4. ESPECTROSCOPIA MOLECULAR

Técnica instrumentales

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1 Técnicas espectroscópicas: Espectroscopia molecular Espectrofotometría de absorción UV-Vis

Aina Font i Barceló ombr

4. ESPECTROSCOPIA MOLECULAR

Las radiaciones se pueden representar en varias zonas dependiendo de que longitud

de onda o frecuencia tengan. Podremos encontrar varias técnicas de espectroscopia

dependiendo de la región del espectro que absorban o emitan.

- Si absorbe en la UV-Visible: Espectroscopia de absorción UV-visible.

- Si emite en UV-Visible: Fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Se

excitaran a una cierta longitud de onda y emitirán también a una longitud de

onda, son unas moléculas especiales que desprenden fluorescencia.

- Si absorbe en IR: Espectroscopia IR

- Cambios en el spin nuclear: RMN

Los espectros de absorción molecular son bastante más complejos que los espectros

atómicos, ya que el número de estados de energía de la molécula son muchísimos mas.

A diferencia de los espectros atómicos, que consisten en líneas, los espectros

moleculares están formados por bandas de absorción que abarcan un rango grande de

longitudes de onda. Las bandas incluyen la transición electrónica (del estado

fundamental al excitado) que a su vez incluyen transiciones de estados vibratorios y

rotacionales. Por lo tanto, el espectro esta formado por muchas líneas cerca entre si que

acaban formando las bandas.


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A cada movimiento le corresponde una cierta absorción de luz de una región diferente

del espectro de radiación.

- REM microondas: Transiciones de rotación sobre el eje de la molécula:

- REM infrarroja: Transiciones de vibración (rotación) -> Espectroscopia IR

- REM ultravioleta-visible: Transiciones electrónicas (vibratorios y rotatorios) -> Espectroscopia UV-Vis

Por lo tanto tal y como se puede ver en la imagen superior, una radiación con longitud

de onda en UV-VIS puede provocar un salto electrónico y a la vez transiciones de

rotación y de vibración. Una REM en zona de IR puede provocar transición de rotación

y de vibración, es menos energética que la UV-Vis y no provoca saltos de electrones. Y

finalmente la REM microondas puede provocar rotación en la molécula pero no es

suficientemente energética para provocar ningún otro tipo de transición.

E total= E rotación+ E vibración+ E electrónico

+ energía de la REM


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4.1 ESPECTROSCOPIA DE ABOSRCIÓN UV-VISIBLE

Se mide la cantidad de luz absorbida por la muestra con un detector. El detector mide

la cantidad de REM transmitida que haciendo el menos logaritmo obtendremos la REM

absorbida.

La longitud de onda de la REM UV-Visible es de 180-1000nm. Debemos recordar que

la REM absorbida es complementaria a la REM transmitida, la que vemos nosotros y

nos da el color.

- Absorción de 420-430nm: color amarillo

- Absorción de 500-520nm: color rojo.

- Absorción total: color negro (no hay transmisión)

- No absorción: color blanco (todo transmisión)

En esta técnica la REM provoca una transición electrónico, y a la vez también rotacional

y vibratorio. Debemos indicar en que estado electrónico se encuentran los electrones

(fundamental (E0) o excitado (E1)) y en que nivel vibratorio y rotacional. Las transiciones

electrónicas se basan en:

-Principio de Franck-Condon:

ü Las transiciones electrónicas tienen lugar entre un nivel energético inferior

(fundamental) a un estado energético superior. De un nivel vibratorio del

estado fundamentas hasta cualquier nivel vibratorio del estado excitado.

ü Se pueden encontrar 3 tipos de transiciones:

o Transiciones de electrones en orbitales moleculares π y σ.

Los enlaces σ son los que tienen lugar entre orbitales lineales al eje

intranuclear.

Los enlaces π son los que tienen lugar entre orbitales perpendiculares al

eje intranuclear.

o Transiciones de electrones en orbitales atómicos f/d

o Transiciones de transferencia de carga.


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FUNDAMENTO: ORBITALES MOLECULARES

Las zonas entre dos átomos unidos con un enlace covalente que están ocupadas por

electrones se llaman orbitales moleculares y se consideran como el resultado de la

superposición de orbitales atómicos.

