20200228 les 3 - UGent · 2020. 2. 19. · Polymerase chain reactie(PCR) 9}Optimalisatie}Primers}Polymerase}Magnesium}Reactiebuffer}Kwaliteit en kwantiteit van het DNA PCR: optimalisatie

2/16/20

1

PCR

Lieven De Veylder

1

} Overzicht

} PCR optimalisatie

} Analyse van de PCR producten

} Toepassingen+ Afgeleide technieken gebaseerd op PCR

Polymerase chain reactie (PCR)

2

2/16/20

2

3

PCR: een moleculaire kopieermachine

} Overzicht

} Nodig:

} es DNA

} 2 startersequenties

} DNA polymerase

} dNTPs

} Buffer (+Mg)

Eerste cyclus:

PCR: overzicht

4

2/16/20

3

} Overzicht

PCR: overzicht

5

} Overzicht

PCR: overzicht

61 pg DNA resulteert na 22 cycli in ongeveer 1ug DNA

2/16/20

4

7

} Voor eerst gepubliceerd (1985) met gebruik Klenowpolymerase (hitte onstabiel)

} Nieuw enzym moest manueel worden toegevoegd na elkestap.

} Max lengte 400bp

} Identificatie van termostabiele polymerase} Bv Thermus aquaticus (1988) uitYellow Stone National

Park heetwaterbron

PCR: overzicht

} Overzicht

PCR: overzicht

8

2/16/20

5

} Overzicht

} PCR optimalisatie


} Toepassingen+Afgeleide technieken gebaseerd op PCR


9

} Optimalisatie

} Primers

} Polymerase

} Magnesium

} Reactiebuffer

} Kwaliteit en kwantiteit van het DNA

PCR: optimalisatie

10

2/16/20

6

} Primers (startersequenties)

Enkele vuistregels bij het ontwikkelen van primers

} 20-30 nt

} Vermijd complementariteit tussen de primers

} Vermijd vorming van een hairpin

} 40-60% GC gehalte

} Eenzelfde smelttemperatuur van de primers

} Verschillende gratis programma’s beschikbaar op het internet: primer3plus

PCR: optimalisatie

11



} Hou rekening met de grootte van het amplicon

¨ Voor analytische doeleinden: 200-500 bp

PCR: optimalisatie

12

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

2/16/20

7



} Hou rekening met de grootte van het amplicon

¨ Voor analytische doeleinden: 200-500 bp

¨ Groter kan nodig zijn voor kloneringen (zie verder)

¨ Kleiner is handig voor quantitatieve PCR (zie verder)

PCR: optimalisatie

13



} Oriëntatie van de primers!

PCR: optimalisatie

14

2/16/20

8


De primers bepalen de annealingtemperatuur

} Annealingtemperatuur ßà smelttemperatuur

} Te hoog?

} Te laag?

} Smelttemperatuur wordt bepaald door

¨ Sequentie van de primers

¨ Lengte van de primers

PCR: optimalisatie

15


De primers bepalen de annealing temperatuur

} Annealingtemperatuur ßà smelttemperatuur

} Te hoog?

} Te laag?

} Vraag:Detectie van een gen waarvan de sequentie niet volledig gekend is. Hoe pak je dit aan?

PCR: optimalisatie

16

2/16/20

9

} Primers (startersequenties) à multiplex PCR

PCR: optimalisatie

17

} Optimalisatie

} Primers

} Polymerase

} Magnesium

} Reactiebuffer


PCR: optimalisatie

18

2/16/20

10

} DNA Polymerase

} Meest gebruikt: Taq polymerase

à maar heeft geen proeflezing (fout: 1/9000)

} Alternatief: Pfu polymerase

PCR: optimalisatie

19

} DNA Polymerase à enkele voorbeelden (tabel NEB)

PCR: optimalisatie

Properties

Phusion®*

Phusion®

Hot

Start Flex*

OneTaq®OneTaq®

Hot

Start

TaqLongAmp

®

Taq

LongAmp®

Hot Start

Taq

Crimson

TaqVentR®

Deep

VentR®Hemo

KlenTaq™

Fidelity

vs. Taq 50X 50X 2X 2X 1X 2X 2X 1X 5X 6X ND

Amplicon

Size≤20 kb ≤20 kb ≤6 kb ≤6 kb ≤5 kb ≤30 kb ≤30 kb ≤5 kb ≤6 kb ≤6 kb ≤2 kb

Extension

Rate2-4 kb/min 2-4 kb/min 1 kb/min 1 kb/min 1 kb/min 1.2 kb/min 1.2 kb/min 1 kb/min 1 kb/min 1 kb/min 0.5 kb/min

