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julio-diciembre de 2006UNIVERSITAS SCIENTIARUMRevista de la Facultad de Ciencias

Vol. 11, N° 2, 23-30

PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE SABORES,PIGMENTOS Y AROMAS A PARTIR DE HONGOS

MICELIALES Y LEVADURAS

G. Reyes-González, M. Franco-Correa Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias,

Pontificia Universidad Javeriana, Cra. 7 No. 43-82 Bogotá, Colombia

[email protected], [email protected]

RESUMEN

La obtención biotecnológica de compuestos biológicos con interés farmacológico ha adquirido un graninterés debido a que los procesos de síntesis química terminan siendo dispendiosos y contaminantes. Elcrecimiento del mercado de sabores, fragancias y pigmentos para el uso en alimentos, bebidas, cosméti-cos y detergentes, requiere nuevas estrategias de producción que no sean nocivas para el medio ambien-te. Este cambio de mentalidad se basa en la idea de una nutrición sana, natural y económica, debido a quelas fuentes de estos compuestos al ser de origen biológico son menos costosas y de fácil acceso. Loshongos por presentar un alto crecimiento y desarrollo, permiten que a través del metabolismo primariode fuentes precursoras, se logre la obtención de sus metabolitos secundarios, como sustancias de interésindustrial por medio de procesos biotecnológicos, lo cual ha generado una alta expectativa en su uso.Como objetivo de esta revisión se pretende acercar al lector a una visión actualizada de numerosas einteresantes posibilidades de bioproducción de sustancias utilizadas en la industria como carotenoide, 6-pentil-á-pirona-2-feniletanol (2-PE) entre otros.

Palabras clave: bioproducción, colorantes, extracción, hongos, sabores.

ABSTRACT

The biotechnological generation of compounds which are of pharmaceutical interest has attracted a lotof interest because the processes of chemical synthesis are expensive and a source of pollutants. Thegrowth of the market of flavors, fragrances and pigments used in foods, drinks, cosmetic and detergentsrequires new strategies that are less harmful to the environment. This change of mentality is based on theidea of healthy, natural and less expensive nutrition, and since the sources of these compounds are ofbiological origin, they are of less expensive and of easy access. The fungi, because of their high rates ofgrowth and development, make possible, through the primary metabolism of precursor sources, theproduction, by means of biotechnical process, of secondary metabolites which are substances of indus-trial interest, which has generate great expectation for their use. The objective of this review is give to thereader an up-to-date vision of the numerous and interesting possibilities for the bioproduction ofsubstances used in the industry, such as carotenoids, 6-pentil-á-pyrrona-2-phenilethanol, among others.

Key words: bioproduction, colorants, extraction, flavors, fungus.

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INTRODUCCIÓN

El desarrollo alcanzado en las técnicas deaislamiento e identificación de aromas,colorantes y sabores, hacen que el área deproductos naturales sea la de mayor creci-miento dentro del campo de la química or-gánica mediante el uso de la biotecnologíay bioingeniería. Los microorganismosconstituyen una de las fuentes menos estu-diadas, ofreciendo grandes posibilidadespara la obtención de nuevas estructuras yactividades biológicas (Brizuela et al.,1998).

Los carotenoides por ejemplo son pigmen-tos orgánicos que ocurren de forma naturalen plantas y otros microorganismosfotosintéticos como algas, algunas clasesde hongos y bacterias. La obtención de es-tos compuestos a partir de hongos es útilen la elaboración de numerosos productosalimenticios (Hui et al., 2005). El mercadode los aromas extraídos de estos microor-ganismos ha evolucionado en los últimosaños, debido a que los procesos físicos uti-lizados en la elaboración de alimentos cau-san pérdida de estos compuestos volátilesrequiriendo de una suplementación poste-rior (Krings y Berger, 1998). Los saboresobtenidos de microorganismos además deasegurar una nutrición sana mejoran laspropiedades organolépticas de los alimen-tos como en el caso de compuestos sulfura-dos en la elaboración y maduración delqueso, entre otros (Berger et al., 1999).