Al momento que dos átomos se unen para formar una molécula, cada uno de ellos

aporta un electrón al enlace y se forman 2 orbitales moleculares (híbridos): uno de baja

energía (enlazante) y el otro de alta energía (inestable): antienlazante. Los electrones

de una molecular en estado fundamental se encuentran en el orbital molecular

enlazante.

De dos orbitales atómicos S se forman orbitales moleculares simétricos σ, un orbital de

baja energía y otro de alta energía (inestable) antienlazante. Estos enlaces moleculares

van asociados a los enlaces sencillos.

Los electrones del orbital σ se encontraran en estado fundamental (baja energía) pero

cuando se le dé una REM UV-Vis estos pasarán a un estado energético más elevado.

Dos orbitales p cuando se enlazan por superposición paralela forman orbitales no

simétricos π. Estos orbitales están relacionados con moléculas con dobles enlaces,

estas contienen dos tipos de orbitales moleculares: un orbital sigma que corresponde a

los electrones enlazantes (σ) y un orbital molecular pi asociado a los electrones (π). Los

electrones se encontraran en estado fundamental (baja energía) pero cuando se le dé

una REM UV-Vis estos pasarán a un estado energético más elevado y inestable

(antienlazantes).


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Además de los electrones pi y sigma, muchos compuestos contienen electrones no

enlazantes (n).

Así una molécula que tenga dobles enlaces, es decir, enlaces π, σ y orbitales no

enlazantes (n) podrá tener los siguientes saltos energéticos:

σ -> σ *, N-> σ * , π -> π* y N -> π*

Los compuestos saturados, con dobles enlaces, tienen electrones no enlazantes en los

orbitales N, estos electrones pueden tener transiciones n -> σ * que necesitan menos

energía que las transiciones σ -> σ *. Estas dos transiciones son poco probable en la

zona espectral UV. La mayoría de transiciones que tienen lugar en la técnica de

absorción UV-Visible son π -> π* y N -> π* por parte de moléculas orgánicas con

enlaces insaturados (dobles).

Las transiciones π -> π* y N -> π* constituyen la mayoría de las aplicaciones de la

espectroscopia UV-Vis de los compuestos orgánicos, esto es a causa que la energía

que se necesita para estos saltos conducen a picos de la región UV-Visible. Las

transiciones N -> π* suelen tener unos picos de absorbancia más bajos que las

transiciones π -> π* . Experimentalmente esta absorción tiene lugar en la zona espectral

de entre 200-700nm.

Energía-

Molécula con enlaces sigma y pi


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Estas grupos insaturadas capaces de absorber UV-Vis, se llaman grupos cromóforos.

La absorción de estos grupos se puede ver afectada por la presencia de grupos

auxocrómicos. Estos grupos funcionales no absorben por si solos en UV-Vis pero

pueden influenciar los picos de absorción de los grupos cromofóros.

- Efecto batocrómico: desplaza aumentando la longitud de onda de máxima

absorción

- Efecto hipsocrómico: desplaza disminuye la longitud de onda de máxima

absorción

- Efecto hipercrómico: aumenta la absorción.

- Efecto hipocrómico: disminuye la absorción

A parte de estos grupos la absorbancia también puede verse modificada por la polaridad

del disolvente donde se encuentra la molécula. Si el disolvente es polar las transiciones

N -> π* se desplazan hacia longitudes de onda más cortas (efecto hipsocrómico) a

diferencia de si la transición es π -> π* que se observa una tendencia inversa (efecto

batocrómico).

La conjugación de grupos cromóforos, es decir que haya alternados enlaces simples y

dobles también provoca una modificación de la absorbancia . Esta conjugación provoca

un efecto batocrómico y un efecto hipercrómico a causa de una reducción de la energía

del orbital π* y por lo tanto un menor carácter antienlazante.

FUNDAMENTO: LEY LAMBER-BEER

En esta técnica estudiamos la absorbancia de REM UV-Vis por parte de una molécula.

Como ya se ha comentado, la absorbancia consiste en el menos logaritmo de la

transmitancia.

La transmitancia se define como la parte de REM incidente que consigue atravesar la

muestra (no absorbida).