Resulting

EndsBlunt Blunt 3´ A/Blunt 3´ A/Blunt 3´ A 3´ A/Blunt 3´ A/Blunt 3´ A Blunt Blunt 3´ A

3´→5´ exo Yes Yes Yes Yes No Yes Yes No Yes Yes No

5´→3´ exo No No Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No

Units/50

µl

Reaction

1.0 1.0 1.25–5.0 1.25–5.0 1.25 5.0 1–5.0 1.25 0.5–1.0 0.5–1.0 N/A20

http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0530.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0535.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0480.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0481.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0273.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0323.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0534.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0324.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0254.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0258.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0332.asp

2/16/20

11

} DNA Polymerase à enkele voorbeelden (tabel NEB)

PCR: optimalisatie

Routine PCR √ √ √ √ √ √ √ √ √ √High Fidelity √ √ √ √ √ √ √ √High Yield √ √ √ √ √ √ √ √Hot Start √ √ √Fast √ √Long Amplicon √ √ √ √ √ √Multiplex PCR √ √ √†††Extraction-free PCR √DNA-labeling √

Site-directed Mutagenesis

Phusion®*Phusion®

HotStart Flex*

OneTaq®OneTaq®

HotStart

TaqLongAmp®

Taq

LongAmp®

Hot StartTaq

Crimson Taq

VentR®Deep

VentR®Hemo

KlenTaq™

21

} DNA Polymerase

} stabiliteit

PCR: optimalisatie

22

http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0530.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0535.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0480.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0481.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0273.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0323.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0534.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0324.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0254.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0258.asphttp://www.neb.com/nebecomm/products/productM0332.asp

2/16/20

12

} DNA Polymerase – aanmaak van lange amplicons: Long PCR

} à probleem: smeer

} mix Taq polymerase en polymerase met proeflezing

PCR: optimalisatie

23

PCR: iProof polymerase

24iProof polymerase demonstrates unrivaled speed, leading to dramatically shorter overall reaction times. The reactionprotocol for iProof polymerase was compared to the recommended protocols for two competing polymerases. Each protocol wasdesigned to amplify 1, 8, or 15 kb products in 30 cycles. Reactions with iProof polymerase used a two-step protocol with acombined annealing and extension step, while the other reactions used three-step protocols with the minimum recommendedextension times. Overall reaction times include temperature ramping times.

iProof DNA polymerase amplifies long templates with high yields. Left, various fragments up to 37 kb in length were amplified from BACDNA using a combined annealing/extension step of 10 min per cycle and 30 U/ml of iProof. Right, various sequences up to 28.8 kb wereamplified directly from human genomic DNA using 30 U/ml of iProof in GC buffer with a combined annealing/extension time of 10 min per cycle.

https://youtu.be/UhET-Qvq4WA

2/16/20

13

} Optimalisatie

} Primers

} Polymerase

} Magnesium

} Reactiebuffer


PCR: optimalisatie

25

} Magnesium

} Cofactor voor het DNA polymerase

} Meegeleverd als apart epje bij reactiebuffer

} reactiebuffer

} à belangrijk voor constante pH

PCR: optimalisatie

26

2/16/20

14

} Optimalisatie

} Primers

} Polymerase

} Magnesium

} Reactiebuffer


} Tabel

} Depurinatie bij hoge temperaturen en lage pH

PCR: optimalisatie

27

} Overzicht

} PCR optimalisatie




28

2/16/20

15


} Sequeneren

} Gel-electroforese

} Controles!!!

- negatieve(contaminatie)

- positieve

Ideaal ß

Analyse van de PCR producten

29


} Gel-electroforese

Niet zo ideaal ß

} Trouble shooting...


30

2/16/20

16

} Analyse van de PCR producten: trouble shooting} Verhogen annealing temperatuur van primers

¨ Gradiënt: per staal andere annealing temperatuur


31



¨ Touch down PCR


2x2x2x30x

32

2/16/20

17



¨ Touch down PCR

¨ Hot start PCR

¨ manueel

¨ aangepast enzyme


33



¨ Touch down PCR

¨ Hot start PCR

¨ manueel

¨ aangepast enzyme

¨ Nested PCR

¨ interne primer(s)


34

2/16/20

18

Nested PCR:

35

} Overzicht

} PCR optimalisatie




36

2/16/20

19

PCR: toepassingen

Moleculaire ArcheologieMoleculaire Epidemiologie

Moleculaire EcologieDNA fingerprinting

Classificatie organismenGenotypering

Prenatale diagnose...

