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ORIGINALES

Deteccin de ADN de CMV en plasma mediante PCRen tiempo real utilizando SYBR-Green I como seal de amplificacinEduardo Varela-Ledoa, Susana Romero-Yusteb, Patricia Ordez-Barbosaa, Patricia Romero-Junga, Elisabeth Prieto-Rodrgueza,Antonio Aguilera-Guiraoa y Benito Regueiro-Garcaa

aServicio de Microbiologa. Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. bServicio de Reumatologa. Complejo Hospitalario de Pontevedra. Espaa.

detection as compared to another real-time PCR methodbased on detection with FRET (fluorescence resonanceenergy transfer) probes for the quantification of CMV DNA.METHODS. The two real-time PCR methods were used totest plasma samples from immunocompromised patientswith clinically suspected CMV disease, patients underfollow-up without symptoms, and healthy adults.A standard curve for quantitative analysis by theSYBR-Green I method was performed with 10-fold dilutedsolutions of DNA from the CMV Towne strain (ATCCVR-977) cultured in MRC-5 monolayer. In addition, frozensamples from patients positive for CMV pp65 antigenemiawere also analyzed and results compared using the tworeal time PCR methods.RESULTS. The real-time PCR technique using SYBR-Green Ion the LightCycler 2.0 was a highly specific, fast, simpleand reliable test to quantify CMV; moreover, it wascost-effective.CONCLUSION. Quantification of CMV DNA in plasma usingthis sensitive, fast, low-cost method was advantageous forthe diagnosis and follow up of patients with opportunisticCMV infection, which are increasingly more frequent in ourdaily hospital clinical practice.

Key words: Cytomegalovirus. LightCycler. Real-time PCR.

Introduccin

El citomegalovirus (CMV) puede ser responsable de gra-ves complicaciones infecciosas que comprometen la vidade pacientes con inmunosupresin severa. Siguiendo auna infeccin primaria o reactivndose desde su estadode latencia, puede provocar enfermedad multisistmica ocuadros localizados en distintos rganos, y con frecuencia,su actividad asocia un incremento de infecciones bacteria-nas y fngicas o la aparicin de rechazo en pacientes conrgano trasplantado1.

La viremia que sigue a la infeccin activa por CMV2 su-pone el mayor factor de riesgo para la progresin a enfer-medad3, especialmente en pacientes con trasplante alog-nico de mdula sea3-5. En cambio en el trasplante dergano slido y en la infeccin por virus de la inmunodefi-ciencia humana (VIH) la presencia de viremia es en menor

OBJETIVO. El objetivo del presente estudio es evaluar unatcnica rpida y sencilla de reaccin en cadena de lapolimerasa (PCR) en tiempo real en LightCycler2.0 revelada con SYBR-Green I, comparndola con otratcnica de PCR en tiempo real que utiliza sondas FRET(fluorescence resonance energy transfer) para revelar laamplificacin.MTODOS. Los dos mtodos de PCR en tiempo real secompararon utilizando muestras de plasma de pacientesinmunodeprimidos con sospecha clnica de enfermedadpor citomegalovirus (CMV), de pacientes monitorizadossin sintomatologa, y de adultos sanos. El estudio secomplet con otras muestras de plasma congeladas decasos positivos por antigenemia pp65, y con ADN de CMVde la cepa Towne (ATCC VR-977) obtenido de cultivo enMRC-5, con el que elaboramos una curva estndar para sucuantificacin.RESULTADOS. La PCR revelada con SYBR-Green I result serclaramente la ms rentable por su alta sensibilidad,rapidez y sencilla realizacin, adems de su bajo coste.CONCLUSIN. La determinacin cuantitativa de ADN de CMVen plasma utilizando un mtodo sensible, rpido y de bajocoste, como el que proponemos, supone una clara ventajapara el diagnstico y seguimiento de estos cuadros,especialmente en hospitales como el nuestro, donde en losltimos aos se ha incrementado sensiblemente el nmerode pacientes susceptibles de padecer esta infeccinoportunista.

Palabras clave: Citomegalovirus. LightCycler. PCR entiempo real.

CMV DNA detection in plasma using real-time PCR basedon the SYBR-Green I dye method

OBJECTIVE. The aim of this study is to assess a real-timePCR technique on the LightCycler 2.0 with SYBR-Green I

Correspondencia: Dr. E. Varela-Ledo.Hospital de Conxo. C.H.U.S.Ramn Baltar, s/n. 15706 Santiago de Compostela. A Corua. Espaa.Correo electrnico: [email protected]

Manuscrito recibido el 15-3-2006; aceptado el 1-6-2006.

