các trường hợp là bằng không.

1.2. TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở TP. HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm.

Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.

Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất (24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được nguyên nhân. 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấy mẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xét nghiệm. ………

Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện giảm 174 người.

Theo TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù vậy, TS. Hùng cho hay, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ

4

http://vatgia.com/hoidap/quicksearch.php?keyword=Vi%E1%BB%87t+Nam

ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm. Do đó, người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp ăn của gia đình mình.

Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 70%) thì tới năm 2010, ngộ độc vi sinh vật thấp đi (<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tới trên 60%. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Xu thế ngộ độc cho hóa chất càng ngày càng tăng lên, ngộ độc do vi sinh vật có xu hướng kiểm soát tốt hơn nhưng không có nghĩa là nguy cơ giảm đi. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện giảm 174 người.

Năm 2010, số vụ ngộ độc do hóa chất là chủ yếu, chiếm trên 60%.

TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP - nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Đặc biệt, thời gian vừa qua, không có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn ra Đại lễ 1.000 năm Thăng Long – Hà Nội.

Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc. Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện ATVSTP.

Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục ATVSTP, nhận thức của người dân về vấn đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008. Theo đó, nhận thức của người

5

sản xuất sản phẩm thực phẩm tăng từ 47,8% lên 55,7%; nhận thức của người kinh doanh thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm tăng từ 38,3% lên 48,65%.

Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng đã bắt đầu có chiều hướng giảm. Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảm gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%.

Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh. Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạt yêu cầu. Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở.

Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65% (2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên 84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4% (2009) lên 79,4% (2010). Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những điểm sáng của công tác VSATTP. Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010).Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442 người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người. So với cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321 người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%). Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với 1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc do vi sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)...

1.3. ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT–TÁC NHÂN CHÍNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Các quá trình hư hỏng của thực phẩm thường do vi sinh vật gây nên. Trong đó rất nhiều trường hợp các vi sinh vật này còn tạo ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Chính vì vậy việc tìm hiểu về các vi sinh vật gây bệnh để từ đó tìm ra các biện pháp khống chế chúng là việc làm cần thiết.

Có 2 dạng gây bệnh có nguồn gốc từ vi sinh vật:

- Vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của các độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Clostridium botulinum tiết ra độc tố gây nên bệnh botulism (chứng ngộ độc thịt); Staphylococcus aureus gây nên bệnh tụ cầu khuẩn

- Vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người. Sự hiện diện của chúng hoặc của các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli,…

Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả 2 dạng gây bệnh này. Ví dụ Clostridium perfringens và Bacillus cereus.

6

http://vatgia.com/raovat/quicksearch.php?keyword=kinh+doanh

http://vatgia.com/raovat/quicksearch.php?keyword=kinh+doanh

1.3.1.Tổng vi khuẩn hiếu khí:

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật chỉ sinh trưởng trong điều kiện có oxy.Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oC trong khoảng 3 ngày.

Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như:

- Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count _ APC)

- Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count _ TPC)

- Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count _ TVC)

- Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count _ SPC)

1.3.2.Tổng nấm men, nấm mốc:

Nấm mốc là vi nấm có khả năng tạo sợi nấm, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty

Nấm men là những tế bào đơn tính sinh sản chủ yếu dạng vô tính theo kiểu nảy chồi.

Aspergillus

Aspergillus flavus và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7-400C và tối ưu ở 24-280C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, đậu phộng, bắp…). Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người.

Hình 9. Asperillus flavus (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

7

1.3.3. Salmonella

Nếu phân loại theo mức độ gây bệnh của Salmonella ta có các loại sau:

- Loại chỉ gây bệnh cho người (vd: S. typhi gây sốt thương hàn tại người)

- Loại chỉ gây bệnh cho động vật (vd: S. typhimurium gây sốt thương hàn tại chuột)

- Loại gây bệnh cho cả người và động vật (chiếm đa số)

Salmonella là trực khuẩn gram (-), không tạo bào tử, có tiên mao (trừ S. gallinarum), có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 m. Giống như nhiều loài vi khuẩn khác Salmonella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ 6 đến 45.60C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C. Salmonella phát triển trong khoảng pH từ 4.1 – 9.0. Trong các món salad có độ pH khoảng 5.5 – 5.7 không nhận dạng được sự thay đổi mùi vị khi Salmonella phát triển. Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của Salmonella là 0.93 – 0.95.

Hình 1. Salmonella typhy (Chuïp qua kính hieån vi ñieän töû)

Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động vật; từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng của chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.

Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12-36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2-7 ngày.

1.3.4. Coliforms

Đây là những vi sinh vật hình que, G-, không tạo bào tử, có khả năng lên men latose và sinh khí trong quá trình lên men này. Phát triển trong khoảng nhiệt độ (từ – 2 đến 50oC), pH từ 4,0 đến 8.5, có thể sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Sau 12 – 16 giờ trên môi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Coliform đi vào thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân. Các loài tiêu biểu cho Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes. Tuy nhiên, ngoài ra còn có khoảng 20 loài mang những tính chất đặc trưng cho Coliform, trong đó bao gồm cả các Enterobacteriaceae khác và các loài thuộc Aeromonas.

8

Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường có nhiệt độ từ 44.5 – 450C (các Coliform khác có t0

opt=370C). Đây cũng là đặc điểm nhận biết và phân biệt Colifom phân. Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform.

Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của Coliform:

- Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, các chất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,..

- Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết.

- Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 460C.

- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường

- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu

Escherichia coli:

Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Các loài E. coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Các. Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến. Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit. Gây nhầy nhớt, hư hỏng thực phẩm.

Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy.

Hình 2. Escherichia coli (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

1.3.5. Staphylococcus

Hiện nay tìm thấy 31 loài. Staphylococcus là cầu khuẩn, G+, các tế bào thường liên kết thành hình chùm nho. Không di động, không tạo bào tử. Nhiệt độ tối ưu là 37oC. Chịu được khô hạn, hơi nóng (ở 50oC vẫn sống được trong 30 phút). Có khả năng sống được trong nồng độ NaCl là 9-10%. pHopt= 6-7 ; aw opt = 0,83- 0,90. Staphylococus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau nhất là trên các môi trường chứa chất hữu cơ. Tuy nhiên phải có nitơ trong môi trường. Nguồn

9

nitơ sử dụng là acid amin. Trong tự nhiên Staphylococcus được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các động vật máu nóng. Staphylococcus sinh một số độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt và không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tó này, sau 4-6 giờ người ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài 6-8 giờ. Ngoài ra Staphylococcus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viêm tủy xương ở người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

Hình 3. Staphylococus aureus (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

Staphylococcus aureus

Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột.

Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn. Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit. Chính vì vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng. Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường). Chúng lên men và phân giải đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm.

Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ da người tiếp xúc với người bệnh. Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa. Riêng không khí không phải là nguồn gây nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci.

Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt, cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream. Nếu không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh.

1.3.6. Vibrio

Có khoảng 28 loài. Trong đó có 4 loài thường gặp nhiều trong hải sản:

- Vibrio vulnificus

- V. cholerae

- V. parahaemolyticus

- V. alginolyticus

10

Vibrio là phẩy khuẩn. Phần lớn thuộc gram (-). Di động nhanh nhờ đơn mao ở đầu. Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính. Thuộc loài hiếu khí tùy tiện. Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3% NaCl. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối đến 7.0%. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 35 – 370C, tuy nhiên vẫn phát triển được ở khoảng nhiệt độ từ 10 – 440C. Khoảng pH mà Vibrio có thể phát triển từ 5.0 – 11.0. Vibrio cholerae tạo ra độc tố tả cholerae-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5g gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố này, loài này còn tiết độc tố hemolysin có độc tính tương tự tetrodotoxin của các nóc.

Thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sản phẩm sữa, các loại thuỷ hải sản tươi sống. Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động của nhiệt độ. Nói một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sự tác động của Vibrio.

Hình 4. Vibrio cholerae (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

1.3.7. Shigella

Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gây bệnh lỵ trực trùng. Chỉ gây bệnh cho người và linh trưởng. Sinh độc tố enterotoxin. Là trực khuẩn gram(-), không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện. Phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 40oC, t0

opt = 370C, pH = 6 – 8, nồng độ muối 5 – 6%. Nhạy cảm với nhiệt.

Hình 5. Shigella sonnei (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

11

Bao gồm 4 loài

– S. dysenteriae

– S. boydii

– S. plexnery

– S. sonnei

Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu đường và acid amin ở ruột non. Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử vong. Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu. Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Không được phép hiện diện trong 25g thực phẩm

Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người. Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm.

1.3.8. Yersinia

Hiện nay tìm thấy 11 loài. Là trực khuẩn gram(-). Trong một số trường hợp có khả năng chuyển động. Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nha bào. Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32oC. Bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 1 – 3 phút. Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica phát triển trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm, cua, gà, đậu phụ,… Y. enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại người. Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng của bệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành. Nếu để lâu sẽ dẫn đến chảy máu dạ dày.

Hình 6. Yersinia pestis (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

12

1.3.9. Clostridium

Hiện nay phát hiện ra hai chủng gây ngộ độc thực phẩm:

- Clostridium botulinum: tạo độc tố gây hại đến hệ thần kinh

- Clostridium perfringens: gây đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều khí. Khi vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra độc tố ruột, gây ngộ độc cho người.

Clostridium botulinum là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí, tạo bào tử. Bào tử rất chịu nhiệt. Nhiệt độ phát triển tối ưu là : 43 – 47oC, pH từ 5 – 9, bị ức chế bởi NaCl 5%, hoặc NaNO3 2,5%

C.botulinum là vi khuẩn sinh độc tố. Tế bào C.botulinum bị tiêu ở nhiệt độ 800C đến 900C. Trong đa số trường hợp C.botulinum sinh gas và tạo mùi khó chịu. Từ đặc điểm này ta có thể loại bỏ thực phẩm nhiễm C.botulinum một cách dễ dàng. Tuy nhiên cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bằng cảm quan về sự nhiễm vi khuẩn C.botulinum của thực phẩm, do đó người sử dụng sẽ bị nhiễm độc tố gây hội chứng botulism (ngộ độc thịt).

Sự ngộ độc thịt xảy ra không thường xuyên, nhưng nó thường gây tử vong. Theo sự phát triển của khoa học, tỷ lệ tử vong do botulism ngày càng giảm. Ví dụ vào những năm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ này chiếm trên 60% tại Mỹ. Theo như thống kê của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh tại Mỹ, thì các sản phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất trong công nghiệp.

Hình 7. Clostridium botulinum và bào tử hình viên đạn (Chụp qua KHV điện tử)

Tùy theo từng loại C. botulinum mà triệu chứng bệnh xuất hiện sau khi sử dụng thực phẩm chứa độc tố xuất hiện sau các khoảng thời gian khác nhau (từ 12 – 36 giờ). Khi bị ngộ độc các triệu chứng đầu tiên xuất hiện là: nôn mửa, tiêu chảy, mệt mỏi, chóng mặt và đau đầu. Sau đó là các triệu chứng táo bón, nhìn một thành hai. Rồi các hiện tượng khó nuốt, khó phát âm xuất hiện. Người bệnh cảm nhận được sự khô miệng, khó thở, lưỡi bị sưng và xuất hiện màng. Có thể lên cơn sốt hoặc không. Tiếp theo là cơ bị tê cứng, rồi đến hệ thống hô hấp bị tê cứng và cuối cùng là tim ngừng đập. Kết quả là người bị bị tử vong do tê liệt hệ thống hô hấp. Sự tử vong này thường diễn ra sau 3 – 6 ngày sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố.

Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố. Tuy nhiên nó chỉ hiệu nghiệm nếu sử dụng khi phát hiện ra các triệu chứng đầu tiên của bệnh. Còn

13

để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi. Chính vì vậy việc xác định bệnh là rất khó khăn. Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho người bệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng các chất lỏng trong cơ thể,..

Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau:

- Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng.

- Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó.

- Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu.

- Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quản tốt và không được hâm nóng.

- Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút.

- Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau:

- Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch.

- Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 820C trong 30 phút.

- Làm lạnh nhanh sau khi đóng gói và bảo quản lạnh.

- Tất cả các bao bì sử dụng phải là loại được bộ Y tế cho phép và chịu lạnh tốt.

1.3.10. Bacillus cereus

B. cereus là trực khuẩn G(+), sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5-500C, tối ưu ở 35-400C. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…).

Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ lạnh vài giờ trước khi sử dụng. Triệu chứng ngộ độc phổ biến là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 14-16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ.

Hình 8. Bacillus cereus (Chụp qua kính hiển vi điện tử)

1.3.11. Feacal streptococcus (Streptococcus phân)

Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, hình cầu hay hình oval kéo dài, Gram dương, thường tụ tập thành hình đôi hay hình chuỗi, không di

14

động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các loài này sống hiếu khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng.

Các loài này có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH ở 9,6 ở 450C.