COLORANTES

Los hongos filamentosos tienen importan-tes propiedades en la producción de ali-mentos y productos medicinales. Supotencial bioquímico y su adaptación acondiciones de vida extremas en medioslíquidos hacen que se explote industrial-mente la producción de estas moléculas.

Existen varios géneros de hongos implica-das en la producción de colorantes comoMonascus sp, el cual produce pigmentosamarillos llamados monascina y ankafla-vina, naranjas como monascorubrín yrubropuctatín y rojos como monascorubra-mina y rubropuctamina. Estos pigmentosse usan para colorear arroz, vino, queso,pescado y carnes principalmente en China,Taiwan, Japón e Indonesia. Hajjaj et al.(2000) aseguran que Monascus ruber pro-duce pigmentos rojos al igual que lacitrinina la cual se clasifica como unamicotoxina nefrotóxica. Wang et al. (2005)resaltan que la producción de los pigmen-tos es independiente a la producción decitrinina. En el estudio de Hajjaj et al.(2000) se evidencia que la producción depigmentos y citrinina aumenta durante lafase inicial del cultivo y luego decrece paralos dos compuestos. La adición de ácidosorgánicos como el L-málico y el succínicoinhiben la producción de los pigmentos.

Carotenoides

Los carotenoides son una clase de pigmen-tos naturales, generalmente encontrados enplantas, algas y bacterias fotosintéticas queson utilizados como aditivos y colorantesen la elaboración de mantequilla, quesos,dulces, helados, entre otros.

Georgiou et al. (2001) proponen que los β-carotenos producidos por Sclerotium rolfsiise forman posiblemente para reducir la ten-sión que se produce cuando el hongo secultiva en condiciones de luz pero tambiénoscuridad. La máxima producción de β-ca-rotenos es de aproximadamente 50-60nmol/g de peso seco. Rodríguez et al.(2004) afirman que Blakeslea trispora esotro microorganismo que sinetiza β-caro-tenos y que la clonación de los genes carRAy carB de este hongo puede ser utilizadapara alterar la expresión genética de algu-nas cepas, logrando producir β-carotenos.

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Thraustochytrium sp, ha sido aislado deambientes marinos tropicales y subtropi-cales; es sintetizador de β-carotenos,astaxantina, fenocoxantina, cantanxantina,y equinenona en medio YPG a determina-das intensidades de luz. La identificaciónde estos carotenoides producidos porThraustochytrium sp se realiza medianteHPLC utilizando como fase móvil la mez-cla hexano, tetrahidrofurano, 2-propanol,trietilamina (77:17:3:3) y RMN (resonan-cia magnética nuclear) (Yamaoka et al.,2004). Phycomyces sp también produceβ-carotenos aunque en cantidades peque-ñas, aproximadamente 0.05 mg/ g de pesoseco (Cerdá, 2001).

La astaxantina (3,3-dihidroxi-β-caroteno-4,4-diona) es un pigmento rojo-rosado queestá adquiriendo interés en la industriapiscícola (colores de salmones y crustá-ceos), es el ingrediente más costoso utili-zado en esta industria además de tenerpropiedades antioxidantes y anticanceríge-nas. La astaxantina es sintetizada química-mente pero sus costos son muy elevados,es por esto que se han estudiado algunosmicroorganismos capaces de producir estecompuesto optimizándoles niveles de glu-cosa, oxígeno y fosfato, además adicionan-do estimulantes químicos como el etanol yúltimamente realizando manipulacióngenética para que las cantidades obtenidassean mayores. La levadura Phaffia rhodo-zyma o Xantrophyllomyces dendrorhous(estado perfecto) es un microorganismo queproduce altas concentraciones de estemetabolito, considerado como una exce-lente fuente de astaxantina cuando es esti-mulada sinérgicamente por Epicoccumnigrum, este microorganismo acumulacarotenoides en concentraciones de 500-2000 mg, de la cual entre el 45 y 95% co-rresponde a astanxantina (Echavarri et al.,2004). Según Hui et al. (2005) el β-carotenoes un importante intermediario en labiosíntesis de la astaxantina y frecuente-mente coexisten, también resalta que los