Enferm Infecc Microbiol Clin 2006;24(9):541-5 541

ENFER INFECC 24 (9) noviembre 10/10/06 11:35 Pgina 541

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medida predictiva de enfermedad6-9. De hecho, el CMVpuede ser detectado en plasma con baja carga viral en unnmero importante de pacientes con infeccin asintom-tica que nunca progresa a enfermedad10,11.

Aunque la profilaxis antiviral puede reducir tanto lamorbilidad como la mortalidad por CMV, la toxicidad delos agentes antivirales como ganciclovir, foscarnet y cido-fovir contina siendo un problema importante.

El desarrollo de mtodos altamente sensibles para de-tectar y cuantificar la carga de CMV en sangre o plasmapuede ser de gran ayuda para la indicacin de la terapiatemprana5,12,13 slo en aquellos pacientes con mayor o ver-dadero riesgo de padecer la enfermedad.

La antigenemia pp65 demostr durante aos ser degran utilidad para el control de estos pacientes, pero supo-ne una tcnica muy laboriosa que requiere de cierta expe-riencia, su interpretacin es relativamente subjetiva y elprocesamiento de las muestras no puede demorarse dema-siado. Adems, resulta inadecuada para algunos pacientesque pueden presentar leucopenia14.

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiemporeal es un mtodo muy sensible y capaz de cuantificar elADN viral en plasma ms precozmente que la antigene-mia15,16, que no se afecta por el retraso de 24 h en la sepa-racin del plasma17 y que permite obtener los resultados demltiples muestras en breve tiempo, al realizar simult-neamente la amplificacin y deteccin del producto, evi-tando as manipulaciones post-PCR18.

Existen mltiples ensayos de PCR en tiempo real paraCMV basados en sistemas de sondas FRET (fluorescenceresonance energy transfer) que, si bien suponen un mto-do especfico de deteccin, tienen la desventaja de su ma-yor coste y manipulacin con respecto a la PCR reveladacon SYBR-Green I.

Nosotros proponemos un sistema de PCR en tiempo realrpido, sensible, de bajo coste y de sencilla realizacinpara deteccin de CMV en muestras de plasma, usandoSYBR-Green I como marcador de la amplificacin.

Materiales y mtodos

MuestrasPara comparar las dos tcnicas de PCR en tiempo real selecciona-

mos 4 grupos de muestras clnicas y utilizamos ADN de CMV obteni-do de cultivos en MRC-5.

El primer grupo incluy 53 muestras pertenecientes a 32 pacientescon sospecha clnica de enfermedad por CMV de los que 8 eran porta-dores de trasplante renal, 8 de trasplante alognico de mdula sea y7 de hgado; 3 eran VIH positivos, 3 procedan del servicio de oncope-diatra, otros 2 de neonatologa, y uno de digestivo.

El segundo grupo estaba formado por 14 alcuotas de plasma con-geladas de muestras con resultado positivo por antigenemia pp65.

Posteriormente aadimos un tercer grupo de 50 muestras de 27 pa-cientes asintomticos sometidos a monitorizacin: de los que 11 erantrasplantados de rin, 8 de mdula sea, 4 de hgado y 4 de oncope-diatra. Y finalmente, incluimos un cuarto grupo de 5 muestras deadultos sanos.

Extraccin de ADNUn total de 300 l de plasma de cada muestra se procesan para ex-

traccin TNAI (total nucleic acid isolation) mediante el sistema auto-mtico COBAS AmpliPrep (Roche Diagnostics Corporation, Indian-polis, EE.UU., y Roche Diagnostics [SchWeiz] Rotkreuz, Suiza)

siguiendo las indicaciones del fabricante. La solucin sobrante deADN que no se utiliza en la PCR se almacena a 20 C para posterio-res ensayos.