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La transmitancia se expresa como: T= P/ P0, donde P indica REM incidente y P0 la REM

transmitida.

La absorbancia por lo tanto será A= -logT.

A partir de este valor de absorbancia Lamber-Beer desarrollo una ecuación que

relacionar este valor con la concentración de analito en la muestra.

La ley de Lamber- Beer relaciona la absorbancia con la concentración, la absortividad y

los cm de la cubeta. La absorbancia es directamente proporciona a la longitud de la

trayectoria de la REM en la solución (cm de la cubeta) y a la concentración del analito

absorbente.

A= ɛ *C* b

ɛ= absortividad molar (característica de la molécula)

c= concentración del analito (g/l)

b= cm de la cubeta (1cm)

Gracias a esta fórmula a partir de la absorbancia podremos obtener la concentración de

nuestro analito en la muestra à análisis cuantitativo.

Esta ley tiene ciertas limitaciones:

- A concentraciones de analito elevadas (>0,01M) se puede ver modificada la absorbancia, se pierde la linealidad entre la concentración y la absorbancia. Esta

limitación es a causa de que la distancia entre las moléculas disminuye hasta el

punto de que cada molécula altera la distribución de carga de las moléculas

vecinas. Por lo tanto solo describe bien la relación concentración-absorción en

soluciones diluidas, si la muestra es muy concentrada será necesario diluirla.

- Desviaciones instrumentales: siempre conducen a errores negativos en la absorbancia. Puede ser causa de una radiación policromática (la ley solo acepta

monocromáticas) , radiación parásita o errores de la lectura de la absorbancia.


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INTRUMENTACIÓN:

Las fuentes de emisión deben ser continuas:

- Lámparas de deuterio (región UV) o hidrogeno.

- Lámparas de filamento de tungsteno (región Visible).

- Lámpara de arco de xenón.

Los selectores de longitud de onda mas utilizados son los monocromadores como el

prisma o la red de difracción. También se podrían usar los filtros.

El material de la cubeta de la muestra no debe absorber REM UV-Visible, por lo tanto

debemos usar:

- UV (<350nm): cuarzo o sílice fundida.

- Vis (350-200nm): vidrios de silicato.

De normal la longitud de la cubeta (b en la ley de Beer) tiene un valor de 1 cm.

Finalmente tenemos los detectores: fototubo (180-600nm) y el más utilizado el tubo

fotomultiplicador (UV-Vis). Este último detector consta de un cátodo y de una serie de

dinodos que amplifican los fotones a electrones.

Como se ha visto en temas anteriores hay varios tipos de instrumentos:

- Haz simple: las determinaciones se hacen por etapas separadas. Primero se mira el blanco y seguidamente la muestra.

- Doble haz: el instrumento nos permite medir a la vez la absorbancia del blanco y de la muestra, de esta manera se reducen los errores instrumentales ya que

en caso que hubiera alguno queda eliminado. Mayor precisión, pasa

simultáneamente la radiación entre las dos cubetas.


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- Instrumento con serie de dinodos: La muestra se encuentra entre la fuente y

el elemento dispersante. La REM primero pasa por la muestra y seguidamente

la radiación no absorbida va a un elemento de dispersión que la separará en

todas las longitudes de onda que se dirigirán hasta el detector que consiste en

una serie lineal de dinodos. El hecho que sea un detector con varios dinodos nos

permitirá determinar varias longitudes de onda a la vez. Podremos conocer la

absorción de la muestra en varias de longitudes de onda en una única

determinación.

APLICACIONES

- Utilizada básicamente para un análisis cuantitativo gracias a la aplicabilidad tanto en sistemas orgánicos cómo inorgánicos, alta selectividad, buena precisión

y fácil adquisición de datos.

- Análisis cualitativo: proporciona una información limitada para el análisis

cualitativo, la identificación de la molécula de manera inequívoca es muy

complicada.

- Interpretación del espectro: hace falta tener una gran base de datos de espectros

para hacer una comparativa muy exhaustiva y poder identificar correctamente la

molécula. Será útil para poder confirmar la presencia de una molécula.