1.4. CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM

1.4.1. Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước

* Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất

Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau:

- Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý, giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml

- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là 10.000 MPN/100ml

* Nước uống

Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu chuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạng nước này như sau:

- Nước uống đóng chai

Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép

1. Coliform (MPN/100ml)

2. Coliform phân (MPN/100ml)

3. E. coli (CFU/100ml)

4. Clostridium khử sulphat (CFU/100ml)

5. Streptococci phân (CFU/100ml)

0

0

0

0

0

- Nước giải khát không cồn

Chỉ tiêuMức độ tối đa cho phép

Không đóng chai Đóng chai

1. Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml)


3. Clostridium perfringens

4. Leuconostoc (CFU/100ml)

5. Nấm men – nấm mốc (CFU/100ml)

5x104

0

0

0

103

102

0

0

0

0

15



6. Staphylococus aureus 0 0

- Nước giải khát có cồn



1. Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml)


3. Clostridium perfringens

4. Vi khuẩn gây đục (quan sát bằgng mắt)

5. Nấm men – nấm mốc (CFU/100ml)

6. Staphylococus aureus/vi khuẩn gây bệnh đường ruột

103

0

0

0

102

0

102

0

0

0

0

0

1.4.2. Chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y tế tháng 4/1998 bao gồm các chỉ tiêu:

- Tổng vi khuẩn hiếu khí

- Coliform

- E. coli

- Staphyloccocus aureus

- Salmonella

- Vibrio parahaemolyticus

- Bacillus cereus

- Streptococcus faecalis

- Pseudomonas aeruginosa

- Clostridium botulinum

- Clostridium perfringens

- Tổng số nấm men, nấm mốc

16

Chương II KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

2.1.LẤY MẪU

2.1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU THỰC PHẨM

Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện cở mật độ thấp và không có sự phân bố đồng đều trong mẫu

Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩm thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh sáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …) được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trong quá trình chế biến. Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện có thể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật.

Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác.

2.1.2. PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU

Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực phẩm sau này. Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu mặc dù được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rất quan trọng trong quá trình thử nghiệm. Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫn tới những sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm.

2.1.2.1. Nguyên tắc lấy mẫu

Việc lấy mẫu phải đảm bảo 02 điều kiện sau:

- Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng.

- Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích.

Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau:

- Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn có thể sẵn dùng).

Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một kích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công nghệ.

- Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và kiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó.

- Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng

17

nhất.

- Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn lượng cần thiết để phân tích.

- Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia thành lô hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô hàng và trộn đều..

- Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm. Mẫu kiểm của một lô hàng lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu bao gói rồi tối thiểu cần 100 g. Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm còn nguyên mới được dùng để phân tích. Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chế biến, nước mắm..): 500ml…

- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp.

Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng

- Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu.

- Trên mẫu cần ghi:

+ Tên mẫu

+ Người lấy mẫu

+ Tên và địa chỉ nhà sản xuất

+ Số lượng mẫu lấy

+ Địa điểm, thời gian lấy mẫu.

- Những mẫu chưa sử dụng ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không cần bảo quản đông thì có thể bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC để tránh sự biến động về thành phần đặc tính của mẫu cũng như vi sinh vật. Nhìn chung, mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 24h.Để lâu hơn có thể bị tăng hoặc giảm vi sinh vật.

Bảng 2.1. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích

STT Tên thực phẩm Lượng mẫu Đơn vị1 Thịt và các sản phẩm của thịt 200 ÷ 500 gram2 Cá, tôm, cua (nguyên con) 200 ÷ 500 gram3 Trứng 5 ÷ 10 Quả4 Nước mắm, nước chấm 500 ÷ 750 ml5 Dấm 500 ÷ 750 ml6 Sữa tươi 500 ÷ 750 ml7 Dầu, mỡ 500 ÷ 750 ml8 Rượu các loại 750 ÷ 1000 ml9 Bột ngũ cốc, sản phẩm của bột 250 ÷ 500 gram10 Bánh, mứt, kẹo 250 ÷ 500 gram11 Gia vị, muối 50 ÷ 100 gram12 Phẩm màu 20 ÷ 50 gram13 Đồ hộp, nước giải khát 5 ÷ 10 hộp, chai

Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên.

18

2.1.2.2. Kế hoạch lấy mẫu

* Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M

- Số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M (c);

- Số lượng mẫu cần thử (n);

- Giới hạn vsv, m & M

+ Chấp nhận (acceptable) (< m)

+ Ngưỡng lân cận giới hạn (Marginally acceptable) (> m and < M)

+ Không chấp nhận (Unacceptable) (> M);

Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính.

* Kế hoạch hai thuộc tính

- Chỉ nêu ra m

- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử >m thì chấp nhận lô hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng

* Kế hoạch ba thuộc tính

- Đặt ra cả m và M

- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP

- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không chấp nhận được

- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng > m và M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm

* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu

Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong thực phẩm. Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thì thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính.

VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt tươi

Mẫu Test N C m M

Thịt tươi gia súc

Thịt gia cầm

- Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình

- Samonella

- Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình

- Salmonella

5

5

5

5

3

0

3

0

106

0

106

0

107

107

2.1.2.3. Thu và vận chuyển mẫu

19

Thu tại nhiều thời điểm và vị trí. Đối với loại thực phẩm đã biết chỉ nhiễm bề mặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hoặc cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu

Dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ vỡ)

Chú ý nhiệt độ và thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm của thực phẩm)

Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng, biến dạng, bị hở các mối ghép hay không? Ghi lại các nhận xét trên. Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm. Chú ý chỉ kiểm các hộp phồng khi có yêu cầu.

Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm

2.1.2.4. Chuẩn bị mẫu phân tích

- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó bỏ vào erlen 150 ml hoặc 200 ml đã có sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.

- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10-100 g mẫu (cả cái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào erlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.

- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể hút trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml mẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt khuẩn. Ta có độ pha loãng 10-1.

- Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE (Polyetylen), đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18 h; hoặc 45oC

trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc bình chứa mẫu nếu có thể để tăng tốc độ giải đông)

- Có thể dùng Stomacher để xử lý mẫu rắn

- Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước đệm phot phat, nước muối sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần.

2.2. KỸ THUẬT PHA LOÃNG

Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theo bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch pha loãng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thực phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.

2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

20

- Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau. Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật.

- Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng… cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lượng của đối tượng vi sinh vật quan tâm. Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu.

- Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ thể thực vật, động vật hoặc VSV.

- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 – 0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.

- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin, các acid béo, các thành phần của màng tế bào... Nồng độ thích hợp của các gốc kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 g /ml. Nồng độ thích hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 g/ml (1 g = 10-6 g )

Thành phần cơ bản chính màng xelluloza của tế bào vi khuẩn

Nguyên tố Dạng tồn tại cho vi sinh vật sử dụng

Thành phần trung bình (%)

CChất hữu cơ

CO2 50

O Chất hữu cơ 20

N NH4+,NO3

- ,NO2- 14

H Chất hữu cơ 8

P H2PO42-, HPO4

2-, PO43- 3

21

S SO42- 1

2.3.1. Phân loại môi trường

Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thành phần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng.

- Theo bản chất

- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác định.

- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với hàm lượng xác định

- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.

- Theo trạng thái vật lý

- - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.

- - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng mật độ vi sinh vật.

- - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp

- Theo mục đích

- - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.

- - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng sinh chọn lọc Salmonella

- - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:

- + Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin, oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide);

- + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium tellurite, sodium lauryl sulfate;

- + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic);

- + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ.

22

- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân biệt trong môi trường phân biệt:

- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH. Chỉ thị pH thường dùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple.

- + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H2S. H2S được phát hiện bằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo ra FeS có màu đen.

- + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môi trường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn.

- + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes.

- - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng.

- Chỉ thị màu môi trường

- Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích vi sinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa những chất chỉ thị màu. Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác nhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môi trường có màu hoặc thay đổi màu.... Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổi màu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinh hoá. Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau. Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích, môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thị màu cho phù hợp.

Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng

-

-

23

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2.3.2. Pha chế, chuẩn bị môi trường

Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trường đông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH-MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi trường ở các lần kiểm nghiệm khác nhau. Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ các môi trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan, chỉnh pH và hấp khử trùng. Phương pháp pha chế môi trường này được thực hiện như sau:

- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn

- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần thiết. Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại. Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cần phải gia nhiệt để làm tan môi trường.

- Điều chỉnh pH môi trường. Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N

- Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho các dụng cụ chứa.

- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực

- Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy

Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường:

- Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bị hỏng

- Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác

- Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn

- Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường, giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọn lọc bị mất, tạo thành các chất ức chế mới.

- Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid

24

- Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ở phòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm)

2.4.KHỬ TRÙNG

2.4.1. Khử trùng dụng cụ, môi trường nuôi cấy

Các tác nhân vật lý hay hóa học như nhiệt độ cao, một số dạng bức xạ hay hóa chất chuyên dụng… có thể dùng để khử trùng vật dụng nuôi cấy

Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do khả năng làm hỏng hay biến tính các thành phần quan trọng tham gia vào hoạt động sống của tế bào như protein và acid nucleic. Có thể khử trùng dụng cụ bằng phương pháp nhiệt khô (sấy 170oC trong 2 giờ) hay nhiệt ướt (đun ở 60oC trong 30 phút, 72oC trong 15 phút, hoặc 100oC trong 10 phút) để diệt thể dinh dưỡng của vi sinh vật. Cũng có thể khử trùng dụng cụ bằng hơi nước cao áp 121oC trong 15-30 phút để diệt cả các thể sinh dưỡng lẫn các bào tử-nếu có- của mọi vi sinh vật

Các bức xạ điện từ với bước sóng ngắn (như tia X hay tia gamma) có khả năng ion hóa nhiều loại phân tử tạo nên những gốc tự do với hoạt tính hoạt hóa cực mạnh có thể phá hủy các thành phần cũng như cấu trúc quan trọng như acid nucleic, màng lipoprotein, các protein trong tế bào. Tia tử ngoại tuy không có khả năng ion hóa nhưng lại là một tác nhân diệt khuẩn mạnh do khả năng tác động lên acid nucleic tạo đột biến gây chết tế bào. Sóng viba (microwaves, dạng sóng điện từ có bước sóng từ khoảng 1-1000nm) cũng được dùng phổ biến nhờ khả năng sinh nhiệt do kích thích các phân tử bất đối xứng về điện tích dao động với tần số cao (trên 900 triệu lần/giây).

Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước giới hạn (< 0,75 µm), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật (trừ mycoplasma có đường kính chỉ khoảng 0,2-0,3 µm và virus). Một số hóa chất như ethylen oxyde, triethylglycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh… có thể kiểm soát sự tăng trưởng của vi sinh vật thường được dùng để khủ trùng hoặc ức chế sự sống cũng như tăng trưởng của vi sinh vật.

2.4.2.Khử trùng dụng cụ, môi trường sau nuôi cấy

Môi trường sau nuôi cấy vi sinh vật và các dụng cụ bị nhiễm cần được khử trùng, tiêu hủy hoặc làm sạch phù hợp. Nói chung việc khử trùng bằng nhiệt đóng vai trò quan trọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau nuôi cấy. Việc khử trùng bằng hóa chất thường chỉ được thực hiện với các dụng cụ có kích thước và cấu tạo nhỏ gọn (như pipet, lam kính…)hoặc trong vài trường hợp đặc biệt.

Đối với các dụng cụ thủy tinh được dùng làm nhiều lần (như bình tam giác, ống nghiệm…) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121oC trong 30 phút. Vật liệu nuôi cấy trong các dụng cụ chứa dùng một lần (như plastic) cũng có thể khử trùng ở nhiệt độ tương tự trong các bao plastic có điểm nóng chảy cao. Sau khi vi sinh bị diệt có thể loại bỏ các đĩa Petri hoặc bao bì nhựa cùng các thứ bên trong.

2.5.KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

2.5.1. KỸ thuật gieo cấy vi sinh vật

Mục đích của việc gieo cấy VSV để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước, đất...)

25

cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của đối tượng VSV mục tiêu.

Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước như sau:

- Ồng nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa.

- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành và miệng ống nghiệm.

- Đầu que cấy có dính VSV được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn.

- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que cấy.

- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.

- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để que cấy.

- Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieo cấy.

Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái.

Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm thạch nghiêng

Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.

Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng

Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các bước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau:

- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.

- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy ống nghiệm.

Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ.

2.5.2.Phân lập vi sinh vật

VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV. Việc phân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.

Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:

26

2.5.2.1.Kỹ thuật hộp ria (streak plate)

Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tế bào riêng rẽ nhau ra. Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từ một tế bào ban đầu.

Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là môt số kỹ thuật ria thường dùng:

Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak)

Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak)

Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch

Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

2.5.2.2.Kỹ thuật hộp trải : Môi trường được chuẩn bị trước trong các đĩa Pettri. Yêu cầu bề mặt môi trường phẳng, không ướt. Nhỏ 0,1 hoặc 0,2 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa môi trường. Dùng que trang vô trùng trải đều mẫu khắp bề mặt đĩa. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.

2.5.2.3.Kỹ thuật hộp đổ : Hút 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa. Đổ 15-20 ml môi trường đã tiệt trùng, đã để nguội khoảng 45-50oC vào giữa đĩa. Dùng tay xoay nhẹ sang trái và xoay nhẹ sang phải vài lần để dịch mẫu hòa để vào môi trường. Để yên đĩa trên bề mặt phẳng cho đông. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.

2.6.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

2.6.1. ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIÊP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (ĐỘ ĐỤC)

Tế bào vi sinh vật là một thực thể khi có trong môi trường sẽ làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong

27

môi trường. Trong một giới hạn nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong môi trường tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Do đó có thể định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm. Trong trường hợp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật có trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp. Phương pháp tiến hành theo hai bước:

1. Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung dịch thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.

Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định lượng tế bào vi sinh vật có trong 1ml ký hiệu N/ml.

Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng. Vẽ đồ thị biểu diễn log (N/ml) (trục tung) theo các giá trị OD đặt trên trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính giữa log (N/ml) với OD.