PCR en LightCycler 2.0

Revelada con SYBR-Green ILa mezcla de reaccin, en 15 l, incluye: MgCl2 4 mM; 0,2 M (con-

centracin final) de cada uno de los primers (Invitrogen, Paisley,Escocia) que reconocen una regin del gen de pp6519 y 2 l de LC-FastStart DNA Master SYBR-Green I (Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Alemania). A esta mezcla aadimos 5 l del ADN obte-nido en el proceso de extraccin, completando un volumen total de20 l para cada capilar de reaccin. Los capilares se alojan en el ca-rrusel del LightCycler 2.0 (Roche Molecular Biochemicals, Mann-heim, Alemania) tras una breve centrifugacin a 3.000 rpm y se poneen marcha el siguiente programa: 10 min de preincubacin a 95 C,seguidos de 50 ciclos de 2 s de desnaturalizacin a 95 C, 10 s de hi-bridacin a 60 C y 15 s de elongacin a 72 C. La medicin de la se-al de fluorescencia se efecta durante la fase de extensin en modosingle a 530 nm.

Al finalizar la amplificacin se efecta un anlisis de las curvas dedisociacin del producto de amplificacin aumentando la temperaturaa razn de 0,1 C/s desde 65 hasta 95 C mientras se registra la sealde fluorescencia a 530 nm en modo continuo.

Sondas FRETUn total de 5 l del ADN extrado de las muestras de plasma se

aaden a 15 l de mezcla de reaccin: con MgCl2 4 mM, 0,66 M decada primer para una regin del gen de la glucoprotena B y 0,4 M delas sondas marcadas con LC-Red 640 y fluorescena (TIB MOLBIOL,Berln, Alemania)20, ms 2 l de LightCyclerFastStart DNA MasterHybridization Probes (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alema-nia). El protocolo de amplificacin fue el siguiente: 10 min a 95 C depreincubacin para la activacin de la Fast Start taq DNA polimera-sa, seguidos de 55 ciclos de 5 s de desnaturalizacin a 95 C, 15 s de hi-bridacin a 57 C y 13 s de elongacin a 72 C. La fluorescencia semide en modo single a 640 nm durante la fase de hibridacin. La mel-ting curve se hace desde 40 C hasta 85 C, subiendo la temperaturaa 0,1 C/s y monitorizando la seal en modo continuo a 640 nm.

CuantificacinEl set de TIB MOLBIOL se complementa con un estndar de cuan-

tificacin que se obtiene mediante clonacin del producto de PCR conTA cloning system (Invitrogen K2000-01) y que alcanza una concen-tracin de 109 copias/ml. La amplificacin de una serie de diluciones1:10 del concentrado inicial permite elaborar una curva de referenciapara cuantificacin mediante el Software 4.0 (Roche DiagnosticsGmbH, Penzberg, Alemania) del LightCycler 2.0.

De cada una de las diluciones preparadas se guardan alcuotas a80 C para utilizar en posteriores anlisis.

Cultivo de CMVCon objeto de comprobar los lmites de deteccin y la correlacin en-

tre ambos sistemas de PCR, preparamos un cultivo de la cepa Townede CMV ATCC VR-977 (American Type Culture Collection. Rockville,Maryland, EE.UU.) en monocapas de clulas MRC-5 (VIRCELL, Gra-nada, Espaa), mantenidas en botellas de 25 cm2 con EMEM suple-mentado con suero bovino fetal (SBF) 10% y L-glutamina 1%. Cuan-do el efecto citoptico se haba generalizado a toda la monocapa, lasclulas se recogieron en suspensin en el medio de cultivo despren-dindolas del fondo de la botella con una pipeta estril. De esta sus-pensin celular concentrada se realiz extraccin de ADN mediante elDNA Mini Kit de QIAGEN (Hilden, Alemania).

Con el ADN obtenido preparamos diluciones seriadas 1:10 de lasque se guardaron alcuotas a 80 C y se realiz un ensayo de cuanti-ficacin mediante el sistema de sondas FRET de TIB MOLBIOL, que

Varela-Ledo E, et al. Deteccin de ADN de CMV en plasma mediante PCR en tiempo real utilizando SYBR-Green I como seal de amplificacin

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nos permiti obtener una grfica estndar de referencia para cuantifi-cacin con SYBR-Green I (fig. 1).