carotenoides se pueden analizar por HPLC,pero debido a que es un método dispendio-so se pueden analizar por medio deespectrofotometría. En este estudio las con-centraciones de astaxantina y β-carotenosa las 18 horas de cultivo son del mismonivel, de 18-36 horas la concentración deastaxantina incrementa levemente y la con-centración de β-carotenos alcanza su máxi-mo valor de 0.5 mg/l a las 30 horas. De las36-54 horas la producción de astaxantinaincrementa a 4.5 mg/l y la de β-carotenosdecrece. Las concentraciones se determi-nan en un rango de 360–520 nm. Otros es-tudios como el de Visser et al. (2003) señalanque la carotenogénesis en algunas cepasde X. dendrorhous, cuya producción es foto-inducible especialmente bajo el estímulode la luz azul, se ve disminuida por el exce-so de esta luz.

AROMAS

Los aromas y fragancias utilizadas en laindustria de alimentos, productos de lim-pieza y cosméticos tienen gran interés co-mercial y muchas de ellas se sintetizanquímicamente mediante largos procesosde producción generando contaminaciónambiental. Es por esto que se han buscadoalternativas biotecnológicas para la obten-ción de estos productos, mediante el usode microorganismos (Krings y Berger,1998).

Trichoderma sp es uno de los géneros queposeen la habilidad de producir ciertos aro-mas utilizados en la industria de alimen-tos. Un ejemplo de lo anterior es el6-pentil-α-pirona (6PP), un compuesto conaroma a coco. Bonnarne et al. (1997) seña-lan que Trichoderma harzianum y T.viridae tienen la habilidad de producir estecompuesto en concentraciones de 19 mg/ly 376 mg/l respectivamente, a partir de acei-tes vegetales como el aceite de castor, elcual incrementa la producción de 6PP yreduce su toxicidad. El compuesto es ex-

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traído mediante un sistema de dos fasesacuosas como lo hace Palomares (2000) apartir de una cepa de T. harzianum, en elcual utilizan como fases acuosas el polieti-len glicol (PEG) y fosfato, estimando laconcentración del metabolito que generala biomasa producida y el aroma, separadomediante cromatografía de gases y la téc-nica de peso seco, respectivamente. A ni-vel de laboratorio se obtienen entre 15–50ml del metabolito y en un fermentador elrendimiento aumenta en un 25%. T. harzi-anum se encuentra en la fase fermentativay el metabolito genera el aroma en la faseextractiva, permitiendo disminuir el efectode inhibición que presenta el 6-pentil-alfa-pirona sobre el microorganismo. SegúnBonnarme et al. (1997), la molécula 6PP,presenta actividad antimicrobiana ya quetiene cierta toxicidad en la membrana ce-lular.

Ceratocystis fimbriata al igual que C.moniliformis son otra clase de hongos uti-lizados en la producción de aromas debidoa su crecimiento rápido y a la variedad decompuestos aromáticos sintetizados. C.fimbriata a partir de un cultivo sólido concascarilla y pulpa de café como fuente decarbono, genera compuestos aromáticos fru-tales como acetato de etilo, etanol yacetaldehído principalmente (Bluemke etal., 2003). Ceratocystis moniliformis crecerápidamente y sintetiza gran cantidad decompuestos como permeato de etilo,acetato de etilo, acetato de propilo y alco-hol isoamílico entre otros. Estos compues-tos son extraídos por preevaporación yanalizados por cromatografía de gases(Bluemke, 2003).