2. Xác định lượng tế bào theo độ đục:

- Đo độ đục của huyền phù của tế bào vi sinh vật cần xác định.

- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. Lưu ý N/ml = 10a với a=log (N/ml).

Hình 13. Máy đo độ đục

Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Trong trường hợp không cần thiết giá trị tuyệt đối của tế bào vi sinh vật thì không cần phải xây dựng biểu đồ tuyến tính giữa mật độ vi sinh vật và giá trị OD.

Phương pháp này cho kết quả nhanh, thường được dùng để theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất, tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật

28

2.6.2.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu. Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thích hợp.

Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy.

Phương pháp này thực hiện như sau:pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên một dĩa petri khoảng 25 – 250. Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức 250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm. Mẫu có thể được cấy bằng kỹ thuật cấy ria hay cấy trải.

Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu. Sao cho các tế bào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc. Kết quả thu được là số trung bình của 2 – 3 đĩa petri với cùng điều kiện nuôi cấy. Kết quả cũng thường được trình bày dưới dạng CFU (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc.

Hình 11. Khuẩn lạc vi khuẩn và dụng cụ đếm khuẩn lạc

Mặc dù có một số nhược điểm song đây vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định số lượng tế bào vi sinh vật. Phương pháp này có độ nhạy cao, nên thường được dùng trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm.

Quy trình chi tiết của phương pháp đếm khuẩn lạc: mẫu được pha loãng theo dãy nồng độ như sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5… Ví dụ: lấy 1ml mẫu, pha vào 9ml dung dịch, pha loãng trộn đều, rồi tiếp tục lấy 1ml của dung dịch 1 cho vào 9ml dung dịch pha loãng ta được dung dịch 2 với độ pha loãng là 10-2.

29

Cứ tiếp tục, sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khi tìm được độ pha loãng thích hợp, cho phương pháp đếm khuẩn lạc.

Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu + 9 phần dung dịch pha loãng cho nên nếu là 0,1ml cần bổ sung 0,9ml dung dịch pha loãng.

Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri

Cách tính kết quả :

Ví dụ: kết quả số khuẩn lạc trung bình từ 2 đĩa petri thu được là 35, độ pha loãng 10-4, số lượng mẫu đưa vào đĩa petri là 0,1ml ta có: 35.10.10000 = 3500000 CFU/ml

Cách biểu diễn kết quả:

- Biểu diễn kết quả phù hợp phương pháp đang áp dụng

- Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.

- Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).

Ví dụ:

- Kết quả 3500000 CFU/ml viết thành 3,5.106 CFU/ml

- Kết quả 3572000 CFU/ml viết thành 3,6. 106 CFU/ml

- Kết quả 3532000 CFU/ml viết thành 3,5. 106 CFU/ml

2.6.3.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẲNG PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) (SỐ CÓ KHẢ NĂNG CAO NHẤT – SCKNCN)

Quy trình định lượng theo phương pháp này như sau:

Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cần xác định với 3 mức nồng độ 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ với thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như:sinh hơi, đổi màu, đục…) ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng MPN/100ml hay số MPN/gam.

Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng.

Bảng. Bảng tra MPN cho loạt 3 ống30

Số ống dương tính

MPN/100 ml

Số ống dương tính

MPN/100 mlSố ml mẫu sử dụng

(ml)Số ml mẫu sử dụng

(ml)10 1 0,1 10 1 0,10 0 0 - 2 0 0 90 0 1 3 2 0 1 140 0 2 6 2 0 2 200 0 3 9 2 0 3 260 1 0 3 2 1 0 150 1 1 6 2 1 1 200 1 2 9 2 1 2 270 1 3 12 2 1 3 340 2 0 6 2 2 0 210 2 1 9 2 2 1 280 2 2 12 2 2 2 350 2 3 16 2 2 3 420 3 0 9 2 3 0 290 3 1 13 2 3 1 360 3 2 16 2 3 2 440 3 3 19 2 3 3 531 0 0 4 3 0 0 231 0 1 7 3 0 1 391 0 2 11 3 0 2 641 0 3 15 3 0 3 951 1 0 7 3 1 0 431 1 1 11 3 1 1 751 1 2 15 3 1 2 1201 1 3 19 3 1 3 1601 2 0 11 3 2 0 931 2 1 15 3 2 1 1501 2 2 20 3 2 2 2101 2 3 24 3 2 3 2901 3 0 16 3 3 0 2401 3 1 20 3 3 1 4601 3 2 24 3 3 2 11001 3 3 29 3 3 3 -

2.6.4. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT MÀNG LỌC

Phương pháp này được dùng để định lượng vi sinh vật trong các mẫu nước với mật độ vi khuẩn thấp. Vì vậy phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật có trong mẫu nước trên màng lọc. Việc xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được. Sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thật có thành phần dinh dưỡng thích hợp. Theo nguyên lý một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật.

Màng lọc có kích thước 0,2 – 0,45 m được chế tạo từ các sợi thủy tinh hay sợi polypropylene.

Ngoài màng lọc thông thường, ngày nay còn dùng màng lọc kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane). Các vạch chia ô làm bằng vật liệu ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc. Số vi sinh vật được tính theo số khuẩn lạc mọc trong các ô.

31

- Từ số các ô vuông có khuẩn lạc suy ra mật độ vsv trong mẫu theo dạng số có xác xuất lớn nhất (MPN): MPN = N. ln(N/(N-x)); trong đó N là tổng số các ô vuông, x là số ô có khuẩn lạc mọc.

Hình 12. Bộ lọc vô trùng và màng lọc

2.6.5. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

Các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men tảo … Có thể định lượng trực tiếp trong buồng đếm hồng cầu qua kính hiển vi. Quy trình đếm trực tiếp cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật trong mẫu. Tuy vậy phương pháp này có các nhược điểm sau:

- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

- Không phân biệt dược tế bào vi sinh vật, các hạt vật thể khác lẫn trong mẫu

- Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.

Có ba phương pháp đếm trực tiếp:

1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu là một dụng cụ bằng thuỷ tinh. Diện tích buồng đếm là 1mm2, chiều cao là 0,1mm. Diện tích 1mm2 được chia làm 400 ô nhỏ và thể tích của 400 ô nhỏ sẽ bằng hoặc 25 ô vuông lớn, tương ứng thể tích của ô vuông lớn là 1/250mm3.

32

Trước khi quan sát cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu. Pha loãng mẫu sao cho trong mỗi ô vuông nhỏ có khoảng 5 – 10 vi sinh vật. Muốn đạt được yêu cầu trên cần phải ước lượng số vi sinh vật trong mẫu, hay phải làm thử một vài lần để xác định được công thức pha loãng tối ưu.

Hình 10. Buồng đếm hồng cầu

Mẫu được pha loãng bằng dung dịch có thành phần:

Thành phần dung dịch pha loãng.

- Pepton 0,1%

- Laurylsulphate 0,1%

- Methyl blue 0,01%

Các dung dịch pha loãng sau khi chuẩn bị phải lọc qua trước khi sử dụng.

Điều chỉnh kính ở độ phóng đại 400 lần rồi tiến hành đếm. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn nằm trên đường chéo của buồng đếm.

Cách tính số vi sinh vật. Gọi x1, x2, x3, x4, x5 là số lượng vi sinh vật trong từng ô lớn ta có :

=

Ta biết thể tích của 1 ô lớn bằng 1/250 mm3

Do đó số lượng tế bào vi sinh vật co trong 1 ml mẫu sẽ là:

Số vi sinh vật (trong 1 ml mẫu) = .250.1000 = .250000

2. Đếm trực tiếp bằng đường đếm Breed

Buồng đếm Breed có diện tích 1cm2 được đánh dấu. Dùng bơm tiêm cho chính xác 0,01ml dung dịch mẩu dàn trên mặt buồng đếm. Sấy khô bằng cách hơ nhẹ trên đèn cồn bằng methyl blue.

Khi đếm phết một lớp dầu trên bề mặt cần đếm. Số lượng vi sinh vật /ml được tính theo công thức:

N/ml=4a.10 4 /d2

a: số lượng tế bào vi sinh vật trong vùng đếm

d: đường kính của vùng đếm

33

3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang

Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như:

- Acridin Cam (AODC)

- 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT)

- Fluoresecin isothio cyanate (FITC)

Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương pháp đếm khuẩn lạc. Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năng phát triển thành khuẩn lạc.

Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật có thật trong mẫu.

2.7. THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật. Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động.

Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính.

Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng. Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinh hoá thường dùng được trình bày trong bảng sau:

Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC

Acinetobacter calcoaceticus

Aci. lwoffi

7844

5886

15308

15306

Aeromonas hydrophila 8049 7966

Alkaligenes faecalis 415 19018

Bacillus cereus

Bac. subtilis

10876

6633

7464

10400

Clostridium histolyticum

Clos. Perfringens

19401

13124

503

8237

Edwardsiella tarda 10396 19547

Enterobacter aerogenes

Ent. cloacae

13048

10005

10006

-

34

Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC

Enterococcus faecalis 29212 -

Escherichia coli 25922 10418

Mycobacterium fortuitum

Myco. kansasii

Myco. phlei

Myco. terrae

10349

10268

8151

10856

6841

14471

19249

15755

Norcadia brazilensis

Nor. otitidicarcaviarum

11274

1934

19296

14629

Proteus mirabilis

Pro. rettgeri

10975

7475

-

-

Pseudomonas aeruginosa 10662

Serratia marcescens 13880 10218

Staphylococcus aureus

Staph. epidermidis

25923

12228

6571

-

Streptococcus agalactiae

Strep. pneumoniae

Strep. salivarius

13813

6303

8681

8181

-

7073

Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật bao gồm như sau:

1. Thử nghiệm khả năng lên men

Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống này sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉ thị màu được bổ sung vào môi trường.

Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red.

2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men

Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp. Phản ứng được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làm chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau.

35

Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là bromothymol blue

3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue.

4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium. Thử nghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màu bromothymol blue.

5. Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2. Phản ứng được nhận diện nhờ sự sủi bọt của giọt H2O2 khi O2

bay lên.

6. Thử nghiệm decarboxylase

Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH môi trường.

7. Thử nghiệm coagulase

Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đông huyết tương.

8. Thử nghiệm urease

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi sinh vật, nhất là nhóm Proteus. Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3

và CO2 làm tăng pH của môi trường.

9. Thử nghiệm gelatinase

Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật.

10. Thử nghiệm khả năng sinh H2S

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase.

11. Thử nghiệm khả năng sinh idol

Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá thành indol. Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu đỏ.

12. Thử nghiệm KIA, TSI36

Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.

13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng.

14. Thử nghiệm oxidase

Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật. Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện của enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương.

15. Thử nghiệm ONPG

Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym b-galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o-nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng.

16. Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môi trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử.

17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của pepton tạo phức đỏ.

18. Thử nghiệm CAMP

Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và b-hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của b-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết)

19. Thử nghiệm tính di động

Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào kích thước của vệt cấy vi sinh vật.

Bộ KIT sinh hoá định danh vi sinh vật

Ngày nay, các thử nghiệm sinh hoá truyền thống để định danh vi sinh vật đã có thể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngoài ra, còn có các bộ KIT cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hoá theo một quy trình hai lựa chọn để

37

định danh vi sinh vật. Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như mỗi bộ KIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn

Hình 24. Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật

CHƯƠNG III

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

1. PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1.1.Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit _ CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.

1.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất

1.2.1.Dụng cụ và thiết bị

Bảng 1.1.. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 1

38

Dụng cụ Thiết bịỐng nghiệm (16 mm) Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmBình tam giác (250 ml) Máy dập mẫu (Stomacher)Ống đong (100 ml) Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Cân phân tíchQue trải pH kếKẹp inox Bể ổn nhiệtĐèn cồn Pipetman (1000, 5000 l)

Lò viba

1.2.2.Môi trường và hóa chất

Bảng 2.2.. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 1

Môi trường Hóa chấtSaline Pepton Water (SPW) Cồn 90o và 70o

Môi trường Cao thịt – pepton HCl 10%plate count agar (PCA) NaOH 10%

1.3.Thực hành

39

1.3.1.Quy trình phân tích

Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

1.3.2.Các bước tiến hành

1. Định lượng mẫu:

Bước 1. Cân 10,0 g (hay 25 g) hay hút 10,0 ml (hay 25 ml) mẫu đưa vào cốc thuỷ tinh vô trùng (nếu là mẫu rắn, phải dập mẫu)

2. Đồng nhất và pha loãng mẫu:

Bước 2. Đổ mẫu vào bình tam giác đã có 90 ml (hay 225 ml) SPW.

Bước 3. Mẫu lỏng thì lắc đều, mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher)

Bước 4. Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng 10-1

Hình 1.1. Kỹ thuật pha loãng

40

Định lượng mẫu10 g hoặc 10 ml

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

Đếm khuẩn lạcChọn đĩa có 25 -250 khuẩn lạc

250 khuẩn lạc

Ủ mẫu30 1 oC trong 72 giờ

Bước 5. Dùng pipetman với đầu tip vô trùng (hay pipet 1ml vô trùng) hút 1ml dịch mẫu 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch SPW để được độ pha loãng 10-2 . Làm tương tự để được các độ pha loãng cao hơn (theo Hình 4.1)

Bước 6. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay.

3. Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa petri:

Bước 7. Chọn các độ pha loãng thích hợp (dự kiến có 25 - 250 TB vi khuẩn/1ml mẫu). Đối với mẫu lạ, không ước đoán được lượng vi sinh vật nhiều hay ít phải cấy nhiều nồng độ pha loãng từ thấp đến cao.

Bước 8. Dùng pipetman hút 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi độ pha loãng 02 đĩa)

Bước 9. Đổ vào mỗi đĩa petri 15 - 20 ml môi trường

Bước10. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ 3 - 5 lần.

4. Ủ mẫu:

Bước11. Đặt các đĩa trên bề mặt ngang cho thạch đông lại. Lật ngược và ủ trong tủ ấm 30 1 oC trong 72 giờ.

5. Đếm khuẩn lạc

Bước 12. Chọn các đĩa có 25 - 250 khuẩn lạc đếm.

1.3.3.Kết quả

Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trên 1 g mẫu được tính như sau:

Trong đó: A là số tế bào vi khuẩn /1g mẫu

N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn

ni là số lượng đĩa cấy tại một độ pha loãng

V là thể tích dịch cấy vào petri

fi là độ pha loãng tương ứng

Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo quản 3 ngày ở 10 oC. Kết quả:

Độ pha loãng (fi) 10-3 10-4

Đĩa số 1 (n1) 224 20Đĩa số 2 (n2) 235 26

Áp dụng công thức, ta có kết quả:

Các kết quả của tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân.

41

Petri có > 250 khuẩn lạc Petri có 25 – 250 khuẩn lạc Petri < 25 khuẩn lạc Petri có khuẩn lạc mọc loang

Hình 1.2. Số khuẩn lạc đếm trên đĩa Petri

Trường hợp khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một khuẩn lạc.

Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ 10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g.

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g.

1.4.Câu hỏi ôn tập1. Taïi sao moâi tröôøng nuoâi caáy toång vi khuaån hieáu khí ñöôïc coi laø moâi tröôøng dinh döôõng?2. Keå teân moät soá thöông hieäu moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät maø em bieát?

2. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MỐC

2.1.Nguyên tắc phân tích tổng số nấm men – nấm mốc

Mật độ nấm men và nấm mốc được xác định dưới dạng tổng nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)…. Mỗi một khuẩn lạc được phát triển từ một tế bào hay bào tử.



42

Hình 2.1. Nấm men và nấm mốc (DRBC)

Bảng 2.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 2Dụng cụ Thiết bị

Ống nghiệm (18 mm) Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmBình tam giác (250 ml) Máy dập mẫu (Stomacher)Ống đong (100 ml) Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Cân phân tích (4 số lẻ)Que trải pH kếĐèn cồn Pipetman (1000, 5000 l)

Lò viba

2.2.2Môi trường và hóa chất

Bảng 2.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 2

Môi trường Hóa chấtSaline Pepton Water (SPW) Cồn 90o và 70o

DG18 HCl 10%DRBC NaOH 10%

2.3.Thực hành


Sơ đồ quy trình định lượng tổng số nấm men - nấm mốc

2.3.2.Các bước thực hiệnBước 1. Định lượng mẫu 10 g hay 10 ml bằng cân kỹ thuật độ chính xác 0,01 g

43

Định lượng mẫu10 g hoặc 10 ml

Đồng nhất và pha loãng mẫu trong dung dịch SPW

Trải 0,1 ml dung dịch mẫu lên môi trường DRBC

Đếm khuẩn lạcChọn đĩa có 25 - 250 khuẩn lạc

Ủ mẫu30 1 oC trong 3 – 7 ngày

Bước 2. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (mẫu dạng mềm) hay xay mẫu (mẫu dạng cứng, dai). Sau đó pha loãng theo cấp 10-n.

Bước 3. Chọn độ pha loãng phù hợp và hút 0,1 ml dịch VSV trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.

Bước 4. Ủ mẫu 30 oC từ 3 – 7 ngày.Bước 5. Chọn đếm đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc.2.3.3. Tính kết quảTương tự cách tính tổng số vi khuẩn hiếu khí.

2.4. Caâu hoûi thảo luận1. Em cho bieát ngoaøi moâi tröôøng DRBC, caùc moâi tröôøng naøo khaùc ñöôïc söû duïng ñeå nuoâi caáy toång soá naám men, naám moác?2 .Taïi sao ña soá caùc vi khuaån khoâng moïc ñöôïc trong moâi tröôøng nuoâi caáy DRBC?

44

3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC

XUẤT LỚN NHẤT (MPN)

3.1.Nguyên tắcPhương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh Lauryl Sulphate Broth (LSB) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng canh Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) và ủ ấm ở 37oC/24-48 giờ.Phương pháp MPN là phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại có ống Duharm. Theo dõi sự đục môi trường và sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.3.2.Dụng cụ, môi trường, hóa chất và thiết bị3.2.1.Dụng cụ và thiết bị

Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 3

Dụng cụ Thiết bịTúi dập mẫu Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đèn cồn Cân kỹ thuậtỐng nghiệmPipette 1 ml, 10 ml

3.2.2.Môi trường và hóa chấtBảng 3.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 3

Môi trường Hóa chấtDung dòch Saline Peptone Water (SPW)

Cồn 90o và 70o

Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 10%Môi trường BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Salt)

NaOH 10%

45

3.3.Thực hành


3.3.2.Các bước thực hiện Bước 1. Cân 10 g mẫu cho vào túi dập mẫu (loại túi dùng cho Stomacher). Đổ 90 ml

dung dịch SPW đã vô trùng vào và đồng nhất mẫu trong 1 phút. Bước 2. Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 ( ví dụ dùng loạt pha loãng liên

tiếp 10-1 , 10-2 , 10-3) vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB, mỗi ống nghiệm cho 1 ống Durham. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2, 10-3.

Bước 3. Ủ ở 37oC trong 48 giờ.Bước 4. Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống LSB (+)Bước 5. Cấy chuyền 1 ml từ các ống LSB (+) sang canh trường BGBL.Bước 6. Ủ ở 37oC trong 48 giờBước 7. Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống BGBL (+)3.3.3.Kết quảDựa vào số ống BGBL (+) tra bảng MPN, suy ra số lượng coliform tổng

46

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LBS, mỗi nồng độ 3 ống

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Chuyển 1 ml dung dịch pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm có 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 1 oC, 48 giờ

Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh BGBL, ủ 37 1 oC, 48 giờ

Ghi nhận ống BGBL (+) ở mỗi độ loãng

Tra bảng MPN suy ra số Coliform tổng

3.4.Câu hỏi thảo luận1.Trong Coliforms tổng có các giống vi sinh vật nào?2. Nêu nguyên tắc của phương pháp MPN? Viết tắt của MPN?3. Nêu vai trò của các thành phần trong môi trường LSB và BGB

4.ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN4.1.Nguyên tắc

Töø Coliforms ñöôïc Blachstein söû duïng ñaàu tieân vaøo naêm 1893 ñeå noùi veà nhöõng vi khuaån Bacilli coù ñaëc ñieåm hình thaùi gioáng E. coli.

Coliforms toång coäng laø nhöõng tröïc khuaån ñöôøng ruoät, gram (-), khoâng sinh baøo töû, hieáu khí hoaëc kò khí tuøy tieän, coù khaû naêng leân men lactose sinh acid vaø sinh hôi ôû35oC - 37oC trong 24-48 giôø. Nhoùm Coliforms hieän dieän roäng raõi trong töï nhieân, trong ruoät ngöôøi, ñoäng vaät. Soá löôïng Coliforms trong maãu ñöôïc duøng ñeå chæ thò khaû naêng hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc, maëc duø ñieàu naøy coøn nhieàu tranh caõi. Nhoùm Coliforms goàm boán gioáng laø: Escherichia vôùi moät loaøi duy nhaát laø E. coli; Citrobacter; Klebsiella vaø Enterobacter.

Coliforms chòu nhieät laø nhöõng Coliforms coù khaû naêng leân men lactose sinh hôi khi uû ôû 44oC/24h trong moâi tröôøng EC.

Coliforms phaân (Faecal Coliforms hay E. coli giaû ñònh) laø Coliforms chòu nhieät coù khaû naêng sinh indole khi uû ôû 44.5oC/24h trong tryptone.

Escherichia coli laàn ñaàu tieân ñöôïc Escherich phaân laäp töø phaân ngöôøi vaøo naêm 1855. Ñaây laø vi khuaån ñöôïc chuù yù nhieàu vaø nghieân cöùu kyõ löôõng nhaát. Chuùng cö truù ôû ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät maùu noùng. Chuùng coù theå laø vi khuaån gaây beänh cô hoäi. E. coli laø vi sinh vaät chæ thò tieâu bieåu nhaát. Söï coù maët cuõng nhö soá löôïng cuûa chuùng chæ ra möùc ñoä veä sinh trong quaù trình cheá bieán, baûo quaûn, vaän chuyeån thöïc phaåm, nöôùc uoáng cuõng nhö söï oâ nhieãm phaân trong moâi tröôøng. Töø naêm 1982 ñaõ phaùt hieän thaáy 4 loaøi E. coli coù khaû naêng gaây beänh coù nguoàn goác thöïc phaåm (Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC; Enteroinvasive- EIEC; Enterotoxigenic – ETEC, trong ñoù coù chuûng O157:H7). Baøi thöïc haønh naøy chæ giôùi haïn ôû vieäc xaùc ñònh E. coli nhö moät vi sinh vaät chæ thò thöïc phaåm.

Phöông phaùp phaân tích trong baøi naøy ñöôïc döïa treân quy trình MPN baèng söû duïng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vaøo test ñoaùn chöøng (presumptive test), sau ñoù duøng canh thang BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) vaø uû aám ôû

47

37oC/24-48 h (ñeå kieåm tra Coliforms). Tieáp theo chuyeån sang moâi tröôøng canh EC (E. coli medium) uû ôû 44.5oC ñeå kieåm tra Coliforms chòu nhieät. Sau ñoù xaùc ñònh Coliforms phaân (E. coli giaû ñònh) baèng caùch caáy sang moâi tröôøng EMB (Eosine Methylene Blue Agar), choïn khuaån laïc ñieån hình vaø thöû khaû naêng sinh Indol (I). Ñeå xaùc ñònh E. coli caàn thöû ba phaûn öùng sinh hoùa tieáp theo laø Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) vaø Citrate (iC). E. coli laø Coliforms phaân vaø cho keát quaû thöû nghieäm IMViC laø + + - -.

4.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường, hóa chất 4.2.1.Dụng cụ và thiết bị


Dụng cụ Thiết bịTúi dập mẫu Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Máy dập mẫu (Stomacher)Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đèn cồn Cân kỹ thuậtỐng nghiệmMicropipet

4.2.2.Môi trường và hóa chấtBảng 4.2.. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 4

Môi trường Hóa chấtDung dòch Saline Pepton Water(SPW)

Cồn 90o và 70o

Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 20%Môi trường BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Salt)

NaOH 20%

Moâi tröôøng Tryptic Soya Agar (TSA)

Thuốc thử Kovac’s

Moâi tröôøng EMB (Eosine Methylen Blue agar)/ Endo

Thuốc thử Metyl Red

Moâi tröôøng MRVP (Metyl Red Voges Prokauer

Dd creatine 0,5 %

Moâi tröôøng thaïch Simons Citrat

Dung dòch - naphtol 5%

Moâi tröôøng Trypton Water (TW)

KOH 40%

48

Thuoác thöû Kovac

HCl 10%

NaOH 10%

4.3.Thực hành4.3.1.Quy trình phân tích

49

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Chuyển 1 ml dung dịch pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm có 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 1 oC, 48 giờ

Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh EC, ủ 44,5 0,2 oC, 24giờ

Ghi nhận số ống (+) ở mỗi độ loãng

Cấy lên thạch EMB, ủ 37 1 oC, 24 giờ

Choïn khuaån laïc deït, hình dĩa, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính ≥ 1mm ñeå caáy sang TSA/BHI, ủ 37 1 oC, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

4.3.2.Các bước thực hiện Bước 1.Cân 10 g mẫu cho vào túi dập mẫu (loại túi dùng cho Stomacher). Đổ 90 ml dung dịch SPW đã vô trùng vào và đồng nhất mẫu trong 1 phút. Bước 2.Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 ( ví dụ dùng loạt pha loãng liên tiếp 10-1 , 10-2 , 10-3) vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB, mỗi ống nghiệm cho 1 ống Durham. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-

2, 10-3. Ủ ở 37oC trong 48 giờ.Bước 3.Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống LSB (+)Bước 4.Cấy chuyền 1 ml từ các ống LSB (+) sang canh trường EC. Ủ 44,5 0,2oC, 24giờ. Bước 5.Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống EC (+)

Bước 6.Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB/ Endo . Ủ các đĩa 37oC, 24giờ.

Nhaân daïng khuaån laïc E.coli:

- Treân moâi tröôøng EMB: khuaån laïc maøu tím, aùnh kim, troøn, bôø ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm

- Treân moâi tröôøng Endo: Khuaån laïc maøu ñoû, aùnh kim, troøn, bôø ñeàu, ñöôøng kính khoaûng 1mm

Bước 7. Chọn khuẩn lạc E.coli giả định trên EMB/Endo cấy vào TSA/BHI, ủ qua đêm

50

Đếm số canh EC (+) và IMViC(++--), tra bảng MPN

E.coli

Hình 4.2 : E.coli trên môi trường EMBHình 4.1 : Các ống EC (+)

Bước 8.Cấy chuyển từ môi trường TSA/BHI vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa Trypton broth, MR- VP, SC. Ủ 44,5 0,2 oC, 24giờ.