Primers y sondas

Direccin 5-3Tamao

del productoTm

gB For: ATAggAggCgCCACgTATTC 57,6 CgB Rev: TACCCCTATCgCgTgTgTTC 254 bp 57,1 CgB-FL: CgTTTCgTCgTAgCTACgCTTACAT-FL 62,0 CgB-LC: LC-640-ACACCACTTATCTgCTgggCAgC-p 62,2 Cpp65 For: gACACAACACCgTAAAgC 43 Cpp65Rev: CAgCgTTCgTgTTTCC 278 bp 41 C

Antigenemia pp65En nuestro laboratorio utilizamos una tcnica de inmunoperoxida-

sa para la deteccin de Ag temprano de CMV en leucocitos polimorfo-nucleares (PMN) de sangre perifrica: CMV-vue (DiaSorin. Minneso-

ta, EE.UU.). Los leucocitos se separan con dextrano al 5%, se lisanlos hemates, y se lavan dos veces con tampn fosfato (PBS). Una vezajustada la concentracin a 2 106 cls./ml, se fijan por duplicado enun portaobjetos con controles + y , y se sigue la tincin con inmuno-peroxidasa segn las recomendaciones del fabricante. El resultado loexpresamos en nmero de clulas positivas/105.

ResultadosEl ADN de CMV obtenido del cultivo en clulas MRC-5

se cuantific mediante el set de TIB MOLBIOL20, y con lpreparamos una serie de diluciones desde 1010 hasta102 copias/ml que se amplificaron en LightCycler conFastStart DNA Master SYBR-Green I en repetidas ocasio-nes. La dilucin con 103 copias/ml presenta el inicio de suseal de amplificacin prxima al ciclo 45. El lmite de de-teccin de la tcnica con el inculo de 5 l estara alrede-dor de las 200 copias/ml, ms que suficiente si tenemos en



44424038363432302826

20

3 4 5 6

Log Concentration

Standard Curve

Error: 0.155Efficiency: 1.901

7 8 9 10

Cros

sing

Poin

t

2224

Std. curve Samples

1,584

1,384

1,184

0,984

0,784

0,584

0,384

0,184

-0,016

-0,216

-0,416

16 18 20 22

Cycles

Log Amplification Curves

24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

log

Fluo

resc

ence

(530

)

1: CMV -1 2: CMV -2 3: CMV -3 4: CMV -4 5: CMV -56: CMV -6 7: CMV -7 8: CMV -8 9: CMV -9

Figura 1. Grfica y curvas estndarde referencia para cuantificacin conSYBR-Green I.



cuenta la mayora de los puntos de corte propuestos parael inicio de la terapia antiviral20,21.

El anlisis de las curvas de disociacin de los productosnos permite distinguir las verdaderas seales de amplifi-cacin de la secuencia buscada en el gen pp65, de aqu-llas debidas a dmeros de primers o a amplificaciones ines-pecficas que a veces se observan con algunas muestrasclnicas cuando se revelan con SYBR-Green I: las mues-tras positivas presentan una melting curve muy bien defi-nida, con un pico prximo a 90-91 C, mientras que lasdebidas a seales inespecficas de amplificacin estnsiempre por debajo de esta temperatura (fig. 2).

Los valores positivos obtenidos con las muestras clni-cas oscilaron entre las 5 106 copias/ml y prximos a las200 copias/ml, que supone el lmite terico de deteccin.En el primer grupo de 53 muestras, se detectaron 26 posi-tivos en total (23 con sondas FRET y 24 con SYBR-Gre-en I) con 5 casos discrepantes (2 a favor de sondas FRETy 3 a favor de SYBR-Green I) en todos los cuales la cargaviral era muy baja. El seguimiento de ellos permiti con-firmar su positividad al observarse incrementos en la car-ga de muestras posteriores.

La cuantificacin mediante SYBR-Green I aproxim losvalores a los obtenidos con las sondas FRET, especialmen-te en aquellas muestras con 104 copias/ml o ms, que sonlos valores con los que casi siempre se correlacionan la ac-tividad viral y los diferentes cuadros clnicos20-24. Igual-mente, la disminucin de la carga postratamiento se pudoseguir de manera equivalente con ambas tcnicas.

Las 14 muestras positivas para antigenemia pp65 lofueron tambin por ambos sistemas de PCR a tiempo real,mostrando una buena correlacin entre la carga viral ob-tenida y el nmero de clulas pp65 positivas.

De las 50 muestras de pacientes en monitorizacin, enseis se amplific ADN de CMV por ambos mtodos dePCR: cuatro de ellas eran de 2 mujeres con trasplante alo-gnico de mdula sea, una de las cuales presentaba unacarga viral inferior a 500 copias/ml, que se mantuvo du-

rante una semana postratamiento para desaparecer alcabo de 10 das. En la otra paciente, la cuantificacin al-canz los 3 106 copias/ml, coincidiendo con un cuadro deneumonitis intersticial, y descendi hasta 1,5 2 105 co-pias/ml (FRET y SYBR-Green I, respectivamente) a los8 das del tratamiento con ganciclovir. Las otras 2 mues-tras positivas pertenecan a 2 pacientes con trasplante re-nal asintomticos, ambos con menos de 500 copias/ml, queen las determinaciones posteriores se negativizaron sin re-cibir tratamiento.