- Determinación del punto isosbéstico y pKa: se basa en que la absorción de la

molécula con grupos funcionales ácidos o básicos depende del pH del medio.

Se debe obtener el espectro de la molécula a diferentes valores de pH,

dependiendo del pH la molécula absorberá una longitud de onda o otra ya que

los grupos funcionales serán diferentes. El punto donde de cruzan los espectros

se denomina punto isosbéstico. Su aparición evidencia que en el equilibrio se

encuentran dos especies absorbentes (acida-base). Gracias al punto isosbéstico

encontraremos el valor pKa, este se define como el valor de pH en el cual la

mitad del compuesto está en la forma ácida y la otra mitad la forma básica.

- Seguimiento de las reacciones químicas.

- Análisis de muestras; la absorbancia total de una disolución a una longitud de

onda concreta es igual a la suma de las absorbancias de los componentes (Ley

de Beer es aditiva). La abosrbancia total depende de las abosrbancias de los

componentes.

Atotal = Aa+ AB+Ac


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1 Técnicas espectroscópicas: Espectroscopia molecular Espectrofotometría de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia


4.2 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Técnicas que se basan en un proceso de absorción de REM y seguidamente un proceso

de emisión. Las moléculas son especiales y presentan una emisión fluorescentes, son

procedimiento luminiscentes. Su espectro nos da información tanto cuantitativo como

cualitativa.

En la fluorescencia la molécula tienen la capacidad de absorber fotones de la región

UV-Visible, por lo tanto deberán tener enlaces pi, y seguidamente emiten luz a una

longitud de onda más larga, es decir a menor energía.

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que la primera no hay un cambio

en el spin del electrón cuando este se excita a diferencia de la segunda técnica que el

electrón excitado se desaparea. Por lo tanto la fluorescencia es una técnica que emite

rápidamente post-excitacion, es decir enseguida los electrones vuelven a su estado

fundamentas y la emisión de luz tiene lugar <10-5s en cambio en la fosforescencia al

haber un cambio en el spin la emisión tiene lugar un cierto tiempo después de haber

excitado la muestra.

FUNDAMENTOS

El electrón lo podemos definir con el spin, la capacidad de moverse sobre si mismo y se

le asigna el valor +-1/2.

En el nivel fundamental los electrones pi se encuentran aparejados creando campos

magnéticos contrarios que quedan anulados. Cuando los electrones pasan a niveles

exitados puede ser con o sin cambio de spin.

Los electrones cuando se encuentran en estado fundamental tienen un estado apareado

de los dos spines, este estado se denomina singulete. Cuando un electrón es excitado

pasaremos a tener un estado excitado singulete, el espín del electrón promocionado

está apareado con el electrón del estado fundamental. Hay algunos casos donde el spin

del electrón excitado y del electrón fundamental se desaparean y se colocan de manera

paralela, en este caso hablaremos del estado excitado triplete. Cuando hablamos de

singulete o triplete hablamos de multiplicidad: estados degenerados correspondientes

al spin electrónico.


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Una transición del estado singulete al estado triplete es mucho menos probable que una

transición del estado singulete fundamental al estado singulete excitado. Por lo tanto en

la fluorescencia, que tiene lugar una excitación singulete-> singulete, habrá una emisión

de radiación (la vuelta del electrón a su estado fundamental) mucho mas rápida que en

la fosforescencia. En este caso el tiempo de vida media del estado excitado triplete es

más larga, la emisión después de una transición triplete/singulete tiene lugar un tiempo

después del fin de la excitación.

DIAGRAMA DE JABLONSKI

El diagrama de Jablonski nos representa la excitación y emisión de los electrones en la

fluorescencia y fosforescencia. Como podemos ver primero hay una absorción donde

los electrones pasan del estado S0 a S2., en el estado excitado éstos pueden sufrir

conversiones internas o la relajación vibracional (cambios entre diferentes estados

exitados) pero emiten RMN no radiantes. Cuando el electrón pasa del estado singulete

excitado al fundamental hay emisión de radiación que nos da el fenómeno de la

fluorescencia. En algunos casos tiene lugar esta transición pero sin que se desprenda

radiación, se desprende calor, son electrones que desactivan, este proceso se llama

conversión externa. Hay una transición que es del singulete S1 a triplte T1, que se llama

cruce entre sistema, esta es una transición no radiante y nos permite llegar al estado

triplete (es imposible a la práctica pasar del S0 a T1). El paso de T1 a estado fundamental

es una transición radiante-> fosforescencia.