Bước 9. Thöû phaûn öùng sinh hoùa .Thử nghiệm IMViC

Phaûn öùng Indol: Caáy khuaån laïc nghi ngôø vaøo oáng nghieäm chöùa 5ml Trypton broth, uû 370C trong 24giôø. Cho theâm 0,5ml thuoác thöû Kovac baèng caùch cho chaûy doïc theo thaønh oáng nghieäm

+ Moâi tröôøng chuyeån maøu ñoû: indol (+)

+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu: indol (-)

Phaûn öùng MR (metyl red): Caáy khuaån laïc nghi ngôø vaøo 2 oáng nghieäm, moãi oáng chöùa 5ml moâi tröôøng MRVP ñeå ôû 370C töø 48 – 96 giôø. Moät oáng thöû phaûn öùng Methyl red, moät oáng thöû phaûn öùng VP.

Cho vaøo moät oáng nghieäm vaøi gioït metyl red ôû pH trung tính hoaëc kieàm yeáu

+ Moâi tröôøng chuyeån maøu ñoû: MR (+)

+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu: MR (-)

Phaûn öùng VP (Voges Proskauer) Cho vaøo oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng MRVP coøn laïi khoaûng 0,6ml dung dòch - naphtol vaø 0,2ml dung dòch kalihydroxyt 40%, laéc ñeàu, ñeå yeân trong 2h.

+ Moâi tröôøng ñoåi sang maøu ñoû eosin hoaëc coù veät ñoû eosin phaùt trieån trong voøng 15 phuùt : VP (+)

+ Moâi tröôøng khoâng chuyeån maøu ñoû: VP (-)

Phaûn öùng citrat : Caáy ria khuaån laïc nghi ngôø leân maët nghieâng cuûa moâi tröôøng simon citrat, ñeå ôû 370C trong 24h.

+ Moâi tröôøng ñoåi maøu luïc sang xanh döông vaø coù khuaån laïc: citrat (+)

+ Moâi tröôøng khoâng ñoåi maøu, khoâng moïc khuaån laïc: citrat (-)

4.3.3.Kết quả

Ống nghiệm cho kết quả EC (+), và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC (++-- ) là ống nghiệm có E.coli (+). Từ số lượng các ống có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu tra bảng MPN để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml

51

Hình 4.3. Phản ứng citrat

5. ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

5.1.Nguyên tắc

Salmonella ñöôïc phaùt hieän töø 1880, ñaïi ña soá laø vi khuaån gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm vaø gaây beänh (soát thöông haøn). Salmonella thuoäc hoï Enterobacteriaceae, tröïc truøng gram aâm, hoâ haáp tuøy tieän, coù khaû naêng di ñoäng, khoâng taïo baøo töû, leân men glucose vaø mannitol sinh acid nhöng khoâng leân men saccharose vaø lactose, khoâng sinh indole, khoâng phaân giaûi urea, khoâng coù khaû naêng taùch nhoùm amine töø tryptophane, haàu heát caùc chuûng ñeàu sinh H2S. Caùc loaïi thöïc phaåm ñeàu yeâu caàu phaûi kieåm nghieäm Salmonella vôùi tieâu chuaån khoâng phaùt hieän/25 g(ml)

Nhö vaäy vieäc xaùc ñònh thoâng thöôøng chæ döøng ôû möùc ñoä ñònh tính, teân chuûng chæ ñöôïc xaùc ñònh trong nhöõng tröôøng hôïp quan troïng. Caàn löu yù Salmonella laø nhoùm chöùa caùc doøng gaây beänh nguy hieåm, do vaäy caàn tuaân thuû trieät ñeå caùc bieän phaùp an toaøn khi laøm vieäc vôùi caùc chuûng ñoái chöùng (+) cuõng nhö khi thao taùc treân caùc chuûng phaân laäp ñöôïc. Caùc moâi tröôøng hay maãu vaät sau khi nuoâi caáy caàn phaûi haáp khöû truøng caån thaän tröôùc khi röûa. Do trong thöïc phaåm Salmonella thöôøng toàn taïi ôû soá löôïng ít, teá baøo coù theå bò toån thöông do ñoù quy trình xeùt nghieäm thoâng thöôøng goàm 4 böôùc: taêng sinh, taêng sinh choïn loïc, phaân laäp vaø khaúng ñònh.

5.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất

5.2.1..Dụng cụ và thiết bị


Dụng cụ Thiết bịỐng nghiệm Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Que trang, que cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đèn cồn Cân phân tíchPipette 1 ml, 10 ml Lò viba

52

Hình 5.1. Salmonella

5.2.2.Môi trường và hóa chấtBảng 5.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu5

Môi trường Hóa chấtDung dòch Buffered Peptone Water (BPW)

Cồn 90o và 70o

Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) Dd creatine 0,5 %Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Dung dòch - naphtol 5%Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%Môi trường Hektoen Entric Agar (HE) Thuoác thöû KovacMoâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA)

HCl 10%

Moâi tröôøng Lysine Decacboxylase broth (LDC)

NaOH 10%

Moâi tröôøng KIA hoaëc TSI


53

Phaân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…


lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:- KIA/TSI: đỏ/vàng, có /không H2S, sinh hơi/không- Urea (-), Indol (-), VP (-)- LDC (+),ONPG (-)

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHI hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37 oC

5

Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: ( ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA,OMB)

Cấy 1 ml canh khuẩn BPW sang RV, ủ 42 oC, 18 -24 g; và sang Selenit cystein/TT ,ủ 370C /24g

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml dung dịch BPW

Ủ 37 oC, 18 – 24 giờ

Salmonella dương tính/âm tính trên 25g(ml) thực phẩm

5.3.2.Các bước tiến hànhBước 1. Tăng sinh

- Caân 25g maãu ñaõ nghieàn, hoặc hút 25 ml mẫu cho vaøo bình ñaõ chöùa saün 225ml moâi tröôøng BPW, laéc ñeàu ñeå ôû 370C trong 24 giờ.Bước 2. Tăng sinh chọn lọc

- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng RV, nuoâi trong 24 giờ ôû 42oC.

- Huùt 1ml canh khuaån BPW sang moâi tröôøng Selenit-cystin/TT, nuoâi trong 24 giờ ôû 37oC.

Bước 3. Phân lập và nhận diện- Duøng que caáy voøng caáy ria canh tröôøng töø moâi

tröôøng taêng sinh chọn lọc leân ñóa petri chöùa moâi tröôøng phaân laäp. Caàn caáy thöa ñeå taïo khuaån laïc rieâng bieät. Ñeå ôû 370C trong 24 giờ. Treân caùc moâi tröôøng phaân laäp. Treân moâi tröôøng XLD, Salmonella taïo caùc khuaån laïc ñoû hoàng, coù hoaëc khoâng coù taâm ñen. Treân moâi tröôøng HE khuaån laïc Salmonella ñieån hình coù maøu xanh lam, coù hoaëc khoâng coù taâm ñen

\

Bước 4. Thử phản ứng sinh hóa

54

Hình 5.2. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD (trái), HE (phải)

Thử

nghiệm TSI/KIA):Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.Caáy ñaâm saâu phaàn coät thaïch vaø caáy ria leân phaàn thaïch nghieâng vi khuaån töø nhöõng khuaån laïc ñieån hình/nghi ngôø leân oáng thaïch nghieâng chöùa moâi tröôøng KIAø. Ủ ôû 370C trong 24 giờ.

Dieãn giaûi söï bieán ñoåi moâi tröôøng nhö sau:Coät thaïch:

- Maøu vaøng: glucose döông tính (leân men glucose)- Maøu ñoû hoaëc khoâng ñoåi maøu: glucose aâm tính (khoâng

leân men glucose)- Maøu ñen: coù taïo thaønh sunfua hidro- Coù boït khí hoaëc coù veát nöùt : sinh khí töø glucose

Beà maët thaïch nghieâng:- Maøu vaøng: lactose/saccharose döông tính (coù söû duïng

lactose/saccharose)- Maøu ñoû hoaëc khoâng ñoåi maøu: lactose/saccharose aâm

tính

Thử nghiệm LDCLấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên môi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờTreân moâi tröôøng LDC, Salmonella phaùt trieån seõ laøm ñuïc vaø chuyeån maøu moâi tröôøng sang tím hay ñoû tía[LDC (+)], LDC (-) khi moâi tröôøng coù maøu vaøng.

Thử nghiệm urea

55

1. Không có VSV2. Lên men lactose và glucose (môi trường màu vàng)3. Sinh khí4. Chỉ lên men lactose (đỏ trên bề mặt, vàng ở dưới )5. Khử lưu huỳnh, sinh H2S (có màu đen)

Hình 5.3. Thử nghiệm KIA

Hình 5.6.Thử nghiệm indol

Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ bản có bổ sung urea. Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím.

Thử nghiệm VPHòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02 giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm 02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vòng 15 phút là phản ứng dương tínhSalmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Thử nghiệm indolCấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường TW, nuôi 37oC ± trong 24 giờ. Sau nuôi, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs. Phản ứng dương tính khi có vòng đỏ trên bề mặt môi trường.

Thử nghiệm β-galactosidase Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có 0,25ml nước muối 0,85%, thả một đĩa giấy ONPG vào ống nghiệm, đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 ± 1 oC, để yên vài phút, đọc kết quả. Phản ứng dương tính đổi màu môi trường sang vàng

Thử nghiệm kháng huyết thanh

+ Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng;Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý lên một phiến kính đã rửa sạch. Dàn đều khuẩn lạc cần thử nghiệm trong giọt dung dịch sao cho thu được một thể huyền phù đục đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính trong 30-60 giây. Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất nên dùng kính lúp.

56

VP (-) VP (+)

Urea (-) Urea (+) Hình5.4. Thử nghiệm Urea

Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có kết dính thì chủng này được coi là tự kết dính và không cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên không thể thực hiện được.

+ Kiểm tra kháng nguyên O: Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự kết dính ở trên, bằng cách thay một giọt kháng huyết thanh O thay cho dung dịch nước muối. Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính. Sử dụng tuần tự một kháng huyết thanh đa giá và đơn giá.

+ Kiểm tra kháng nguyên Vi: Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự kết dính bằng cách thay một giọt huyết thanh Vi thay cho dung dịch nước muối. Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.

+ Kiểm tra kháng nguyên H: Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự dính kết thuần khiết lên thạch dinh dưỡng thể nữa đặc (phần dính kèm), ủ ấm 18-24 giờ, 371oC.

Dùng giống này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự dính kết, nhưng sử dụng một giọt kháng huyết thanh H thay cho dung dịch nước muối sinh lý. Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính. LƯU ÝCó thể sử dụng kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB để phát hiện sự có mặt của

các kháng nguyên Salmonella. Trên 98% các chủng Salmonella cho phản ứng ngưng kết với một trong hai kháng huyết thanh OMA, OMB. Do vậy khi thấy có sự dính kết với một trong hai kháng huyết thanh đa giá trên có thể kết luận là Salmonella. 5.3.4.Kết quả

Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu

5.4.Câu hỏi ôn tập1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Salmonella2. Vai trò của môi trường tăng sinh BPW ?4. Môi trường tăng sinh chọn lọc dùng trong quy trình phân tích Salmonella là gì?5. Vai trò của môi trường tăng sinh chọn lọc?6. Giải thích tại sao khuẩn lạc Salmonella có thể có tâm đen?

57

7. Trình bày các phản ứng sinh hóa dùng trong phân tích Salmonella: tên môi trường, hóa chất, kết quả, giải thích kết quả.

6. PHÂN TÍCH STAPHYLOCOCCUS AUREUS ( PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC)

6.1.Nguyên tắcStaphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm có khả năng lên men và sinh acid từ succrose, mannitol và sinh sắc tố vàng, chịu mặn (7,5% NaCl). và có khả năng đông tụ huyết tương (phản ứng coagulase (+)). Staphylococcus aueus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng trên môi trường Baird Parker Agar bằng kỹ thuật hộp trải và phản ứng làm đông huyết tương. Dựa vào số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase (+) suy ra mật độ vi khuẩn này trong thực phẩm. 6.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất6.2.1. Dụng cụ và thiết bị


Dụng cụ Thiết bịPhieán kính, laù kinh Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)Đèn cồn Cân phân tíchỐng nghiệm

6.2.2. Môi trường và hóa chấtBảng 6.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 6

Môi trường Hóa chấtDung dòch Saline Peptone Water (SPW)

Cồn 90o và 70o

Moâi tröôøng Baird-Parker HCl 10%Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA)

NaOH 10%

58

Hình 6.1. Sta. aureus trên BPA

Brain heart broth (BHI) KH2PO4

Huyết tương thỏ


6.3.2.Các bước tiến hành

Bước 1. Pha loãng mẫu theo nồng độ pha loãng thập phân: Cân/hút 10g/10ml mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị vào chai/bình tam giác có chứa sẵn 90ml dung dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha loãng 10-1

Bước 2. Chuyển 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm tương tự, thu được mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4....

Bước 3. Chuyển 0,1 ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ pha loãng thu được vào chính giữa đĩa môi trường BPA đã được chuẩn bị trước (bề mặt các đĩa môi trường này không được ướt), dùng que trang trải đều mẫu trên mặt thạch. Cấy vào 2 đĩa mỗi nồng độ.