Las 5 muestras de adultos sanos fueron negativas conambas tcnicas.

DiscusinEl creciente aumento de pacientes con cuadros de inmu-

nosupresin y el nmero de muestras, cada vez mayor, quese reciben en el laboratorio para detectar ADN de CMV,hacen necesaria la utilizacin de mtodos de diagnsticogiles, que se puedan incluir en la rutina de trabajo dia-ria. Disponer de una tcnica rpida, sensible, de bajo costey que exige una manipulacin mnima, representa un clarobeneficio a la hora de organizar esta rutina del servicio,disminuyendo posibles errores tcnicos y acortando la de-mora en la emisin de informes, que en algunas ocasionesse solicitan con mxima urgencia.

La PCR en tiempo real revelada con SYBR-Green I reu-ne todas estas condiciones, a nuestro juicio, mejor queotras tcnicas de diagnstico para CMV: en nuestros ensa-yos, se muestra al menos tan sensible como las sondasFRET y obtenemos valores cuantitativos muy similares.

En la PCR revelada con SYBR-Green I utilizamos pri-mers para la regin UL83 que codifica la protena de ma-triz pp6519 en lugar que los de gB del set de TIB MOL-BIOL (Ikewaki et al25 observan en algunos pacientes unatendencia a detectar menor carga viral de CMV con pri-mers para gB que con otros para US17 y UL65). La ampli-


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1,9941,7941,5941,3941,1940,9940,7940,5940,3960,196

-0,006

66 68

1: 03/597186: 1182711: 1723016: 200500008230

2: 04/108647: 1201112: 1813417: c+ATCC -3

3: 111118: 1249313: 3021818: c + ATCC -2

4: 115919: 1484314: 30224

5: 1159510: 1527015: 3363 - o

70 72

Temperature (C)

Melting PeaksTM Calling

74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94

(d/dT

) Fluo

resce

nce (

530)

Figura 2. Melting peaks que mues-tran los productos de amplificacincon SYBR-Green I de algunas de lasmuestras clnicas positivas para CMV.





ficacin de un segmento de mayor tamao con nuestrosprimers, nos permite obtener un melting peak a mayortemperatura, confiriendo ms especificidad a la tcnica.

Al no necesitar sondas marcadas se simplifica la pre-paracin de las mezclas, y se evitan problemas de almace-namiento y/o disponibilidad de reactivos adems de re-ducir el coste26. (La PCR a tiempo real con SYBR-Green Ipodra resultar incluso ms barata que la antigenemiapp65 dependiendo del mtodo de extraccin de ADN quese utilice).

Para la mayora de las muestras que recibimos, un m-todo de cribado sensible que permita descartar los casosnegativos sera suficiente, pero la PCR en tiempo real conSYBR-Green I puede ser til tambin para aproximar lacarga viral y establecer una mejor correlacin entre eldiagnstico de laboratorio y el cuadro clnico20-24.

Como inconvenientes cabe citar la posible aparicin deseales inespecficas de amplificacin con algunas mues-tras y la falta de un control interno que permita poner derelieve la presencia de inhibidores de la reaccin. No obs-tante, la inhibicin total de la amplificacin con muestrasde plasma o suero es muy infrecuente: en nuestro labora-torio no ocurri en ningn caso despus de amplificar msde 300 muestras de plasma y suero con el kit CMV Moni-tor AMPLICOR (Roche. Branchburg, Nueva Jersey,EE.UU.) que incluye un control interno de amplificacin) yen ltimo caso, la inhibicin parcial no impide la deteccincualitativa27, permitiendo al menos realizar el seguimien-to del paciente dependiendo de su cuadro clnico.

En cuanto a las seales inespecficas de amplificacin, elanlisis final de las curvas de disociacin nos permite dis-tinguir los productos obtenidos de la secuencia de CMVde aquellos debidos a dmeros de primers u otras secuen-cias que, de presentarse, suelen hacerlo iniciando su curvade amplificacin en los ltimos ciclos.

Financiacin

Este trabajo ha sido financiado en parte por el proyecto: PGI-DIT03BTF91802PR de la Xunta de Galicia.

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