El aroma a rosas es muy utilizado en la ela-boración de perfumes y cosméticos. El 2-feniletanol (2-PE) es un compuestoaromático con olor a rosas. Su producciónsintética no difiere significativamente dela natural. Estchmann et al. (2002) señalanuna gran variedad de microorganismos pro-

ductores de este compuesto entre los quese encuentran: Phenillus ignarius, P.laevigatus y P. tremulae, pero los microor-ganismos más prominentes en producciónson las levaduras, entre las que se encuen-tran Saccharomyces vini y Torulopsis utilisproduciendo 12 mg/l de 2-feniletanol en 7días. Otros microorganismos son Pichiafermentans L-5, con 453 mg/l en 16 horas;Kloeckera saturnus con 1.7 g/l en 24 horasy S. cerevisiae Giv 2009 que alcanza con-centraciones de 2.35 g/l en 48 horas.

En la industria de los quesos se ha usadouna gran variedad de microorganismos paraefectos del sabor y aroma. Para esto se hanutilizado asociaciones microbianas entreGeotrichum candidum, bacterias comoCorynebacterium sp y algunas levadurascomo Kluyveromyces lactis y Yarrowialipolitica entre otras asociaciones que pro-ducen compuestos sulfurados aromáticos.Estos son extraídos, analizados y compara-dos con aromatizantes comerciales. Laoptimización de esos métodos analíticosgenera grandes resultados debido a que lassustancias son fácilmente detectables en losmedios de cultivo. Asociando K. lactis conuna bacteria, se producen ésteres y alcoho-les en cantidades relativamente grandes. Y.lipolitica en asociación con bacterias pro-duce compuestos aromáticos como 2-propanol, cetonas como 2-butanona entreotros. Geotrichum candidum produce com-puestos sulfurados que al interactuar conlas sustancias producidas por Yarrowialipolitica hace que el nivel de estos com-puestos aumente y los aromas se intensifi-quen en el producto (Martin et al., 2001).

SABORES

En la industria, uno de los usos más cono-cidos de los microorganismos productoresde sabores es en bebidas alcohólicas, estasfermentaciones dan como resultado etanol,CO

2 y otras sustancias que ayudan a ex-

traer el sabor de los componentes de las

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uvas, producir enzimas y metabolitos se-cundarios. El principal microorganismo im-plicado es Saccharomyces cerevisiae,encontrándose otros géneros comoCandida sp y Hanseniaspora sp los cualesse caracterizan por presentar tolerancia aaltas concentraciones de etanol (Graham,2003). Lilly et al. (2000) concluyen quelos alcoholes y ésteres derivados de la fer-mentación como acetato de alquilo, con-tribuyen significativamente a la presenciade aromas frutales en vinos.

El ácido cítrico es ampliamente utilizadoen la industria de alimentos para la produc-ción de bebidas no alcohólicas, sales efer-vescentes y medicinas, para el plateado deespejos y como aditivo en las tintas. El 99%del ácido cítrico mundial es producido porfermentación con algunas bacterias y hon-gos. Aspergillus niger, A. wentii, A.clavatus, Penicillium citrinum y Mucorpiriformis son microorganismos típicosusados en su producción (Ghassempour etal., 2003). Para su obtención se utilizanfuentes de carbono como sacarosa, gluco-sa, fructosa entre otros. En el trabajo deBizukojc y Ledakowicz (2004) se estudiasi la glucosa y fructosa obtenidas porhidrólisis de la sacarosa son fuentes de car-bono equivalentes para Aspergillus niger,concluyendo que la utilización de lafructosa es inhibida por concentracioneselevadas de ácido cítrico y que esto estáligado probablemente con la interferenciadel ácido cítrico en el sistema de transportede la fructosa. En el trabajo de Sánchez etal. (2004) se describe una alternativa dife-rente para la producción de ácido cítrico apartir del suero de la leche, en cultivo su-mergido con hongos del género Aspergi-llus sp, con miras al aprovechamiento deeste subproducto que es uno de los princi-pales desechos de la industria láctea. Losautores concluyen que este medio de culti-vo proporciona los nutrientes necesariospara el desarrollo del hongo así como parala biosíntesis de ácido cítrico, aunque A.