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Por lo tanto en resumen:

ü Radiantes: Fosforescencia (tàs)

Fluorescencia (s1às0)

ü No radiantes: Conversión externa(s1às0)

Conversión interna (s2às1)

Cruce entre sistemas (s1-àt1)

Relajación vibracional (los electrones excitados se van relajando

a estados menos energéticos)

Como ya hemos comentado la duración de los procesos despende de como de probable

sea el proceso, por lo tanto la fluorescencia (10-6) en cambio la fosforescencia (102 -105).

El hecho que los electrones sufran relajación vibraciones, es decir, que se exciten a un

nivel elevado de energía y se vayan relajando a niveles inferiores antes de emitir, se

denomina relajación de Stokes. Define que las bandas de fluorescencia o fosforescencia

aparecen a una longitudes de onda mayores que la línea de excitación a causa de la

relajación vibracional.

Los espectros de fluorescencia siempre tendrán: una parte de excitación/absorción que

será a más energía y una longitud de onda más baja, luego habrá la parte de emisión

de fluorescencia y finalmente una parte con menos energía y más longitud de onda que

será la fosforescencia.

λ excitación < λ fluorescencia < λ fosforescencia

E excitación > E fluorescencia > E fosforescencia


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CUANTIFICACIÓN DE LA FLUORESCENCIA

El requisito mas importante para que haya fluorescencia o fosforescencia es que las

moléculas posean una estructura que absorba el UV-Visible, deben tener lugar las

transiciones de pi à pi* y nà pi*.

En esta técnica nos interesa medir la emisión de REM por parte de la molécula, para

cuantificarla utilizaremos el rendimiento cuántico. Este concepto se define como la

diferencia entre fotones emitidos y fotones absorbidos.

Rendimiento cuántico= Moléculas que emiten/ moléculas absorbidas

Rendimiento cuántico = Fotones emitidos/ fotones absorbidos

El máximo rendimiento cuántico (100%) será la situación en que cada fotón absorbido

resulta ser un fotón emitido. Todo lo que absorbe la molécula será emitido.

RELACIÓN FLUORESCENCIA-CONCENTRACIÓN

En la UV-Visible encontramos la Ley de Beer que relaciona la concentración de la

muestra con la absorbancia. En el caso de la fluorescencia encontramos la ecuación

de Kavanagh.

Relaciona la intensidad de la fluorescencia con la concentración.

F= KI0 2.303εbc

I0= Intensidad del haz indecente de la muestra

F= fluorescencia de la muestra

C= concentración de la muestra

La representación de relación entre la fluorescencia y la concentración de las especies

emisoras es lineal a bajas concentraciones. A concentraciones mayores se pierde la

linealidad,


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PROPIEDADES DE LAS MOLECULAS FLUORESCENTES

Las moléculas deben absorber REM UV-Visible por lo tanto deberán tener electrones pi

y n que se excitarán a niveles superiores (π -> π* y N -> π*).

Deberán ser moléculas con enlaces dobles o triples y si son conjugados y con alto grado

de estabilización por resonancia, serán mas fluorescentes. Otras características que

tienen estas moléculas son: aromaticidad, gran rigidez, estructuras multicíclicas y

grupos dadores de electrones.

Para aumentar la rigidez de las moléculas y por lo tanto la fluorescencia podemos

aumentar el pH, aumentar la viscosidad del medio, llevar a cabo la reacción en un

ambiente sin oxigeno y utilizar temperaturas bajas.

Hay algunos aspectos que pueden provocar una disminución de la fluorescencia

(Quenching):

- Estático: si la molécula fluorescente interacciona previamente con otra

molécula y se queda estática disminuirá la fluorescencia.

- Colisiones: molécula excitada que choca con otra molécula y pierde energía

(intensidad) y eso provoca una reducción de la fluorescencia.

- Químicos: el pH, presencia de oxigeno, polaridad.