Lưu ý: Nếu số lượng Staphylococcus aureus dương tính thấp, có thể nâng nồng độ dịch mẫu lên 10 lần, nghĩa là cấy 1ml dịch mẫu sơ khởi (mẫu nguyên nếu là chất lỏng, hoặc mẫu 10-1 nếu là chất rắn) vào 3 đĩa. Kết quả ở 3 đĩa này được xử lý gộp như một đĩa khi đọc, khẳng định và báo cáo kết quả

59

Mẫu thử đã pha loãng (10-1, 10-2, 10-3...)


lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Canh BHI/thạch TSA(37,0 ± 1,0oC, 24 giờ)

Baird-Parker (37,0 ± 1,0oC; 24 – 48 giờ)Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng, 5 khuẩn lạc không đặc trưng

5

Phản ứng coagulase (37,0 ± 1,00C)(0,1ml dịch BHI; 0,3 ml huyết tương thỏ)

Đồng nhất mẫu30 giây

Định lượng 10 g hoặc 10 ml mẫu thực phẩmtrong dung dịch SPW

Bước 4. Lật ngược các đĩa và ủ 37,0 ± 1,00C trong 24 ± 3 và 48 ± 4 giờ

Bước 5. Sau 24 ± 3 giờ, trên môi trường thạch Bair parker khuẩn lạc Staphylococcus aureus dương tính có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa. Sau 48 ± 4 giờ, khuẩn lạc Staphylococcus aureus dương tính có đường kính 1,5-2,0mm, màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng, trong rộng 2-4 mm. Ngoài ra còn có các khuẩn lạc không tạo vầng sáng bao quanh, không tạo vùng đục sát khuẩn lạc, đó là các khuẩn lạc không điển hình. Các khuẩn lạc không điển hình này cũng được đánh dấu ở mặt sau của đĩa.

Bước 6. Cấy chuyển 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ Baird Parker Agar sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trường BHI. Ủ 37,0 ± 1,0oC trong 24 ± 3 giờ.

Bước 7. Chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường BHI vào 0,3 ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất) trong các ống nghiệm nhỏ đã tiệt trùng có kích thước 10mm x 75mm, để tủ ấm 37,0 ± 1,0oC. Chú ý làm mẫu blank( mẫu chứng). Kiểm tra sự đông vón của huyết tương sau 4, 6, 8, 24giờ. Phản ứng làm đông tụ huyết tương được coi là dương tính khi thể tích đông vón chiếm 3/4 toàn bộ thể tích chọn lựa

6.3.4.Keát quaûMaät ñoä Staphylococcus aureus trong 1g maãu (CFU/g) =

Trong đó: - F1 và F2 : 2 độ pha loãng liên tiếp- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2

- Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha loãng F1, F2

- Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng

- Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng

6.4. Câu hỏi ôn tập1. Tại sao phải bổ sung Egg Yolk Tellurite emulsion vào môi trường BPA cơ bản?2. Môi trường BHI có vai trò gì trong quy trình phân tích Staphylococcua aureus?3. Hãy nêu hình thái khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcua aureus trên BPA.4. Giải thích tại sao Staphylococcua aureus có khả năng đông tụ huyết tương thỏ

7. KIEÅM TRA VI KHUAÅN BACILLUS CEREUS7.1. Nguyeân taéc:

60

Hình 6.2. Đông tụ huyết tương thỏ

B.cereus laø nhöõng tröïc khuaån, Gram döông, hieáu khí, kî khí tuøy yù, di ñoäng, taïo noäi baøo töû, leân men glucose sinh hôi, phaûn öùng VP(+). Coù khaû naêng söû duïng nitrat. B.cereus coù theå tieát ra hai loaïi ñoäc toá chính laø diarrhoeal toxin gaây tieâu chaûy vaø emetic toxin gaây noân möûa.

Loaøi naøy taêng tröôûng ñöôïc trong khoaûng nhieät ñoä töû 5-500C, toái öu ôû 35-400C, pH dao ñoäng töø 4,5-9,3, deã taïo baøo töû vaø baøo töû naûy maàm raát deã daøng. Treân moâi tröôøng choïn loïc loaøi naøy taïo khuaån laïc raát to, moïc lan, rìa nhaên. Vi khuaån naøy hieän dieän trong ñaát, buïi, caùc loaïi thöïc phaåm (söõa, thòt, rau quaû, hoãn hôïp gia vò, saûn phaåm khoâ...).

B.cereus ñöôïc phaùt hieän vaø ñònh löôïng baèng moâi tröôøng thaïch choïn loïc Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoaëc Cereus Selective Agar (Mossel). Khuaån laïc B.cereus coù hình thaùi ñaëc tröng treân caùc moâi tröôøng naøy. Caùc khuaån laïc naøy ñöôïc tieáp tuïc khaúng ñònh döïa treân caùc thöû nghieäm sinh hoùa vaø caùc ñaëc ñieåm nhö leân men glucose sinh acid trong ñieàu kieän kî khí, khöû nitrat thaønh nitrit, thöû nghieäm VP(+), thuûy phaân L-tyrosine, taêng tröôûng ñöôïc trong 0,001% lysozym


7.2.1.Dụng cụ và thiết bịBảng 7.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 7

Dụng cụ Thiết bịỐng nghiệm Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer)Kẹp inox Cân kỹ thuậtĐèn cồn Lò vibaPipette 1 ml, 10 ml


Môi trường Hóa chấtNước đệm Salin Pepton Water (SPW) / Buffered Petone Water (BPW)

Cồn 90o và 70o

61

Dd creatine 0,5 %Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) /Cereus Selective Agar (Mossel)

Dung dòch - naphtol 5%

Nhũ lòng đỏ trứng (EGG YOLK Emulsion),50% KOH 40%Canh Phenol Red Glucose

Thạch Tyrosine HCl 20%Canh Lysozyme NaOH 20%Môi trường MRVP Griess – Ilowvay’s reagentMANNITOL MOBILITY NITRATE Bụi kẽmThạch dinh dưỡng Nutrient Agar/ Tryptic

Soya Agar (TSA) Hóa chất nhuộm Gram

Nutrient broth polymyxin B 0,1%Tyrosine 5%, lysozyme 0,1%


7.3.2. Các bước thực hiện

Bước 1.Pha loãng mẫu

Maãu ñöa veà phoøng thí nghieäm, môû ra cho vaøo khay voâ truøng. Duøng keùo vaø keïp voâ truøng laáy ñaïi dieän 10g maãu cho vaøo bao PE voâ truøng trong ñieàu kieän voâ truøng. Maãu

62

10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10-1 Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-210-310-4

......

Cấy trải 0,1ml mẫu lên môi trường MYP, ủ 300C, 24-48 giờ

Cấy 05 khuẩn lạc nghi ngờ lên TSA, ủ 300C qua đêm

Thử sinh hóa các khuẩn lạc nghi ngờ:Thử khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (+),thử VP(+), thử lên men glucose(+), thử nghiệm tyrosin(+), thử nghiệm Lysozyme(+)

ñöôïc ñoàng nhaát vôùi 90ml dung dòch ñeäm phosphat baèng maùy daäp maãu ñeå coù dung dòch pha loaõng 10-1.

Duøng pipet voâ truøng huùt 1ml dung dòch pha loaõng 10-1

sang oáng nghieäm chöùa 9ml dung dòch ñeäm phosphat ñeå ñöôïc dung dòch pha loaõng 10-2. Tuøy theo möùc ñoä nhieãm baån cuûa maãu maø tieán haønh pha loaõng ôû caùc ñoä pha loaõng cao hôn.

Bước 2. Caáy maãu leân moâi tröôøng MYP

Choïn 2 noàng ñoä pha loaõng thích hôïp, huùt 0,1ml dòch pha loaõng vaøo moãi ñóa MYP (moãi noàng ñoä 2 ñóa). Duøng que gaït traûi caån thaän chaát nuoâi caøng nhanh caøng toát. UÛ 30oC, 24 – 48 giôø.

Bước 3. Khaúng ñònh Bacillus cereus baèng caùc phaûn öùng sinh hoùa

Choïn vaø ñeám caùc ñóa coù töø 15 – 150 khuaån laïc ñaëc tröng cuûa Bacillus aureus (deït, ñöôøng kính 2 – 3mm, bôø hình raêng cöa, maøu ñoû hoàng, xung quanh coù voøng ñuïc). Chuyeån 5 khuaån laïc nghi ngôø naøy leân moâi tröôøng phuïc hoài TSA , uû ôû 30oC qua ñeâm tröôùc khi tieán haønh caùc thöû nghieäm sinh hoaù.

- Thöû nghieäm khaû naêng leân men glucose : caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng canh glucose, uû 35oC trong 24 giôø. Bacillus cereus cho phaûn öùng döông tính laøm ñoåi maøu moâi tröôøng töø ñoû sang vaøng.

- Thöû nghieäm khaû naêng chuyeån hoùa nitrat thaønh nitrit : caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng nitrat, uû ôû 35oC trong 24 giôø. Bacillus cereus coù phaûn öùng döông tính neân sau khi nhoû thuoác thöû vaøo canh khuaån chuyeån sang maøu đoû cam trong 10 phuùt.

- Thöû nghieäm Voges – proskauer : caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang moâi tröôøng canh MR - VP, uû ôû 35oC trong 48 giôø. Bacillus cereus cho phaûn öùng döông tính: moâi tröôøng chuyeån sang maøu hoàng khi cho thuoác thöû -Naphthol vaøo (tröôùc khi nhoû -Naphthol vaøo phaûi laøm kieàm hoùa moâi tröôøng nuoâi caáy baèng KOH 40%).

63

Hình 7.1. Bacillus aureus trên MYP

- Thöû nghieäm Tyrosin: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang oáng thaïch nghieâng Tyrosin, uû 35oC trong 48 giôø. Khuaån laïc Bacillus phaân huûy tyrosin taïo khoaûng trong xung quanh khuaån laïc.

- Thöû nghieäm Lysozyme: caáy vi khuaån töø moâi tröôøng TSA sang oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng Nutrient Broth vôùi 0,001% lysozyme, uû 35oC trong 24 giôø. Bacillus phaùt trieån laøm moâi tröôøng ñuïc ñeàu.

7.3.3. Đọc keát quaû:

Soá Bacillus cereus treân 1g maãu =

N: toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc

n: soá löôïng ñóa ñeám

f: ñoä pha loaõng töông öùng

V: theå tích dòch maãu caáy vaøo trong moãi ñóa

R: tæ leä xaùc nhaän = tæ leä giöõa soá khuaån laïc nghi ngôø cho thöû nghieäm döông tính so vôùi soá khuaån laïc nghi ngôø.

8. KIEÅM TRA VI KHUAÅN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

64

8.1.Nguyeân taéc:

Gioáng Clostridium laø caùc vi khuaån Gram döông, hình que, kî khí, sinh baøo töû, phaàn lôùn di ñoäng. Clostridium perfringens laø loaøi kî khí khoâng baét buoäc, taïo caùc khuaån laïc maøu ñen trong moâi tröôøng phaân laäp quy ñònhClostridium perfringens là vi khuẩn chỉ sự ô nhiễm do phân người, động vật, bùn đất, nước cống rãnh. Vi khuẩn có bào tử và có sức đề kháng cao. Nếu thực phẩm chế biến không đảm bảo vệ sinh, nhiệt độ khử khuẩn, đun nấu không đủ diệt bào tử, vi khuẩn vẫn còn tồn tại và phát triển, làm hư hỏng thực phẩm và gây ngộ độc thức ăn ( nhất là thực phẩm đồ hộp)Do tính chất của Clostridium perfringens là phát triển trong môi trường kỵ khí và có khả năng phân giải Sodium sulfit hoặc phân giải protein tạo H2S. Cấy trên môi trường có Sodium sulfit và phèn sắt ( môi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin:TSC), tạo khuẩn lạc màu đen, thử tính chất sinh hóa để định danh




Dụng cụ Thiết bịỐng nghiệm Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer)Kẹp inox Cân kỹ thuậtĐèn cồn Lò vibaPipette 1 ml, 10 mlBình kî khí


Môi trường Hóa chấtTRIPTOSE SULPHIT CYCLOSERINE AGAR BASE (TSC)

Cồn 90o và 70o

MANNITOL MOBILITY NITRATE Dd creatine 0,5 %

THIOGLYCOLATE Dung dòch - naphtol 5%GELATINE-LACTOSE KOH 40%IRON SULPHITE AGAR (ISA) Thuoác thöû Kovac

HCl 10%NaOH 10%

65

C.selective supplementAnaerobic indicatorTúi kỵ khíGriess – Ilowvay’s reagentBụi kẽm

8.3.Thực hành8.3.1. Quy trình phân tích

8.3.2. Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

66

Lấy 01 ml mẫu vào đĩa, rót khoảng 20ml môi trường TSC, xoay đều, đợi đông, phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường TSC, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ khí

Chọn 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Cấy ria các khuẩn lạc này lên môi trường thạch TSC cơ bản, phủ thêm 10 ml môi trường TSC cơ bản, ủ 370C ± 10C, 20 giờ trong bình kỵ khí

Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình:Thử nghiệm tính di động, thử nghiệm sự có mặt của nitrit, thử nghiệm sự hóa lỏng geletin, lên men lactose

10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10-1 Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-210-310-4

......

Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở môi trường TSC, không di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hóa lỏng geletin trong 48 giờ được coi là Clostridium perfringens

Bước 2:Dùng pipet vô trùng để lấy ở mỗi nồng độ pha loãng 1 ml dung dịch huyền phù ban đầu hoặc 1 ml mẫu thử ( nếu mẫu là chất lỏng) cho vào giữa đĩa Petri, mỗi nồng độ 02 đĩa.Bước 3: Rót 15-20 ml môi trường TSC vào đĩa Petri và trộn đều bằng cách xoay nhẹ.Bước 4: Khi môi trường đã đông chặt, rót thêm một lớp 10 ml môi trường TSC phủ lên trên.Bước 5: Để đông và xếp các hộp Petri nắp ở phía trên vào bình kỵ khí, Bước 6: Đếm và ghi lại số lượng khuẩn lạc điển hình ở các đĩa. Khuẩn lạc Clostridium perfringens có màu đenXác nhậnChọn tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Nếu không có khả năng tách riêng rẽ tốt các khuẩn lạc điển hình thì nuôi 10 khuẩn lạc điển hình đó trong môi trường lỏng thioglycolate, nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.Cấy ria các khuẩn lạc này trên môi trường thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10 ml môi trường TSC cơ bản. Để đông và nuôi yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.Tách ở mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và dễ tách biệt. Xác nhận tính sinh hóa

Thử nghiệm tính di động : Làm môi trường thạch đứng Mannitol Mobility

Nitrate. Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào môi trường . Nuôi dưỡng trong điều kiện

yếm khí 370C ± 10C, 18-24 giờ.Kiểm tra ống môi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu. Sự sinh trưởng khuyếch tán vào môi trường từ vết cấy sâu thể hiện rõ tính di động của vi sinh vật nuôi cấy

Thử nghiệm sự có mặt của nitrit: Thêm 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit vào mỗi ống môi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ HOP). Sự hình thành màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitat thành nitrit. Nếu trong 15 phút mà màu đỏ không hình thành thì thêm một lượng nhỏ bột kẽm. Để yên 10 phút, nếu màu đỏ được hình thành sau khi thêm bột kẽm thì không có phản ứng nitrat thành nitrit.

Xác định sự hóa lỏng geletin:

Cấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin-lactose. Nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ. Kiểm tra ống môi trường xem có sự sinh khí và có chuyển màu vàng không ( tạo acide) cho biết sự lên men của lactose. Làm lạnh 1 giờ ở 50C và kiểm tra sự hóa lỏng của geletine. Nếu môi trường vẫn rắn, nuôi cấy thêm 24 giờ và kiểm tra sự hóa lỏng của geletine.

8.3.3. Đọc kết quảVi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở môi trường TSC, không di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hóa lỏng geletin trong 48 giờ được coi là Clostridium perfringens. Nếu nhiều hơn hoặc bằng 80% số khuẩn lạc điển hình đếm

67

được được xác định là Clostridium perfringens thì toàn bộ số khuẩn lạc đếm được được coi là Clostridium perfringensCác trường hợp khác kết quả được tính toán dựa vào tỷ lệ phần trăm của các khuẩn lạc được xác nhận là Clostridium perfringens so với số khuẩn lạc đếm được

Tham khảo quy trình phân tích Clostridium ( không dùng bình kỵ

khí)

9. ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

9.1. Nguyên tắc

68

Ñoàng nhaát maãu vaø pha loaõng maãu theo daõy thaäp phaân, xöû lyù maãu 800C trong 15-20 phuùt,

Caáy 1ml maãu vaøo trong oáng nghieäm voâ truøng, ñoå 10-15 ml moâi tröôøng ISA ôû 450C , laéc ñeàu

Ñoå lôùp ISA thöù hai cao 1-2 cm sau khi phaàn döôùi ñoâng ñaëc, uû 370C, 24-48 giôø

Ñeám taát caû caùc khuaån laïc maøu ñen xuaát hieän trong oáng

Tính keát quaû soá Clostridium trong 1ml/1g maãu phaân tích

Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động, phản ứng oxidaza dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 420C, lên men đường sacaroza, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat.

Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.


9.2.1. Dụng cụ và thiết bịBảng 9.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu9

Dụng cụ Thiết bịỐng nghiệm Tủ cấy vô trùngĐĩa petri (100 mm) Nồi hấpCốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấmĐầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l)Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer)Kẹp inox Cân kỹ thuậtĐèn cồn Lò vibaPipette 1 ml, 10 ml Máy nghiền đồng thể mẫu

Bể điều nhiệt Máy lắc ống nghiệm

9.2.2. Môi trường và hóa chấtBảng 9.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 9

Môi trường Hóa chất

Ancalin Peptone Water (APW) Cồn 90o và 70o

69

Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-Salt-Sacaroza (TCBS thạch).Chú thích: không hấp khử trùng môi trường

HCl 10%

Triple Sugar Iron agar –TSI/ Klingler Iron Agar -KIA

NaOH 10%

Hugh - Leifson Glucoza hoặc O/F Glucoza Trypton

NaCl

Canh thang muối trypton ( trypton 1%) có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10).Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối

Que thử Oxidase

RSU Các đĩa 10 mg và 150 mg O/129 Vibriostat

Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường cơ bản) (LDC)

Dầu khoáng vô trùng

(Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 0C trong 30

phút)

Moâi tröôøng Tryptic Soya Agar (TSA) 2% NaCl

Đĩa thử ONPG

Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản) (symolcitrat)

Dung dịch nước muối sinh lý

9.3. Thực hành


7025 g mẫu + 225 ml nước APW, nghiền, dập mẫu ủ 37,00C ± 1,00C trong 6 - 24 giờ

9.3.2.Các bước thực hiện

Bước 1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm

Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút.

Mẫu kiểm tra thường ví dụ: mẫu hàu

Lấy phần thịt của 10 - 12 con hàu (kể cả nước) rồi cắt nhỏ, trộn đều. Sau đó, nghiền bằng máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu trong 450 ml nước pepton kiềm APW

71

Cấy ria vào môi trường TCBS thạch . ủ 37,00C ± 1,00C trong 18 - 24 giờ

Ria cấy 03 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường TSA 2% NaCl, ủ 37,00C ± 1,0oC trong 18 - 24 giờ

Th ử nghiệm sinh hóa : Thử nghiệm sinh hóa sơ bộ:TSA/KIA, thử nghiệm canh thang trypton muối(+), thử nghiệm lên men, oxy hóa(+), thử nghiệm oxidaza(+), nhuộm Gram(-)Thử nghiệm sinh hóa khẳng định: thử phát triển ở 42,00C(+), thử nghiệm cacbonhydrat, thử nghiệm decacboxylaza, thử nghiệm urea(-), thử nghiệm ONPG(+), thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức phẩy khuẩn O/129 Vibriostat(-)Thử nghiệm kháng huyết thanh:

Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.

(4.2.1) trong 2 phút. Chia dung dịch mẫu này vào 2 bình vô trùng, mỗi bình chứa 225 ml rồi pha loãng thành hai dãy bằng cách trộn đều 10 ml dung dịch mẫu trong 90 ml nước pepton kiềm APW. Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 37,00C ± 1,00C và 42,00 ± C 0,20C .

Bước 2. Tăng sinh

a. Ðối với mẫu thông thường

Ủ các bình chứa mẫu đã chuẩn bị (kể cả mẫu chứng dương và mẫu chứng âm) ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong 6 - 8 giờ. Sau đó, phân lập như qui định , phần còn lại ủ tiếp 16 - 24 giờ rồi phân lập lại.

b. Ðối với mẫu hàu

Ủ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong 6 - 8 giờ và 16 - 24 giờ.

Ủ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 42,00C ± 0,20C trong 6 - 8 giờ.

Bước 3. Phân lập và đọc kết quả trên đĩa

Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên , không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch . ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong 18 - 24 giờ.

Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V. cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh.

Bước 4. Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh

a. Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ

Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl . Ủ ở nhiệt độ 37,00C ± 1,0oC trong 18 - 24 giờ. Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá.

* Thử nghiệm trên môi trường TSI/KIA

Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI ( hoặc KIA . Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong 18 - 24 giờ.

Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S.

* Thử nghiệm với các canh thang trypton muối

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % . Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0 ± 1,0 0C trong 18 - 24

72

Hình 9.1.V. cholerae trên TCBS

giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi trường.

* Thử nghiệm lên men - oxy hoá

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống. ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0 ± 1,00C trong 1 - 2 ngày. V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.

* Thử nghiệm oxidaza

Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza /que thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây .

Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.

* Nhuộm gram

V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.

b. Thử nghiệm sinh hoá khẳng định

* Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C

Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl . Ủ ở nhiệt độ 42,00C ± 0,20C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 420C làm môi trường bị đục.

* Thử nghiệm cacbonhydrat

Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các loại cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-mannoza . Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.

V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính.

* Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza

Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng . Ủ các ống ở nhiệt độ 37,00C ±1,0 0C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).

V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính.

* Thử nghiệm urê

Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê , ủ ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng.

* Thử nghiệm ONPG

Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm

73

và đọc kết quả như trên. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.

* Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat

Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl . Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37,0 ± 1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.

* Thử nghiệm kháng huyết thanh

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.

Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2.

Bảng - Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1

Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1

Dung dịch muối sinh lý

Kết luận

Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae

+ - V.cholerae O1


- - V.cholerae non- O1


+ + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1

Bảng - Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.cholerae O1

Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba

Kháng huyết thanh Ogawa

Dung dịch muối sinh lý

Kết luận

V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba

V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa

V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima

V.cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu

9.3.3. Ðọc kết quả

74

Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.

10. ĐỊNH TÍNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM10.1.Nguyên tắcShigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy tiện, cho thử nghiệm catalase (+) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men glucose không sinh hơi, hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ latose, dulcitol, không sinh H 2S, không có enzyme lysine decarboxylase.Shigella có thể được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi

75

trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.


10.2.1.Dụng cụ và thiết bịBảng 10.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 10


10.2.2.Môi trường và hóa chấtBảng 10.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 10

Môi trường Hóa chấtDung dòch Trypton Soya (TSB) Cồn 90o và 70o

Canh Gram Negative (GN) Dd creatine 0,5 % Tergitol-7 Agar (T7A) Dung dòch - naphtol 5%Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%Môi trường Hektoen Entric Agar (HE)Deoxycholate Citrat Agar (DCA) HCl 10%Thạch Mac Conkey (MAC) NaOH 10%Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA)

Thuốc thử catalase

Moâi tröôøng Lysine Decacboxylase broth (LDC)

Que thử oxydase

Moâi tröôøng KIA hoaëc TSI RSU

10.3.Thực hành


76

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml TSB, ủ 370C , 16 – 24 giờ

10.3.2.Các bước tiến hànhBước 1. Tăng sinh

- Caân 25g maãu ñaõ nghieàn, hoặc hút 25 ml mẫu cho vaøo bình ñaõ chöùa saün 225ml moâi tröôøng TSB, laéc ñeàu , ủ 370C , 16 – 24 giờ

Bước 2. Tăng sinh chọn lọc- Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủû 37oC

trong 10-20 giờ.

Bước 3. Phân lập

77

Chọn ít nhất 05 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA , ủ 370C trong20-24giờ

Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml môi trường GN, ủ 370C , 16 – 24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt (T7A,MAC,XLD,HE,DC…), ủ 370C , 24 – 48giờ

Thử nghiệm sinh hóa:KIA/TSI : đỏ/vàng, H2S (-), gas (-)Không di độngOxydase (-)

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25 g mẫu

- Duøng que caáy voøng caáy ria canh tröôøng töø moâi tröôøng taêng sinh chọn lọc leân ñóa petri chöùa moâi tröôøng phaân laäp. Caàn caáy thöa ñeå taïo khuaån laïc rieâng bieät. Ñeå ôû 370C trong 24-48 giờ. Nên sử dụng ít nhất 2 môi trường phân lập khác nhau. Treân moâi tröôøng XLD, Shigella taïo caùc khuaån laïc ñoû,trong suốt. Treân moâi tröôøng HE khuaån laïc Shigella ñieån hình coù maøu xanh nhạt, trong suốt. Treân moâi tröôøng T7A khuaån laïc Shigella ñieån hình coù maøu xanh nhạt (môi trường đục như sữa, có màu xanh hơi vàng nhạt). Treân moâi tröôøng MAC khuaån laïc Shigella ñieån hình coù maøu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục)

Bước 4. Thử phản ứng sinh hóaThử

nghiệm sàng lọc trên TSI/KIA ): Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.Caáy ñaâm saâu phaàn coät thaïch vaø caáy ria leân phaàn thaïch nghieâng vi khuaån töø nhöõng khuaån laïc ñieån hình/nghi ngôø leân oáng thaïch nghieâng chöùa moâi tröôøng KIAø. Ủ ôû 370C trong 24 giờ.

