1. นํา file จาก ClutalX ที่ได Align Sequence Protein ที่ download จาก NCBI ดังแสดงในรูปที่ 1

รูปที่ 1 แสดงโปรแกรม Clustalx

2. Save file เปน Phylip แลว copy file มาวางใน Phylip Program ใน floder EXE

รูปที่ 2 แสดงไฟรตางๆ ใน floder exe ของ Program Phylip

3. เปลี่ยนช่ือ file เปน infile.phy

รูปที่ 3 แสดง file ที่ช่ือ infile ใน Phylip

4. เลือก seqboot รูปที่ 4 แสดง ภาพหนาจอกอนการเปลี่ยนแปลงคาเพื่อการวิเคราะห Seqboot

5. เปลี่ยนคากอนการวิเคราะหดังน้ี D Molecular sequence

Random seed

O ANSI R 1000

111

รูปที่ 5 แสดงหนาจอการเปลี่ยนแปลงคาตางๆ กอนการวิเคราะห

ตอบ Yes จะได file ช่ือ outfile ออกมา นํา file ช่ือ infile เกาเปลี่ยนช่ือแลว สราง floder ใหม 1 floder เพื่อเก็บ file ที่ใชแลวไมใหมีจํานวน file ใน floder exe มากเกินไป เปลี่ยนช่ือ file outfile เปน infile เพื่อการวิเคราะหในขั้นตอนตอไปและทําการเปลี่ยนช่ือ file ในรูปแบบนี้ตลอด

6. วิเคราะห Genetic distance โดยคลิกท่ี proml ดังแสดงในรูปที่ 2 ซึ่งจะไดหนาจอกอนการเปลี่ยนแปลงคาคลายกับรูปที่ 4 แลวเปล่ียนแปลงคากอนการวิเคราะห ดังน้ี

P PAM M select type D Data set =10 O ANSI

Number of time to jumble 10

เมื่อเปล่ียนคาสําเร็จดังแสดงในรูปที่ 6

รูปที่ 6 แสดงผลการเปลี่ยนแปลงคากอนการวิเคราะห Proml

7. เปลี่ยน outfile เปน infile และเปลี่ยน outtree เปน intree ดังวิธีในขอ 5 แลวคลิกเลือก consense เพื่อการสราง Phylogeny Tree เปล่ียนแปลงคาดังน้ี

T ANSI

รูปที่ไดจะแสดง

รูปที่ 7 แสดงหนาจอของ consense กอนการวิเคราะห เมื่อวิเคราะหเสร็จแลวจะได file 2 files คือ outfile และ outtree แลว เปล่ียน file ช่ือ outfile เปน infile และ เปลี่ยน outtree เปน intree

8. นํา file outtree คัดลอกไปเปดใน Treeview program เมื่อคัดลอกไปแลวหนาจอของ Treeview Program เปดขึ้นแสดงภาพ Phylogeny Tree ดังแสดงในรูปที่ 8

รูปที่ 8 แสดงหนาจอของ Treeview Program หลังการคัดลอก file เขาไป

9. Phylogeny Tree ที่ไดจากขอ 8 จะยังไมไดตั้งคา outgroup ตั้งคาไดโดยการเขาไปที่ tool bar เลือก tree ตอดวย Defile Group เลือกช่ือท่ีตองการใหเปน Outgroup ดังแสดงในรูปที่ 9

รูปที่ 9 แสกงการตั้งคา outgroup ใหกับ phylogeny tree

10. เมื่อต้ังคาเสร็จแลวเลือกที่ tool bar เลือก tree เลือก root with out group จะได phylogeny tree ที่แสดง outgroup ดังแสดงในรูปที่ 10

รูปที่ 10 แสดง phylogeny tree ที่มี outgroup

11.ตั้งคาใหแสดงคาตางๆดังรูปที่ 11 คือท่ี tool bar เลือก Phylogram เพื่อแสดง Phylogeny tree เลือก Show internal edge labels เพื่อแสดงคาความตาง (Distance)ของแตละ clade

รูปที่ 11 แสดง Phylogeny tree

12. ผลการวิเคราะหที่ไดทั้งหมดดังแสดงในรูปที่ 11 แสดงใหเห็นวา caspase ที่มาจากคนละสิ่งมีชีวิตกันยังคงมีความคลายกันทางสายบรรพบุรุษ (Phylogeny) มากกวาสิ่งมีชีวิตที่มาจากที่เดียวกันแตตางชนิดกัน อยางไรก็ตาม การใช เพียง Phylip ในการหา Phylogeny Tree ในปจจุบันไมเปนที่นิยม เนืองจากตองใชหลายขั้นตอน ผลการวิเคราะหที่ไดทั้งหมด แสดงใหเห็นวา sequence ทั้ง 23 ชนิดที่ มีความคลายกันทางสายบรรพบุรุษ (Phylogeny) โดยเลือก C.elegans เปน out group เพราะจากการ Alignment ของ Clustal X จะเห็นไดวา สิ่งมีชีวิตที่สนใจในการวิเคราะหครั้งนี้คือ Salmon ซึ่งผลที่ไดดังนี้

1. T-B และ A-Homo มีความคลายกัน

2. Samon มีความคลายคลึงกับ D. rerio, 3B, 96609_T และ T.

3. 3B มีความคลายคลึงกับ niger และ D.

4. 7 มีความคลายคลึงกับ h G.กับ U-homo

Home

หมายเหตุ

ช่ือยอ สิ่งมีชีวิต ช่ือยอ สิ่งมีชีวิต ช่ือยอ สิ่งมีชีวิต ช่ือยอ สิ่งมีชีวิต

C.elegans C. elegans 3A medaka3A niger Gobius3 h_G chicken7

Samon Salmon3B 3B medaka3B 3_XENLA Xenopus3 J-Homo Human3 C_6A Salmon6A 96609_T Tetraodon3 X.laevis Xenopus6 A-Homo Human6A C Salmon6B T Tetraodon7 7 Xenopus7 T-B Human6B D Salmon7 T. Takifugu3 3c chicken3 U-homo Human7 6 rainbow6 D. zebrafish3 gallus 6 chicken6