- Concentración: al momento en el que se llega a una concentración de la

molécula máxima la intensidad de fluorescencia tenderá a reducirse.

Las moléculas que desprenden radiaciones fluorescentes se denominan fluorocromo, los más típicos que tienen fluorescencia intrínseca son:

- Aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptófano, tirosina, aunque no todos

tienen el mismo rendimiento quántico.

- Vitaminas A, B6, B12, E.

- Catecolaminas

- Porfirinas: hemoglobina

- Esteroides: colesterol.

- Tetraciclinas, AINES, barbitúricos.

Hay algunas moléculas que no son fluorescente pero se les puede añadir un marcador

fluorescente (conjugación), hay una unión covalente o no covalente entre la molécula y

el marcador.


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FLUORESCENCIA- INTRUMENTACIÓN

Para la fluorimetría se pueden usar dos instrumentos, debemos recordar que en esta

técnica la luz incidente y la luz emitida (detector) deben estar a 90º:

- Espectrofluorímetro, tiene de elemento de difracción el monocromador.

- Fluorímetro de filtro usan como elemento de difracción los filtros.

Espectrofluorímetro

La luz procedente de la fuente de excitación pasa a través de un monocromador que

permite escoger la longitud de onda a la que queremos excitar. Una vez la luz pasa a

través de la muestra, los electrones se excitan absorbiendo luz y seguidamente se

emitirá luz fluorescente a todas las direcciones. Algunas de las REM emitidas pasaran

por un segundo monocromador y llegarán al detector. Es importante que haya dos

monocromadores el primero que nos permite seleccionar la longitud de onda a la que

queremos excitar y el siguiente pre-detector nos permite escoger la longitud a la que la

molécula emite (análisis cualitativo). El detector debe estar colocado a 90º de la fuente

de emisión, es un factor muy importante porque sino el detector también nos dará

información de la REM no absorbida (REM parásita) y nosotros queremos conocer la

REM emitida (fluorescente).

Las lámparas usadas deben de ser UVI-Visible y se usan: lámpara de arco de xenón,

lámpara de vapor de Hg o láser. Seguidamente encontramos los monocromadores. La

REM incidirá a la muestra que se encuentra en una cubeta, es necesario que sea

transparente y no absorba la luz, en esta técnica vamos a utilizar el cuarzo. Finalmente

encontraremos el detector, el mas utilizado es el tubo fotomultiplicador, la señal es de

baja intensidad y este detector nos permite ampliarla.

REM Parásita


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Análisis del espectro

En esta técnica podemos analizar dos espectros diferentes:

- Espectro de excitación: representa la absorción por parte de la molécula. No se

selecciona ninguna longitud de onda en el monocromador de emisión. Se van

modificando las longitudes de onda de excitación mientras que las de emisión

se mantienen, así se podrá buscar la longitud donde haya máxima excitación y

por lo tanto fluorescencia.

- Espectros de emisión: representan la emisión de fluorescencia y fosforescencia,

se deberá dejar fija la longitud de onda del primer monocromador (la longitud de

onda debe ser aquella donde la excitación sea máxima).

Nos dará un espectro con dos bandas, la primera a mas energía y menos

longitud de onda corresponde la fluorescencia y la segunda de menos energía

pero mas longitud de onda a la fosforescencia.

El detector nos da un espectro que permite un análisis tanto cualitativo como cuantitativo

de la molécula.

- Cualitativo: las bandas que aparecen en el espectro nos dan información

cualitativa, son características de cada molécula, por lo tanto si comparamos los

espectros con bases informáticas podremos identificar la molécula. La longitud

de onda de emisión de las moléculas es característica de cada uno y nos permite

poder identificar. Da mucha información en el cas de interacción entre dos

sustancias, se puede observar el efecto sobre el fluorocromo según la

interacción.

- Cuantitativos: alta sensibilidad y límites de detección más bajos que en UV-

Visible. Con la ley de Kavanagh se puede relacionar la intensidad de la

fluorescencia a una determinada longitud de onda con la concentración. Esta

ley solo se cumple a absorbancias bajas (A<0,05), a partir de este valor se pierde

la linealidad de la recta y por lo tanto ya no se cumple la ecuación.

APLICACIONES

- Técnica muy sensible y selectiva, muy útil para los estudios cuantitativos.

Gracias a la relación lineal de fosforescencia y concentración, podemos hacer

una recta de calibrado que nos permitirá conocer a partir de la F la concentración.


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- Microscopia de fluorescencia: observación de la expresión de una proteína.

Cuando se hace la reacción con la proteína se une un fluorocromo que nos

indicara si hay presencia o no de la proteína.

- Detección de interacción entre proteínas: 2 fluorocromo diferentes están cerca

con diferentes longitudes de onda de emisión y de absorción. En este caso los

fluorocromo interaccionan y se superponen (transferencia de energía).

- Estudio de fragmentos para el desarrollo de fármacos: un fármaco si esta unido

al agua no desprende fluorescencia pero cuando interacciona con las proteínas

desprende. Se pude utilizar la técnica para conocer la desnaturalización de las

proteínas y si nuestro fármaco se une a ellas, a medida que se ira uniendo a las

proteínas, dejará de unirse al agua y desprenderá fluorescencia.

FOSFORESCENCIA- INTRUMENTACIÓN

Técnica muy parecida a la fluorescencia pero la radiación tarda unos segundo a ser

emitida después de haber excitado la muestra.

El hecho que tarde un tiempo en emitirse la REM hace que sea una técnica más

compleja y menos usada, se necesita una temperatura y condiciones muy constantes

para que los electrones no se desexciten con una REM no radiante. Se suele utilizar el

nitrógeno líquido para mantener las condiciones. La estructura molcular y el entorno

químico influencian que una sustancia termine emitiendo REM luminiscente y la

intensidad.

Para aumentar la probabilidad de que tenga lugar este proceso podemos trabajar con

temperaturas muy bajas, aumentar mucho la viscosidad o incorporar un tensioactivo que

haga la molécula más rígida.

Los instrumentos que se usan para esta técnica son el fosforímetro o

espectrofosforímetro, ambos instrumentos son muy parecidos a los usados en la

fluorescencia pero tienen un componentes adicionales: el vaso de Dewar que

proporciona una temperatura constante

APLICACIONES

- Aplicaciones muy específicas, como la determinación de especies orgánicas o

inorgánicas, por la dificultad de las condiciones necesarias.


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4.3 ESPECTROSCOPIA DE QUIMIOLUMINISCENCIA

Se basa en el mismo fundamento que la fosforescencia y la fluorescencia pero en este

caso no hay una lámpara que excite la muestra, sino que la transición a niveles

superiores tiene lugar en respuesta a una reacción química.

La reacción química permite la transición de los electrones a estados superiores y al

relajarse emitirán la REM, no hay ninguna radiación de excitación. La reacción entre la

muestra y el reactivo dará la emisión, y la intensidad de está dependerá de la

concentración de los reactivos. El rendimiento de luminiscencia nos dará la información

de la eficacia de la técnica.

La instrumentación en esta técnica es muy básica, por lo tanto es una técnica muy

sencilla. El luminometro detecta la luz emitida por nuestra muestra utilizando de detector

un tubo fotomultiplicador que ampliará cada fotón a un seguido de electrones (campo

eléctrico).

APLICACIONES

- Determinación de especies orgánicas o inorgánicas: según la presencia o no

de ciertas sustancias tiene lugar la reacción de quimioluminiscencia.

RESUMEN

En resumen de las tres técnicas:

- Fluorescencia: hay una lámpara que irradia nuestra muestra, esta absorbe la

energía y pasa de estado S0 a S1 (no hay cambio de spin). La radiación que

emite será justo después de haber excitado la muestra.

- Fosforescencia: hay una lámpara que irradia nuestra muestra, esta absorbe la

energía y pasa de estado S0 a T1 (hay cambio de spin). La radiación que emite

será unos segundos después de haber excitado la muestra, harán falta unas

condiciones muy constantes.

- Quimioluminiscencia: No es necesario una lámpara de REM para excitar los

electrones, estas transiciones tienen lugar gracias a una reacción química. El

detector determina la radiación emitida después de la reacción química.

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4. ESPECTROSCOPIA MOLECULAR