niger no asimila adecuadamente la lactosadel suero de leche. Este ácido se puede de-terminar mediante análisis gravimétricos,cromatografía de gases, espectometría demasas, potenciometría y biosensores, sien-do la HPLC y métodos espectrofotométricoslos más utilizados (Ghassempour et al.,2003).

En la industria quesera es muy frecuente eluso de microorganismos para mejorar lascaracterísticas organolépticas del produc-to, es el caso de Leptographium procerum,que además mejora el sabor de algunas sal-sas y cereales. Estos sabores son produci-dos por hidrólisis del RNA de las levadurasmediada por enzimas como la 5-fosfodies-terasa producida por el hongo, el cual secultiva en agar extracto de levadura y susmetabolitos se analizan por HPLC (Steens-ma et al., 2004). La especie Geotrichumcandidum es igualmente utilizada en la in-dustria quesera debido a la producción desabores sulfurados asociados con la produc-ción de metan-etiol (MTL). Berger et al.(1999) encontraron que cultivando el hon-go en medio PDA y posteriormente en unmedio líquido de queso, se produce MTL yotros derivados como tioacetato de S-metilo, tiobutarato de S-metilo, trisulfitode dimetilo entre otros, los cuales son ana-lizados por cromatografía de gases yespectrofotometría de masas. También seanalizó que el uso de esta cepa junto conPenicillium camemberti confiere un sabormás típico que el obtenido sólo con G.candidum. Otro hongo utilizado en asocia-ción con P. camemberti, es Penicilliumcaseifulvum, cultivado y fermentado enmedio Czapek, mediante el cual se lograextraer compuestos sulfurados entre los quese encuentran: 2-metil-1-propanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, 2-heptanonay 2-undecanona principalmente (Ostenfeld1999). Park (1999), en su artículo confirmalo presentado por Ostenfeld, (1999), seña-lando que P. roquefortii utilizado en la ela-boración del queso azul, también produce

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2- alcanonas, estos compuestos son extraí-dos de microcápsulas que contienen lasesporas del hongo y posteriormente sonanalizados por cromatografía de gases.

En el trabajo de Lomascolo et al. (2000)realizado en el Laboratorio de Biotecnolo-gía de los Champiñones y el Centro Supe-rior de Biotecnología de Francia, seconsidera que el uso biotecnológico dehongos filamentosos para producir saboresha adquirido gran interés, ya que estos sa-bores son definidos como naturales y con-siderando el incremento de la producciónde sabores por procesos biotecnológicos seofrece una alternativa viable como fuentede diversas sustancias. La vainillina es ob-tenida usando hongos con habilidadescomplementarias de bioconversión comoAspergillus niger que transforma el ácidoferúlico a ácido vainílico y, Phanerochae-te cinnabarinus y P. chrysosporium quetransforman el ácido vainílico a vainillina,logrando recuperar más de 200 mg devainillina (Lomascolo et al., 2000). Priefertet al. (2001) coinciden con Lomascolo etal. (2000) en que A. niger interviene en labioconversión del ácido ferúlico, en esteestudio A. niger produce 3.6 g/l de ácidovainilíco, Phanaerochaete chrysosporiumproduce 0.628 g/l de vainillina y P.cinnabarinus 0.481 g/l de la misma.

Los metabolitos producidos por hongosseguirán abriéndose paso en el mercado,ya que numerosos estudios acreditan suefectividad logrando competir con las sus-tancias sintetizadas químicamente en ca-lidad y aportando significativamente enla disminución de la contaminación am-biental.

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Recibido: 15.11.2005Aprobado: 31.08.2006

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