BioinformaticaKloning

Genoomprojecten...

Site-directed mutagenesis

Genexpressie...

Moleculaire identificatie Sequentiebepaling Moleculaire engineering

} Diagnostica

PCR: diagnostica

38

2/16/20

20

} Kloneren met behulp van PCR

PCR: kloneren

39


PCR: kloneren

40

2/16/20

21


PCR: kloneren

41

} RAPD (rapid amplified polymorphic DNA) analysisà DNA vingerafdruk

à Korte primer (10 nt)

PCR: RAPD

42

2/16/20

22

} Forensic use of RAPD analysis in the investigation of bioterrorism by Bird, Jessica Lee, M.S.,

} The events that occurred after September 11, 2001 brought the threat of bioterrorism to the forefront. One of the most important aspects of protecting against a bioterrorism attack is the ability to rapidly identify and link separate isolates of a bioterrorism agents to a common source. In the anthrax mailings of 2001, determining whether or not they were the same strain and hence from a common source was of great importance in the investigation. We used Bacillus cereus , a strain of bacteria that is closely related to Bacillus anthracis , the bacterium responsible for anthrax, as our model system. Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD), a type of analysis used to examine a genomic profile in organisms in which little or no genetic research has been accomplished, was used to study DNA profiles produced from different isolates of Bacillus cereus . This procedure is capable of distinguishing between Bacillus and non-Bacillus isolates and demonstrates genetic differences between strains of Bacillus cereus . Thus, this procedure can be utilized to link isolates used in bioterrorism attacks to each other and to a common source.

PCR: RAPD

43

Exp Appl Acarol. 2012 Feb 17.

Detection of genetic variability in various isolates of cattle tick, Boophilusmicroplus from Tamil Nadu, India using PCR-RAPD analysis.

VelayuthamV, Shanmugavel S, Munusamy A, Sundaram J.

The genomic DNA from ten isolates of the cattle tick, Boophilus microplus collected in and around Chennai, India, was analyzed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) using PCR. Selected five random primers were used for the study of genetic variability among different isolates of B. microplus. A high degree of genetic polymorphism with a different pattern of RAPD profiles for each tick isolate was detected with all these random primers. This variability was also confirmed by similarity coefficient values and dendrogram which were performed using mean RAPD profiles for all the primers between various isolates of ticks. The findings suggest the existence of a complex genotypic diversity of the tick B. microplus in an endemic region such as Chennai.

PCR: RAPD

44

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Velayutham%20V%22%5bAuthor%5dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shanmugavel%20S%22%5bAuthor%5dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Munusamy%20A%22%5bAuthor%5dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sundaram%20J%22%5bAuthor%5d

2/16/20

23

PCR: RAPD

45

} Amplified fragment length polymorphism (AFLP) (Prof. Zabeau, 1993)

} Verschillende stappen} Verknippen van het totale cellulaire DNA

} Ligatie aan adaptoren

PCR: AFLP

46

2/16/20

24


} Verschillende stappen} Selectieve amplificatie mbv primers

PCR: AFLP

47

PCR: AFLP

48

2/16/20

25


} Verschillende stappen} Scheiding van de amplicons

Gelelectroforese

Capillaire electroforese

} Extra informatie: http://insilico.ehu.es/AFLP/info.html

PCR: AFLP

49

} real-time PCR = quantitatieve PCR (qPCR)

} Is quantificatie met behulp van PCR mogelijk?

} In theorie wel maar....

‘real-time’ -PCR

Log

Targ

et D

NA

Theoretical

Real LifeReal Life

# cycli50

http://insilico.ehu.es/AFLP/info.html

2/16/20

26

} real-time PCR = quantitatieve PCR (qPCR)

} PCR reactie in ‘real-time’ volgen door middel van fluorescente agentia die een maat zijn voor de hoeveelheid dubbelstrengig DNA.

} hoeveelheid product: P= 2n x P0

} Ct (cycle threshold) : cyclus waarbij de amplificatiecurve de threshold snijdt

‘real-time’ -PCR

51

‘real-time’ RT-PCR

} Hoe kleiner de Ct waarde, hoe meer DNA aanwezig in het oorspronkelijk staal

} Hoe groter de Ct waarde, hoe minder DNA er oorspronkelijk aanwezig was

Ct verschil = 1 → cDNA concentratie verschil = 2Ct verschil = 3,3 → cDNA concentratie verschil = 10

52

2/16/20

27

= beginconc → ≠ eindconc

Eindpuntdetectie vs real-time analyse

53

Eindpuntdetectie vs real-time analyse

≠ beginconc → = eindconc

54

2/16/20

28

Detectiemethoden: DNA-intercallerendeagentia

} Sybr Green

55

Detectiemethoden: DNA-intercallerendeagentia

} Sybr Green

56

2/16/20

29

SYBR green: assay ontwerp

} Ontwerp en optimalisatie Sybr Green assay} Primer en ampliconontwikkeling

• amplicon: 75-200 bpGC gehalte tussen 50-60%geen lange herhalingen van eenzelfde basegeen complexe secundaire structuur

57

5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’


} Ontwerp en optimalisatie Sybr Green assay} Primerontwikkeling

• exon-exon overlappende primer of primers gelegen in verschillende exonen

• GC gehalte tussen 50-60%• Smelttemperatuur tussen 50-65°C• vermijd primer-dimeren

• Vermijd secundaire structuren

• Vermijd herhalingen van meer dan drie G of C’s

58

2/16/20

30


• Voorbeeld programma voor ontwikkeling primers/probes: primer3plus

• BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analyse!!!

59

SYBR green: assay validatie

• componenten• Template

• Primers• PCR master mix à

• PCR reactie programmeren• 1.

• 2.• 3.

• Optimalisatie

60

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgihttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2/16/20

31


• Optimalisatie

61

} Eerste controlePCR efficiëntie bepalen


62 https://toptipbio.com/calculate-primer-efficiencies/

2/16/20

32

Fluorescence vs. Temperature

change in fluorescencechange in fluorescence

single amplified productsingle amplified product

TmTm

1stDerivative

Sybr Green: assay validatie

} Tweede controle:Smeltcurve analyse: bepalen aantal amplicons

63


} Smeltcurve analyse: bepalen aantal amplicons

64

2/16/20

33


} Tweede controle:Smeltcurve analyse: bepalen aantal amplicons

65

Sybr Green} Data analyse

} Absolute kwantificatie} Relatieve kwantificatie (vergelijken met huishoudgenen)

66

2/16/20

34

Sybr Green} Voordelen

• geen gen-specifieke probe nodig

• Eenvoudige assay-ontwikkeling

• Snel voor het testen van verschillende genen (validatie)

• “Goedkoop”

• specificiteit van de reactie kan getest worden

} Nadelen

• zal alle DNA-fragmenten binden; ook aspecifieke producten(bv primerdimeren)

67

Detectiemethoden: sequentie-specifieke probes

} Hydrolyse probes / TaqMan probes

68

2/16/20

35

Detectiemethoden: sequentie-specifiekeprobes

} Hydrolyse probes / TaqMan probes

69

Hydrolyse probes / Taqman probes

} Voordelen• multiplex assays mogelijk

} Nadelen• aankoop probes voor ieder gen van interesse

70

2/16/20

36

Molecular beacons

71


• Zeer specifiek à kan gebruikt worden voor allelische discriminatie


• Moeilijker om te ontwikkelen

Molecular beacons

72

2/16/20

37

hybridizatieprobes

73

Intermezzo: energietransfer

} Voorbeelden} FRET (fluorescente resonantie energietransfer)} BRET (biolumiscente resonantie energietransfer)

74

2/16/20

38


• Grotere “signal-to-noise’ ratio


• Moeilijker om te ontwikkelen

hybridizatieprobes

75

Webpagina’s voor primers en probes

76

2/16/20

39

2-staps reactie 40 cycli 1. 10”, 95°C2. 1’ , 60°C → detectie

3-staps reactie 40 cycli 1. 10” , 95°C2. 30” , 60°C → detectie3. 30” , 72°C → detectie

PCR reactie

77

Doelstelling:

het belang aantonen van de PCR reactie in het huidig biotechnologisch onderzoek

Deze kennis kunnen toepassen voor het beantwoorden van bepaalde biologische vraagstukken.

PCR reactie

78

2/16/20

40

Oefening 1

à Experimentele aanpak stalenwelke real-time PCR aanpakhoe uitwerken

79

Oefening 2

à Experimentele aanpak welke real-time PCR aanpakhoe uitwerken

80

Documents

20200228 les 3 - UGent · 2020. 2. 19. · Polymerase chain reactie(PCR) 9}Optimalisatie}Primers}Polymerase}Magnesium}Reactiebuffer}Kwaliteit en kwantiteit van het DNA PCR: optimalisatie