Dieãn giaûi söï bieán ñoåi moâi tröôøng nhö sau:Coät thaïch:

- Maøu vaøng: glucose döông tính (leân men glucose)- Maøu ñoû hoaëc khoâng ñoåi maøu: glucose aâm tính (khoâng

leân men glucose)- Maøu ñen: coù taïo thaønh sunfua hidro- Coù boït khí hoaëc coù veát nöùt : sinh khí töø glucose

Beà maët thaïch nghieâng:- Maøu vaøng: lactose/saccharose döông tính (coù söû duïng

lactose/saccharose)

78

1. Không có VSV2. Lên men lactose và glucose (môi trường màu vàng)3. Sinh khí4. Chỉ lên men lactose (đỏ trên bề mặt, vàng ở dưới )5. Khử lưu huỳnh, sinh H2S (có màu đen)

Hình 5.3. Thử nghiệm KIA

- Maøu ñoû hoaëc khoâng ñoåi maøu: lactose/saccharose aâm tính

Thử nghiệm khẳng định : Các đặc trưng sinh hóa của Shigella được tóm tắt theo bảng :

Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

Simmon citrate - Saciline -

Arginine decarboxylase - Xylose -

Lysine decarboxylase - Cellobiose -

Urea - Adonitol -

Malonate - Dulcitol -

MR + Inositol -

VP -

Thử nghiệm LDCLấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên môi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờTreân moâi tröôøng LDC, Shigella phaùt trieån seõ laøm ñuïc vaø chuyeån maøu moâi tröôøng sang tím hay ñoû tía[LDC (+)], LDC (-) khi moâi tröôøng coù maøu vaøng.

Thử nghiệm urea Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ bản có bổ sung urea. Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ.

79

Urea (-) Urea (+) Hình5.4. Thử nghiệm Urea

Shigella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím.

Thử nghiệm VPHòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02 giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm 02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vòng 15 phút là phản ứng dương tínhShigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường

10.3.4.Kết quảVới quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella được phát hiện trong 25g mẫu

10.4.Câu hỏi ôn tập1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Shigella2. Nêu hình thái các khuẩn lạc đặc trưng Shigella trên các môi trương phân lập khác nhau

11. ĐỊNH TÍNH FAECAL STREPTOCOCCUS TRONG THỰC PHẨM

11.1.Nguyên tắc

80

VP (-) VP (+)

Khi được nuôi cấy trong môi trường chứa acid tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride, khuẩn lạc Streptococcus phân có màu hồng đến màu đỏ đậm do sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Các loài này không có catalase, không có cytocrom c, có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối chứa NaCl, pH 9,6 ở 45oC.





11.2.2.Môi trường và hóa chấtBảng 11.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 11

Môi trường Hóa chấtDung dòch Trypton Soya (TSB) Cồn 90o và 70o

Enterococcus agar Dd creatine 0,5 %BHI Brain heart infusion 6,5% muối NaCl Dung dòch - naphtol 5%BHI Brain heart infusion pH 9,6 KOH 40%Moâi tröôøng Trypticase Soy Agar (TSA)

HCl 10%NaOH 10%Thuốc thử catalaseQue thử oxydase


81

11.3.2.Các bước tiến hànhBước 1. Mẫu được pha loãng thập phân thành các nồng độ phù hợp 10-1, 10-2, 10-3…Bước 2. Phân lập Cấy trải 0,1 ml mẫu lên bề mặt môi trường chọn lọc Enterococcus agar, trải khắp bề mặt đĩa bằng que trải thủy tinh. Lật ngược đĩa và ủ 440C trong 2 ngày.

Bước 3. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, kích thước khoảng 0,5-3mm, có thể có vòng không màu xung quanh khuẩn lạc. Bước 4. Thử phản ứng sinh hóaChọn ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng, chuyển qua TSA, ủ qua đêm ở 370C. Thử sinh

hóa qua môi trường BHI 6,5% NaCl, BHI pH 9,6, thử nghiệm catalase, oxydase. Enterococcus phân có phản ứng catalase (-), oxydase (-), phát triển được trong môi trường BHI 6,5% NaCl, BHI pH 9,6.

11.3.4.Kết quả Tính tỷ lệ khẳng định và mật độ theo CFU/g hay CFU/g

82

Khẳng định (+):Chịu muối 6,5%, chịu pH ở 9,6 (+)Catalase (-); Oxydase (-)

Đếm tất cả khuẩn lạc đặc trưng

Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng vào TSA, ủ ở 37oC, 24 giờ

Trải lên MT Enterococcus agar, ủ 44oC, 48 giờ

Chuẩn bị dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 …..

Mật độ Streptococcus phân ( CFU/g hay CFU/ml)

11.4.Câu hỏi ôn tập1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Streptococcus phân2. Nêu các phản ứng sinh hóa khẳng định Streptococcus phân

CHƯƠNG IV

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

4.1. PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP

Phương pháp phát quang sinh học ATP được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc phát quang sinh học ở đom đóm dưới xúc tác của enzym luciferase.

Phân tử ATP hiện diện ở tất cả các tế bào sinh vật sống, do đó, sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzym luciferase nhờ một máy đo sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP (10 -12g) tương đương với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15g ATP/tế bào). Thông thường trong phân tích, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được tách chiết ra khỏi tế bào (thường dùng trichloacetic acid 5%) và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra. Sự phân tích được thực hiện nhanh chóng chỉ diễn ra trong vài phút. Cơ chế phản ứng phát quang của phương pháp xảy ra như sau:

Luciferase + Luciferin + ATP Luciferase-Luciferin AMP + PPi

Luciferase-Luciferin AMP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (phát quang)

4.2. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA (Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme) dựa trên nguyên tắc là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên-kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym).

ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ.

ELISA đã thay thế một số kỹ thuật huyết thanh “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng như các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.

Xét nghiệm ELISA có thể được tiến hành với một số phương pháp như ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.

83

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene). Quá trình này có thể là trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể. Khi huyết thanh được thêm vào, các kháng thể có thể kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase).

Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng. Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm.

Hình 15: Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA

Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.

Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme. Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể có thể tạo ra hàng ngàn phân tử màu do hoạt tính enzyme. Trước khi các kháng thể gắn enzyme có thể được sử dụng rộng rãi, các kháng thể phóng xạ đã được sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radio immuno assays-RIA). Kỹ thuật RIA như là một đột phá có ý nghĩa và người sáng tạo ra nó là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào năm 1977.

84

Hình 16. Nguyên tắc của phương pháp ELISA

Hình 17. Quy trình thực hiện phương pháp ELISA

Trong phương pháp này, các kháng thể đơn dòng được phủ bên ngoài những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Thông qua việc theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hoá chất (kit) thương mại. Hiện nay, đã có các bộ kit dùng cho Salmonella, E. coli gây bệnh, Listeria, Staphylococcus. Độ nhạy của các bộ kit này khoảng 104 CFU/ml, và vẫn cần thực hiện tăng sinh hoặc tăng sinh chọn lọc khi thực hiện phương pháp này. Ngoài ra còn có các sản phẩm khác như TECRA (Australia) dựa trên nguyên tắc này để định danh độc tố của Staphylococci trong thịt .

85

Hình 18. Máy rửa và máy đọc trong quy trình ELISA

4.3.PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)

Phương pháp lai phân tử còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử . Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA của môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.

4.4. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này được Karl Mullis (Mỹ) phát minh vào 1985.

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính.

86

4.4.1. Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR

a. DNA mẫu (DNA template)

Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng).

Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho phép khuyếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người chết....

b. Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:

+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.

+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá trình lai xảy ra tốt hơn.

+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.

+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.

+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm primer dimer (Hình 3.7).

+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kết hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.

+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base.

c. Enzyme polymerase chịu nhiệt

Enzyme ssử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tag-polymerase) không biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase. Hiện nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được sử dụng là: Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase, rTth...Các hoạt tính của chúng được trình bày ở bảng:

Enzyme Hiệu suất Tần số lỗi Tần số Exo Exo

87

tương đối

(Relative

efficiency)

(Error

rate)

mở rộng

(Extention

rate)

3’-5’ 5’-3’

Taq-polymerase

Vent-

polymerase

Pfu- polymerase

rTth

88

70

60

Không XĐ

2x10-4

4x10-5

7x10-7

Không XĐ

75

67

Không XĐ

60

Không

Có

Có

Không

Có

Không

Không

Có

d. Các loại nucleotid

Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng (200μM/loại nucleotid).

e. Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế... Nói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác.

f. Dung dịch đệm

Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4) 2SO4, 200mM Tris-

Cl pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)

g. Ion Mg2+

Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM. Người ta thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn.

4.4.2. Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).

a. Giai đoạn biến tính (denaturation)

Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95 oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giưã hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.

b. Giai đoạn lai (hybridization)

Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).

88

Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.

Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là:

Tm=4(G+C) + 2(A+T)

c. Giai đoạn kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.

Hình 19. Ba giai đoạn của của phản ứng PCR

Chu kỳ ba bước lặp lại nhiều lần, sau 30-40 chu kỳ sẽ tạo ra 10 6 bản sao. Sau phản ứng PCR, ADN được nhuộm bởi ethidium bromide và được quan sát qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV

89

Hình 20. Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của phản ứng PCR

Bảng . Số bản sao của phân tử DNA mẫu tạo thành qua các chu kỳ của phản ứng PCR

90

Chu kỳ Số bản sao

1

2

4

10

15

20

25

30

...

n

21=2

22=4

24=16

210=1.024

215=32.768

220=1.048.576

225=33.554.432

230=1.073.741.824

...

2n

Hình 21. Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân

Ưu điểm của phương pháp PCR

+ Thời gian (6-48 giờ)

+ Phát hiện vsv khó nuôi cấy

+ Hóa chất dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với huyết thanh học

+ Có thể tự động hóa

Hình 22. Mô hình máy PCR (Polymerase chain reaction) và máy PCR realtime của Bio-Rad

Nhược điểm

+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase

+ Mật độ vsv trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh

+ Không phân biệt được tế bào sống và chết, có thể dẫn đến dương tính giả (tuy vậy, có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vsv gây độc)

+ Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus

Thông thường khi thực hiện phương pháp PCR, trình tự được tiến hành như sau:

- Tăng sinh: vi sinh vật được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường chọn lọc (TSB) 10-20 giờ.

- Tách chiết DNA vi sinh vật

- Thực hiện phản ứng PCR

- Điện di trên gel agarose 1,5%, đọc kết quả trên đèn UV.

91

4.5. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM

Petrifilm là màng quét lên một lớp chất dinh dưỡng và tác nhân tạo gel. Khi tiến hành xét nghiệm, 1ml mẫu được cấy vào Petrifilm và ủ. Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường. Các đường kẻ ô giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn. Các phương pháp Petrifilm đã được thử nghiệm và được AOAC công nhận. Kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coloform, coliform phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời gian sử dụng lâu và không cần hấp khử trùng môi trường

Hình 14. Quy trình phân tích vi sinh vật dùng Petrifilm

CHƯƠNG V

ĐÁNH GIÁ VỆ SINH CÔNG NGHIỆP

QUY ĐỊNH KIỂM SOÁT VI SINH

MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ, VỆ SINH TAY, BAO BÌ

Ñieåm kieåm soùat

Caùch laáy maãu kieåm traChæ tieâu kieåm tra

1. Moâi tröôøng:-Phoøng roùt saûn phaåm

- Ñaët maãu ñóa moâi tröôøng ôû vò trí taïi baát kyø moät trong

- TPC ≤ 10kl- Naám men/

92

- Phoøng Vi sinh

caùc maùy roùt trong 15 phuùt.

- Ñaët maãu ñóa moâi tröôøng ôû taïi vò trí baøn thöû trong 15 phuùt

moác: ≤ 2kl

- TPC ≤ 2kl- Naám men/ moác : khoâng coù

2. Thieát bò:- Boàn chöùa -Ñöôøng oáng roùt saûn phaåm- Ñaàu roùt saûn phẩm

- Boàn chöùa: Duøng boâng tieät truøng swab moät vuøng beân trong boàn, dieän tích 100cm2

ngay sau khi keát thuùc veä sinh- Ñöôøng oáng roùt:Duøng boâng tieät truøng swab vuøng beân trong oáng, chieàu cao 10cm ngay sau khi keát thuùc veä sinh

- Ñaàu roùt: Duøng boâng tieät truøng swab vuøng beân trong oáng, chieàu cao khoûang 5-10cm tuøy theo ñaàu roùt saûn phaåm ngay sau khi keát thuùc veä sinh

- TPC ≤ 10kl- Coliform:

khoâng coù

- Naám men/ moác : khoâng coù

3.Veä sinh tay:-Nhaân vieân phoøng roùt saûn phaåm-Nhaân vieân cheá bieán /phaân chia thöùc aên

- Duøng boâng tieät truøng swab baøn tay

-Coliform: khoâng coù- E.coli: khoâng coù

4.Bao bì sau tieät truøng

- Duøng nöôùc tieät truøng traùng beân trong bao bì chöùa saûn phaåm

- Duøng boâng tieät truøng swab vuøng beân trong bao bì

- TPC : khoâng coù- Coliform:

khoâng coù


5.Baûo hoä lao ñoäng: Quaàn/aùo/noùn

- Swab 1 vuøng dieän tích100cm2

treân quaàn /aùo /noùn ngay sau khi hoøan taát coâng ñoïan saáy khoâ

- Coliform: khoâng coù

- E.coli: khoâng coù


93

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Bài giảng: Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm -Trần Quốc Huy, Nguyễn thúy Hương,2010

[2]. Lê Đình Hùng, Nguyễn Đức Hùng, Huỳnh Lê Tâm, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2004

[3]. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006

[4]. TCVN 4830-1:2005(ISO 6888-1:1999) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn gia súc - phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch. Phần 1: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker.

[5]. Thomas A. Mc Meekin, Detecting pagothens in food, Woodhead Publishing Limited (ISBN 1-85573-704-3) and CRC Press LLC (ISBN 0-8493-1756-8), 2003

[6]. Shabbir Simjee, Foodborn Diseases, Humana Press (ISBN: 978-1-59745-501-5), 2007

94

Documents

173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd