11/04/23

Introduzione ai trattamenti biologici:

Cenni di microbiologia e cinetica biologica

Claudio Lubello

Corso Ingegneria Sanitaria

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I microrganismi

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La suddivisione degli esseri viventi: classificazione filogenetica

Albero filogenetico della vita come definito dalla comparazione dell’RNA ribosomale. L’albero è costituito da tre domini degli organismi: Bacteria ed Archaea che hanno una cellula di tipo procariotico ed Eukarya, di tipo eucariotico. In rosso sono cerchiati i macrorganismi tutti gli altri sono quelli comunemente indicati come MICRORGANISMI.

MACRORGANISMI

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Procarioti ed Eucarioti

Eucariote: organismo costituito da cellule con nucleo ben differenziato e separato dal citoplasma per mezzo di una membrana nucleare.

Procariote: organismo unicellulare il cui materiale cellulare non è racchiuso dentro una specifica membrana. Manca la suddivisione della funzione cellulare in specifici organuli.

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Batteri

In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (10-3mm) e hanno sviluppato gli adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive.

Si trovano in quasi tutti gli ambienti: nell'aria, nel suolo, nell'acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti calde e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondità oceaniche.

I batteri sono organismi procarioti costituiti da una singola cellula.

Le cellule batteriche si riproducono per scissione binaria.

I batteri possono essere di differente forma: - SFERICA (Cocchi), - a BASTONCINO (Bacilli), - ELICOIDALE (Spirilli).  

Composizione tipica dei batteri

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Elementi %TSS Formula empirica (%VSS)

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Alghe verdi-azzurre

Da non confondersi con le alghe. Sono cianobatteri ed appartengono al dominio dei BACTERIA.

Sono organismi fotosintetici.

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Alghe

Rientrano fra le alghe numerosi organismi eucariotici che contengono clorofilla e svolgono la fotosintesi. La maggior parte sono microscopiche (quelle di nostro interesse), sono presenti tuttavia organismi macroscopici di dimensione molto elevata.

Colonie di Volvox

Le alghe contengono clorofilla e si presentano di colore verde, possono assumere colori diversi (marrone o rosso) per la presenza di altri pigmenti.

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Protozoi

I protozoi sono organismi eterotrofi generalmente unicellulari, sprovvisti di una ben delimitata parete cellulare. La maggior parte è mobile. Possono essere patogeni per l’uomo o per altri animali.

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Funghi

Muffe:

Sono funghi con struttura filamentosa, caratteristici per le loro efflorescenze polverose di colore bianco-grigio, verdastro, nero. Si riproducono tramite spore che differiscono nella morfologia, nel modo in cui sono prodotte, nel colore. Le loro condizioni ottimali di pH sono di circa 5,6 con intervallo tra 2 e 9.

Lieviti:

Funghi unicellulari che vivono in habitat liquidi o umidi.

Sono organismi eterotrofi pluricellulari, caratterizzati dalla presenza di una parete cellulare e dalla produzione di spore.

I gruppi di maggiore importanza sono: muffe, lieviti e funghi fruttiferi.

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Virus

Il termine virus significa, “veleno” e venne usato per la prima volta per indicare particelle patogene più piccole dei batteri. Essi non possiedono molti degli attributi tipici delle cellule ed, in particolare, sono sistemi dinamici e aperti in grado di assimilare nutrienti ed espellere metaboliti.

Sono parassiti intracellulari obbligati e solo quando infettano una cellula sono in grado di riprodursi.

I virus non sono cellule ma particelle composte da acidi nucleici (DNA o RNA) racchiusi in un involucro proteico

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Metabolismo microbico

Percorsi metabolici e conseguente classificazione dei

microrganismi

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Il metabolismo dei microrganismi

Un organismo per potersi riprodurre e funzionare correttamente ha bisogno di:

- Energia- Carbonio - Elementi inorganici (nutrienti) - Fattori di crescita (amminoacidi, vitamine, basi azoto, …)

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Anabolismo e Catabolismo

Le attività metaboliche seguono due percorsi metabolici diversi: - cammino anabolico (consumo di energia), che è un

processo assimilativo che comporta la sintesi dei componenti della cellula (biosintesi),

- cammino catabolico (rilascio di energia), che è un processo dissimilativo. Le sostanze assunte vengono degradate attraverso una serie di passaggi intermedi fino a prodotti stabili. In questi passaggi si rende disponibile l’energia necessaria per la crescita e il mantenimento.

I due processi si completano l’uno con l’altro.

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Ossido riduzione

Nei sistemi biologici la produzione e la conservazione dell’energia coinvolge reazioni di ossido-riduzione (redox). In queste si ha uno scambio di elettroni tra un elemento donatore che si ossida, ed un elemento accettore che si riduce.

Le reazioni redox rispetto ad altre reazioni chimiche, hanno un valore più elevato della resa di energia per mole di reagenti coinvolti.

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ATP

ATP (Adenosintrifosfato): è la molecola che nel metabolismo delle cellule svolge l’importante funzione energetica di accumulare energia fornita dal catabolismo e di fornirla successivamente per le reazioni metaboliche, comportandosi come una sorta di batteria. L’ATP è costituito da un gruppo adenosina e tre gruppi fosfatici.

Quando l’ATP perde un gruppo fosfatico, la rottura del legame rilascia una grande quantità di energia e si forma ADP (adenosindifosfato).

ATP ADP + Pi + energia

Con un meccanismo di ricarica l’energia fornita dal catabolismo viene accumulata dalla reazione inversa.

ADP + Pi + energia ATP

È opportuno evidenziare l’importanza del fosforo che deve essere sempre presente per garantire lo svolgimento delle reazioni metaboliche.

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ATP

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ATP

Illustrazione schematica del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo

.

SUBSTRATO(Fonte energetica)

ATP

ADP

scambiodi

energia

Sintesi della biomassa

Metabolismo di mantenimento

PRODOTTI METABOLICI

²GReazioni AnabolicheConsumo di energia libera

Reazioni CatabolicheGenerazione di energia libera

²G = - 7kcal/moleATPH2OATPasi ADPPiiodrolisi ATP

Fosforilazione ADP ADPPiFosforilazione

ATP ²G = 7kcal/mole

fosfo

rila

zion

e idrolisi

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ATPATP

ADPADP

Reazioni CatabolicheGenerazione di energia libera

Prodotti metaboliciProdotti metaboliciReazioni AnabolicheConsumo di energia libera

Sintesi della biomassaSintesi della biomassa

Metabolismo di mantenimento

Metabolismo di mantenimento

Idrolisi ATP ATP+H2O ADP+Pi

Fosforilazione ADP ADP+Pi ATP

Scambio di

energia

Scambio di

energia

Schema del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo

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Enzimi e coenzimi

Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero tempi lunghi, non compatibili

con il metabolismo cellulare. Alcuni enzimi per svolgere la loro attività hanno necessità di un composto addizionale, che può essere costituito da

ioni inorganici o da molecole organiche dette coenzimi

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Enzimi

Cinetica enzimatica

La velocità della reazione globale aumenta proporzionalmente alla concentrazione del substrato e quindi del complesso E-S. Come si può notare dalla figura, questo incremento decresce sino al raggiungimento di un plateau in cui la concentrazione di S è così elevata da mantenere sempre saturo l’enzima; in queste condizioni la velocità di reazione per unità di enzimi (o batteri), V/E, è massima e pari a k.La relazione tra concentrazione di substrato e la velocità è stata studiata da Michaelis- Menten

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Nutrienti

Elementi Forma più comune in natura

Carbonio CO2, composti organici

Azoto NH4+, NH3, NO3

-, N2, composti organici azotati

Idrogeno H2O, composti organici

Ossigeno H2O, O2, composti organici

Fosforo PO43-

Zolfo H2S, SO42-, comp. organici, metalli solfati

Potassio K + in soluzione o Sali di potassio

Magnesio Mg2+ in soluzione o Sali di magnesio

Sodio Na+ in soluzione o Sali di sodio

Calcio Ca2+ in soluzione o Sali di calcio

Ferro Fe2+ o Fe3+ in soluzione o come Sali di Ferro

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SORGENTE DI CARBONIO: viene convertito in materiale cellulare (protoplasma)

DONATORE DI ELETTRONI (SUBSTRATO): alimenta la semireazione di ossidazione e rappresenta la fonte di energia nel cammino catabolico.

ACCETTORE DI ELETTRONI: alimenta la semireazione di riduzione nel cammino catabolico.

I principali elementi che devono essere considerati per la classificazione dei microrganismi sono:

Classificazione dei microrganismi

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Fonte di Carbonio

Eterotrofi: organismi che utilizzano come fonte il carbonio contenuto nei composti organici

Autotrofi: organismi che utilizzano come fonte di carbonio la CO2

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Energia Le cellule richiedono energia per le attività di sintesi e di

mantenimento. L’energia può essere ottenuta da tre fonti diverse:

I microrganismi che utilizzano la luce come sorgente di energia sono detti FOTOTROFI;

quelli che invece usano l’energia chimica sono definiti CHEMIOTROFI.

- Composti chimici organici

- Composti chimici inorganici

- Luce

CHEMIOTROFI

FOTOTROFI

Chemiorganotrofi

Chemiolitotrofi

Energia

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Classificazione in funzione del ruolo dell’ossigeno

I diversi tipi di metabolismo possono essere distinti sulla base delle modalità con le quali viene prodotta l’energia necessaria per le funzioni vitali. In particolare sulla necessità o meno dell’ossigeno come accettore finale delle reazioni di ossido-riduzione.

Metabolismo aerobico quando l’ossigeno funge da accettore finale degli elettroni (i microrganismi che sfruttano questo metabolismo sono detti AEROBICI)

Metabolismo anaerobico quando viene utilizzato un accettore finale di elettroni diverso dall’ossigeno (i microrganismi sono detti ANAEROBICI).

Un caso particolare di metabolismo anaerobico è quello in cui gli accettori finali di elettroni siano i nitriti e/o i nitrati. Si parla in questo caso di Metabolismo anossico (spesso svolto da microrganismi FACOLTATIVI, che cioè in presenza di ossigeno usano questo come accettore ed in sua assenza nitriti e nitrati).

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Respirazione: ossigeno molecolare o altro composto inorganico come accettore di e-. Il substrato organico viene ossidato a CO2.

Fermentazione: assenza di un accettore di e- esterno. Vengono utilizzati gli stessi composti organici donatori.

La fermentazione è caratterizzata in termini energetici da una resa inferiore alla respirazione (minore velocità di crescita ed inferiori rendimenti di sintesi)

Respirazione e Fermentazione

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Condizioni potenziale redox

CO2

Substrato

organico

C

N O 3- , S O 4

- - , C O 3- -

Respirazione

anossica

O 2

Respirazione

aerobica

Fermentazione

anaerobica

Substrato

organico

Prodotti di

fermentazione

C

e-

CO2

Substrato

organico

C

e -

POTENZIALE REDOX

molto negativo debolmente negativo

o circa zero

positivo

Accettore dielettroni

Trasformazionedel Carbonio

Ossido-Riduzioniinterne

Flussointerno

di e-

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Tipo Reazione Fonte C Donatore e- Accettore e- ProdottiAerobico eterotrofo

Respirazione Aerobica

Composti Organici

Composti Organici

O2 CO2, H2O

Aerobico autotrorfo

Nitrificazione CO2 NH4+, NO2

- O2 NO2-, NO3

-

Aerobico autotr. Ossidazione Ferro CO2 Fe (II) O2 Fe (III)

Aerobico autotr. Ossidazione Solfuri CO2 H2S O2 SO42-

FacololtativoEterototrofo

Denetrificazione Anossica

Composti Organici

Composti Organici

NO2-, NO3

- N2, CO2, H2O

Anaeraerobico Eterotrofo

FermentazioneAcida

Composti Organici

Composti Organici

Composti organici VFA

Anaerobico Eterotrofo

Riduzione FerroComposti Organici

Composti Organici Fe (III)

Fe(II), CO2, H2O

Anaerobico Eterotrofo

Riduzione SolfatiComposti Organici

Composti Organici

SO42- H2S, CO2, H2O

Anaerobico Eterotrofo

MetanogenesiComposti Organici

Acidi Grassi Volatili (VFA)

CO2 Metano

Classificazione processi metabolici

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Definizione dei parametri cinetici

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Velocità e tasso di crescita

Sia nei reattori batch, che in quelli a flusso continuo la velocità (rateo) di crescita dei batteri può essere definita dalla seguente relazione:

in cui

rg è la velocità di crescita batterica (massa/unità di volume x tempo)

X è la concentrazione di microrganismi (massa/unità di volume)I

Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita:

dt

dXrg

dt

dX

X

1

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Velocità e tasso di respirazione endogena

L’attività di respirazione endogena corrisponde all’utilizzo come fonte di carbonio ed energia lo stesso materiale cellulare. Tale fase è sempre presente in contemporanea con la crescita cellulare. Diventa l’attività prevalente quando il substrato è esaurito.

La velocità (rateo) di respirazione endogena dei batteri è definita dalla seguente reazione:

in cui

rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo)Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione

X della biomassa si introduce il tasso di respirazione endogena:

dt

dXrd

dt

dX

Xkd

1

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Velocità di crescita nettaLa velocità di crescita netta è data dalla differenza fra quella di

crescita e quella endogena (che comporta un consumo del materiale cellulare).

r’g = rg - rd

in cui

rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo)

Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita netta:

’ = - kd

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Velocità di utilizzazione del substrato

La velocità di utilizzazione del substrato (termine con cui spesso si indica il donatore di elettroni) rappresenta la velocità con cui i batteri utilizzano il substrato:

in cui

rsu è la velocità di utilizzazione del substrato (massa/unità di volume x tempo)

S è la concentrazione del substrato (massa/unità di volume)

Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di utilizzazione del substrato:

dt

dSrsu

dt

dS

XU

1

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Fattore di resa (rendimento di crescita)

Una parte del substrato è convertito in prodotti inorganici ed organici finali mentre un’altra parte porta alla formazione di nuove cellule. La successiva relazione mette in relazione il tasso di utilizzazione del substrato (rsu massa/unità di volume x tempo) con rg il tasso di crescita batterico:

In cui Y (massa/massa) è il fattore di resa.Tenendo conto che una parte del biomassa viene degradata a causa della

respirazione endogena è utile introdurre il fattore di resa osservato Yobs:

Xdt

dXessendo

Y

X

dt

dS

dtdS

dtdX

r

rY

su

g 1

/

/

su

gobs r

rY

'

dt

dXrg

dt

dSrsu

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Esempio di calcolo del fattore di resa Calcoliamo Y nel caso di un substrato noto (p.es. formaldeide CH2O)

8 CH2Osubstrato

3O2 NH3 C5H7NO2

biomassa

3CO2 6H2O

Y

BiomassaprodottaSubstratoconsumato

C5H7NO2

8CH2O

113830

0.47gSSV/ gsubstrato Y

BiomassaprodottaSubstratoconsumato

C5H7NO2

8CH2O

113830

0.47gSSV/ gsubstrato

Peso molecolare del substrato CH2O = 30 Peso molecolare della biomassa C5H7NO2 = 113

Il fattore di resa può anche essere calcolato come:

gCOD (nella biomassa prodotta) /gCOD (nel substrato degradato)

Massa atomica C = 12 ; N = 14; H = 1; O = 16

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Calcolo di Y in termini di COD Equivalenza COD/substrato:

3222275 255 NHOHCOONOHC

8 CH2O 8O2 8CO2 8H2O

f COD

8O2

8CH2O

832830

1.06gCOD/ gsubstrato

Equivalenza COD/biomassa:

f X

5O2

C5H7NO2

532113

1.42gCODcell/ gbiomassa

Pertanto Y:gCOD

gCOD

gsubstrato

gSSV

substrato

biomassaY 63,0

06,1

42,147,047,0

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Tasso di crescita e concentrazione del substratoUna relazione empirica della relazione esistente fra il tasso di crescita della

biomassa e la concentrazione di substrato, largamente utilizzata nella pratica, è quella ricavata da Monod derivata dalla cinetica enzimatica di Michelis-Menten:

Sostituendo questa espressione nella definizione del fattore di resa si ha:

Dove k è il tasso massimo di utilizzazione del substrato, pari a μmax/Y.

Ks rappresenta il valore della concentrazione del substrato al quale corrisponde un tasso di crescita pari alla metà del tasso massimo.

Si noti che

Per S>>Ks = max (cinetica di ordine zero)

Per S<< Ks = maxS/Ks (cinetica di ordine uno)

SK

S

S max

SK

kSX

SK

SX

Yr

SSsu

maxXdt

dXessendo

Y

X

dt

dS

dtdS

dtdX

r

rY

su

g 1

/

/

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Proprietà della cinetica di crescita

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All’aumentare del substrato disponibile il tasso di crescita aumenta fino ad un valore massimo. Si noti come in presenza di alti valori di Ks il rateo massimo di crescita si ottiene per valori più elevati dalla concentrazione del substrato, mentre con valori bassi di Ks si ottiene già con basse concentrazioni.

Andamento rateo di crescita

0

1

2

3

4

5

6

7

0 200 400 600 800 1000 1200

Substrato (mg/l)

Ra

teo

di

cre

sc

ita

(1

/d) KS = 100

KS = 10

KS = 50

Effetto della costante di semisaturazione

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Sostanze inibitrici dei processi di crescitaOggi le acque reflue raccolgono spesso sostanze tossiche (composti

organici o metalli pesanti) che possono diventare inibitori della crescita microbica impedendo così il funzionamento dei sistemi biologici di depurazione. Tale effetto di inibizione si esplica, solitamente, superando una definita soglia di concentrazione.

Per esempio, nel caso di microrganismi eterotrofi, alcune soglie sono riportate di seguito:

Arsenico 0.05 mg/l; Cadmio 1 mg/l; Cromo tot. 10 mg/l; Cromo esa. 1 mg/l; Rame 1 mg/l, Piombo 0.1 mg/l; Mercurio 0.1 mg/l; Nickel 1 mg/l; Zinco 1 mg/l.

Nel caso di microrganismi autotrofi nitrificanti le soglie sono inferiori.